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1 Technical Applications for Scientific Research 2009 年第一期总第二期 服务科学, 世界领先

2 用你的 生命 信任我们 买一 二 送 LED-HERAEUS-FLY-0874

3 赛默飞世尔科技 (Thermo Fisher Scientific, 原热电公司 ) 是全球科学服务领域的领导者, 我们致力于帮助客户使世界更健康 更清洁 更安全 公司年销售额超过 100 亿美元, 拥有员工约 33,000 人, 在全球范围内服务超过 350,000 家客户 我们的主要客户类型包括 : 医药和生物公司, 医院和临床诊断实验室, 大学 科研院所和政府机构, 以及环境与工业过程控制装备制造商等 我们借助于 Thermo Scientific 和 Fisher Scientific 这两个主要的品牌, 帮助客户解决在分析化学领域从常规的测试到复杂的研发项目中所遇到的各种挑战 Thermo Scientific 能够为客户提供一整套包括高端分析仪器 实验室装备 软件 服务 耗材和试剂在内的实验室综合解决方案 Fisher Scientific 为卫生保健, 科学研究, 以及安全和教育领域的客户提供一系列的实验室装备 化学药品以及其他用品和服务 赛默飞世尔科技将努力为客户提供最为便捷的采购方案, 为科研的飞速发展不断地改进工艺技术, 提升客户价值, 帮助股东提高收益, 为员工创造良好的发展空间 CONTENTS 微孔板仪器 优化仪器设置和测量参数进行荧光和化学发光的动力学测量 KingFisher 磁珠纯化系统在多肽和蛋白质生物标记物 (Biomarker) 研究中的应用 利用荧光素酶报告基因测定环境中二恶英类化合物毒性 实验室自动化及细胞成像 中医药研究中的重要方法 高内涵技术 14 实验室用水 实验室用水 Q&A 17 实验室耗材 NUNC UpCell TM 最新细胞培养表面 19 环境控制 / 样品制备和保存 碳纤时代使用纯铜内胆的 CO2 培养箱预防细胞培养中的污染脐带血干细胞冷冻保存研究

4 微孔板仪器 在动力学测量中, 仪器设置和测量参数取决于荧光和化学发光的反应速度, 正确的设置是进行成功实验的关键 本文列举了过氧化氢 / 过氧化物酶检测 ( 荧光法 ) ATP 检测 ( 化学发光法 ) 钙离子检测 ( 化学发光法 ) 三种类型的动力学实验, 通过这些实例来展示如何根据反应速度来选择仪器设置和测量参数的方法 优化仪器设置和测量参数进行荧光和化学发光的动力学测量 原文 :AppliReija-Riitta Harinen, Jorma Lampinen, Marika Raitio. Thermo Fisher Scientific Oy, Vantaa, Finland. 编译 : 俞立超 在酶标仪上进行荧光和化学发光测量的优势在于可进行高通量的测量 为了获得最佳的实验结果, 反应的动力学速度将决定所需仪器的必备条件和测量参数的设置 如果需要通过向微孔板中加入试剂开始反应, 那么选择手工加入试剂 ( 如移液枪 ), 还是使用自动进样器分液, 这取决于该反应的速度 如果加入试剂后, 反应的荧光或化学发光信号迅速上升, 达到峰值后迅速下降, 那就意味着手工加样不能满足检测的需要 这是因为加样后检测的时间延迟会降低反应的检测灵敏度, 因此具有快速动力学特点的反应必须在配备有自动进样器的仪器上进行 特别的, 如果反应速度极快, 这就要求仪器不仅需要自动进样器, 而且分液位与测量位必须在同一位置, 只有这样才能保证实时跟踪反应的进程 在一些动力学测量中, 往往要求在加入试剂开始反应前先测量一段基线信号 对于这样的应用, 用户必须能够对动力学测量过程进行设置, 使得分液可以在动力学测量的特定时间点进行 对于在微孔板上进行的动力学实验, 根据需要选择进行 整板 单孔 或 组 ( 多个孔 ) 进行测量十分关键 如果属于快速动力学反应, 那么必须在完成第一个孔中的所有操作步骤 ( 如分液后读数 ) 后才能继续下一个孔的测量, 即以 单孔 的方式进行实验 否则, 当测量其它孔时, 会损失信号强度, 或将无法获得正确的动力学起飞点数据 而如果动力学之间的间隔时间足够长, 那么可以将试剂先预分至所有孔中, 然后以 整板 的方式进行测量 当然, 也可以根据反应速度, 选择多个孔构成一组, 以 组 的方式进行 分液器的设置也是十分重要的 在软件中必须能够对分液速度进行优化, 粘度越大的液体需要更快的分液速度 优化的分液速度还能保证所加入的试剂与孔中原有溶液之间的充分混合 如果分液速度过低, 将导致孔内溶液的混合效果不好, 而速度过快, 试剂就有可能溅出孔外 在当前的一些应用中, 常常包括了多个分液步骤, 这就要求仪器具有配备多个自动进样器的能力 例如, 双报告基因检测系统 DLR(Promega, USA) 需要两步的试剂分液, 因而二个自动进样器对于 DLR 实验而言是必须的 材料与方法所有的荧光和化学发光实验都在 Varioskan Flash 全波长多功能读数仪 (Thermo Scientific) 上进行 使用 SkanIt 软件 (Thermo Scientific) 进行参数设置 Amplex Red 过氧化氢 / 过氧化物酶检测试剂盒 (Invitrogen, USA) 