2 黑八一农垦大学学报第 29 卷 Table 1 表 1 20 份供试材料 20 cultivars of kidney bean for SSR analysis 编号品种名称产地编号品种名称产地 YD1 杂化豆 1 号 YD11 红花芸豆 YD2 矮饭豆东宁 YD12 小黑芸豆

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1 第 29 卷第 6 期 201 年 12 月黑八一农垦大学学报 Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University 29(6):1~ Dec. 201 doi: /j.issn 不同 SSR 标记检测技术在芸豆品种的遗传多样分析中的应用杨义杰 1, 王颖 1,2, 张东杰 1, 沈琰 1, 张桂芳 2, 赵雅楠 1 (1. 黑八一农垦大学食品学院, 大庆 ;2. 国家杂粮工程技术研究中心 ) 摘要 : 以黑省 20 份芸豆品种为材料, 分别应用银染法和荧光检测法检测对 SSR 引物的扩增产物聚类分析表明, 两种方法均能将供试品种鉴别开, 荧光检测法的等位变异及 PIC 较聚丙烯酰胺凝胶电泳检测更多更高, 荧光检测法检测出的遗传多样性指数略高于银染法结果表明荧光检测法较银染法灵敏度更高检测结果更准确, 更适于用于遗传多样性分析关键词 : 芸豆 ;SSR; 银染法 ; 荧光检测法 ; 遗传多样性中图分类号 :S29 文献标识码 :A 文章编号 : (201) Application of Different SSR Markers Detection Technology on Genetic Diversity Analysis of Common Bean Varieties Yang Yijie 1,Wang Ying 1,2,Zhang Dongjie 1,Shen Yan 1,Zhang Guifang 2,Zhao Yanan 1 (1.College of Food,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing ; 2.National Coarse Cereals Engineering Research Center) Abstract: 20 kidney bean cultivars from Heilongjiang Province as materials,silver staining and fluorescence detection were applied to detect pairs of SSR primers amplified products. Cluster analysis showed that both two methods could identify the tested varieties,compared with polyacrylamide gel electrophoresis detection,equipotential variation and PIC of fluorescence detection method could detect much more and higher,the genetic diversity index by fluorescence detection method was higher than that of silver staining method. The results showed that the fluorescence detection method was more sensitive and accurate than the silver staining method,and it was more suitable for the analysis of genetic diversity. Key words:common bean(phaseolus vulgaris);ssr;silverstaining;fluorescence detection;genetic diversity 目前检测 SSRPCR 产物的方法主要包括 3 种 : (1) 琼脂糖凝胶电泳 (AGE), 在电泳操作中, 需用溴化乙锭 (EB) 做染料,EB 具有强致癌性, 对身体有害, 且分辨率低, 常用于产物的初步检测 (2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE), 分辨率较高 ( 测序胶可检测到 1 光标记技术在芸豆中的应用, 研究对 SSR 标记银染法和荧光检测法 2 种检测方法进行比较, 分别应用 PAGE 银染法和荧光检测法对黑省部分种质进行遗传多样性分析, 为 SSR 检测技术的选择提供参考 bp 的核苷酸差异 ), 但操作过程复杂, 检测耗时耗力 (3) 荧光标记毛细管电泳检测法, 检测扩增产物以 1 材料与方法峰的形式表现, 显示扩增片段的大小, 具有高分辨 [13] 率高通量及分析过程自动化等优点利用 SSR 荧光标记检测技术已经在小麦水稻玉米等多种作物种质资源的评价和遗传多样性分析等方面均有应 1.1 材料供试材料来源于黑省代表性且栽培面积大的 20 份芸豆品种 ( 表 1) 引物为前期筛选对核心引物, 具体信息见表 2 [6] 用在对芸豆的研究中还未见报道为促进 SSR 荧收稿日期 : 基金项目 : 黑省应用技术与开发重大项目 (GA1B10); 十二五农村领域国家科技计划项目 (2012BAD3B02) 作者简介 : 杨义杰 (199), 女, 黑八一农垦大学食品学院 2013 级硕士研究生通讯作者 : 张东杰, 男, 教授, 博士研究生导师, zdj_66@126.com

