1500 WORLDCHINESEMEDICINE June2018,Vol.13,No.6 paredwithmodelgroup,e cadherinexpresionwassignificantlyincreasedthanothergroups(p<0 05),andtherewerenod

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菱编汪
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1 1499 桃红芪术软肝煎对肝纤维化大鼠病理及 TGF β/smad 信号通路的影响 1 王靖思吴 2 洁 1,2 孙桂芝 1,5 张秋云 3 刘玉琴 2 陈兰羽 4 朱宏伟 (1 首都医科大学附属北京中医医院, 北京,100010;2 中国中医科学院广安门医院, 北京,100053;3 中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所, 北京,100005;4 中国中医科学院望京医院病理科, 北京,100102; 5 首都医科大学中医药学院, 中医临床基础学学系, 北京,100069) 摘要目的 : 观察桃红芪术软肝煎抗大鼠肝纤维化的作用及对 TGF β/smad 信号通路的影响方法 : 选取 105 只 Wistar 大鼠, 随机分为空白组模型组对照药物组 ( 秋水仙碱组扶正化瘀胶囊组 ) 桃红芪术软肝煎组 ( 桃红芪术低剂量组中剂量组高剂量组 ) 除空白组外, 分周 3 个时间点采用 50%CCl 4 1mL/kg 橄榄油溶液腹腔注射进行肝纤维化模型制作, 同时进行 HE 染色和 Mason 染色观察肝纤维化的病理表现 ; 并采用免疫组织化学法检测肝脏组织的 E Cadherin Vim entin 转化生长因子 (TGF) β 1 Smad2 蛋白表达 ;RT PCR 方法检测肝脏组织的 E Cadherin Vimentin TGF β 1 Smad2 的 mrna 表达结果 : 肝纤维化病理结果显示, 随着造模给药时间的延长, 各给药组均能明显阻断模型大鼠肝组织纤维化进展 ; 与模型组比较, 第 9 周时桃红芪术高剂量组作用最明显免疫组织化学结果显示, 与模型组比较, 用药各组从第 3 周至第 9 周,E cadherin 表达均较模型组表达明显增加 (P<0 05), 用药各组间比较, 差异无统计学意义 (P>0 05); 与模型组比较, 用药各组 TGF β 1 表达明显减弱, 差异有统计学意义 (P<0 05), 用药各组组间比较, 差异无统计学意义 (P> 0 05) RT PCR 结果显示, 与空白组比较, 模型组 Smad2mRNA 表达量明显升高, 差异有统计学意义 (P<0 05), 桃红芪术低剂量组 VimentinmRNA Smad2mRNA 表达量明显下降, 差异有统计学意义 (P<0 05), 桃红芪术软肝煎中剂量组 Smad2mRNA 表达下降, 差异有统计学意义 (P<0 05); 扶正化瘀胶囊组 TGF β 1 mrna VimentinmRNA 表达量均较模型组下降, 差异有统计学意义 (P<0 05) 结论: 桃红芪术软肝煎可持续通过 TGF β/smad 信号通路调节上皮间质转化, 治疗肝纤维化关键词孙桂芝 ; 桃红芪术软肝煎 ; 肝纤维化 ; 肝硬化 ; 肝纤维化防治 ; 转化生长因子 β/smad 信号通路 ; 上皮间充质细胞转化 ; 转化生长因子 β 1 EfectsofTaohongQizhuRuanganDecoctiononPathologyandTGF β/smadsignal PathwayinRatswithLiverFibrosis WangJingsi 1,WuJie 2,SunGuizhi 1,2,ZhangQiuyun 1,5,LiuYuqin 3,ChenLanyu 2,ZhuHongwei 4 (1BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100010,China;2Guang anmenhospital ofchinaacademyofchinesemedicalsciences,beijing100053,china;3instituteformedicalresearch,chineseacademyofmedi