第 卷第 期 年 月 杭州师范大学学报 自然科学版!"# "$%% &'" $((& ) 反转录转座子分子标记及其在植物研究中的应用 汪 尚 索娜娜 赵红燕 冯尚国 卢江杰 王慧中 杭州师范大学生命与环境科学学院 浙江杭州 南京农业大学大豆研究所国家大豆改良中心 江苏南京 摘 要 反转录转座子以高拷

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1 第 卷第 期 年 月 杭州师范大学学报 自然科学版!"#"$%% &'" $((&) 反转录转座子分子标记及其在植物研究中的应用 汪 尚 索娜娜 赵红燕 冯尚国 卢江杰 王慧中 杭州师范大学生命与环境科学学院 浙江杭州 南京农业大学大豆研究所国家大豆改良中心 江苏南京 摘 要 反转录转座子以高拷贝在植物基因组中广泛分布 具有高度的异质性 可作为分子标记对植物基因组进行研究 文章对 -*-*!3-* 及 * 种基于植物反转录转座子开发的分子标记技术的原理 技术流程 特点及其在植物研究中的应用进行了概述 关键词 反转录转座子 分子标记 植物 遗传多样性 品种鉴定中图分类号 0 文献标志码 - 文章编号 ) 反转录转座子是植物中最为丰富的一类转座元件 在植物基因组中广泛存在 是一类可移动的遗传因子 由于其转座需要由 - 介导的反转录过程而得名 1 年第一例植物反转录转座子报道以来 许多研究小组对其进行了相关研究 发现很多植物中都有反转录转座子的分布 植物基因组中反转录转座子的分子量大小随植物种类的不同和反转座子类群的差异而变化很大 从 ;2 不等 不同植物中 反转录转座子在整个基因组中所占的比例差距较大 如拟南芥. 6 ' 包含 个反转录转座子 每个反转录转座子仅两个拷贝 其拷贝数占基因组的 水稻. 6 ' 包含 个左右的反转录转座子家族 其拷贝数占基因组的 小麦. 6 ' 反转录转座子占小麦基因组 以上 根据是否含有 =/&'7"$&##7 反转录转座子可以分为两大类 即 =/ 反转录转座子和非 =/&&=/ 反转录转座子 反转录转座子具有分布广泛 多拷贝 高度异质 插入位点多态的特性 因而其非常适合用于开发分子标记 目前 基于反转录转座子开发的分子标记技术 主要包括 -* 特异序列扩增多态性 (@&($8$#"$8$#7$&%"$(" -* 反向反转录转座子扩增多态性 $&777#&((&#"$8$%"$("!3-* 反转录转座子 微卫星扩增多态性 77#&((&"$(#7$7#"$8$%"$(" 和 * 基于反转录转座子的插入多态性 7 7#&((&2#($&(7$&%"$(" 1 等 文章对这种分子标记技术的原理 技术流程及其在植物研究中的应用进行了全面的介绍 旨在为相关研究提供一定的理论指导 收稿日期 基金项目 国家自然科学基金项目 111 浙江省重大科技专门项目 1.1 杭州市属高校重点实验室科技创新项目 1/ 浙江省科技创新团队基金项目 通信作者 王慧中 男 教授 博士 主要从事植物系统生物学研究!"#$5"