应用于荧光的动力学检测 在过氧化物酶的存在下,Amplex Red 试剂与过氧化氢反应生成异吩恶唑酮 (Resorufin), 该化合物可通过荧光法检测, 激发光波长 550nm, 发射光波长 590nm 取 50μl 终浓度为 100μM 的 Amplex Red 和 2mU/ml 的辣根过氧化物酶 (HRP) 混合液, 加入 96 孔黑板 Microfluor 1(Thermo Scientific) 中, 进行荧光动力学检测 选择在动力学起始点或第五 个时间点加入 50μl 浓度为 10μM 的 H2O2 激活反应 使用两种类型的 ATP 检测试剂用于化学发光的动力学检测 一种是 CheckLite HS Set(Kikkoman Corp., Japan), 另一种是 ATP Biomass HS Kit(Biochemist AB, Sweden) 这两种试剂盒的反应原理都是通过萤火虫荧光素酶催化底物 D-luciferin 和 ATP 产生化学发光, 但前者属于快反应 (flash, 闪光型 ), 后者属于慢反应 (glow, 辉光型, 发光持续时间更长 ) 取 30μl 的 0.01μM ATP 加入 384 孔白板 Microlite 1+(Thermo Scientific), 然后通过自动进样器分别加入闪光型或辉光型的 30μl 试剂后开始反应 对于闪光型反应, 测量的积分时间是 1s, 动力学时间间隔为 0( 即以仪 4

5 器所具有的最小动力学时间间隔进行测量 ), 反应总时间 10min 对于辉光型反应, 积分时间是 500ms,1min 时间间隔, 反应总时间 60min( 即 60+1 个时间点 ) 另一个实例是反应速度极快的化学发光反应 应用水母发光蛋白 (Aequorin) 检测钙离子 Aequorin 是钙离子的特异性指示 剂, 可以与钙离子结合产生蓝色的化学发光信号 取 1pmol 的 AquaLite 重组 Aequorin (Invitrogen, USA) 加入 96 孔白板 Microlite 1+(Thermo Scientific) 中, 通过自动进样器加入 10μl 的 500mM CaCl2 溶液进入微孔板中激活反应 测量的积分时间是 10ms, 间隔时间 0, 反应总时间 10s 结果在不同时间点 ( 起始点和第五个动力学点 ) 加入 H2O2 激活 Amplex Red 反应的荧光动力学曲线, 如图 1 所示 在 SkanIt 软件中, 可以灵活的设置动力学过程中的分液时间点, 见图 2 选择在动力学的起始点就分液启动反应, 则检测所得的信号就是反应的荧光强度 而在第五个时间点加入试剂, 则动力学过程测得的前 4 个点数据代表的是反应的荧光本底信号水平, 软件生成的动力学曲线将自动扣减本底 图 1. Amplex Red 反应的荧光动力学曲线 RFU 表示相对荧光强度 蓝色线代表在动力学起始点就加入启动试剂, 而红色线代表在第五个动力学时间点加入试剂 图 2. 在 SkanIt 软件中, 可任意设置动力学过程中的分液时间点 闪光型和辉光型化学发光反应的动力学曲线如图 3 所示 对于闪光型反应, 化学发光信号在自动进样器分液后的 4s 达到信号的峰值, 然后化学发光信号水平迅速下降, 其信号半衰期约为 2min 这一结果表明, 对于闪光型化学发光反 应, 使用自动进样器是必须的 因为手工加样无法跟上反应的快速进行, 将会严重降低反应的灵敏度 此外, 该动力学过程必须以 单孔 的方式进行, 只有在完成一个孔的所有动力学检测后才能对下一个孔继续测量 图 3. 闪光型 (A) 和辉光型 (B) 化学发光反应的动力学曲线比较 5

6 对于辉光型反应而言, 化学发光的信号水平在一定时间内是相对稳定的 试剂加入后的 1min 内, 化学发光强度达到峰值, 之后缓慢下降, 即使是 1 小时后, 反应仍有约 70% 的化学发光信号水平 因而, 对于这样的反应, 可以对整板进行手工分液后再检测 少许的时间延迟对反应的检测并没有太大的影响 使用自动进样器分液, 对于辉光型反应, 可以获得比手工分液更好的数据重复性和可靠性 闪光型和辉光型反应的速度不同, 因而必须对软件作出相应的不同设置, 如图 4 所示 对于闪光型反应, 动力学的时间间隔必须足够短, 因此动力学读数必须按 单孔 (well loop) 的方式进行, 即在一个孔中完成所有的步骤后再继续到下一个孔 而对于辉光型反应, 分液和连续的动力学测量可以按 整板 的方式进行, 这是因为动力学之间的时间间隔足够完成所有检测孔的测量 图 4. 闪光型和辉光型化学发光反应动力学在 SkanIt 软件中的设置 水母发光蛋白 (Aequorin) 检测钙离子的化学发光反应动力学过程, 如图 5 所示 通过自动进样器加入钙离子的 0.5s 后, 反应的化学发光强度达到峰值, 随后迅速下降, 信号的半衰期为 2s 10s 反应时间后, 残留的信号水平小于 10% 对于这类反应速度极快的化学发光反应, 必须在分液后立即进行测量, 否则就会检测不到真实的化学发光反应强度 而且, 自动进样器的分液位 与测量位必须在同一位置, 只有这样才能保证真正的没有延迟的分液后测量 在 SkanIt 软件的设置中, 反应的积分时间必须设置的足够短, 如本例的 10ms, 否则会损失反应动力学的真实细节 而检测方式, 显然必须以 单孔 的方式进行 此外, 还必须保证足够快的分液速度 ( 