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沙干
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1 生命科学导论 -- 生物技术与生命科学干细胞治疗方芳 Tel: (O) 安徽省重组蛋白质药物工程技术研究中心 1

2 心脏干细胞疗法第一人 Piero Anversa 2

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4 内容 1 干细胞基本理论知识 2 干细胞研究发展史 3 干细胞治疗应用 4

5 1 基本理论知识 - 干细胞 5

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7 干细胞 (stem cell) 具有自我更新高度增殖能力的细胞, 能产生表型基因型和自己完全相同的子细胞, 同时还能分化为祖细胞即这些细胞可以通过细胞分裂维持细胞群的大小, 同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞, 从而构成有机体各种复杂的组织和器官 7

8 干细胞 (stem cell) 不对称分裂 8

9 干细胞 (stem cell) 1. 干细胞的形态和生化特征 : 形态 : 圆形或卵圆形, 核质比相对较大各种细胞器不够发达, 增殖力强等生化 : 基因高度甲基化 2. 干细胞增殖与分化受到微环境的精密调控 9

10 干细胞 (stem cell) 发育的全能性或多能性自我更新能力长的生命周期及相对慢的增殖速度 10

11 干细胞 (stem cell) 发育的全能性或多能性 11

12 干细胞 (stem cell) 自我更新 (A) 不对称分裂当干细胞发生分裂后, 产生一个干细胞和一个分化细胞 (B) 对称分裂 12 当干细胞发生分裂后, 所产生的两个子代细胞都是干细胞或都是分化细胞

13 干细胞 (stem cell) 长的生命周期及相对慢的增殖速度定义 : 当干细胞进入分化程序后, 首先经过一个短暂的增殖期, 产生过渡放大细胞过渡放大细胞经若干次分裂后, 生成分化细胞生理意义 : 有利于干细胞对特定的外界信号做出反应, 以决定是进入增殖状态还是进入特定的分化程序 ; 还可以减少基因发生突变的危险, 使干细胞有更多的时间发现和校正复制错误 13

14 干细胞 - 根据细胞分化潜能分类 14

15 全能干细胞受精卵多能干细胞胚胎干细胞 15

16 单能干细胞 Common lymphoid - 淋巴 progenitor NK cell T cell B cell macrophage neutrophil Hematopoietic stem cell 造血干细胞 Common myeloid 脊髓 progenitor Gran/Mac progenitor Erythro/Plt progenitor basophil eosinophil RBC Platelet 16

17 单能干细胞皮肤干细胞 17

18 2 干细胞研究发展 18

19 胚胎干细胞的发现 20 世纪 50 年代,Stevens 在小鼠内发现了畸胎瘤 Beatrice Mintz Karl Illmensee Martin Evans Leroy Stevens( ) 最终确定了胚胎干细胞 (Embryonic Stem Cell) 的概念 19

20 人胚胎干细胞系的建立 20

21 成体干细胞的发现它们是存在于已经分化组织内 ; 具有自我更新的能力 ; 能够分化形成该类型组织的细胞, 在组织中含量极低 21

22 成体干细胞的发现含有干细胞的成体组织 : 骨髓外周血脑脊髓牙髓血管骨骼肌表皮和消化系统角膜视网膜肝脏和胰腺造血干细胞神经干细胞间充质干细胞 22

23 造血干细胞的发现 1963 年 :McCulloch 和 Till 证明老鼠骨髓中存在一种自我更新的细胞 23

24 1968 年 :Gatti 应用骨髓移植成功治疗了一例重症联合免疫缺陷患者 ( 造血干细胞 ) 1978 年 : 在人脐带血中发现了造血干细胞 24

25 间充质干细胞的发现 1968 年在骨髓中发现存在一群干 / 祖细胞能支持造血和分化为骨细胞 ; 1974 年体外培养这类贴壁培养的干细胞呈漩涡状生长 1988 年这类干细胞被命名为骨髓基质干细胞 1991 年进一步把这类干细胞命名为间充质干细胞 2006 年国际细胞治疗协会统一了间充质干细胞的定义 ( 也是鉴定标准 ), 使得间充质干细胞有了全球范围的最低鉴定标准这个定义包括三方面的内容 :1 在标准培养环境下具备塑料粘附性 (plastic-adherent );2 细胞表面表达一些特异性标记物 ;3 具有向脂肪细胞成骨细胞软骨细胞分化的能力 25

