第 2 期张建新等 : 利用微卫星 DNA 标记法进行 5 个肉用绵羊的多态性分析和杂种优势率预测 219 群体的遗传多态性, 从而度量群体遗传变异来预测间杂种优势雁门关生态畜牧经济区是我省重要的肉羊生产基地, 肉用绵羊存栏数量较多, 但良种覆盖率极低, 生产效率极差为了提高本地绵羊的生产效率

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苑詹颜
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1 第 19 卷第 2 期 2010 年 4 月激光生物学报 ACTA LASER BIOLOGY SINICA Vol.19No.2 Apr.2010 doi: /j.isn 利用微卫星 DNA 标记法进行 5 个肉用绵羊的多态性分析和杂种优势率预测张建新, 岳文斌, 张雨 ( 山西农业大学动物科技学院, 山西太谷 ) 摘要 : 研究选择了与产肉性能相关的 5 个微卫星标记, 分析了这 5 个位点在杜泊德国美利奴特克塞尔道塞特和右玉本地绵羊 5 个中的遗传多态性通过遗传分析预测了 4 个国外引进肉用绵羊与右玉本地绵羊的杂种优势, 并与实际测定结果进行了比较分析结果表明, 利用微卫星 DNA 多态性进行间杂种优势预测是可行的, 杜泊羊与右玉本地绵羊杂交的杂种优势最大, 与实际测定结果一致关键词 : 羊 ; 微卫星 ; 遗传距离 ; 杂种优势中图分类号 :S813.3 文献标识码 :A 文章编号 : (2010) StudyonPolymorphism andheterosisoffivemeatsheep UsingMicrosateliteMarker ZHANGJian xin,yuewen bing,zhangyu (AnimalTechnologyColege,ShanxiAgricultureUniversity,Taigu030801,Shanxi,China) Abstract:Thestudyselectedfivemicrosatelitemarkerswhichrelatedofthemeatperformancetoanalysisthepolymor phismindoropor,merino,texel,poldorsetandyouyulocalsheep,forecasttheheterosisoffourintroducedbreedsand Youyulocalsheepbythegeneticanalysisandcomparewiththeactualresults.Theresultshowedthatitisfeasibleto forecasttheheterosisofdiferentsheepbreedsbygeneticpolymorphismofmicrosatelitedna.theheterosisisthelargest indoroporandyouyulocalsheep,accordingtothetestingresultsonactualheterosis. Keywords:sheep;microsatelitemarker;geneticdistance;heterosis 微卫星 (microsatelite) 是指以少数几个核苷酸 (1~6 个 ) 为单位多次串联重复的 DNA 序列, 亦称简单重复序列 (Simplesequencerepeats,SSR), 具有数量大分布广且均匀多态信息含量高检测快速方便等优点, 被认为是各类遗传标记中最有价值的一种 [1 3] 微卫星 DNA 标记是近年继 RFLP 之后发展起来的一种新的分子遗传标记技术, 以其所具有的优越性, 已广泛应用于动物群体遗传多样性分析遗传连锁图谱构建,DNA 指纹图的制作, 功能基因和 QTL 的定位, 以及亲缘关系的鉴定等多个方面, 尤其是在分析群体遗传结构和遗传变异方面发挥着越来越重要的作用 [4 7] 现代杂种优势理论认为: 杂种优势的大小在一定程度上取决于亲本间遗传差异的大小, 即遗传距离 [8] 因此可以用微卫星标记法分析收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 山西省科技攻关项目 ( ) 作者简介 : 张建新, 男, 博士研究方向为动物遗传育种与繁殖 ( 电话 ) ;( 电子邮箱 )ypzjx@126.com