见图 6), 以满足反应速度的要求 图 5. Aequorin 检测钙离子的化学发光反应过程 图 6. SkanIt 软件中的分液器速度设置 结果与讨论正确的荧光和化学发光的反应动力学检测取决于检测仪器的设置和测量参数 选择合适的仪器设置和优化的测量参数将能很大程度的改善反应的检测灵敏度 使用自动进样器可以帮助获得可靠的 重复性的测量结果, 消除手工分液的误差 更重要的是, 如上所述的多种反应类型, 如果没有自动进样器是不能完成检测的 赛默飞世尔科技的荣誉产品 Varioskan Flash 全波长多功能读数仪可以配备多至 3 个自动进样器, 满足多种试剂的分液需求 灵活的 SkanIt 软件, 可以根据反应的速度创建动力学程 序 测量可以在分液后立即开始, 真正的无延迟分液后测量, 这一点对于快速的动力学反应而言是至关重要的 动力学过程中的分液时间点可以根据用户的需要选择, 生成的动力学曲线将自动扣除本底的信号水平 动力学的进行方式可以灵活的选择 整板 单孔 或 组 对于快反应, 必须选择 单孔 的方式进行, 而对于慢反应, 可以按 整板 或 组 的方式进行 自动进样器的分液速度可以跟据使用的溶液类型和反应速度进行优化 以上这些选择可以帮助用户在进行基于微孔板的动力学实验时, 获得最大的检测效率和高质量的实验结果 6

7 KingFisher 磁珠纯化系统 在多肽和蛋白质生物标记物 (Biomarker) 研究中的应用 原文 :Automated Profiling and Identification of Endogenous Peptidomic Markers in Human Plasma 方法和流程 ( 见图 1): 1 基于磁珠的样本制备 ;2vMALDI 质谱采集 ; 3 数据库检测和软件分析 其中 KingFisher 96 磁珠纯化系统参与血浆中多肽样品的制备 通过疏水反向 RPC 磁珠, 选择性的分离和富集人血浆中发现的内生多肽 经过 vmaldi 质谱采集以及一种新的差异表达分析的软件 (BioSieve ), 编译 : 欧阳志荃 前言近十年来, 对生物标记物的兴趣经历爆发性的过程, 越来越多的研究开始关注多肽组质谱图特征性的变化作为不同疾病变化指示剂在医疗方面的潜在应用 在人血浆多肽组中含有约 5000 个独特的肽段 开发一种能准确鉴定多肽组中相关成分的强大的方法势在必行, 不仅可以加快对疾病生物学状态的了解, 也加强开发这些疾病生物标记的能力 该软件能自动鉴定经 vmaldi MS 质谱检测的 在统计学上具备明显变化相关信号强度的变化 这种结合和检测多肽水平变化的方法, 可以精确检测加有 6 种人工合成多肽标准品的人血浆样品 生物标志物 (Biomarker) 是指可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标, 通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程 检查一种疾病特异性的生物标志物, 对于疾病的鉴定 早期诊断及预防 治疗过程中的监控可能起到帮助作用 寻找和发现有价值的生物标记物已经成为目前研究的一个重要热点,DNA,RNA, 蛋白质, 小分子多肽, 糖类作为分子标记物已经大量用于基础和疾病诊断研究和应用, 基于多肽和蛋白质生物标记物的蛋白组表达模式诊断是一种很有前景的疾病早期检测 Thermo Scientific 联合马赛诸赛州综合医院建立了 Biomarker Research Initiative in Mass Spectrometry (BRIMS) 中心, 该中心建立了基于磁珠的色谱分离技术研究血清中的分子标记, 以一种简单 有效和可重复的方式每天处理上百的样品 采用基于疏水相互作用的反相 RPC 磁珠 (Reverse Phase Chromatography,Dynabeads RPC18) 可以从血浆样品中结合多肽片段, 经乙氰洗脱, 获得高质量的肽段表达谱 通过比较不同条件下肽段表达图谱的差异, 以寻找潜在的可能血浆生物标志物 本文介绍 BRIMS 中心基于全自动磁珠的色谱分离技术从人血浆中分离鉴定内生多肽谱标记物的研究, 发展一种自动化 基于 vmaldi 技术和计算软件的从人血浆中内生肽差异分析 图 1.(A) 工作流程,(B) 常规质量范围 ( m/z) 和 (C) 高质量范围 ( m/z)vmaldi 人血浆质谱图, 血浆经疏水相互作用的反相 RPC 磁珠富集, 星号标记的是加入的多肽标准品 7

8 实验过程和结果 : 一 样品自动化准备为了模拟在人血浆中的时间流程试验, 血管紧缩素 I(Angiotensin I), 纤连蛋白片段 ( fibronectin fragment)( ), 蛙皮素 (bombesin),acth 片段 (18-39) 胰血糖素 (glucagon ) 和氧化的胰岛素 B 链 (oxidized insulin B chain)(sigma, St. Louis, MO) 等 6 种多肽标准品按以下不同浓度被加入到解冻的人血浆中 : 两个多肽浓度按 2 倍递减, Angiotensin I (640-20fmol/μL), glucagon (64 -.2pmol/μ L), 两个多肽浓度按 2 倍递增 fibronectin (30-960fmol/μL), ACTH ( fmol/μ L), 两个多肽浓度固定 