calsciences,beijingunionmedicaluniversity,beijing100005,china;4departmentofpathology,wangjinghospitalafiliatedto ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100102,China;5ColegeofBasicClinicalTraditionalChineseMedicine, CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China) Abstract Objective:ToobserveefectsofTaohongQizhuRuanganDecoctionontreatingliverfibrosisofrats,andefectson TGF β/smadsignalpathway.methods:atotalof105wistarratswererandomlydividedintoblankgroup,modelgroup,control group(colchicineandfuzhenghuayucapsulegroup),taohongqizhuruangandecoctiongroup(lowdosegroup,middledose group,highdosegroup).exceptblankgroup,theliverfibrosismodelwasestablishedbytheintraperitonealinjectionof50% CCl 4 1mL/kgofoliveoilsolutionat3,6,9week.Atthesametime,HEstainingandMasonstainingwereusedtoobservethepatho logicalexpresionsofliverfibrosis.theexpresionsofe Cadherin,Vimentin,TGF β 1 andsmad2inlivertisuesweredetectedby immunohistochemistry.themrnaexpresionsofe Cadherin,Vimentin,TGF β 1 andsmad2inlivertisuesweredetectedbyrt PCR.Results:Thepathologicalresultsofliverfibrosisshowedthatwiththeprolongationofmodelingandadministrationtime,each drug administeredgroupcouldsignificantlyblocktheprogresionofhepaticfibrosisinmodelrats.andcomparedwithmodelgroup, efectofhighdosetaohongqizhuruangandecoctiongroupwasmostobvious.immunohistochemical:from3weekto9week,com 基金项目 : 中国中医科学院博士研究生创新基金 (CX201404) 作者简介 : 王靖思 ( ), 女, 博士, 医师, 研究方向 : 中西医结合防治肿瘤学,E mail:aly7161@sina com 通信作者 : 孙桂芝 ( ), 女, 本科, 主任医师, 研究方向 : 中西医结合防治肿瘤学,E mail:whongzhong@263 net; 张秋云 ( ), 女, 博士, 教授, 中医临床基础学学系主任, 研究方向 : 慢性肝病的中医药防治, zhangqiuyun8202@aliyun com

2 1500 WORLDCHINESEMEDICINE June2018,Vol.13,No.6 paredwithmodelgroup,e cadherinexpresionwassignificantlyincreasedthanothergroups(p<0 05),andtherewerenodifer encesbetweengroups(p>0 05);comparedwithmodelgroup,TGF βexpresiondecreasedsignificantlyinotherdruggroups(p <0 05),andtherewerenodiferencesbetweengroups(P>0 