2 2 黑八一农垦大学学报第 29 卷 Table 1 表 1 20 份供试材料 20 cultivars of kidney bean for SSR analysis 编号品种名称产地编号品种名称产地 YD1 杂化豆 1 号 YD11 红花芸豆 YD2 矮饭豆东宁 YD12 小黑芸豆 YD3 兔子腿爱辉 YD13 特大荚五常 YD 花腰豆 YD1 黄芸豆 YD 窝郎豆海林 YD1 花脸豆 1 号 YD6 白花腰豆 YD16 60 天还家 YD 紫白花豆爱辉 YD1 花脸豆 2 号 YD 花芸豆呼兰 YD1 黑花芸豆林甸县 YD9 大马掌 YD19 双色芸豆 YD10 奶花芸豆哈尔滨市 YD20 杂花芸豆克山县表 2 对引物序列 Table 2 pairs of primer sequences 引物名称正向引物 ( 3 ) 反向引物 ( 3 ) 退火 / TTAGCAATACCGCCATGAGAG ACTGTAGCTCAAACAGGGCAC 0 GAGTGCGGAAGCGAGTAGAG TCCGTGTTCCTCTGTCTGTG 3 TGCACAACACACATTTAGTGAC CCTACCAAGATTGATTTATGGG TGAGGAGGAACAATGGTGGC CTCACAAACCACAACGCACC BM12 AAGAGGAGGTCGAAACCTTAAATCG CCGGGACTTGCCAGAAGAAC 0 BM16 CTTGTTCCACCTCCCATCATAGC TGCTTGCATCTCAGCCAGAATC 2 BM1 ACTTAACAAGGAATAGCCACACA GTTAATTGTTTCCAATATCAACCTG 2 CGTGCTTGGCGAATAGCTTTG CGCGGTTCTGATCGTGACTTC 实验方法基因组提取 20 个芸豆品种基因组提取取新鲜菜豆叶片约 0.2 g 于研钵中, 加入液氮迅速研磨成粉末提取总 DNA 方 [9] 法为采用改良的 2% 的 CTAB 法, 用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测总 DNA 后稀释成 100 ng μl 1, 储存于 20 备用荧光引物与普通引物的 PCR 扩增基于非变性聚丙烯酰胺结合银染技术的 PCR 扩增反应体系配置 ( 表 3): 试剂 10 Buffer 上游引物下游引物 dntp Taq 聚合酶 ( U/μL) Mg2+(2 mm) 模版 DNA ddh 2 O 总体积表 3 SSR 标记 20 μl 体积扩增反应体系 Table 3 The reaction of SSR markers in the 20 μl volume 终浓度 10 mm 1 U 0 ng 体积 2 μl 0. μl 1.2 μl 1 μl 1. μl 20 μl PCR 扩增程序 :9 预变性 2 min;9 变性 1 s, 依据各引物退火温度复性 1 s,2 延伸 30 s, 共 3 个循环 ; 最终 2 延伸 10 min 基于毛细管电泳的荧光电泳检测技术的 PCR 扩