bombesin (300fmol/μL),Insulin B chain oxidized (1600fmol/μL), 产生 6 种不同的血浆样本 将加有多肽的血浆样品置于冰上直至分层 将所有 6 种经处理的样品各取 25ul 加到 96 孔板中, 并设置未加多肽标准品的血浆作为阴性对照, 含血浆样品的 96 孔板放入 KingFisher96 磁珠分离系统进行处理, 通过专利的磁珠转移技术, 将磁珠从一个孔收集后转移到另一个孔, 再释放磁珠, 自动富集血浆中的内生多肽和多肽标准品 在磁珠分离富集过程中, 每个样品孔中加入 50ul 反相 RPC 磁珠, 结合 2 分钟后, 吸取磁珠, 转移到洗涤液中, 共洗涤三次, 每次 30 秒钟 洗涤后洗脱磁珠上的多肽片段, 洗脱液为 25ul 含 0.1% 甲酸的 50% 乙腈溶液中, 并将磁珠转移, 得到富集的血浆多肽溶液 得到的样品可以直接点样到 vmaldi 板上, 通过 Finnigan LTQ linear ion trap fitted with a vmaldi source 和 Finnigan TSQ Quantum HR triple quadrupole MS (Thermo Scientific, San Jose, CA) 进行快速 LC-SRM 分析 二 软件的数据处理分析通过磁珠纯化富集, 在人血浆中加入 6 中人工多肽标志物, 其中 ACTH ( fmol/μ L) 按 2X 递增, glucagon (64 -.2pmol/μL) 按 2X 递减,Insulin B chain oxidized (1600fmol/μL) 浓度保持不变, 产生 6 种不同的血浆样本检测水平 ( 见图 1) 每种水平的样品点样 11 次, 产生 66 个质谱数据 vmaldi MS 的数据收集起来通过 BioSieve 分析, 自动从多重 LC/MS 样品套数据中分析 MS 图谱相关变化, 结果见图 2 和图 3 样品自动化准备 :KingFisher 血浆多肽及检测流程图 磁珠纯化和富集人 8

9 图 2:(A)Thermo Scientific Finnigan TSQ Quantum ( m/z, m/z, -21 V, 1.5 mtorr) 对纤连蛋白 (fibronectin) 的 LC-SRM 定量校正曲线 ;(B) 血浆中纤连蛋白肽段的回收量增加与标准品加入量增加同步 图 3:vMALDI MS 的数据经 BioSieve 分析结果 9

10 总结采用基于疏水相互作用的反相 RPC 磁珠和 KingFisher96 全自动磁珠纯化系统的自动化样品处理过程, 可以从血浆样品中可重复的富集多肽片段, 这种富集方法保留了相关的丰富的信息, 完全满足高通量差异分析的需求 可以精确鉴定和检测一个单一扫描样品在 统计学上的显著变化, 检测范围达到 25-50fmol 每个样品点的水平, 这个变化来自于在一系列标准品加入到一个复杂的混合物中 ( 通过磁珠富集血浆中的多肽 ) 的反应 通过这个平台, 可以进行差异和趋势分析, 以追踪单个多肽在复杂混合物中的水平改变 结论生物标记物的研究和开发, 尤其是与人类疾病相关的标记物的研究, 已经成为热点 在多肽和蛋白质的标记物研究过程中, 样品的前处理成为一个很重要的环节, 磁珠富集法已经成为蛋白质组表达谱研究中制备样品的强有力工具, 适合血清 血浆 尿液 脑脊液 关节腔滑液 支气管洗脱液 细胞裂解液 组织提取物和各种分泌物等样本 Thermo Scientific 的 KingFisher 磁珠纯化系统, 以创新专利的磁珠分离技术, 在不同的纯化阶段 磁珠与样品结合 清洗以及目标物洗脱等过程中采用磁棒通过磁珠转移纯化对象, 避免了液体处理过程, 提高了自动化程度, 使之成为一种可靠和强大的分离纯化技术 ; 可以 从各种来源的材料如全血, 细胞培养液, 组织裂解液, 土壤, 排泄物等中间提取纯化目标分子, 包括 DNA,RNA, 蛋白质, 多肽片段, 细胞等 KingFisher 磁珠纯化系统提供一个开放的平台, 所有商业化的磁珠如表面标记疏水 亲水 阳离子 阴离子 弱阳离子 弱阴离子 金属离子鳌合 ( 如 Cu Fe) 带有 ConA 和蛋白 G 的磁珠都可以在该仪器上运行, 自动富集多肽片段, 以满足高通量多肽和蛋白质生物标记物研究的样品制备 Thermo Scientific 为生物标志物的开发提供从样品处理, 分离, 鉴定等一系列研究仪器和相关分析软件的整体解决方案, 包括离心机, 移液器, 磁珠纯化系统, 样品处理耗材, 质谱及分析软件等 参考文献 1 T. Richmond1, M. Askenazi1, J. Sutton1, L. Bonilla1, Automated Profiling and Identification of Endogenous Peptidomic Markers in Human Plasma 2 Villanueva, Anal. Chem. 2004, 76, Angelo Depalma,Biomarkers: Biologists Best Friends, Drug Discovery & Development 4 Ana Villar Garea,Matthias G,Axel I.Biomarker discovery from body fluids using mass spectrometry[j].j Chromatogr B,2007,849: Aldred S,Grant MM,Griffiths HR.The use of proteomics for the assessment of clinical samples in research[j].clin Biochem,2004,37:

11 作者简介 : 宋茂勇, 男, 博士, 副研究员, 中科院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室北京主要从事环境毒理学研究电话 : 二恶英类化合物 (dioxin-like compounds) 是二恶英 (dioxins) 和多氯联苯 (PCBs) 的统称 二恶英是两类化学结构和毒理学性质相似的三环多氯代芳香烃类化合物的简称, 包括多氯代二苯并 - 对 - 二恶英类 (PCDDs) 和多氯代二苯并呋喃 (PCDFs) 二恶英类化合物在环境样品中的含量往往是痕量的, 一般在 pg/g 或 pg/l 的水平甚至更低 二恶英类化合物的化学检测方法主要是采用气相色谱来进行分离, 多种检测器都曾用来进行检测, 包括 ECD FID AED MS 和 MS/MS 等, 但与 MS 联用检测是最常用的方法 要对复杂基质中二恶英类化合物进行 pg/g 水平准确地定性和定量, 同位素稀释 / 高分辨气相色谱 / 高分辨质谱联用法 (HRGC/HRMS) 是必不可少的手段 Mclachlan 提出了一种利用重组受体 / 报告基因来检测和评价受体介导毒物的体外检测方法 目前二恶英类化合物生物学检测法基本上都利用二恶英致毒机理, 即二恶英类化合物与 Ah 受体结合的特性, 进而检测表达效应 利用培养的细胞或重组的细胞, 最常用的如大白鼠肝癌细胞 (H4IIE), 模拟活体效应, 快速实现生物检测 最近发展起来的化学诱导荧光素酶表达检测法 (CALUX) 已经被很多机构用来进行大规模的二恶英类化合物的筛选 本文以转录了由 AhR 调控的荧光素酶报告基因的大鼠杂交肝瘤细胞 (H4IIE) 和 Varioskan Flash 多功能读数仪为技术手段, 测定环境样品的二恶英类毒性 1 实验部分 1.1 实验材料主要试剂及缓冲液 : DMEM 培养基 (Dulbecco s Modified Eagle s Medium,Sigma) 不含 Ca 2+ 和 Mg 2+ 的 PBS 缓冲液 (10L): 2.0g KCl, 2.0g KH2PO4, 80.0g NaCl, 11.5g Na2HPO L H2O 含 Ca 2+ 和 Mg 2+ 的 PBS 溶液 :1L PBS+0.1g (anhydrous) 无水 CaCl2+0.1g MgCl2.6H2O 胰岛素 -EDTA 溶液 (Sigma, St. Louis, MO): 10 倍浓度母液用 PBS 稀释到 1 倍浓度 ( 用于细胞培养时使细胞从培养皿壁上脱离, 悬浮细胞 ) 细胞生存测定试剂盒 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (L-3224,Molecular Probes, Invitrogen, Eugene, OR) LucLite TM 荧光素酶分析试剂盒 (Packard Instruments 1000 assay kit; Meriden, CT) TCDD 标准品 (Sigma) 主要仪器 : CO2 培养箱 (Thermo Scientific) Varioskan Flash 全波长多功能读数仪 (Thermo Scientific, 包括 LumiSens 化学发光模块,2 个自动进样器 ) 1.2 样品采集被测物为国内某市排污河底泥样品 所有底泥样品用不锈钢铲采泥器取自河底表层泥 (<10cm), 装入事先经正己烷冲洗过的玻璃瓶中, 并用铝箔纸封口保存在 -20 的冰箱中 1.3 样品处理首先将底泥样品匀浆后冷冻干燥, 干燥后的底泥经过研磨过 63µm 的微孔筛使样品颗粒均匀 取 5g 过筛后的底泥样品与 10g 硅胶 (Merck,60 目 ) 和 15g 无水硫酸钠混合均匀 最后与 10g 活化后的铜粉混合后索氏提取 16 小时 提取溶剂为 300 ml1:1 混合的二氯甲烷与正己烷 空白对照中只含有铜粉 无水硫酸钠和硅胶 提取完成后提取物通过旋转蒸发和氮吹浓缩, 最后样品转移到正己烷中并浓缩到 1mL 浓缩后的样品通过 10g 的弗罗里土 ( 目,Sigma) 色谱柱进行组分分离, 弗罗里土事先经过 400 烘箱过夜处理 分离过程依照 Hilscherova 方法进行 500µL 索氏提取的样品经过弗罗里土柱分离后, 各组分转移到正己烷中并定容至 1mL 备用 1.4 细胞暴露细胞培养至丰度达到 80% 后可开始暴露 用于标准对照的 TCDD 采用 3 倍稀释的 6 个浓 Varioskan Flash 全波长多功能读数仪对于以下测量具有极其优异的灵敏度 : 荧光强度测量 化学发光强度测量 时间分辨荧光强度测量 比色测量 以上测量均可进行全波长波谱扫描 11