05).RT PCR:Comparedwiththeblankgroup,Smad2mRNAex presioninmodelgroupsignificantlyincreased(p<0 05).VimentinmRNAandSmad2mRNAexpresionoflowdosegroupof TaohongQizhuRuanganDecoctionsignificantlydecreased(P<0 05).Smad2mRNAexpresionofmiddledosegroupofTaohong QizhuRuanganDecoctiondecreased(P<0 05);TGF βmrna,vimentinmrnaexpresionoffuzhenghuayucapsulegroup decreasedcomparedwiththemodelgroup(p<0 05).Conclusion:TaohongQizhuRuanganDecoctioncanregulateepithelial mesenchymaltransitionthroughtgf β/smadsignalingpathwaytotreatliverfibrosis. KeyWords SunGuizhi;TaohongQizhuRuanganDecoction;Hepaticfibrosis;Livercirhosis;Preventionandtreatmentofhe paticfibrosis;tgf βsignalpathway;epithelial mesenchymaltransition;tgf β 1 中图分类号 :R289 5;R 文献标识码 :A doi: /j.isn 慢性病毒性肝炎是肝纤维化的主要原因, 在肝硬化的形成过程中, 肝纤维化是慢性病毒性肝炎向肝硬化发展的不可避免的阶段 [1], 肝纤维化及其并发症给社会带来巨大健康负担, 由于缺乏有效的治疗方法, 慢性肝脏疾病困扰着世界上数百万人 [2] 且慢性肝病中一旦由纤维化进展到硬化, 发展到肝细胞癌的概率就会增加 [3 4], 因此有效抑制甚至逆转肝纤维化具有重要的临床意义桃红芪术软肝煎 ( 简称桃红芪术 ) 为孙桂芝主任医师的经验方 [5], 观察其抗大鼠肝纤维化的作用及其可能的作用机制 1 材料与方法 1 1 材料动物选取 105 只雌性 Wistar 大鼠, 体重 (180±20)g, 购自北京华阜康生物科技有限公司动物生产许可证号 :SCXK( 京 ) 大鼠分笼饲养于中国中医科学院广安门医院动物房, 清洁级, 适应性饲养 7d, 饲以标准的大鼠合成饲料, 自由饮用纯净水, 环境温度 (22±2), 相对湿度 40%~ 60% 药物桃红芪术软肝煎, 由生黄芪炒白术太子参桃仁莪术等药材组成, 所用药材购自本草方源药业, 全量水提取 2 次, 浓缩收清膏 2700g 灌装, 含生药量为 2 9g/kg 扶正化瘀胶囊, 含生药量 4 0g/kg( 上海黄海制药有限责任公司, 国药准字 Z ); 秋水仙碱 ( 西双版纳药业有限责任公司, 国药准字 H ) 试剂丙氨酸氨基转移酶试剂盒天冬氨酸氨基转移酶剂盒白蛋白试剂盒 ( 均购自美国贝克曼库尔公司 );4% 多聚甲醛 (Solarbio 公司 ); 磷酸缓冲盐溶液 (PBS)(Hyclone 公司 );CCl 4 分析纯水合氯醛 ( 国药集团化学试剂有限公司 ); 苏木精伊红 (HE) 染色及 Mason 染色试剂盒 ( 均购自南京建成科技有限公司 );Trizol 试剂盒 (Lifetechnologies 公司, 批号 :84802); 快速反转录试剂盒 (FastQuantRT Kit)( 天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司, 批号 : N2828);RT PCR 试剂盒 ( 天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司, 批号 :N2828); 引物序列由赛百盛生物公司合成仪器低速离心机 ( 型号 600 A), 白洋离心机厂 ; 荧光正置显微镜,ScopeA1, 德国 Zeis 公司 ; ASP300 脱水机 EG1150H 包埋机 RM2235 切片机, 德国 LEICA 公司 ;BX51 显微镜, 日本 Olympus 公司 1 2 动物分组及造模 105 只大鼠随机分组, 分为空白组模型组对照药物组 ( 