3 第 6 期杨义杰等 : 不同 SSR 标记检测技术在芸豆品种的遗传多样分析中的应用 3 增反应体系配置见表试剂上游引物下游引物 2 Taq Mix 模版 DNA ddh 2 O 总体积表 SSR 标记 20 μl 体积扩增反应体系 Table The reaction of SSR markers in the 20 μl volume 终浓度 0 ng 体积 0.3 μl 0.3 μl 10 μl 1 μl. μl 20 μl PCR 扩增程序 :9 预变性 2 min;9 变性 1 s, 依据各引物退火温度复性 1 s,2 延伸 30 s, 共 3 个循环 ; 最终 2 延伸 10 min 不同检测方法检测扩增产物 (1) 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物采用 % 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测, 电泳在 SequiGen GT 核酸电泳系统 (Bio Rad,USA) 中进行然后通过改良的银染方法进行染色 : 固定液 ( 含 0% 乙醇和 2% 的醋酸 ) 固定 3 min ; 倒掉固定液, 蒸馏水洗 1 次, 时间 30 s, 加入染色液 (0.2% 的硝酸银 ) 染色 min; 倒掉染色液, 蒸馏水洗 2 次, 每次时间 30 s, 加入显色液 (3%NaOH 和 0.% [10] 甲醛 ), 至谱带清晰为止, 拍照统计位点 (2) 毛细管电泳检测首先, 利用琼脂糖凝胶电泳对所有扩增产物检测, 每个样品取 μl 产物, 电泳 90 V 电压约 1 h 若结果良好则进行毛细管电泳检测将甲酰胺与分子量内标按的体积比混匀后, 取 1 μl 加入上样板中, 再加入 1 μl 稀释 10 倍的 PCR 产物然后使用 330XL 测序仪进行毛细管电泳, 利用 Genemarker 中的 Fragment(Plant) 片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析, 将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比 [1113] 较分析, 得到片段大小 1.2. 数据统计与分析聚丙烯酰胺凝胶电泳检测数据记录在相同迁移位置, 有带记作 1, 无带记作 0; 将荧光检测法得到峰图同样转化成 0 1 字符串, 有效峰记为 1, 无效记为 0 将两个检测方法所得到的数据均利用 NTSYSpc 2.10e 软件计算供试材料的遗传距离, 采用类平均法 UPGMA 聚类分析 ; 利用 Popgene version 1.32 软件计算 Nei 基因多样性指数 H 和 Shannon 信息指数 I 2 结果与分析 2.1 荧光检测法与银染法的比较应用对具多态性且特异性好的引物对黑省 20 个芸豆品种进行扩增, 经聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法进行电泳检测, 个 SSR 标记共检测出 0 个等位基因, 每个位点检测出的等位基因数为 ~ 个, 平均每个位点个, 多态性信息指数 PIC 范围为 0.6 ~0.01, 平均 0.6 0; 通过毛细管电泳检测共检测到 61 个等位基因, 每个位点检测出的等位基因数为 6~11 个, 平均.62 个多态性信息指数 PIC 范围为 0.6 9~0.20, 平均 0.9 ( 表 ) Table 表 2 种方法检测出的等位变异的对比 Comparison of allelic variations obtained by the two detection methods 引物聚丙烯酰胺凝胶电泳等位基因数 PIC 等位基因数毛细管电泳 PIC BM BM BM

4 黑八一农垦大学学报第 29 卷毛细管电泳技术在每个位点平均检测到的等位变异比 PAGE 银染法多 2 个, 且 PIC 含量要高于 PAGE 检测的 PIC, 表明荧光检测法具有更高的灵敏性, 更适于做遗传遗传多样性分析 2.2 两种检测技术对黑省芸豆的遗传多样性分析银染法检测分析芸豆遗传多样性根据 PAGE 银染对芸豆的检测数据来看, 对引物能够将 20 个品种完全区分, 品种间遗传相似系数为 0.3~0.9 之间, 聚类图显示在遗传相似系数 0. 处将 20 份芸豆品种分为 2 个类群, 如图 1 所示, 第 Ⅰ 类即奶花芸豆红花芸豆与小黑芸豆共 3 个品种, 其余 1 个品种为第 Ⅱ 类在遗传相似系数 0.6 处将 20 份芸豆品种分为个类群, 第 Ⅰ 类包括奶花芸豆红花芸豆与小黑芸豆 ; 第 Ⅱ 类包括白花腰豆 ; 第 Ⅲ 类包括兔子腿黑花芸豆窝朗豆 60 天还家花脸豆 2 号特大荚花芸豆黄芸豆 ; 第 Ⅳ 类包括杂花豆 1 号矮饭豆花腰豆紫白花豆大马掌花脸豆 1 号双色芸豆杂花芸豆利用 POPGENE 软件进行多样性分析, 结果表明, 反映芸豆品种遗传多样性 Shannon 信息指数 I 为 ~1.21,Nei 基因多样性指数 H 为 ~ 0.2 0( 表 6) Fig.1 图 1 20 个芸豆品种聚类分析图 (PAGE) UPGMA dendrogram of 20 common bean cultivars(page) 引物 BM12 BM16 BM1 表 6 2 种方法检测出的遗传多样指数的对比 Table 6 Comparison of genetic diversity index by the two detection methods 聚丙烯酰胺凝胶电泳毛细管电泳香农指数基因多样指数香农指数基因多样指数 I H I H 荧光检测法分析芸豆遗传多样性荧光检测法数据显示, 对引物能够将 20 个品种完全区分开, 品种间遗传相似系数为 0.2~0.92 聚类图显示在遗传相似系数 0.6 处将 20 份芸豆品种分为 2 个类群, 第 Ⅰ 类群为小黑芸豆, 第 Ⅱ 类为其余 19 个品种在遗传相似系数 0.6 出将将 20 份芸豆