12 度, 为 pg well -1 提取物与各组分以体积稀释 6 个浓度, 取各个浓度的提取物或组分 2.5 μl 加入需测定孔中, 用移液枪吸头混匀 ( 注意不要破坏细胞 ), 每个浓度做三个平行 为减少实验的误差和便于计算各部分的 TCDD 当量, 每张 96 孔板上都同时测定 TCDD 标准 溶剂对照和空白对照 未加样品的孔中加入 PBS 溶液保证板内的湿度和减少检测时边缘效应的影响 加样后的 96 孔板放于二氧化碳培养箱连续暴露 3 天 暴露过程中要随时观察细胞是否受到污染 1.5 细胞毒性的检测高浓度的目标化合物或者环境样品提取物中的未知成分会对 H4IIE 细胞株产生细胞毒性, 导致细胞死亡 这样得到的数据不能够真实的反应 H4IIE 细胞株对被测物质的响应 因此, 只有那些没有或者有较低细胞毒性作用的响应值才能用于被测物毒性当量的计算 本实验中细胞毒性由 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit 测定 该试剂盒中包括两种染料 : 多聚阴离子钙黄绿素和溴化乙啶 钙黄绿素能与活细胞的细胞膜结合而不被洗脱, 结合物在紫外的激发下发出强烈的绿色荧光 ( 激发波长 / 发射波长 ~495nm/~515nm); 溴化乙啶能够与发生溶解的死细胞的 DNA 结合形成二聚体, 在紫外下发出红色荧光 ( 激发波长 / 发射波长 ~495nm/~635nm) 两种荧光强度的比值能间接反映活细胞和死细胞的数量变化 该测定于荧光素酶活性的测定之前进行, 两种染料并不影响荧光素酶的测定结果 1.6 荧光素酶活性的检测测定前配制检测溶液, 将 LucLite TM 分析试剂盒中的检测试剂按照 7.8g/10mL 的浓度溶于缓冲液中 ( 试剂盒中提供 ), 按照 75 μ L/assay 的剂量进行配制 测定时先把 96 孔板中的培养液倒出, 加入 120 μl PBS 溶液清洗 96 孔板三遍 将 PBS 溶液甩干后加入 75μL 含有 Ca 2+ 和 Mg 2+ 的 PBS 溶液, 再加入 75μL 配制好的荧光素酶检测试剂, 室温下放置 20 分钟进行反应 荧光素酶的活性由 Varioskan Flash 全波长多功能读数仪测定, 每板以最高浓度的 TCDD 浓度的响应为参考 1.7 数据分析 TCDD 和被测物的在不同浓度的响应值 ( 荧光素酶的活性 ) 可以得到剂量 - 响应曲线 (dose-response curve), 目标化合物或者环境样品提取物的毒性大小通过与标准物质 TCDD 的响应比较而得到 TCDD-EQ 或者 RPF 本实验依照 Villeneuve[14] 所表述的方法计算被测物的毒性当量 2.1 方法评价考虑到 96 孔板存在的差异, 在每次测定中, 样品与 TCDD 标准曲线和空白对照 溶剂对照点在同一张板上 样品的测定结果用标准物质 TCDD 的最大响应值的百分比 (%TCDDmax) 表示, 其毒性当量的计算通过与标准曲线对照而得出 因此,H4IIE 细胞株的稳定性至关重要 图 1 是不同板上 TCDD 标准曲线的比较, 从图上可以看出, 尽管每张板上 TCDD 的最高响应值会有些变化, 但其 EC50 基本稳定 对于 H4IIE 细胞株测定方法的精密度有着不同的要求 Tillitt 和 Tysklind 等人测定 H4IIE 细胞株对 TCDD 的 EROD 活性时,CV 在 25%-35% 之间 Villeneuve 等人测定 H4IIE 细胞株对 TCDD 的荧光素酶活性时,CV 小于 20% 本实验对标准 TCDD 和提取物测定时, CV 在 5%-20% 之间 %TCDDmax EC TCDD Concentration pg well -1 图 1 不同 96 孔板中 TCDD 标准曲线的比较 2.2 检测限 灵敏度和 EC50 H4IIE 生物分析法中的检测限根据化学联合会 (IUPAC) 定义的方法计算, 即被测物高于空白对照值 3 倍标准偏差的最低浓度 本实验中 H4IIE 细胞株对标准 TCDD 的检测限为 0.16 pg well -1 (0.05 fmol well -1 ) 在本实验中, 标准 TCDD 在 H4IIE 生物分析法中的 EC50 为 2.52±0.49 pg well -1 (0.80±0.16 fmol well -1 ) H4IIE 细胞株对底泥提取物显示了很强的灵敏度,0.01µL well( -1 相当于 0.5mg 的底泥提取物 ) 的样品量就足以引起显著的响应 2.3 样品的细胞毒性 11 个样品采用 6 个稀释浓度进行测定, 每孔分别为 2.5µL 0.83µL 0.25µL 0.09µL 0.03µL 和 0.01µL 当总提取物含量超过 11% (0.28 µl extract well -1, 总体积为 250µL) 时, 总提取物对 H4IIE 细胞株产生明显的细胞毒性 总提取物含量为 0.49%-3.7%(0.01 µl well -1 至 0.09 µl well -1 ) 的暴露孔中未检测到细胞毒性 在暴露实验开始阶段,H4IIE 细胞的丰度大于 12