2 第 期 汪 尚 等 反转录转座子分子标记及其在植物研究中的应用 反转录转座子分子标记的原理 分子标记技术 -* 标记技术是由 #' 等利用大麦 # 逆转座子开发而成 其原理和操作流程类似于 -,=* 经典的 -* 由限制性内切酶 和 # 消化基因组 +- 然后连接接头 再分别进行预扩增和选择性扩增 通过同一位置片段的有无来判断其多态性 -* 在估计植物系统发生关系上比传统的 -,=* 标记更为有效 -* 标记技术的基本要求是 特异序列与接头酶切位点之间的距离在可扩增范围之内 因此只要引物设计合理 几乎可以用于任何己知序列的反转座子研究中 -* 标记既可以用来检测插入位点的多态性 又可以检测逆转座子内部的变异 被认为是多态性最丰富 灵敏度最高 反映多态性信息最多的一种标记类型 4 分子标记技术 -* 标记技术根据反转录转座子的 =/ 包含的保守序列设计引物 引物在 *. 过程中与 =/ 反转录转座子的相应区域退火 扩增出相邻的同一家族的反转录转座子成员间的片段 从而检测反转录转座子插入位点间多态性 也可根据反转录酶基因的相对保守序列设计引物进行扩增 从理论上讲 反转录转座子可以任意方向整合入基因组中 因此同一个反转录转座子家族的两个成员可以以 种形式相邻 即头对头 尾对尾和头对尾 )4,- 分子标记技术反转录转座子微卫星扩增多态性是在大麦中开发的 以特定的长末端重复 &'7"$&##7( =/( 在基因组中的位置为基础的分子标记!3-* 标记技术的原理是根据反转录转座子的 =/ 保守序列和微卫星序列进行引物设计 一个引物是外向的 =/( 引物 能与反转录转座子的 =/( 中的序列配对 另一个引物是锚定的微卫星序列引物 利用所设计的引物进行 *. 扩增出反转录转座子与最接近的微卫星间的片段 从而检测反转录转座子与简单重复序列之间的多态性 04; 分子标记技术 1 * 标记技术是由,# 等利用豌豆 *+ 逆转座子开发而成 *+ 为广泛散布于豌豆属植物中的一类 /%' 型逆转座子 该标记最大的优点是应用点杂交检测可使其分析完全自动化 能够同时实现对多个样品的快速 高通量标记分析 * 引物设计一般是以 *+ 反转座子元件为基础 筛选基因组文库 通过测序获得该反转座子及两侧翼的碱基序列 再分别设计特异于 侧翼和 侧翼正向引物 - 反向引物! 和逆转座子内部保守区引物. 由 -! 组合或.! 组合产生 *. 扩增引物 1 反转录转座子分子标记技术流程 种反转录分子标记一般的技术流程见表 反转录转座子分子标记技术在植物研究中的应用 活跃的反转录转座子可在基因组中制造新的插入位点 用来在谱系中建立系统发生关系 基于反转录转座子的分子标记在基因组中分布广泛 操作简单 重复性好 多态性高并具有高共显性等优点 表 其在生物多样性与系统进化 体细胞变异进化和品种鉴定以及遗传连锁图谱构建和基因定位等研究中得到广泛的应用

3 杭州师范大学学报 自然科学版 年 表 0 种反转录分子标记技术流程 ++'"%"$'!$"&"&#%'"#."%%!&&!1&" "$.5"& 标记类型反应体系 *. 程序检测方法参考文献 -* -* 预扩增 B*. 缓冲液 ""=/*( >+- 聚合酶 "=!*$"" = 3(*$" 连接产物 &' 基因组 +- 连接后得到的产物 选择性扩增 预扩增稀释产物 &' B*. 缓冲液 ""=/*( > /#@+- 聚合酶 "==/$" "= 选择性接头引物 体系 B*. 缓冲液 ""=/*( "= 引物 >+- 聚合酶 &' 基因组 +-!3-* 体系 * =/ 引物和微卫星序列引物各 "= ""=/*( >+- 聚合酶 &' 基因组 +- 或 体系 > 的 +- 聚合酶 上下游引物各 3= 3=/*( &' 模板 +- 预扩增 *. 程序 9 预变性 ( 循环 次 9 变性 (9 退火 ( 9 延伸 ( 9 延伸 "$& 9 结束保存 选择性扩增 *. 程序 9 预变性 ( 9 变性 ( 9 退火 ( 每循环递减 9 9 延伸 ( 个循环 9 变性 ( 9 退火 ( 9 延伸 ( 个循环 9 延伸 "$& 9 保存 9 预变性 "$& 多采用 变性丙烯酰胺凝胶电泳检测 银染进行分析 9 变性 (/" 9 退火 ( 的琼脂 9 延伸 "$& 个左右的循 糖凝胶或丙烯酰胺 环 胶电泳检测 9 延伸 "$& 9 保存 9 预变性 "$& 9 变性 ( 1 9 退火 (9 延伸 "$& 每循环依次增加 ( 共 个循环 9 延伸 "$& 9 保存 9 预变性 "$& 个循环 9 变性 "$&/" 9 退火 "$& 9 延伸 "$& 9 延伸 "$& 9 保存 表 反转录转座子分子标记技术的特点 ++'"$'$%"&#%'""%%!&&!1&" "$.5"& 琼脂糖凝胶上进行电泳 现多采用芯片技术来检测扩增产物的多态性 标记类型 基因组中分布 重复性 多态性 操作过程 所需模板量 遗传性 通用性 -* 广泛 高 很高 较复杂 少 共显性 一般 -* 广泛 高 高 简单 少 共显性 高!3-* 广泛 高 高 简单 少 共显性 高 * 广泛高高复杂少共显性较高 1