5 第 6 期杨义杰等 : 不同 SSR 标记检测技术在芸豆品种的遗传多样分析中的应用品种分为 3 个亚类群, 第一亚类群为小黑芸豆, 第二亚类群兔子腿白花腰豆杂花芸豆大马掌黃芸豆紫白花豆及花脸豆, 第三亚类群为杂花豆 1 号花腰豆红花芸豆花脸豆矮饭豆 60 天还家窝朗豆奶花芸豆特大荚花芸豆 (YD) 黑花芸豆双色芸豆同样利用 POPGENE 软件进行多样性分析, 结果显示,Shannon 信息指数 I 为 1.6 0~ ,Nei 基因多样性指数 H 为 0.23 ~0.26 ( 表 6) Fig. 2 图 2 20 个芸豆品种聚类分析图 ( 毛细管电泳 ) UPGMA dendrogram of 20 common bean cultivars(ce) 种检测法分析芸豆品种遗传多样性的差异 PAGE 银染与荧光检测法检测分析的结果均显示出, 黑省芸豆品种遗传多样性较高银染法相似系数 0.3~0.9, 小黑芸豆与双色芸豆之间相似系数最小为 0.3, 而荧光检测法的相似系数是 0.2~ 0.92, 小黑芸豆与双色芸豆之间相似系数最小 0.2 两者检测方法均表明二者亲缘关系较远而银染法相似系数最大的是 60 天还家与花脸豆 (YD1), 荧光检测法的相似系数最大的是红花芸豆与花腰豆, 两者检测的结果不同荧光检测法检测出的遗传多样性指数略高于银染法, 可能是由于荧光检测法检出一些等位变异, 在银染中未检测出 ( 例如引物银染法检测出个等位变异, 荧光检测出 11 个 ), 而这些等位变异可能体现了品种间遗传背景的不同, 银染法却无法检测出这些等位基因, 即一些信息被掩盖了 3 结论与讨论研究对常规银染法和荧光检测法 2 种检测 SSRPCR 产物的方法进行了比较, 选取对多态性及特异性较好的引物, 分别用银染法和荧光检测法对 20 个黑省 20 个品种进行遗传多样性分析两种方法均能将供试品种鉴别开, 但由于荧光检测法可检测到的等位变异数量较银染法更多更精确, 可将具有相似遗传背景的品种有效区分因此, 荧光检测法反映的品种间的遗传多样性较银染法略高荧光检测法得到的等位基因差异最小为 2 bp, PAGE 银染测法得到的等位基因差异最小为 bp 毛细管电泳荧光检测法检测样品时含有分子量内标,DNA 片段大小与其泳道内分子量内标相比就可精确获得而变性 PAGE 银染法检测的不同样品 DNA 片段大小, 所得片段大小只能用肉眼与分子量标准 (Marker) 相比较估测得出, 且离 Marker 泳道较远的泳道的数据准确性也会受到一些影响银染法数据收集依赖于人工读带, 会有人为误差而荧光标记技术自动智能化, 在数据收集处理上采用软件分析, 工作效率大大提高, 数据更加准确参考文献 : [1] 张赤红, 曹永生, 宗绪晓, 等. 普通菜豆种质资源形态多样性鉴定与分类研究 [J]. 中国农业科学,200,3(1):232. ( 下转第 19 页 )

AFLP % 1. 1 DNA 5 RAPD DNA 0. 1g % ~ ph 6 10 DNA 9 40μl TE SSR STS 20ng /L

AFLP % 1. 1 DNA 5 RAPD DNA 0. 1g % ~ ph 6 10 DNA 9 40μl TE SSR STS 20ng /L 2012 13 2 201-206 Journal of Plant Genetic Resources / 071001 41 SSR 21 SSR 41 52 2 ~ 4 2. 5 Shannon 0. 21 ~ 1. 40 0. 73 5. 54 3 7 9 13. 16% ~ 186. 49% 5. 48 6 11 SSR Genetic Diversity of Peanut Arachis

2 黑八一农垦大学学报 第 29 卷 Table 1 表 1 20 份供试材料 20 cultivars of kidney bean for SSR analysis 编号 品种名称 产地 编号 品种名称 产地 YD1 杂化豆 1 号 YD11 红花芸豆 YD2 矮饭豆 东宁 YD12 小黑芸豆

2 黑八一农垦大学学报第 29 卷 Table 1 表 1 20 份供试材料 20 cultivars of kidney bean for SSR analysis 编号品种名称产地编号品种名称产地 YD1 杂化豆 1 号 YD11 红花芸豆 YD2 矮饭豆东宁 YD12 小黑芸豆