秋水仙碱组扶正化瘀胶囊组 ) 桃红芪术组 ( 低剂量组中剂量组高剂量组 ) 每组 15 只除空白组外均进行肝纤维化模型制作造模方法 : 造模组采用含 50% CCl 4 的橄榄油溶液 1mL/kg 腹腔注射制作肝纤维化模型,2 次 / 周, 分周 3 个时间周进行造模空白组则采用含 50% 的 0 9%NaCl 溶液的橄榄油溶液进行腹腔注射均每周称体重 1 次, 以调整腹腔注射剂量 1 3 干预造模同时各组进行每日灌胃干预, 桃红芪术低剂量组给予桃红芪术 3 1g/(kg d) 中剂量组给予 31g/(kg d) 高剂量组给予 62g/(kg d), 秋水仙碱组给予 0 1% 的秋水仙碱 0 1mg/(kg d), 扶正化瘀胶囊组给予扶正化瘀胶囊 0 415g/ (kg d), 空白组给予 0 9% 生理盐水, 直至 9 周末 1 4 取材分别在干预第周末分批处死各组大鼠, 称重后麻醉 ( 按照 3 5mL/kg 体重的标准腹腔注射 10% 水合氯醛 ), 打开腹腔, 抽取腹主动脉动脉血,4 静置 3h 后,4000r/min 离心 10min, 分离血清 ; 抽取血液后摘取大鼠肝脏和脾脏, 用滤纸吸取血液取肝脏右叶同一部位约 1cm 1cm 0 5cm 大小的肝脏组织放入 4% 多聚甲醛液中固定, 以制作病理切片 ; 再取肝脏右叶约 1cm 1cm 大小的新鲜肝脏组织放入冻存管内, 置 -80 超低温冰箱保

3 1501 存, 用于 RT PCR 检测 1 5 观察指标肝脾指数计算摘取的大鼠肝脏和脾脏, 分别用千分位电子天平称取质量并记录, 计算肝脾指数计算公式 : 肝指数 (%)= 肝质量 / 体重 100%; 脾指数 (%)= 脾质量 / 体重 100% 肝脏病理观察采用苏木精伊红 (HE) 染色和 Mason 染色 1) 取材和固定 : 取肝组织标本, 立即置于 4% 多聚甲醛中固定 ;2) 冲洗 : 标本固定 24 h 后, 流水冲洗 30min;3) 脱水 ;4) 透明 : 将标本经二甲苯 (Ⅰ) 二甲苯 (Ⅱ) 二甲苯 (Ⅲ) 处理, 各级时间 20min 左右 ;5) 浸蜡及包埋 : 将含有肝脏组织的包埋盒放在熔蜡箱内约 1h, 共 3 次切片粘片及烤片 : 用石蜡切片机连续切片后粘片, 烤片 2h 后进入染色过程 HE 染色及 Mason 染色步骤参照试剂盒说明书肝纤维化病理参照标准 : 参照 2000 年西安会议上由中华医学会传染病与寄生虫病学分会肝病学分会联合修订的慢性肝炎分级分期标准 [6] E Cadherin Vimentin TGF β 1 Smad2 蛋白表达检测采用免疫组织化学法检测 1) 将切片脱蜡入蒸馏水,PBS 洗 5min 后进行抗原修复,PBS 洗 5 min 3 次,3%H 2 O 2 孵育 10min,PBS 洗 5min 3 次, 一抗作用 37 2h,PBS 洗 5min 3 次, 二抗作用 37 1h,PBS 洗 5min 3 次, 显色, 苏木精复染, 盐酸乙醇分色, 饱和碳酸锂返蓝, 上行脱水透明封片 2) 光镜下观察各指标表达, 每张切片从左至右随机选择 5 个视野观察各指标的阳性表达情况应用 MIAS 医学图像分析管理系统分析软件测量各指标的光密度值, 计算平均吸光度值, 并进行统计分析 E Cadherin Vimentin 转化生长因子 (TGF) β 1 Smad2 的 mrna 表达检测采用 RT PCR 方法检测 1)RNA 制备 : 按 Trizol 试剂盒说明书步骤提取 RNA, 测 A 值 (260nm,280nm) 其余样品 -20 冻存或立即反转录 2)RNA 反转录 : 使用快速反转录试剂盒 (FastQuantRTKit) 合成第一链 cdna, 得到的 cdna 可用于后续实验, 或低温保存 ;3)Real timepcr 扩增 : 反应体系 20μL/ 管,2 SyBrGreen Mix10μL, 上下游引物各 1μL(10μmol/L),DEPC H 2 O7μL,cDNA1μL 引物序列如表 1 反应条件 :95 5min;95 30s,55 30s,72 35s,40 个循环 ;72 延伸 8min 根据实时 PCR 的原始检测结果, 按照相对定量计算公式计算出各样品的目的基因相对定量结果 2 -Ct 计算方法 : Ct= 实验组 (Ct 目的基因 -Ct 管家基因 )- 对照组 (Ct 目的基因 - Ct 管家基因 ) 表 1 引物序列基因序列号引物序列扩增产物长度 (bp) Smad2 