第 3 卷第 5 期 2010 年 9 月水生态学杂志 JournalofHydroecology Vol.3,No.5 Sep.,2010 斑马鱼性别决定相关基因的表达分析陈芸, 王艺磊, 田佳, 张雅芝 ( 集美大学水产学院福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室, 福建厦门

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1 第 3 卷第 5 期 2010 年 9 月水生态学杂志 JournalofHydroecology Vol.3,No.5 Sep.,2010 斑马鱼性别决定相关基因的表达分析陈芸, 王艺磊, 田佳, 张雅芝 ( 集美大学水产学院福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室, 福建厦门 ) 摘要 : 选择一些可能参与斑马鱼性别决定相关的基因 (cyp19a cyp19b gata4 dmrt1 和 wt1), 通过 RT-PCR 和实时荧光定量 PCR 技术分析各个基因在斑马鱼 64 细胞期 (2h) 256~512 细胞期 (2.5h) 囊胚球体期 (4h) 30% 外包 (4.6h) 50% 外包 (5.2h) 75% 外包 (8h) 胚孔封闭期 (10h) 10~15 体节期 (15h) 成型期 10~20(32h) 孵化期 (60h) 幼苗期 (120h) 以及和 30d 的表达情况结果显示 :cyp19a 与 cyp19b 基因随着胚胎的发育表达量逐渐增加, 在 28~30d 达到最高 ;gata4 基因在胚孔封闭期表达量最高, 随后降低 ;dmrt1 基因在 30% 外包期表达量最高, 随后逐渐递减 ;wt1 基因在 10~15 体节期表达量最高, 随后逐渐递减并保持稳定的表达关键词 : 性别决定 ; 性别分化 ; 斑马鱼 ;RT-PCR; 实时荧光定量 PCR 中图分类号 :Q344 文献标志码 :A 文章编号 : (2010) 鱼类性别决定和分化机制极其复杂有雌雄异体和雌雄同体 ( 先雌后雄先雄后雌和雌雄同步 ) 以及发育过程中的性逆转类型, 并且鱼类的染色体组型在不同种类之间存在很大差异 (XX/XY ZZ/ZW 和 ZO 等 ) 温度 ph 盐度光照水质食物丰度和种群内部关系对不同种鱼类的性别决定和分化的影响各不相同, 所以鱼类性别决定的机制呈现多样化 ( 姚延丹等,2009) 目前, 对鱼类性别决定和分化机制的认识已经进入到基因水平, 许多鱼类性别决定相关基因都已被克隆 ( 姚延丹等,2009) 斑马鱼 (Daniorerio) 作为一种模式生物, 具有繁殖能力强体外受精和发育胚胎透明性成熟周期短个体小易养殖等诸多优点, 特别是可以进行大规模的正向基因饱和突变与筛选, 这些特点使其成为功能基因组时代生命科学研究中重要的模式生物之一斑马鱼共有 50 条染色体, 未发现性染色体, 也没有性连锁基因的相关报道 (WalaceB& Wal laceh,2003) 斑马鱼在胚胎发育的各个时期可能受到多种性别决定基因的调节 (1)FTZ-F1 基因该基因参与肾的发育, 进而促进类固醇的生物合成, 且其表达模式与组织的再生分化功能相关联 (ChaiC&ChanW,2000) (2)cyp19 基因几收稿日期 : 收修改稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ), 集美大学创新团队基金 (2008A001) 作者简介 : 陈芸,1978 年生, 女, 湖北大冶人, 博士, 主要从事分子遗传学研究 yunchen@jmu.edu.cn 乎在所有的脊椎动物中都含有芳香化酶, 哺乳动物仅有 1 种芳香化酶, 而鱼类却有脑型和性腺型 2 种芳香化酶, 它可以使睾酮转变成 17b- 雌二醇, 内源性导致雄性向雌性逆转, 在斑马鱼中 cyp19 基因分为 cyp19a 和 cyp19b2 种, 并且 cyp19a 主要在性腺表达而 cyp19b 主要在脑部表达 (ChiangE etal, 2001) (3)dmrt1 基因 dmrt1 基因是 dmrt 基因家族的一个重要成员, 它具有一个锌指样的 DNA 结合结构域, 称为 DM 结构域郭一清等 (2004) 在斑马鱼中得到了 dmrt1 基因的全长序列, 并且发现 dmrt1 基因在精巢和卵巢均有表达, 在精巢中具有较高的表达原位杂交发现 dmrt1 基因在斑马鱼发育中的生殖细胞具有很强的表达信号 (4)gata4 基因 gata4 基因属于 gata 基因家族中的一种, 在哺乳动物中 gata4 基因是 sry 基因和 amh 基因的重要调控因子 (TevosianSetal,2002) 在斑马鱼中发现 ga ta4 基因可作为 cyp19 基因的调控因子, 从而可能调节芳香化酶的表达 (TchoudakovaA etal,2001) (5)amh 基因在斑马鱼中 amh 基因不应该归结到参与性别决定的因子中, 因为鱼类缺乏缪勒管, 但是 amh 基因在性腺发育过程中起重要作用在斑马鱼中已获得 amh 的 cdna 并发现该基因专一地在性腺中表达, 通过原位杂交发现 amh 主要在精巢的赛尔托利细胞和卵巢的卵泡层中表达 (vonhofstenjet al,2005) (6)sox9 基因在斑马鱼中确认有 2 种 sox9 基因, 分别命名为 sox9a 和 sox9b, 它们都具有 HMG-box, 并且可以结合 AACAAAG 识别位点, sox9a 和 sox9b 在斑马鱼成体中的表达模式不一样,

2 2010 年第 5 期田佳等, 斑马鱼性别决定相关基因的表达分析 11 sox9a 呈现泛表达模式, 在脑肾肌肉精巢胸鳍中中 64 细胞至幼苗期取 20 个胚胎,7~14d 取 10 条都有表达 ; 而 sox9b 仅仅在卵巢中被检测到 (Chiang 仔鱼,16~20d 取 5 条仔鱼,20~24d 取 3 条仔鱼, Eetal,2001) (7)wt1 基因它是一种调控尿殖 26~30d 取 1 条仔鱼用 TrizolReagent(Invitrogen) 嵴发育的基因, 在胚胎发育早期尿殖管道的发育中试剂盒抽提总 RNA, 用 2% 的琼脂糖凝胶电泳检测起重要作用 wt1 基因在鱼类也参与芳香化酶基因总 RNA 的完整性的调控,Nakamoto 等 (2006) 发现在罗非鱼中 wt1 基 1.3 合成 cdna 第 1 条链因对芳香化酶 cyp19a 起调控作用, 在斑马鱼中 wt1 在 8μL 总 RNA 中加入 1μLDNase 和 1μL 基因主要在肾脏分化过程参与中胚层表达 (Drum DNaseReactionBufer, 充分混匀,37 温浴 15~30 mondietal,1998) min 去除 DNA 的污染加入 1μL 的 EDTA,68 温以上的研究仅对单个基因的克隆以及在各组织浴 10min 终止反应在 0.5mL 的 PCR 管中, 加入和胚胎发育前期的表达做了阐述, 在斑马鱼胚胎发如下反应体系 : 约 3μg 总 RNA,1μL6 碱基随机引育后期 (10~30d) 这些基因的表达情况未见研究物 (10mmol/L) 补水至 14μL,70 5min 随后加而斑马鱼从胚胎发育生长性别分化到性腺成熟的入 4μLMMLVRT5 Bufer,1μLdNTP(10mmol/ 各个阶段均同时需要多个功能基因的参与本文结 L),1μL 逆转录酶 (200U/μL), 混合均匀 25 合目前的研究进展, 选择斑马鱼性别决定相关的基下 10min, 再在 37 下反应 90min, 最后 70 温浴因 (cyp19a cyp19b gata4 dmrt1 和 wt1), 通过 RT- 5min 灭活逆转录酶 PCR 和实时荧光定量 PCR 技术分析各个基因在斑 1.4 引物的设计与合成马鱼不同发育阶段的表达情况, 初步分析这些基因根据已发表的斑马鱼性别决定基因 (cyp19a 在各发育阶段的作用, 为深入了解斑马鱼性别决定 cyp19b gata4 dmrt1 和 wt1) 设计特异性引物 ( 表 1) 和生殖腺发育的分子调控机制提供参考资料用于 RT-PCR 的半定量检测, 设计荧光定量 PCR 的特异性引物 ( 表 2) 用于检测各基因在各个发育阶 1 材料和方法段的表达情况, 所用引物均由上海捷锐生物有限公 1.1 材料鱼司合成本实验所用斑马鱼为 Tuebingen 品系野生型, 1.5 RT-PCR 反应体系及条件饲养于 28 恒温循环水系统, 薄片鱼饲料 ( 海豚水 PCR 反应体系中包含有 :1μL 的 cdna 模板, 族有限公司 ) 和丰年虫卵 (BrineShrimpEggs, 美国 0.5μL 的 10mmol/L 的引物,0.5μL 的 25mmol/L 海星国际有限公司 ) 交替喂养, 产卵期间加喂 1 次的 dntp 混合物,0.5U 的 TaqDNA 聚合酶,3μL10 丰年虫卵通过人工诱导产卵, 收集胚胎以及仔鱼, Bufer 保存于液氮中 