2 第 2 期张建新等 : 利用微卫星 DNA 标记法进行 5 个肉用绵羊的多态性分析和杂种优势率预测 219 群体的遗传多态性, 从而度量群体遗传变异来预测间杂种优势雁门关生态畜牧经济区是我省重要的肉羊生产基地, 肉用绵羊存栏数量较多, 但良种覆盖率极低, 生产效率极差为了提高本地绵羊的生产效率, 特引进国外著名肉用绵羊与其进行杂交本研究采用微卫星标记法, 对 4 个国外著名肉用绵羊与右玉本地绵羊进行遗传多样性评价, 遗传结构分析, 利用 Nei 氏遗传距离方法计算出绵羊间的遗传距离, 并分析群体间遗传距离的远近 ; 开展杂交后代的杂种优势分析, 从而在分子水平上标记辅助选择育种, 为右玉本地绵羊的杂交改良奠定科学基础 1 材料与方法 1.1 实验材料本实验在山西省右玉县宏宇牧业养殖场采集杜泊德国美利奴特克塞尔道塞特以及本地绵羊 5 个绵羊群体共 249 个个体的耳组织一小块 ( 约 0.5g), 放于装有 1mL70% 乙醇的 1.5mL 的离心管中, 冰壶保存, 带回实验室,-70 保存备用实验室进行耳组织 DNA 提取和 PCR 扩增 1.2 实验方法耳组织 DNA 提取 STE(DNA 抽提液 ) 蛋白酶 K(TagDNAPolmeraseTaq 酶 ) SDS( 十二烷基硫酸钠,Sodium dodecylculphase) 过夜消化, 酚氯仿异戊醇 ( ) 抽提法引物的选择根据微卫星选择标准, 考虑到微卫星位点在染色体的位置引物序列组成特点微卫星位点多态性及产物大小等, 确定了与产肉性能相关的 5 个微卫星基因座 BM3215 BMS1724 BMS460 CSSMO180V BM3413, 由大连宝生物工程有限公司合成引物序列为 : BM3215:5 TGCATCAACTAAGCCACACTG 3 ; 5 TTACACGCTGGTTTTCTGGG 3 BMS1724:5 GACTTGCCCCAATCCTACTG 3 ; 5 ATTTCAGGTTTGTTGGTTCCC 3 BMS460:5 TGCCCCATAGTGTAGTGCTC 3 ; 5 GCCAGCAGAGAATTGTAGCA 3 CSSM018OV:5 AGGAATTCCCTCTAGAAAAGCAGGC 3 ; 5 TGTGCATAATTTGTGTCCGTCCGGA 3 BM3413:5 TCCCTGGTAACCAATGAATTC 3 ; 5 CAATGGATTTGACCCTCCC PCR 反应条件微卫星 BM3215 扩增条件 : 反应总体积 15μL, 双蒸水 9.5μL,10 缓冲液 1.5μL,Mg μL,dNTP1.2μL(0.22mmol/L), 引物 0.3μL(0.24mmol/L),Taq 酶 0.2μL(0.3U), DNA2μL 扩增程序为:95 预变性 4min;94 变性 30s,58.1 退火 30s,72 延伸 30s,33 个循环微卫星 BMS1724 扩增条件 : 反应总体积 15μL, 双蒸水 10.4μL,10 缓冲液 1.5μL( 含 Mg 2+ ), dntp1.3μl(0.22mmol/l), 引物 0.65μL(0.24 mmol/l),taq 酶 0.15μL(0.3U),DNA1μL 扩增程序为 :95 预变性 4min;94 变性 30s,57.1 退火 30s,72 延伸 30s,33 个循环微卫星 BMS460 扩增条件 : 反应总体积 15μL, 双蒸水 9.5μL,10 缓冲液 1.5μL,Mg μL, dntp1.2μl(0.22mmol/l), 引物 0.3μL(0.24 mmol/l),taq 酶 0.2μL(0.3U),DNA2μL 扩增程序为 :95 预变性 4min;94 变性 30s,58.4 退火 30s,72 延伸 30s,33 个循环微卫星 CSSM018OV 扩增条件 : 反应总体积 15μL, 双蒸水 10.5μL,10 缓冲液 1.5μL( 含 Mg 2+ ),dntp1.3μl(0.22mmol/l), 引物 0.65μL (0.24mmol/L),Taq 酶 0.1μL(0.3U),DNA1μL 扩增程序为 :95 预变性 4min;94 变性 30s, 58.6 退火 30s,72 延伸 30s,35 个循环微卫星 BMS3413 扩增条件 : 反应总体积 15μL, 双蒸水 9.5μL,10 缓冲液 1.5μL,Mg μL, dntp1.2μl(0.22mmol/l), 引物 0.3μL(0.24 mmol/l),taq 酶 0.2μL(0.3U),DNA2μL 扩增程序为 :95 预变性 4min;94 变性 30s,57.1 退火 30s,72 延伸 30s,33 个循环 PCR 扩增产物的电泳检测将扩增产物用 10% 的聚丙烯酰胺凝胶电泳, 再用银染法进行定影显影其银染过程如下 : 蒸馏水洗 1 次, 将凝胶放入约 500mL 硝酸银染色液中, 在格床上轻摇 15min~ 20min, 蒸馏水洗 1 次, 先加 100mL 碳酸钠显色液轻摇 15s, 弃去显色液后再加 400mL 显色液, 轻摇 15min, 即可看清楚条带数据统计分析等位基因片段的大小和频率通过凝胶成像系统分析获得用 PopGen32 软件计算每个基因座的有效等位基因数杂合度多态信息含量和群体间的遗传距离绵羊各杂交组合杂交效果测定在相同的饲养条件下, 分别测定以国外 4 个引进杜泊