NM_ 上游 5 agtcaaaacccagagcgaaa 下游 5 tatgcccaacgagacatca 3 TGF β 1 NM_ 上游 5 caacaatcctggcgtacc 下游 5 tgggactgatcccatgat 3 E cadherin AB 上游 5 agccaatcctgatgaaatcg 下游 5 ccatacatatcggccagct 3 下游 5 caaaacacccaggagcagat 3 TGF βr1 NM_ 上游 5 tgctgatgtcagctctgg 下游 5 gcctcaaggcac tgag 3 Vimentin NM_ 上游 5 agatcgatgtggacgtcc 下游 5 tccggtatcgtgactcc 3 GAPDH NM_ 上游 5 acccagaagactgtggatgg 下游 5 cacatgggggtaggaacac 统计学方法采用 SPSS18 0 统计软件进行数据分析, 组间比较使用单因素方差分析, 先进行方差齐性检验, 方差齐使用 LSD 方法进行组间的两两比较 ; 方差不齐先用 Welch 方法校正, 然后再用 DunnetT3 方法进行各组间比较以 P<0 05 为差异有统计学意义 2 结果 2 1 对大鼠一般情况的影响空白组 : 大鼠精力充沛, 反应灵活, 毛发有光泽, 脾气温和, 实验过程中无死亡模型组 : 大鼠精神萎靡, 反应迟钝, 目光呆滞, 毛发粗糙欠光泽, 脱落较多, 脾气暴躁, 对造模实验不配合, 并且后期有腹部膨隆口唇及皮毛出血等现象, 无死亡桃红芪术组 ( 低剂量组中剂量组高剂量组 ) 和对照药物组 ( 秋水仙碱组扶正化瘀胶囊组 ): 精力较充沛, 反应灵敏, 目光灵活, 毛发较光泽, 脾气较好, 对造模及灌胃过程配合较好, 桃红芪术高剂量组和秋水仙碱组各死亡 1 只 2 2 对大鼠肝纤维化程度的影响从干预第 3 周至第 9 周的 HE 染色及 Mason 染色图片可以看出, 第 3 周 HE 染色造模病理图片中部分纤维组织增生,Mason 染色病理图片中少许纤维组织着色, 提示部分组织发生纤维化, 桃红芪术中剂量组及高剂量组改善最为明显 ; 第 6 周模型组病理图片已经存在纤维纵隔, 将肝小叶分隔成大小不等的肝细胞团, 形成假小叶, 部分区肝被膜纤维组织显著增生, 提示肝纤维化造模成功, 其他用药各组病理程度均较模型组轻, 模型组 Mason 染色纤维组织明显增多, 其他各组纤维染色不及模型组显著, 提示桃红芪术及扶正化瘀胶囊秋水仙碱对于大鼠肝纤维化具有明显的缓解作用, 桃红芪术高剂量组改善较其他组显著见图 1 第 9 周 HE 染色图片可见造模各组均形成

12±0 03 0 15±0 02 模型组 (n=5) 0 12±0 02 0 30±0 05 0 25±0 09 THQL 组 (n=5) 0 22±0 05 0 17±0 02 0 17±0 02 THQM 组 (n=5) 0 22±0 02 0 14±0 03 0 19±0 03 THQH 组 (n=4) 0 21±0 05 0 18±0 02 0 15±0 04 FZHY 组 (n=5)

4 1502 WORLDCHINESEMEDICINE June2018,Vol.13,No.6 假小叶, 但是用药各组假小叶结构均较模型组有所改善, 特别是桃红芪术中剂量组及高剂量组肝组织结构改善最为明显, 模型组染色纤维显著增多, 用药各组纤维染色增多程度不及模型组表 2 各组大鼠肝组织中 E cadherin TGF β 1 Vimentin 比较 ( x±s,a) 珋组别 E cadherin TGF β 1 Vimentin 空白组 (n=5) 0 22± ± ±0 02 模型组 (n=5) 0 12± ± ±0 09 THQL 组 (n=5) 0 22± ± ±0 02 THQM 组 (n=5) 0 22± ± ±0 03 THQH 组 (n=4) 0 21± ± ±0 04 FZHY 组 (n=5) 0 22± ± ±0 03 QSXJ 组 (n=5) 0 18± ± ±0 04 注 : 与空白组比较, P<0 05; 与模型组比较, P<0 05 图 1 大鼠肝组织 (Mason 染色, 100) 注 :A: 空白组 ;B: 模型组 ;C: 桃红芪术低剂量 ;D: 桃红芪术中剂量组 ;E: 桃红芪术高剂量组 ;F: 扶正化瘀胶囊组 ;G: 秋水仙碱组 2 3 对大鼠肝组织 E Cadherin Vimentin