PCR 反应条件 :94 预变性 10min,94 30s, 1.2 总 RNA 的提取 60 30s,72 30s, 共进行 30 个循环, 最后 72 延上述每个发育阶段均取 3 组重复样, 在每一组伸 10min 以 β-actin 基因作为 PCR 的内参表 1 RT-PCR 所用基因的特异性引物 Tab.1 OligonucleotideprimersusedforRT-PCR NCBI 登录号引物序列碱基位置 AF cyp19a-f 5 AGCACTCGCATCTGTCCAAG3 1101~1120 cyp19a-r 5 TCAGAGAGTGTTTCTGAGGATAAG3 1538~1561 NM cyp19b-f 5 ATGATGGAGCATGTGGTAAAGG3 1157~1178 cyp19b-r 5 TTGAGGTGCGGTTGTCCGCTG3 1581~1601 NM gata4-f 5 CTGCGTCTTACGAGTCCGGTTT3 110~131 gata4-r 5 TGCTGATGTTTTTGGGTTTGCG3 880~901 NM dmrt1-f 5 CAGACTCATCGCCGAGAGACAG3 186~209 dmrt1-r 5 TCATTTGGTGGCCCCCCCTAT3 817~837 NM wt1-f 5 ATGGGTTCTGATGTTCGTGACC3 72~93 wt1-r 5 CCGTGCCGTAACCTTGATTC3 461~480 AF actin-f 5 TTGTTGGACGACCCAGACAT3 154~173 actin-r 5 ACCGCAAGATTCCATACCCA3 852~872

3 12 第 3 卷第 5 期水生态学杂志 2010 年 9 月表 2 实时荧光定量 PCR 所用基因的特异性引物 Tab.2 Oligonucleotideprimersusedforreal timepcr NCBI 登录号引物序列碱基位置 AF cyp19a-f 5 TCTGGGTCCTATTGTCTCCTAC3 232~253 cyp19a-r 5 CAGTTTACTTCCAAAGCGTGA3 407~427 NM cyp19b-f 5 CAGCAACATCGCAAAGTGGA3 478~497 cyp19b-r 5 GTCCTGAGGCGTCTGTGAAC3 604~627 NM gata4-f 5 ACCACCTCCTATAACTCAAGCACC3 270~293 gata4-r 5 CAGAGCCCGAGACCCGAAAT3 388~407 NM dmrt1-f 5 GCAGTCGCTCCATGTTGTCT3 404~423 dmrt1-r 5 AGTGGGCTGGTAAAGGTTGT3 494~513 NM wt1-f 5 GGAATCAAGGTTACGGCACG3 460~479 wt1-r 5 CTGGAGGAGGAACGGGATAC3 602~621 AF actin-f 5 GATCTGGCATCACACCTTCTACAA3 305~328 actin-r 5 CTCTCTGTTGGCTTTGGGATTC3 383~ 实时荧光定量 PCR 反应体系及条件实时荧光定量 PCR 反应体系以 cdna 第 1 条链为模板, 以 β-actin 作为内标基因, 基因特异性引物和 SYBRGreen 试剂盒进行定量 PCR 扩增经过预实验, 对引物和模板浓度进行一系列的优化后, 每个反应体系如下 :10μLSYBRGreenRealtimePCR MasterMix,0.5μL 正向反向基因特异引物,9μL cdna 第 1 条链每个发育阶段取 3 组重复样, 每组重复样做 4 次技术性重复实时荧光定量 PCR 反应条件如下 :95 变性 1 min, 进行如下 40 个循环 :95 变性 15s,60 退火 1min 1.7 数据分析记录下仪器 (ABI7500) 自动给出的每个样本的 RQ 值, 基因表达水平用 RQ 平均值 ± 标准差表示, 并用 SPSS15.0 统计学软件对数据进行单因素方差分析 2 结果 2.1 RT-PCR 检测结果采用 RT-PCR 对各基因 (cyp19a cyp19b ga ta4 dmrt1 和 wt1) 在斑马鱼不同发育阶段的表达进行了分析斑马鱼性别决定基因在各发育阶段的表达情况见图 1 cyp19a 基因与 cyp19b 基因在各发育阶段都有表达, 其中在 30d 左右表达量要高于其它发育阶段 gata4 基因从 75% 