4 第 期 汪 尚 等 反转录转座子分子标记及其在植物研究中的应用 ) 遗传多样性与系统进化 多样性来源于突变的存在 而反转录转座子作为高等植物基因组中古老的转座元件 在生物进化中起着重要的作用 因此反转录转座子分子标记技术是研究植物遗传多样性和进化的理想工具 在早期研究中 "$7 等利用 * 标记成功的鉴别出野生型豌豆和栽培型豌豆 并构建了豌豆 种质资源框架图 而 -* 标记技术也能对豌豆品种进行研究 揭示出豌豆属种间和种内的亲缘关系 在大麦属亲缘关系分析中 应用 -* 和!3-* 标记技术 能够检测大麦属 的多态性 建立能 良好反映大麦属亲缘关系的进化图 #;$ 等大麦中的斑叶病菌进行 -* 标记分析 在对组织培养的大麦体细胞无性系品种进行检测中 -* 标记技术可作为鉴别植物组织培养过程导致变异的有效工具 对了解体细胞无性系的变异有重要意义 基于小麦反转录转座子的 -* 标记技术 能够对小麦品种的遗传差异进行客观评估 通过传统 1 分子标记技术与反转录分子标记技术的结合 $(5#( 等对柑橘的 1 个品种构建系统进化树 利用 -* 和!3-* 引物 通过构建树状图也能对苹果进行亲缘关系的分析 +&8$ 等 对利用 -*!3-* 和 -* 标记技术对葡萄进行鉴别 在芭蕉属植物的遗传分析中 -* 标记技术可以 为杂交种祖先基因型的确定提供有效的鉴定信息 在向日葵属种内多样性和种间多样性研究中 亚麻 属植物遗传多样性分析 咖啡品种谱系构建 不同栽培品种的油橄榄鉴定 烟草遗传多样性 1 分析 茄子亲缘关系分析 甜瓜品种鉴定以及兰属植物系统分析中 反转录分子标记也得到了广泛应用 ) 体细胞变异进化和品种鉴定 研究表明 组织培养可激活植物中某些反转录转座子的转座 使其拷贝数增加 倍之多 因此 以反转录转座子为基础的分子标记 可以作为检测体外植株再生过程中突变产生的高精度检测工具 而且这类标记的高精度检测可以延伸到品种鉴定过程中 是保护作物新品种 防止假冒伪劣品种进入市场的重要手段 在对苹果反转录标记开发应用中?# 等首次从苹果基因组中分离出两个完全不同完整的 ()) ' 转座子 * 和 * 并开发了它们的 -* 标记成功鉴别红富士芽变品种 通过比较 -,=* 和 -* 种分子标记技术 -* 标记能更明确区分芽变及其原始品种 贾怀志建立了适 合苹果及其近缘种的 -* 标记技术 杜晓云等利用 -* 方法建立了部分柿属植物的指纹图谱 并很好区分芽变品种 *$# 等设计!3-* 和 -* 标记引物 成功的对葡萄 个栽培品种及个芽 变品种进行了鉴别 而利用 -* 标记技术 更正了香蕉栽培种 个命名错误的基因型 与传统分子 1 标记技术 -*+,=* 和 -,=* 相比 反转录分子标记的品种鉴别能力更强 在茄子指纹图谱的构建和品种鉴定中 -* 和!3-* 也发挥作用 同时 反转录转座子的激活可能是产生芽变的原因之 一 -* 分子标记技术可有效地鉴定出杂合个体 且有效的区分, 和, 代中的杂合位点 不论两 个亚种地理来源如何 都能对两个水稻亚种进行准确的鉴别 同时 大多数 ()' 类转座子的转座插入是独特的 仅检测到极少共有带 )) 遗传连锁图谱构建和基因定位 遗传连锁图谱构建是基因组研究中的重要环节 是基因定位与克隆乃至基因组结构与功能研究的基础 反转录转座子分子标记已被用来构建一些植物的遗传图谱 3#&&$&& 等采用!3-* 和 -* 标记技术将大麦 &727 抗性基因定位于染色体 : 上 并构 建了一个含有 个反转录转座子标记的遗传连锁图 利用 -*!3-* 和 分子标记技术 能够构建小麦的高密度细胞遗传连锁图 并且从中定位了 个与抗病相关的基因 为育种工作提供了一定的指导 通过!3-* 分子标记技术与 -*-*+ 标记技术的结合 :# 等构建了棉花高密度的遗传连锁图谱 并用该图谱检测与农艺产量性状相关的 0/=( 位点 % 等所获得的 -* 标记在连锁