TGF β 1 蛋白表达的影响从第 9 周数据分析, 与模型组比较, 用药各组 E cadherin 表达较模型组表达明显增加 TGF β 1 表达较模型组明显减弱, 差异有统计学意义 (P<0 05), 用药各组间比较, 差异无统计学意义 (P >0 05), 其中以桃红芪术软肝煎中剂量组和扶正化瘀胶囊组作用最明显, 差异有统计学意义 (P< 0 05) 见图 2~4, 表 2 图 2 大鼠肝组织 E Cadherin 蛋白表达 ( 免疫组织化学法, 20) 注 :A: 空白组 ;B: 模型组 ;C: 桃红芪术低剂量 ;D: 桃红芪术中剂量组 ;E: 桃红芪术高剂量组 ;F: 扶正化瘀胶囊组 ;G: 秋水仙碱组图 3 大鼠肝组织 TGF β 1 蛋白表达 ( 免疫组织化学法, 20) 注 :A: 空白组 ;B: 模型组 ;C: 桃红芪术低剂量 ;D: 桃红芪术中剂量组 ;E: 桃红芪术高剂量组 ;F: 扶正化瘀胶囊组 ;G: 秋水仙碱组图 4 大鼠肝组织 Vimentin 蛋白表达 ( 免疫组织化学法,1 20) 注 :A: 空白组 ;B: 模型组 ;C: 桃红芪术低剂量 ;D: 桃红芪术中剂量组 ;E: 桃红芪术高剂量组 ;F: 扶正化瘀胶囊组 ;G: 秋水仙碱组 2 4 对大鼠肝组织 E Cadherin Vimentin TGF β 1 Smad2mRNA 表达的影响 RT PCR 结果显示, 与空白组比较, 模型组 Smad2mRNA 表达量升高 (P< 0 05), 说明造模过程中,Smad2mRNA 表达上升, 促进上皮间质转化, 从而发生肝纤维化 ; 桃红芪术低剂量组 TGF βmrna VimentinmRNA Smad2mRNA 表达下降 (P<0 05), 桃红芪术软肝煎中剂量组 Smad2 mrna 表达下降 (P<0 05); 桃红芪术高剂量组 E cadherinmrna 表达上升 (P<0 05), 说明桃红芪术软肝煎可以通过下调 Smad2mRNA 表达, 下调 TGF β 表达, 逆转上皮间质转化, 其中以桃红芪术软肝煎低剂量组疗效最好 5 1 大鼠 RT PCRmRNA 曲线见图 6 3 讨论肝纤维化是肝脏受损伤后 ( 如肝脏感染发生乙型肝炎或丙型肝炎酒精性肝炎药物性肝病自身免疫性肝病等 ) 的结果, 病理性肝纤维化主要归因于纤维化与基质降解所造成的失衡 [7] 上皮间充质细胞转化 (Epithelial mesenchymaltransition,emt) 是指在组织重建和多细胞生物胚胎发育中存在的现象 [8], 其主要特征为 : 上皮细胞标志物钙黏蛋白 E cadherin 表达的降低或缺失 ; 间质细胞表型的获得如 Vimentin 等标志物的升高及细胞形态间质化等研究发现 EMT 分为 3 型, 其中 2 型 EMT 与器官纤维化

1503 密切相关 [9] β 受体 (TGF betareceptors,tβr) 相结合, 并进一步活化下游的 Smad 蛋白 ( 如 Smad2 Smad3 Smad5 Smad8 等 ), 最终导致大量胶原纤维的产生, 形成肝纤维化 [11] 在肝纤维化中,TGF β 诱导肝脏细胞发生 EMT, 是成纤维细胞的潜在来源之一 [12] 图 5 大鼠 RT PCRmRNA 曲线注

是导致肝纤维化最重要的细胞因子 [10] 肝脏受损后, 肝脏内 TGF β 1 表达明显上升, 与 TGF 图 6 各组大鼠 Vimentin Smad2 TGF β 1 E CadherinmRNA 表达目前, 肝纤维化动物模型一直是我们从事肝纤 [13] 维化动物实验研究的重点及难题, 李萍等对 30 只雄性 Wistar 大鼠给予腹腔注射牛血清白蛋白成功 [14] 制作肝纤维化模型

5 1503 密切相关 [9] β 受体 (TGF betareceptors,tβr) 相结合, 并进一步活化下游的 Smad 蛋白 ( 如 Smad2 Smad3 Smad5 Smad8 等 ), 最终导致大量胶原纤维的产生, 形成肝纤维化 [11] 在肝纤维化中,TGF β 诱导肝脏细胞发生 EMT, 是成纤维细胞的潜在来源之一 [12] 图 5 大鼠 RT PCRmRNA 曲线注 :A:VimentinmRNA 扩增曲线 ;B:VimentinmRNA 熔解曲线 ; C:Smad2mRNA 扩增曲线 ;D:Smad2mRNA 熔解曲线 ;E:E Cadherin mrna 扩增曲线 ;F:E CadherinmRNA 