26 诱导性多能干细胞 (ips) 的产生可诱导的多能干细胞技术 26

27 2012 Nobel Prize in Physiology or Medicine for cloning and stem cell for the discovery that mature cells can be reprogrammed to become pluripotent John Gurdon Shinya Yamanaka 27

28 诱导性多能干细胞 (ips) 的产生重编程 (reprogramming) 将成体细胞逆向分化获得多能性细胞的过程 ips: 通过基因转染技术将某些转录因子导入动物或人的体细胞, 使体细胞直接重构成为胚胎干细胞样的多潜能细胞 28

29 How the ips Cell Lines are made 29

30 How the ips Cell Lines are made 多能性验证 : DNA 甲基化方式基因表达谱染色质状态形成嵌合体动物等方面 30

31 2007 年末,Thompson 实验室和山中伸弥实验室几乎同时报道, 利用 ips 技术同样可以诱导人皮肤纤维母细胞成为几乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞所不同的是日本实验室依然采用了用逆转录病毒引入 Oct3/4 Sox2 c-myc 和 Klf4 4 种因子组合, 而 Thompson 实验室则采用了以慢病毒载体引入 OCT4 SOX2 加 NANOG 和 LIN28 这种因子组合 2008 年, 哈佛大学 George Daley 实验室利用诱导细胞重新编程技术把采自 10 种不同遗传病患者病人的皮肤细胞转变为 ips, 这些细胞将会在建立疾病模型药物筛选等方面发挥重要作用 31

32 中国的 ips 研究中国科学家于 2008 年 11 月利用 ips 细胞培育出小鼠小小中国科学院动物研究所周琪研究员利用 ips 细胞能够得到成活的具有繁殖能力的小鼠 32

33 ips 优点与经典的胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术不同,iPS 技术不使用胚胎细胞或卵细胞, 因此没有伦理学的问题利用 ips 技术可以用病人自己的体细胞制备专用的干细胞, 所以不会有免疫排斥的问题 33

34 ipsc 的免疫原性, 争议进行时提出异议 : 2011 年, 来自加州大学圣地亚哥分校的徐洋 (Yang Xu) 教授却驳斥了这一假设他的研究小组利用一种小鼠皮肤细胞生成了 ipscs, 将其移植到基因相同的小鼠体内以这种方式移植的 ESCs 形成了畸胎瘤, 证实其确实具有多能性但徐洋的 ipscs 却无法形成畸胎瘤, 因为它们受到了小鼠白细胞的攻击, 遭到了排斥表示支持 : 2013 年, 来自日本的科学家们利用重编程小鼠干细胞生成了皮肤和骨髓, 并将它们移植到基因相同的小鼠体内, 证实不会引发强烈的免疫反应资料来源 : 34

35 ipsc 的免疫原性, 争议进行时 35

36 ips 缺点诱导周期长, 效率低 ; 诱导过程中病毒载体的使用 ; 诱导因子为潜在原癌基因 36

37 诺奖之后, 细胞重编程技术重大突破山中伸弥利用病毒插入 4 个基因诱导 ips 需要 4 周的时间 ; 无法协调细胞之间时间同步 ; 并且最终实际上只有不到 1% 的处理细胞变成了干细胞 Weizmann 研究所 Yaqub Hanna 博士实验室证实, 从成体细胞中除去 MBD3 可提高效率, 加速这一过程达几个数量级 (100%) 生成干细胞所需的时间从 4 周缩短至 8 天 37