13 80%, 如果被测样品对 H4IIE 细胞具有致死效应, 暴露终止阶段的 H4IIE 细胞丰度会小于 80% 甚至更低, 通过显微镜可以清楚地观察到这一结果 有些样品虽然对 H4IIE 细胞并无致死作用, 却可以抑制其生长 死细胞和活细胞变化的比例可以指示被测物毒性的影响 2.4 总提取物 (SCE) 中二恶英类化合物的生物活性底泥提取物对 H4IIE 细胞株诱导产生的荧光素酶的活性大小以每张 96 孔板上的标准 TCDD 诱导的荧光素酶最高值的百分比表示, 即 %TCDDmax 底泥提取物诱导 H4IIE 细胞株产生的荧光素酶的最大值如图 2 所示 其中最大值为 63.5% TCDDmax 由于细胞毒性的缘故, 只有两个样品的响应值超过了 50% TCDDmax, 只有一个样品的响应值未达到 20% TCDDmax 图 2 H4IIE 细胞对底泥样品总提取物的响应值根据该市环境质量报告,2002 年流经该区域的工业废水达到了 吨 仅一个污水处理厂每天就要向该排污河 吨废水, 有将近 65% 的生活污水经过该排污河进入渤海 这些污水是该流域底泥中具有较高的二恶英类化合物的生物活性的可能来源之一 我们利用基于 H4IIE 细胞株的体外实验得到的底泥中二恶英类化合物的生物活性与已经报到的某些区域底泥中的二恶英类化合物的生物活性大体相当, 如英国河口 ( ng TCDD-EQ g -1 dw) 和捷克河湾 ( ng TCDD-EQ g -1 dw) 2.5 各组分中二恶英类化合物的生物活性 5 个具有较高荧光素酶诱导活性的底泥提取物经过弗罗里土柱分离得到的三个组分, 各个组分同样以 6 个稀释浓度进行 H4IIE 细胞株诱导产生荧光素酶的测定 各组分的最高响应值见图 3: 图 3 H4IIE 细胞对弗罗里土柱分离后各组分的响应值第一组分中主要是 PCBs 和 PCDD/PCDFs 这些物质大部分具有很强的 AhR 活性, 也就是说, 这部分物质对 H4IIE 细胞株具有很强的荧光素酶诱导能力 但这部分物质并不是底泥中二恶英类化合物生物活性的主要来源 一是因为具有细胞毒性的化合物也存在于这一组分中, 这些有毒化合物是否影响 PCBs 和 PCDD/PCDFs 对荧光素酶的诱导产生并不清楚 另一方面,PCBs 和 PCDD/PCDFs 在环境中以较低的浓度存在, 该浓度还不足以对 H4IIE 细胞株诱导产生大量的荧光素酶 此外,PCBs 和 PCDD/PCDFs 混合物对彼此间与 AhR 结合能力的影响还没有明确的实验结果 对 H4IIE 细胞株具有较强的荧光素酶诱导作用存在于第二和第三组分中 在第二组分中主要是 PAHs 和其衍生物 有机氯农药以及烷基化合物等 一些 PAHs, 例如 benzo(a)pyrene (BAP), dibenz(a,h)anthracene (DBA), benzo (a)anthracene (BA), benzo(k)fluoranthene (BkF), benzo(b)fluoranthene (BbF), chrysene (Chr), and indeno(1,2,3-c,d)pyrene (IdP), 都具有相对较强的 AhR 结合能力, 并诱导 H4IIE 细胞株产生荧光素酶 而且这类化合物已经证明在该流域具有很高的浓度 第二组分经过浓硫酸处理 ( 去除 PAHs) 后, 其诱导 H4IIE 细胞株产生的荧光素酶活性大大降低 ( 接近检测限 ) 因此可以看出,PAHs 是第二组分中诱导荧光素酶产生的主要物质 而第三组分中主要是一些极性化合物, 这些未知化合物如何诱导荧光素酶的产生目前并不清楚 从表 1 中可以看到, 通过 H4IIE 细胞株测定的二恶英毒性远大于其它三个组分测定的二恶英毒性的总和 化合物之间可能存在的联合效应是产生此结果的主要原因 结论与展望在环境中, 污染物常常是以同类物 (congers) 异构体 (isomer) 或多种物质混合的形式存在 在这些 混合物 中, 各种物质的浓度和毒性可能存在着数量级上的差别 另外, 不同种类的物质混合在一起, 可能会产生新的毒性或毒性强弱的变化 这样以来, 使这些 混合物 的危险评价和风险评估变得更加复杂 因此, 每一种分析方法或者评估体系都不免会存在各种各样的特点和缺点 化学分析 ( 仪器分析方法 ) 能够准确的了解 混合物 中各种成分的组成和含量, 但是难以表征这些组成的毒性和生物活性, 尤其是 混合物 的毒性大小 有一些潜在的 重要污染物 并未得到准确地分析, 原因是缺少适合的分析方法或分析用的标准物质 换一句话说, 仪器分析的方法只是适用于那些具有可靠分析技术和标准的污染物 体外细胞试验作为一种快速灵敏而且分析成本相对化学分析低的分析方法, 它能够评价环境介质提取物中通过相同作用途径或模式的化合物的总毒性 体外细胞试验通常在 96 孔板中进行, 高通量的特点使它成为一种理想的大规模的筛选工具, 通过体外细胞试验可以研究某一种单一化合物的毒性或多种化合物的复合毒性 13

14 实验室自动化 及细胞成像 中医药研究中的重要方法 高内涵技术 访上海中医药大学刘成海研究员 农历己丑年正月初五 当人们还沉浸在新年的喜悦 中 忙碌着四处拜年时 上海中医药大学肝病研究 所的工作人员却已经投入紧张的工作中了 研究员 刘成海老师说 一年之际在于春 我们搞科研工 作的 春节长假正是我们静心梳理 潜心钻研的好 时机 普普通通的一句话 却清楚地折射出了一位 刘 没错 就是这样 编辑 那么高内涵技术有哪些技术特点 呢 刘 高内涵技术可以以活体细胞为模型 实时 动态地进行观测 适合于成分与复合物等 多种形式的样品 它具有多通道 多靶点 高通 量的特点 即在一次实验中 不仅可以同时检测 大量的样本 保持传统高通量筛选的特性 而 且针对每一个样本可设计多达 6 个的多靶点同 步分析 通过一次实验 可在线同时获得细胞的 多项变化指标 来进行药效的综合评价和相互 影响评价 既提高了获取数据的效率 又增加了 