熔解曲线 ;G:TGF β1 扩增曲线 ;H:TGF β1 熔解曲线许多信号通路参与肝纤维化的过程, 有研究认为 TGF β 1 是导致肝纤维化最重要的细胞因子 [10] 肝脏受损后, 肝脏内 TGF β 1 表达明显上升, 与 TGF 图 6 各组大鼠 Vimentin Smad2 TGF β 1 E CadherinmRNA 表达目前, 肝纤维化动物模型一直是我们从事肝纤 [13] 维化动物实验研究的重点及难题, 李萍等对 30 只雄性 Wistar 大鼠给予腹腔注射牛血清白蛋白成功 [14] 制作肝纤维化模型王晓晗等通过喂养 C57/B6 雄性小鼠含 0 1% 的 3 5 二乙氧基羰基 1 4 二氢三甲基吡啶 (DDC) 饲料成功构建肝纤维化模 [15] 型李旭等给 Wistar 大鼠采用胆总管结扎术的 [16] 方法制作肝纤维化模型 Fan 等采用 SD 大鼠腹腔注射 50% CCl 4 / 橄榄油溶液 0 2mL/100g 造模 [17] 还有使用复合因素造模者, 张贵阳等曾采用 CCl 4 联合高脂低蛋白食物饮食 30% 乙醇饮用水等控制因素的方法制作大鼠肝纤维化模型,6 周即可成模目前国际常用模型多为单一造模方式, 较少使用复合造模方法, 避免造模过程中产生较多干扰因素, 较 [18] 经典的模型是 Nakamura 等对 Wistar 大鼠腹腔注射 1mL50%CCl 4 / 橄榄油溶液 2 次每周制作肝纤维化模型,4~8 周即可成模, 本研究采用此种造模方法, 第 6 周模型组 HE 染色及 Mason 染色病理图片可见假小叶形成, 肝纤维化模型成功形成金明丽 [19] 等研究四氯化碳不同注射方式对于构建大鼠不同分期肝纤维化模型的影响, 发现腹腔注射及皮下注射的方式均可以建立大鼠不同分期的肝纤维化模型, 但是皮下注射造模死亡率比腹腔注射的死亡率低, 但是造模需要的时间较长,2 种注射方式获得有意义的肝纤维化模型无明显差异 [20] Chen 等研究发现外源性骨形态生成蛋白可以缓解血吸虫病肝纤维化小鼠的急性期和慢性期进展, 并且其机制可能是通过 TGF β/smad 信号通路 [21] 实现的 Tang 等通过体内体外实验认为积雪草

6 1504 WORLDCHINESEMEDICINE June2018,Vol.13,No.6 酸可能是抗肝纤维化的潜在药物, 其机制通过诱导 Smad7 针对 TGF β/smad 信号通路诱导的肝纤维化 [22] 的阻断作用实现的 Zhou 等将 200nmol/L 的紫杉醇干预经过人重组 TGF β 1 诱导因子诱导后的肝星状细胞, 发现 Smad2/3 的磷酸化作用, 从而抑制胶原纤维 Ⅰ 和 Ⅲ 及纤连蛋白的表达, 认为紫杉醇可以 [23] 通过抑制 TGF β 信号缓解肝纤维化喻勤等研究发现荔枝核总黄酮通过抑制 TGF β 1 及 Smad3, 上调 Smad7 减轻二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化损 [24] 伤程度赵窻等发现健脾软肝方可以抑制 TGF β/smad 信号通路中 TGF β 1 TGF βr1 及 Smad3 Smad7 的表达, 从而缓解 CCl 4 大鼠肝纤维化程度 [25] 牛学敏等发现益气活血方可以使 TGF β 1 的 mr [26] NA 及蛋白表达显著降低 (P<0 05) 邓莉等研究认为复方鳖甲软肝片可以通过抑制肝生长因子表 [27] 达来抗大鼠肝纤维化张智慧等认为银杏叶提取物 (GbE) 可以降低 TGF β 1 的表达, 有效防止 CCl 4 [28] 诱导大鼠肝纤维化的进展尚双艳研究发现香附多糖组大鼠的组织金属蛋白酶抑制剂 2(TIMP 2) 和 TGF β 1 水平明显低于模型组, 提示香附多糖可有 [29] 效改善肝纤维化大鼠肝脏纤维化黄晨恺等熊果酸 (UrsolicAcid,UA) 这种从药用植物中提取出的天然三萜类化合物, 能抑制肝脏中 TGF β 的表达, 从而下调下游促纤维化信号通路, 减少 I 型胶原的 [30] [31] 产生杨欣等和夏雪皎等研究得出结论 : 疏肝健脾活血方可以通过影响大鼠转化生长因子 β 1 / Smad 信号通路传导, 从而显著改善肝纤维化大鼠肝组织病理变化, 具有不错的抗肝纤维化作用马滢 [32] 等认为丹酚酸 B 在二甲基亚硝胺 (DMN) 诱导肝纤维化肝癌进程中, 可能通过增强 psmad3c/p21 介导的抑癌信号来减弱 psmad3l/pai 1/c