外包开始表达, 在胚胎胚孔封闭期左右表达量最高 dmrt1 基因在各发育阶段都有表达, 其中在 30% 外包和胚胎胚孔封闭期表达量最高, 随后逐渐递减 wt1 基因在各发育阶段都有表达, 其中在 10~15 体节表达最高 2.2 实时荧光定量 PCR 检测结果 cyp19a 基因在各个发育阶段的表达情况如图 2 所示经统计学分析,cyp19a 基因在 16d 之前表达量处于很低的水平, 从 20d 左右开始逐渐增加,30d 的表达量显著高于其它发育阶段图 1 性别决定相关基因在斑马鱼不同发育时期的表达情况 Fig.1 Theexpresionlevelofgeneswhichrelatedto sexdeterminationduringdiferentstages ofembryogenesisofzebrafish 注 :1~11 分别代表 64 细胞期 (2h) 256~512 细胞期 (2.5h) 囊胚球体期 (4h) 30% 外包 (4.6h) 50% 外包 (5.2h) 75% 外包 (8 h) 胚孔封闭期 (10h) 10~15 体节期 (15h) 成型期 10~20(32 h) 孵化期 (60h) 幼苗期 (120h) 以及和 30d cyp19b 基因在各个发育阶段的表达情况图 3 显示 cyp19b 基因在成型期 10~20d 以前表达量较低, 随后升高并且表达量处于相对平稳的阶段, 从 20d 开始表达量继续增加直到 28d 左右达到最高 gata4 基因在各个发育阶段的表达情况图 4 显示 gata4 基因在胚胎发育 50% 外包之前表达量较低从 75% 外包开始升高并且在胚胎胚孔封闭期表达量达到最高, 随后逐渐降低并稳定表达到 12d 左右, 之后表达量开始下降 dmrt1 基因在各个发育阶段的表达情况图 5 显示 dmrt1 基因从 64 细胞期有较高的表达到 30% 外包达到最高表达量, 随后表达量逐渐下降至幼苗期开始稳定表达 wt1 基因在各个发育阶段的表达情况图 6 显示 wt1 基因 10~15 体节之前处于很低的表达量, 到 10~15 体节突然升高, 随后递减并且稳定表达

4 2010 年第 5 期田佳等, 斑马鱼性别决定相关基因的表达分析 13 图 2 cyp19a 基因在斑马鱼不同发育时期的表达情况 Fig.2 Theexpresionlevelofcyp19agenesduringdiferentstagesofembryogenesisofzebrafish 注 :a 与 b,b 与 c: 显著性差异 (P<0.05);a 与 c,a 与 d,b 与 d,c 与 d: 极显著差异 (P<0.01) 图 3 cyp19b 基因在斑马鱼不同发育时期的表达情况 Fig.3 Theexpresionlevelofcyp19bgenesduringdiferentstagesofembryogenesisofzebrafish 注 :a 与 b,b 与 c,c 与 d: 显著性差异 (P<0.05) a 与 c,a 与 d,b 与 d: 极显著差异 (P<0.01) 别分化过程中起非常重要的作用, 可以使睾酮转变 3 讨论成雌二醇, 在类固醇代谢过程起关键作用 cyp19a 在性别分化之前, 不管染色体背景如何, 所有的基因主要在斑马鱼性腺中表达, 其中卵巢中的表达斑马鱼性腺发育都类似于卵巢卵巢的发育是性腺量较高 (ChiangEetal,2001) 本研究表明 cyp19a 发育的默认途径, 大概在受精后 10d 开始, 持续到基因在胚胎期从 64 细胞期到 14d 一直处于较低的 20d 受精 21~30d 期间, 精巢开始发育而相应的表达水平, 虽有小幅波动, 但差异不显著 ;cyp19b 基卵巢细胞开始凋亡, 斑马鱼性成熟一般需 3 个月, 但因在 16~24d, 表达量迅速升高, 此时正是性别分化是性别分化大约在受精后 21~23d 即被确定 (Uch 的关键时期, 对维持雌性的发育方向具有重要作用 idadetal,2002) 其中, 芳香化酶在斑马鱼的性在 20d 左右开始出现, 先较高表达并且持续增长,