38 诺奖之后, 细胞重编程技术重大突破山中伸弥是利用病毒载体进行基因运送, 具有致癌隐患, 对于以后的临床应用有较大风险中科院裴端卿研究员开发出化学小分子诱导多能干细胞的方法, 简单高效, 所需的初始细胞量少 38

39 Currently Available Methods to Generate Pluripotent Stem Cells 基因蛋白化合物理论上证明了女儿国存在的可行性单性繁殖则是未受精的卵子最终发育成胚胎 39

40 小保方晴子事件刺激触发的多能性获得 (STAP) 40

41 然后 3 月 14 日,RIKEN 的初步调查报告出来了, 证明晴子的实验方法和结论都存在致命错误, 但不能肯定是蓄意造假 4 月 1 日 RIKEN 的最终报告发布, 认为晴子是蓄意造假, 篡改实验数据, 实验记录混乱且不全, 根本无法证明其实验结果 8 月, 小保方晴子的导师笹井芳树自杀身亡 41

42 42

43 肿瘤干细胞 43

44 肿瘤干细胞存在的证据传统的肿瘤干细胞理论主要是基于 NOD/SCID mice 的实验, 就是把一定数量的肿瘤细胞打到这些免疫缺陷的老鼠里, 看看长出了多少个独立的肿瘤, 进而统计出有多少细胞能够致瘤, 结论是能够致瘤的癌细胞数量占总细胞数的极少部分, 进而支持了肿瘤干细胞理论但 NOD/SCID mice 模型有个严重的缺点, 就是残留的 NK 细胞活性 2012 年 8 月 3 日, 自然和科学杂志相继刊发 3 篇研究文章称, 用遗传细胞标记技术成功追踪到癌症干细胞踪迹科学家相信精确地消灭它, 或可防止癌症复发这一研究成果为癌症干细胞的存在增加了新证据 44

45 肿瘤干细胞存在的证据 ====================================================== Tumor type Surface antigens Year reported Reference Acute Myeloid leukemic CD34+/CD Bonnet D, 1997 Brain tumor CD Singh SK, 2003 Breast cancer CD44+/CD Al-Hajj M, 2003 Multiple Myeloma CD Matsui W, 2004 Colon cancer CD O'Brien CA, 2007 Liver cancer CD Ma S, 2007 Pancreatic cancer CD44+/CD Li C, 2007 Lung cancer CD Eramo A, 2008 Ovary cancer CD44+/CD Zhang S, 2008 Prostate cancer CD133+/CD Maitland NJ, 2008 Melanoma CD4+/CD25+/FoxP Schatton T, 2008 Gastric cancer CD Takaishi S, 肿瘤干细胞表面标记物 Hui H et al: Stem Cells: General Features and Characteristics,

46 How Do Cancer Stem Cells Arise? 46

47 传统观点肿瘤发生的干细胞学说新观点基因突变理论肿瘤干细胞理论肿瘤发生的干细胞学说 : 干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的原始细胞, 恶性肿瘤进行性生长转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似, 推测肿瘤是干细胞分化增殖失调而产生的异常组织 Tannishtha, Sean JM, Michael FC,et al. Nature,2001,414:105 47

48 肿瘤干细胞肿瘤干细胞的定义 : 是存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞性质的细胞群体, 它具有自我更新的能力, 是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤不断扩大的源泉 48

49 肿瘤干细胞的特点自我更新分化潜能高致瘤性 : 主要从两个方面进行评价 : 1. 癌干细胞的体外克隆形成 (clonogenicity) 能力, 即源自原发性肿瘤组织或肿瘤细胞系的癌干细胞在软琼脂 (soft agar) 或基底膜类似物 (matrigel) 上形成克隆数及其大小 2. 癌干细胞在免疫缺陷动物体内的肿瘤形成 (tumorigenicity) 能力, 即将分选的相同数量的癌干细胞和非干细胞分别原位或异位接种免疫缺陷动物, 观察其在相同时间内成瘤情况 ( 统计成瘤动物数, 比较形成肿瘤的大小等 ) 耐药性具有与非致瘤细胞不同的表面标志 ( 所占比例少 ) 49