2 微卫星基因座等位基因频率 5 个微卫星基因座的等位基因分布及其频率分布见表 (1~5) 由表可见, 在 BM3215 基因座共发现了 6 个等位基因, 变异范围在 129~167 之间, 其中等位基因 167 仅见于道赛特羊中, 右玉本地绵羊中没有发现等位基因 160; 在 BMS460 基因座共发现了 6 个等位基因, 变异范围在 125~147 之间, 其中 136

3 220 激光生物学报第 19 卷特克塞尔道塞特德美及其与右玉本地绵羊杂交一代公羊 ( 各 30 只 ) 的初生重 1 月龄 3 月龄 6 月龄及周岁重 2 结果与分析 2.1 绵羊微卫星标记 DNA 多态性检测结果图 1 图 2 为两个位点在两个群体中的部分聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱微卫星遵循孟德尔定律, 且呈共显性遗传如果一个 2 倍体染色体相对位点的微卫星核心重复数相同, 则该个体在该位点纯合基因型 ; 重复数不同, 碱基插入或缺失等其它原因表现为杂合型, 反映在凝胶电泳上则是纯合个体是 1 条带, 杂合子则是 2 条带 2.2 微卫星基因座等位基因频率 5 个微卫星基因座的等位基因分布及其频率分布见表 (1~5) 由表可见, 在 BM3215 基因座共发现了 6 个等位基因, 变异范围在 129~167 之间, 其中等位基因 167 仅见于道赛特羊中, 右玉本地绵羊中没有发现等位基因 160; 在 BMS460 基因座共发现了 6 个等位基因, 变异范围在 125~147 之间, 其中 136 等位基因仅在德美和右玉本地绵羊中发现, 杜泊和道赛特羊中没有发现等位基因 147; 在 BMS1724 基因座共发现了 6 个等位基因, 变异范围在 147~ 174 之间, 其中等位基因 174 没有在杜泊和道赛特羊中发现 ; 在 CSSMO180V 基因座共发现了 5 个等位基因, 变异范围在 120~139 之间, 其中 129 等位基因仅在右玉本地绵羊中未发现, 杜泊和道赛特羊中没有发现等位基因 139;BM3413 基因座共发现了 7 个等位基因, 变异范围在 170~201 之间, 其中等位基因 170 仅见于杜泊和道赛特羊中, 等位基因 201 仅见于特克赛尔和德美羊中实验结果表明,5 个微卫星基因座在 5 个绵羊中存在多态性, 因此, 可以用于绵羊遗传多样性的评估图 1 微卫星位点 BMS1724 的 PCR 产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 Fig.1 PAGEresultofPCRproductatBM1724 图 2 微卫星位点 CSSMO180V 的 PCR 产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 Fig.2 PAGEresultofPCRproductatCSSMO180V 表 1 微卫星基因座 BM3215 等位基因分布及频率 Tab.1 AlelesndistributionandfrequenciesofmicrosatelitelociBM 杜泊 Dorper 特克塞尔 Texel 德美 Merino 本地绵羊 Localsheep 道塞特 Dorset 表 2 微卫星基因座 BMS460 等位基因分布及频率 Tab.2 AlelesndistributionandfrequenciesofmicrosatelitelociBMS 杜泊 Dorper 特克塞尔 Texel 德美 Merino 本地绵羊 Localsheep 道塞特 Dorset