5 14 第 3 卷第 5 期水生态学杂志 2010 年 9 月图 4 gata4 基因在斑马鱼不同发育时期的表达情况 Fig.4 Theexpresionlevelofgata4genesduringdiferentstagesofembryogenesisofzebrafish 注 :a 与 e,b 与 d,b 与 e,c 与 d: 显著性差异 (P<0.05);a 与 b,a 与 c,a 与 d,b 与 c,c 与 e: 极显著差异 (P<0.01) 图 5 dmrt1 基因在斑马鱼不同发育时期的表达情况 Fig.5 Theexpresionlevelofdmrt1genesduringdiferentstagesofembryogenesisofzebrafish 注 :a 与 b,a 与 d,b 与 c,c 与 d,d 与 e,e 与 f: 显著性差异 (P<0.05);a 与 c,a 与 e,a 与 f,b 与 d,b 与 e,b 与 f,c 与 e,c 与 f,d 与 f: 极显著差异 (P<0.01) 直到 30d 达到最高值, 表明在性腺分化之后, 性腺在 cyp19 基因的启动子区有 gata4 的结合位点对雌激素的需求增强鱼中主要在脑部表达, 在胚 (TchoudakovaAetal,2001), 表明它在调控芳香化胎中表达峰值分别在 22d 和 28d, 正好在性别分化酶的表达中具有重要功能, 且表达要先于 cyp19 基进行期和分化结束期, 主要参与了芳香化酶的合成, 因, 这与本研究中 cyp19 基因的表达情况相互呼应在性别分化和性腺发育中有重要功能 dmrt1 基因主要在斑马鱼胚胎发育的前期 (64 gata4 基因在胚胎胚孔封闭期和 10~15 体节表细胞期到 10~15 体节 ) 有较高的表达 Raymond 等达最高, 其余时期维持较高水平的表达, 稍有波动 (1998) 最早在人类中克隆出 dmrt1 基因, 并且认为 gata4 基因在哺乳类性别决定和分化期间是 sry 和该基因为性别分化基因, 与雌雄性别发育有关,dm amh 的重要转录调节因子 (TevosianSetal,2002), rt1 基因缺失会导致性逆转而在鱼类研究中表明

6 2010 年第 5 期田佳等, 斑马鱼性别决定相关基因的表达分析 15 图 6 wt1 基因在斑马鱼不同发育时期的表达情况 Fig.6 Theexpresionlevelofwt1genesduringdiferentstagesofembryogenesisofzebrafish 注 :a 与 b,b 与 d: 显著性差异 (P<0.05);a 与 c,a 与 d,b 与 c,c 与 d: 极显著差异 (P<0.01) dmrt1 基因主要在雄性中表达, 该基因可被当成胚及其表达 [J]. 中国水产科学,15(4): 胎向雄性方向发育的早期标记 (MatsudaM etal, 郭一清斑马鱼 Dmrt1 和 Dmrt5 基因克隆和表达分析 2002;NandaIetal,2002; 邓思平和陈松林, [D]. 武汉 : 武汉大学. 姚延丹, 龙华, 陈建武, 等鱼类性别决定及其研究 2008) 本研究结果证明 dmrt1 基因在幼苗的性别方法进展 [J]. 上海海洋大学学报,18(1): 决定和性别分化中有重要的功能, 可以作为雄鱼的 ChaiC,ChanW.2000.DevelopmentalexpresionofanovelFtz 胚胎期指示基因 -F1homologue, f1b(nr5a4),inthezebrafish(danio 在哺乳动物中,wt1 可以抑制细胞分裂和分化, rerio)[j].mechanismsofdevelopment,91(1/2):421 并且影响间质细胞形成精巢它是一种调控尿殖嵴发育的基因, 在胚胎发育早期尿殖管道的发育中起 ChiangE,PaiC,WyatM,etal.2001.Twosox9genesondu 重要作用在斑马鱼研究中表明 wt1 基因和 f1b 基 plicatedzebrafishchromosomes:expresionofsimilartran 因共同参与了肾上腺类固醇的合成, 从而推测 wt1 scriptionactivatorsindistinctsites[j].developmentalbi 基因在最早的生殖腺形成过程中起着重要的作用 ology,231(1): (KuroiwaAetal,1984) 本研究结果显示 wt1 基因 ChiangE,YanY,GuiguenY,etal.2001.TwoCyp19(P450 在 10~15 体节显著性表达, 而 10~15 体节正是斑 aromatase)genesonduplicatedzebrafishchromosomesare 马鱼生殖腺形成的重要阶段 (KimmelC etal, expresedinovaryorbrain[j].molecularbiologyande 