50 肿瘤干细胞分裂方式 1. 不对称分裂即一个肿瘤干细胞分裂产生的两个子代细胞中, 一个总是进一步分化成肿瘤细胞群, 另一个总是肿瘤干细胞, 以维持干细胞的数量不变 2. 对称分裂即一个肿瘤干细胞分裂成两个相同的子代细胞, 然后随机决定其中一个仍为肿瘤干细胞, 而另一个继续分化成为肿瘤细胞群 50

51 肿瘤干细胞的耐药性 ABC transporter Candace A. Gilbert and Alonzo H. Ross:Targets for New Combination Therapies In Cancer Stem Cells Theories and Practice,

52 肿瘤干细胞肿瘤干细胞理论提出的意义为肿瘤的治疗和发病机制的研究提供了新的视野 : 1. 正常干细胞和其它细胞突变后成为肿瘤干细胞, 导致肿瘤的发生 ; 2. 根治肿瘤 : 即要靶向性清除肿瘤干细胞 ; 3. 干细胞修复组织和器官时警惕干细胞突变 ; 52

53 3 干细胞治疗的应用 53

54 干细胞应用再生医学 3D 打印技术 ( 生物化人工组织或器官 ) 干细胞技术 ( 移植技术 ) 药物再生诱导 54

55 再生医学大事记在一本人类历史上最早的外科教科书中, 印度医生 Suśruta 介绍了用面颊部皮肤修复耳垂撕裂伤, 以及用前额皮瓣进行鼻重建的方法 55

56 再生医学大事记被称为生物学之父的瑞士自然学家 Abraham Trembley 56 发现了水螅的再生现象

57 再生医学大事记 1901 年遗传的概念因利用果蝇研究染色体在遗传中的作用而闻名于世的美国科学家 Thomas Hunt Morgan 撰写了著作 Regeneration 这本书使该研究领域混乱的术语得以统一和更为清晰 1907 年组织工程学的起源美国生物学家 Ross Granville Harrison 发现了在实验室培养青蛙胚胎细胞的方法他首先实施的干细胞实验和第一个成功的组织培养方法为组织工程研究铺平了道路 1952 年美国科学家 Robert Briggs 和 Thomas King 首先报道了核转移克隆 1963 年干细胞的发现 1981 年胚胎干细胞技术 57

58 再生医学大事记生物学家 Eugene Bell 及其同事报道了用自体细胞构建的人工皮肤修复创面的方法 Bell 随后建立了 Organogenesis 公司, 并于 1998 年成为首家 FDA 批准的生产含有活细胞的产品的公司 58

59 再生医学大事记哈佛医学院科学家 Joseph Vacanti 及其团队通过组织工程技术使小鼠背部长出人耳 59

60 再生医学大事记来自北卡罗琳娜州 Wake Forest School of Medicine 的外科医生 Anthony Atala 成功的将实验室培养的膀胱移植到 7 个具有先天性缺陷的儿童患者 60

61 再生医学大事记 2010 年一个脊髓损伤的患者成为接受胚胎干细胞治疗的第一人同年研究报道了来源于患者健康角膜的干细胞可以在实验室生长, 移植到受损的角膜可使视力得以恢复 2015 年欧盟委员会批准 Holoclar 用于治疗角膜严重受损的患者这是第一个进入市场的干细胞治疗方法 61

62 干细胞的应用 1. 基础研究揭示发育机制及影响因素 2. 药学研究 3. 细胞替代治疗和基因治疗的载体 62

63 干细胞治疗细胞治疗是指将正常或遗传改造过的人体细胞直接移植或输入患者体内, 以达到替代受损细胞治疗疾病的目的利用干细胞及其分化细胞进行细胞治疗是干细胞临床应用的重要研究方向目前只有少数成体干细胞 ( 骨髓干细胞移植和脐带血干细胞移植 ) 在细胞治疗上己开始取得临床疗效, 大多数的干细胞治疗还在实验阶段 63

全球已经获批的干细胞产品意大利 2015.02 Holoclar (Chiesi 公司 ) 人体自体角膜细胞中重度角膜缘干细胞缺乏日本 2016.