5 杭州师范大学学报 自然科学版 年 图上的分布表明 该反转录转座子对插入区间无偏好 进一步证实了 -* 在图谱构建中的适用性 在 1 柑橘种和酸橙高密度遗传图谱构建中 -* 标记也得到了成功的应用 除此之外 在其他植物的研究中 也获得了与重要性状相关的反转录转座子标记 小 结 反转录转座子在生物基因组中广泛存在 它能覆盖全基因组 提供更丰富的信息 用于高通量分子标记技术的开发 具有很大的发展潜力 -*-*!3-* 和 * 分子标记技术都以植物反转录转座子为基础进行引物设计 相比于其它基于 *. 的分子标记技术 如 -*+ 等 显示出了更大的优越性 基于反转录转座子分子标记的诸多优点 此类标记技术已成为植物遗传研究的有效工具 尤其在植物的遗传多样性分析和品种鉴定中得到了广泛的应用 目前 从不同物种中分离出的反转录转座子还比较少 在一定程度上限制了反转录转座子分子标记的开发 但是随着反转录转座子快速分离技术和高通量 低成本 +- 测序技术的快速发展 植物基因组序列信息中反转录转座子序列的获取将更加方便 这将促使反转录转座子分子标记技术在植物遗传多样性研究 品种鉴定 高密度遗传图谱的构建 重要性状基因的定位及分子育种等研究领域更加广泛的应用 参考文献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

6 第 期 汪 尚 等 反转录转座子分子标记及其在植物研究中的应用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肖炳光 杨本超 利用 -* 标记分析烤烟品种间遗传差异 西北植物学报 陶爱芬 刘中华 祁建民 等 烟草资源遗传多样性的 -* 和 标记比较分析 武汉植物学研究 1 1 赵海艳 赵纯 杨爱珍 等 -* 分子标记在茄子种质资源亲缘关系分析中的应用 华北农学报 1 增刊 王东 江彪 娄群峰 等 甜瓜属!3-* 分子标记体系的建立及应用 中国瓜菜 吴振兴 施农农 赵艳 等 应用 3-*+ 分子标记技术研究兰属植物间的亲缘关系 分子细胞生物学报 1 <#&'&?#&',&':#&;./#&(($7$&87$"$&$#7$&7#77#&((#2"&7"*$&'$&- #2$($(7#$#&#*#7-#$>-?#$$&'+#$:&'%#&.#&'=$&$&(#7$&875&"7/%$#77#&((&(8"##&"& (7#7$&8(8$-*"#;(8$(7$&'$($&'2(7(83#("(7$#,$/&7&"( &7$+&$&$=+&$&$*77#&((&##7$(#7$&#&8$&'$&7$&'8#&(2%-*"#;(/ -&7 贾怀志 刘艳红 渠慎春 等 苹果 -* 技术体系的建立及优化 果树学报 杜晓云 罗正荣 部分柿属植物 -* 反应体系的建立和指纹图谱构建 农业生物技术学报 *$#:##-+'#3&"$#&#%($(8#$&77#&((&7$&$7$($&$8#/- &7111 #$-/.5##/&"#(($8$#7$&82#&#&#7$#(8"7&$#($&'-*"#;(!%7$ # 1 1&7*-($&(3&7$8$#7$&#&'&"$$(7$27$&8'%(%$;77#&((&($&.$7(#&*&$(/- &71 王利英 杜永臣 张斌 等 茄子 -* 和!3-* 分子标记的开发 园艺学报 1 73 *$.*$&#-/+$($8$#7$&8.$7("&7$&#:7/#&#'7#7$%*#'#7.$( 3*%'&7!1 4& 33#.=$("2:$'7'777#&((&2#(8(&7"#;($"$&8"#7$&&7&7 #&#$($"$&#7$&*#&737( )$#$&'&&:&'<$#&.&$&'8'&"($8$7$7$+-(@&($&5$$8$'&$8 #&7"&78/%'%(%77#&((&2#(-*"#;8$(7$&'$($&'$(#7$#=$&$##&#&$#(2 ($(&7(.!111 &%$3$;$/"$//%$#77#&((&2#(-* (@&($8$#"$8$%"$("8' &7$#&#%($(8(577#7/-&711 3#&&$&&4#&#2$&(&-$#7$&8-!77#&((& "#;(77"#$&'8#"#($(7#& '&8&727$&2#%3&&7 下转第 页

7 杭州师范大学学报 自然科学版 年 %!2/#2"."&#%'".#%.&# /&""."!$"&/%'##""!%&%.%!& <>?$#- &(&'.'8$&:#&'"#>&$($7%:#&'.$&# &"2( 上接第 页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