1995) volution,18(4): DrummondI,MajumdarA,HentschelH,etal.1998.Early 目前, 研究表明在斑马鱼性腺发育过程中, 可能 developmentofthezebrafishpronephrosandanalysisofmu 存在多个基因协同调节芳香化酶基因的表达, 使其 tationsafectingpronephricfunction[j]. Development, 活力下降或者缺失, 从而导致雌激素的减少最终导 125(23): 致卵巢程序性死亡, 这时睾丸细胞开始分化并且伴 KimmelC,BalardW,KimmelS,etal.1995.Stagesofem 随着睾丸素水平的增加 (vonhofstenj& OlsonP, bryonicdevelopmentofthezebrafish[j].developmental 2005) 由本实验的结果可知 gata4 基因和 dmrt1 Dynamics,203(3): 基因在斑马鱼胚胎发育前期表达量相对较高, 而 KuroiwaA,HafenE,GehringW.1984.Cloningandtranscrip cyp19a cyp19b 基因的表达量一直处在相对较低的 tionalanalysisofthesegmentationgenefushitarazuofdro 水平, 从而证明了 gata4 基因和 dmrt1 基因对芳香化 sophila[j].cel,37(3):825. 酶基因的抑制作用 MatsudaM,NagahamaY,ShinomiyaA,etal.2002.DMYisa 参考文献 : Y-specificDM-domaingenerequiredformaledevelop 邓思平, 陈松林半滑舌鳎 Dmrt1α 基因的 cdna 克隆 mentinthemedakafish[j].nature,417:

7 16 第 3 卷第 5 期水生态学杂志 2010 年 9 月 NakamotoM,MatsudaM,WangD,etal.2006.Molecular cloningandanalysisofgonadalexpresionoffoxl2inthe medaka,oryziaslatipes[j].biochemicalandbiophysical ResearchCommunications,344(1): NandaI,KondoM,HornungU,etal.2002.Aduplicatedcop yofdmrt1inthesex-determiningregionoftheychro mosomeofthemedaka,oryziaslatipes[j].proceedingsof thenationalacademyofsciencesusa,99(18): RaymondC,ShamuC,ShenM,etal.1998.Evidenceforevo lutionaryconservationofsex-determininggenes[j].na ture,391: TchoudakovaA,KishidaM,WoodE,etal.2001.Promoter characteristicsoftwocyp19genesdiferentialyexpresedin thebrainandovaryofteleostfish[j].journalofsteroid BiochemistryandMolecularBiology,78(5): TevosianS,AlbrechtK,CrispinoJ,etal.2002.Gonadaldif ferentiation,sexdeterminationandnormalsryexpresionin micerequiredirectinteractionbetweentranscriptionpart nersgata4andfog2[j].development,129(19): UchidaD,YamashitaM,KitanoT,etal.2002.Oocyteapop tosisduringthetransitionfrom ovary-liketisuetotestes duringsexdiferentiationofjuvenilezebrafish[j].journal ofexperimentalbiology,205(6): vonhofstenj,larsona,olsonp.2005.novelsteroidogenic