64 全球已经获批的干细胞产品意大利 Holoclar (Chiesi 公司 ) 人体自体角膜细胞中重度角膜缘干细胞缺乏日本 Temcell( 澳大利亚 Mesoblast) Prochymal 器官移植攻击宿主疾病国际上已有多个干细胞产品上市, 其中韩国 3 个, 美国 2 个, 比利时 1 个, 澳大利亚 1 个, 加拿大 1 个, 意大利 1 个, 日本 1 个, 中国 0 资料来源 : 64

65 干细胞治疗的应用 65

66 胚胎干细胞的应用 66

67 ips 细胞的应用 67

68 胚胎干细胞的应用 4 月 11 日, 适逢第二十一个世界帕金森日, 中国宣布国内正式备案的首批两个干细胞临床研究项目正式启动由军事医学科学院输血研究所和中科院动物研究所在郑州大学第一附属医院启动基于配型的用人胚胎干细胞分化出的神经前体细胞治疗帕金森胚胎干细胞分化出视网膜色素上皮细胞来治疗年龄相关性黄斑变性 68

69 ips 细胞的应用 69

70 干细胞治疗的应用 70

71 造血干细胞的应用 71

72 间充质干细胞的应用 730/6000 studies found for: Mesenchymal stem cell 2012 年 Osiris 公司申报 MSC 作为药品上市得到加拿大 FDA 的批准, 适应症为儿童急性激素抵抗的移植物抗宿主病 (GVHD), 随后适应症扩大为成年人 GVHD, 并在新西兰瑞士等国上市 72

73 间充质干细胞的特点高度自我增殖, 多向分化潜能低免疫源性来源丰富移植无需配型 73

74 干细胞治疗的应用定制器官是科学家和患者的共同梦想 74

75 干细胞治疗中的难点异体移植的免疫排斥反应解决途径 : 自身体细胞核移植 ( 治疗性克隆 ) 干细胞基因改造采用自身干细胞成瘤性的危险胚胎干细胞植入动物体内会形成畸胎瘤, 如何防止干细胞移植后可能因分化不彻底形成肿瘤, 是必须解决的问题解决途径 : 完善定向诱导分化方法改进筛选纯化技术 75

76 干细胞治疗的中长期安全性 76

77 中国干细胞治疗行业此前状况干细胞美容 : 世界在试验, 中国已疯狂 77

78 中国干细胞治疗行业此前状况 1. 治青光眼 : 人体实验未有结果 2. 治糖尿病 : 尚处研究阶段 3. 治疗脊椎损伤 : 正在试验中卫生部发文整顿干细胞临床研究和应用项目, 叫停未经卫生部和国家食品药品监督管理局批准的干细胞临床研究和应用 78

79 79

80 中国干细胞治疗行业目前状况 80

81 中国干细胞治疗行业目前状况 81

82 21 世纪是生命科学大发展的世纪, 干细胞研究促进了再生医学的发展, 这是继药物治疗手术治疗之后的又一场医疗革命 2009 年 11 月 3 日. 温家宝总理发表让科技引领中国可持续发展讲话 82

83 生命科学导论 -- 生物技术与生命科学 Thank you! 83

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<4D6963726F736F667420506F776572506F696E74202D20B5DAC1F9D5C220C9FACEEFB5C4B7A2D3FD> 第六章从细胞到个体第七章生物的发育第一节生殖细胞的形成与受精作用第二节胚胎发育过程第三节发育的分子机制生物的生活周期 : 世代交替 (alteration generations): 多细胞生物体的生活史中, 存在双倍体细胞和单倍体细胞