4 第 2 期张建新等 : 利用微卫星 DNA 标记法进行 5 个肉用绵羊的多态性分析和杂种优势率预测 221 表 3 微卫星基因座 BMS1724 等位基因分布及频率 Tab.3 AlelesndistributionandfrequenciesofmicrosatelitelociBMS 杜泊 Dorper 特克塞尔 Texel 德美 Merino 本地绵羊 Localsheep 道塞特 Dorset 表 4 微卫星基因座 CSSMO180V 等位基因分布及频率 Tab.4 AlelesndistributionandfrequenciesofmicrosatelitelociCSSMO180V 杜泊 Dorper 特克塞尔 Texel 德美 Merino 本地绵羊 Localsheep 道塞特 Dorset 表 5 微卫星基因座 BM3413 等位基因分布及频率 Tab.5 AlelesndistributionandfrequenciesofmicrosatelitelociBM 杜泊 Dorper 特克塞尔 Texel 德美 Merino 本地绵羊 Localsheep 道塞特 Dorset 微卫星基因座的多态信息含量有效等位基因数及群体杂合度 5 个微卫星基因座的多态信息含量有效等位基因数及群体杂合度见表 6 由表可以看出, 基因座 BM3215 的多态信息含量有效等位基因数和群体杂合度最高, 基因座 BMS460 的多态信息含量有效等位基因数和群体杂合度相对较低, 说明基因座 BM3215 的变异最大, 而基因座 BMS460 的变异较小从的角度来看, 杜泊羊的各项指标最高, 右玉本地绵羊的相对较低, 说明杜泊羊的遗传变异较大, 而右玉本地绵羊的遗传变异较小 2.4 间的遗传距离 5 个绵羊间的遗传距离见表 7 由表可以看出, 杜泊与右玉本地绵羊的遗传距离最大, 其次为特克赛尔德美道赛特, 杜泊与道赛特的遗传距离最小间的遗传距离可以反映它们亲缘关系的远近遗传距离越大, 二者的亲缘关系就越远, 杂交后的杂种优势就会越大, 由此可以预测, 杜泊与右玉本地绵羊杂交后的杂种优势最大杜泊绵羊原产于南非, 是有角陶赛特与波斯黑头羊杂交培育而成的肉绵羊, 所以二者遗传距离小, 符合它们的育成史个引进与右玉本地绵羊杂交一代生产性能及杂种优势的比较 4 个引进绵羊与右玉本地绵羊杂交一代初生重 1 月龄重 3 月龄重 6 月龄重周岁重及杂种优势率见表 8 由表可以看出, 杜泊羊与右玉本地绵羊杂一代的体重和杂种优势率最高与利用微卫星标记技术预测的杂种优势结果一致

5 222 激光生物学报第 19 卷表 6 5 个微卫星基因座在各中的多态信息含量 (PIC) 有效等位基因数 (E) 及群体杂合度 (H) Tab.6 Polymorphism informationcontent,thenumberofefectivealelesandheterozygosityoffivemicrosatelite lociineachbreeds 基因座 Loci 杜泊特克赛尔德美本地绵羊道赛特平均 BM3215 PIC E H BMS460 PIC E H BMS1724 PIC E H CSSMO180V PIC E H BM3413 PIC E H 平均 Mean PIC E H 表 7 5 个间的遗传距离 Tab.7 Geneticdistancesamongfivebreeds 杜泊特克赛尔德美本地绵羊道赛特杜泊 Dorper 特克赛尔 Texel 德美 Merino 本地绵羊 Localsheep 道赛特 Dorset 表 8 杂种一代绵羊初生重 1 月龄 3 月龄 6 月龄周岁重及杂种优势 Tab.8 Theweightandheterosisrateatborth one,three,six month oldandoneyearoldofageinfirstfilial 性状杂交组合杜泊本地特克赛尔本地德美本地道赛特本地初生重一代杂种平均值 () 双亲平均 () 杂种优势率 (%) 月龄重一代杂种平均值 () 双亲平均 () 杂种优势率 (%) 月龄重一代杂种平均值 () 双亲平均 () 杂种优势率 (%) 月龄重一代杂种平均值 () 双亲平均 () 杂种优势率 (%) 周岁重一代杂种平均值 () 双亲平均 () 杂种优势率 (%)

6 第 2 期张建新等 : 利用微卫星 DNA 标记法进行 5 个肉用绵羊的多态性分析和杂种优势率预测讨论 5 个微卫星基因座在 5 个绵羊群体中均存在多态性根据微卫星选择的标准, 每个微卫星要有 4 个等位基因方可较好的用于遗传多样性评估实验结果得知,BM3215 基因座有 6 个等位基因,BMS460 基因座有 6 个等位基因,BMS1724 基因座有 6 个等位基因,CSSMO180V 有 5 个等位基因,BM3413 有 7 个等位基因所以以上 5 个微卫星基因座均可以用于绵羊遗传多样性的评估由于本文所用的绵羊和微卫星基因座较少, 对绵羊间遗传关系的准确评估还有待进一步研究多态信息含量 (PIC) 和杂合度 (H) 反映群体内的遗传变异程度, 数值高说明遗传变异大, 反之则群体内的遗传变异小实验结果表明,5 个微卫星基因座在 5 个绵羊群体中均表现高度多态 (PIC>0.5) 杜泊羊的群体多态信息含量和杂合度最高, 右玉本地绵羊的较低, 表明杜泊羊的遗传变异程度最大, 这说明不同的由于遗传背景来源不同, 变异程度也不同杜泊羊是有角陶赛特与波斯黑头羊杂交培育而成的肉用绵羊, 有着丰富的遗传基础, 因而变异程度较高, 而右玉本地绵羊是中国的一个地方优良, 是经过长期的本选育形成, 引进的外血较少, 因而变异程度较小一般来说, 分布地区距离较远, 来源差别较大的, 可以获得较大的杂种优势从实验结果看, 杜泊羊与右玉本地绵羊的杂种优势最大杜泊绵羊是利用英国有角陶赛特与波斯黑头羊杂交培育而成的肉用绵羊, 前胸丰满, 后躯肌肉发达, 生长迅速, 而右玉本地绵羊生长速度较慢, 产肉性能差, 因而二者有较高的杂种优势本研究通过实际测定杜泊德美特克赛尔道赛特羊与右玉本地绵羊的杂交效果与理论预测的杂种优势进行比较, 得出同样的结果, 说明利用微卫星 DNA 多态性预测绵羊间的杂种优势是可行的传统的间杂种优势测定一般都要通过杂交实验完成, 即费时又费力, 而利用微卫星 DNA 多态性预测杂种优势即快速又节省成本, 对今后引进肉羊在中国的合理利用及绵羊育种工都具有重要的应用价值 4 结论 5 个微卫星基因座 (BM3215 BMS460 BMS1724 CSSMO180V BM3413) 在 5 个绵羊 ( 杜泊特克赛尔德美道赛特右玉本地绵羊 ) 中存在多态性, 因此, 可以用于绵羊遗传多样性的评估通过不同间遗传距离分析, 在引进的 4 个绵羊中, 与右玉本地绵羊的杂种优势由大到小依次为杜泊道赛特特克赛尔德美, 与实际杂种优势的测定结果相符合, 说明利用微卫星 DNA 多态性预测绵羊间杂种优势是准确可行的 References [1] BAUMUNGR,CUBRIC CURIKV,SCHWENDK,etal.Ge neticcharacterisationandbreedasignmentinaustriansheep UsingMicrosateliteMarkerInformation[J].Anim Breed Genet,2006,123(4): [2] KIM TH,KIMKS,CHOIBH,etal.GeneticStructureofPig fromkoreaandchinausingmicrosatelitelocianalysis [J].AnimSci,2005,83(10): [3] FANGM,HUX,JIANGT,etal.ThePhylogenyofChineseIn digenouspiginferedfrom MicrosateliteMarkers[J]. AnimGenet,2005,36(1):7 13. [4] ZHANGGX,WANGZG,CHENW S,etal.GeneticDiversity andpopulationstructureofindigenousyelowcatleof ChinaUsing30MicrosateliteMarkers[J].AnimGenet,2007, 38(6): [5] WANGJZ,CHUM X,WANGAG,etal.GeneticRelation shipsamongsevensheeppopulationsusingfourmicrosatelite Markers[J].JofGenetiseandGenomics,2004,26(5): [6] JIAB,CHENJ,ZHAORQ,etal.MicrosateliteAnalysisof GeneticDiversityandPhylogeneticRelationshipofEightSheep inxinjiang[j].jofgeneticsandgenomics,2003,30 (9): [7] QUL,LIX,XUG,etal.EvaluationofGeneticDiversityin ChineseIndigenousChickenUsingMicrosateliteMarkers [J].SciChinaCLifeSci,2006,49(4): [8] 李俊杰, 桑润滋, 贾青, 等. 畜禽杂种优势估测方法的研究进展 [J]. 黄牛杂志,2001,27(1):4 7 LIJun jie,sangrun zi,jiaqing,etal.researchprogresof ForecastingMethodsinAnimalHeterosis[J].JournalofYelow CatleScience,2001,27(1):4 7.

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