Myc 介导的促纤维化癌变信号, 从而阻碍肝纤维化向肝癌发展 [33] 的进程张可锋等发现七味净肝灵的高中剂量组大鼠的肝纤维化病变程度比模型组减轻明显, 从而得出结论 : 七味净肝灵对于 DMN 诱导的大鼠肝纤维化具有显著的改善作用, 其机制可能与抑制 TGF [34] β 1 的表达有关张玉等研究发现二氢杨梅素 (Dihydromyricetin,DHM) 能够通过抑制 TGF β 1 / Smad 信号通路介导的细胞外基质从而抑制 HSC T6 [35] 细胞的活化杨文明等观察发现肝豆扶木汤可以降低 TX 小鼠肝纤维化血清学指标, 作用机制可能是抑制 TGF β 1 和 Smad2 蛋白的表达以及上调 [36] Smad7 蛋白的表达吕建林等研究发现海珠益肝化纤方可降低肝纤维化大鼠 α SMA 和 TGFβ 1 的 [37] 表达从而抑制肝纤维化的进展章圣朋等认为夏枯草总三萜通过下调 p ERK 表达和调控 TGF β 1 / [38] Smad 信号通路保护肝脏张家富等观察肝乐颗粒中高剂量组可以减轻肝组织病理损伤程度, 减少胶原纤维沉积, 还可以显著降低 Smad2,ColagenⅠ, TGF β 1,TβRⅠ 蛋白及 mrna 的表达在肝纤维化过程中, 肝脏内胶原纤维组织增加, 造成肝脏重量增加 ; 肝纤维化时, 肝组织受损后, 门静脉系统血液回流受阻, 压力增高, 脾静脉回流受阻, 造成脾脏瘀血, 最终导致脾脏增大, 本研究发现桃红芪术软肝煎可以降低 CCl 4 大鼠肝纤维化的肝脾值, 缓解肝脾淤血情况 ; 增加肝纤维化大鼠体重, 改善营养状况 ; 随着造模给药时间的延长, 各给药组均有阻断模型大鼠肝组织纤维化进展的功效, 以桃红芪术软肝煎中高剂量组作用最为明显 ; 免疫组织化学蛋白表达结果及 RT PCRmRNA 结果显示桃红芪术软肝煎可上调 E cadherin, 下调 TGF β 及 Vim entin Smad2 蛋白表达, 提示桃红芪术软肝煎可能通过调节 TGF β/smad 信号通路, 降低 Smad2 蛋白表达, 从而下调 TGF β Vimentin, 上调 E cadherin 表达, 发挥改善上皮间质转化治疗肝纤维化的作用结合动物实验肝脾指数病理染色免疫组织化学及 RT PCR 结果, 可以看出桃红芪术软肝煎中高剂量均有较好的治疗肝纤维化的作用, 对比扶正化瘀胶囊和秋水仙碱组, 也有较好的疗效扶正化瘀胶囊由虫草绞股蓝松花粉五味子桃仁丹参等药物组成 [39], 具活血祛瘀, 益精养肝之效已被证实对于治疗肝纤维化具有较好疗效 [40 46] 西医对于肝纤维化没有特效用药, 研究发现秋水仙碱可以刺激胶原酶的活性, 促进胶原的降解 [47], 孙嘉临和王 [48] 先化发现秋水仙碱可以降低肝纤维化大鼠血清中的肿瘤坏死因子 (TumorNecrosisFactor,TNF α) 和干扰素 γ(ifn γ), 通过抑制炎性反应来缓解肝纤维化研究证明, 桃红芪术软肝煎与中成药扶正化瘀胶囊西药秋水仙碱具有相同甚至更好的疗效, 因此, 桃红芪术软肝煎有希望成为治疗肝纤维化的潜在用药, 有待于临床疗效的验证参考文献 [1]ZhangB,WangZ,DengB,etal.IdentificationofEnolase1and Thrombospondin 1asserum biomarkersinhbv hepaticfibrosisby proteomics[j].proteomesci,2013,11(1):30. [2]LimYS,KimWR.Theglobalimpactofhepaticfibrosisandend stage liverdisease[j].clinliverdis,2008,12(4): ,vi. [3]BiselDM.Chronicliverinjury,TGF beta,andcancer[j].expmol Med,2001,33(4):

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中华医学会肝病学分会中华医学会感染病学分会 Ó Ñ Ñ Ñ Ñ Ò Ò Ò Ó Ó Ò Ó Ñ Ò Ò Ó Ò Ò Ñ Ò Ñ Ñ Ò Ò Ñ Ñ Ñ Ò Ó Ò Ò Ñ Ó Ò Ò Ó Ó Ñ Ó Ó Ó Ò Ò Ó Ò Ó Ó Ò Ò Ò Ñ Ó Ò Ñ Ò Ò Ñ Ò Ò Ò Ó Ò Ô 中华医学会肝病学分会中华医学会感染病分会慢性乙型肝炎防治指南年更新版中华实验和临床感染病杂志