factor-1homolog(f1d)iscoexpresedwithanti-mule rianhormone(amh) inzebrafish[j].developmental Dynamics,233(2): vonhofstenj,olsonp.2005.zebrafishsexdeterminationand diferentiation:involvementofftz-f1genes[j].repro ductivebiologyandendocrinology,3(1):1-11. WalaceB,WalaceH.2003.Synaptonemalcomplexkaryotype ofzebrafish[j].heredity,90(2): ( 责任编辑杨春艳 ) ExpresionAnalysisofGenesWhichRelatedtoSexDeterminationofZebrafish CHENYun,WANGYi lei,tianjia,zhangya zhi (TheKeyLaboratoryofScienceandTechnologyforAquacultureandFoodSafety, FisheriesColege,JimeiUniversity,Xiamen ,China) Abstract:Theexpresionlevelofgenes(cyp19a,cyp19b,gata4,dmrt1andwt1)whichrelatedtosexdetermina tionwasprofiledduringdiferentstagesofembryogenesisofzebrafish(64-cel,256~512-cel,sphere,30% - epiboly,50% -epiboly,75% -epiboly,bud,10~15-somites,prim-10-20,pec-fin,earlylarva,and7, 10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30dpf(day post fertilization))usingreverse transcriptionpolymerase chainreaction(rt-pcr)andreal timepcr.theresultsindicatedthattheexpresionlevelofcyp19ageneand cyp19bgeneat28dpfand30dpfstageweresignificantlyhigherthanotherstages.theexpresionlevelofgata4 genewashigheringastrula budstagethanotherstages.thedmrt1genewasmostexpresedin30% -epiboly stage.thewt1genewasmostexpresedin10~15somitesstage. Keywords:Sexdetermination;Sexdiferentiation;Zebrafish;RT-PCR;qRT-PCR

人工催产干法授精孵化胚胎发育观察

人工催产干法授精孵化胚胎发育观察金万昆俞丽杨建新张慈军高永平赵宜双王春英人工催产干法授精孵化胚胎发育观察胚盘隆起细胞期细胞期细胞期细胞期细胞期多细胞期囊胚早期囊胚中期囊胚晚期原肠早期原肠中期原肠晚期神经胚期胚孔封闭期眼泡出现期尾芽期晶体出现期肌肉效应期心脏搏动期孵出期日龄仔鱼日龄仔鱼日龄仔鱼日龄仔鱼感谢中国水产科学院黑龙江水产研究所沈俊宝研究员的悉心指导

第 3 卷第 5 期 2010 年 9 月 水生态学杂志 JournalofHydroecology Vol.3,No.5 Sep.,2010 斑马鱼性别决定相关基因的表达分析 陈芸, 王艺磊, 田佳, 张雅芝 ( 集美大学水产学院福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室, 福建厦门

第 3 卷第 5 期 2010 年 9 月水生态学杂志 JournalofHydroecology Vol.3,No.5 Sep.,2010 斑马鱼性别决定相关基因的表达分析陈芸, 王艺磊, 田佳, 张雅芝 ( 集美大学水产学院福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室, 福建厦门