数据的准确性与可靠性 科研学者身上所肩负的那种责任和使命 我不禁被 编辑 那就是说在同一时间做了许多事 情 事半功倍了对吧 这种崇尚知识的态度和敬业勤勉的精神所感动 带 着这份感动 我们开始了此次关于高内涵在中医药 领域中应用的采访 刘 可以这么说 编辑 刘老师 您从事肝病研究多久了 刘 从接触学习到不断尝试 始终在肝病 领域 临床科研 科研临床 不觉间已是 20 多个 春秋虚度 编辑 这么多年的工作 带给您最大的感 受是什么 刘 中医药是我们祖先千百年医疗实践 的智慧结晶 是我国独具原创特色的优势学科 之一 学习好中医药基本理论知识 为广大病患 解除病痛 传承和发扬这项伟大的事业 是令人 自豪的事业 然而 随着当今社会生活与科学技 术的发展 中医药也需要与时俱进 在现代化进 程中 中医药的研究显得相对滞后 如何采用先 进的技术 建立适合中医药学复杂特点的创新 研究方法 发现中药有效物质 科学评价中药毒 性 阐明中药作用机理等 以促进创新药物及其 中医药理论的发展 是时代赋予我们的重大使 命与机遇 编辑 中医药学理论博大精深 在研究方 法与手段上有哪些特点呢 刘 自主创新 方法先行 作为我国原 创的中医药学 其科学思维与方法论较之西方 医学有其明显的特点 也正是由于这种特点 中 医药学作为一门完整的学科在历史长河中逐渐 形成与发展壮大 中医注重 整体观念与辨证论 14 治 中药是在中医理论指导下的具体应用 其 本身具有有效物质多组分 作用机制多环节等 特点 因此 在采用现代科技手段研究中药时要 充分考虑中药这种 二多 的复杂特点 以组学 为主的系统生物学方法为中医药研究提供了良 好的技术 而对于中药研究 高通量 高内涵 多 靶点 多通道的分析方式是较好的重要研究方 法之一 也体现了复杂多变与整体联系的系统 生物学特点 事实上 不仅对中医药的研究 对现代生 物学研究 往往也是一种系统的工程 例如细胞 信号通路的研究 就如同一张复杂的蜘蛛网 彼 此关联 此渗透 环环相连 缺一不可 我们实 验室使用的高内涵活细胞分析系统就是采用这 类分析模式进行研究的工具 编辑 您提到了高内涵分析 能具体跟我 们介绍一下什么是高内涵技术吗 刘 高 内 涵 技 术 最 早 是 由 美 国 Cellomics 公司提出 它是一种集合了微孔板 读数 荧光成像术 流式细胞术与生物信息学的 综合技术 可在保持细胞结构和功能完整性的 前提下 尽可能同时检测被筛样品对细胞形态 生长 分化 迁移 凋亡 代谢途径及信号转导等 多个环节的影响 从单一实验中获取大量相关 的信息 确定其生物活性和潜在毒性等 编辑 也就是说高内涵技术在细胞学基 础上开发出的一种现代化的分析手段 是吗 编辑 在药物开发上 高内涵技术又有哪 些优势呢 刘 我们知道药物开发往往需要经历很 长时间的探索过程 这其中包括初筛 药效评 价 毒理分析 临床等复杂繁琐的过程 加大筛 选的范围与内容 提高候选药物的命中率 是缩 短药物研发时间与耗费的重要一环 高内涵技 术在药物开发方面最大的优势在于变 串行 研 究模式为 并行 研究模式 将以往耗时耗力的 连串工作同时使用仪器完成 使研究人员在新 药研究的早期阶段就能获得活性化合物对细胞 的多重效应的详细数据 提高药物后期开发的 成功率 减少了开发成本和时间 可以说 高内 涵技术标志着创新药物的研究策略和技术手段 进入了一个崭新的发展阶段 对于在创新药物 研究中应用系统生物学思想 建立后基因组时 代的药物研究新模式都具有重要意义 编辑 高内涵技术应用于中药的研究开 发上 例如对于成分更为复杂的中药 有哪些优 势呢 刘 我们知道中药有几大特点 第一 有 效物质的多样性 临床有效中药尤其是中药复 方 往往在部位 组分与成分各层次上具有多个 有效物质 这些物质可具有不同的药理活性特 点 第二 有效组分 成分 的协同配伍作用 一 个有效的中药 有其内在的有效组分 成分 的 配伍组合 这种组合不仅具有质的不同 而且往 往具有量的规定 即优化的量比组合 第三 毒 效相关性 复杂的中药成分 不仅具有有效物 质 也存在毒性物质 而且 由于应用范围与剂 量等的变化 毒效物质可相互转化 去粗存精 去毒增效 是我们 古为今用 创新研发中药的 重要目标 细胞水平的传统单靶点筛选模式 不尽适 合中药功能研究的复杂性与特殊性 例如 MTT 法即不适合黄酮类中药物质的细胞毒性评价 基于蛋白质分子水平的靶点筛选 由于多组分 成分的干扰 不适合提取物与部位的活性追踪 筛选等 基于动物水平的筛选 显然存在 高通 量 上的局限 因此 基于中药的这种复杂特性 我们十分需要在方法学上创新 高内涵筛选的 细胞水平 与微量 高效 综合等特点 适合复杂 中药的大样本 多组成 多水平的筛选评价研 究 是研究中药的理想技术方法之一 当然 我 们也需要在中药的细胞培养受试体系等方面改 进 如渗透压与 ph 值等 避免高内涵技术在中 药应用上的 水土不服 以 洋为中用 促进中 药研究发展 编辑 那么您觉得高内涵技术和其他的 一些现有设备技术有什么显著区别呢 刘 目前较为常用的研究手段包括 显 微镜 电泳 酶标仪和流式细胞仪等 这些都是 开展研究所必需的 有其优良的性能与应用特 点 但也具有其局限性 例如显微镜 尤其是激光共聚焦显微镜 可以很好的观察细胞的形态及其细胞内物质的 相互关系等 但是较难做到多通道 多靶点的高 通量定量数据分析 电泳和酶标仪获得的结果 往往是从多个细胞中获得的一个总数据 对于 具体的单个细胞不能逐个分析 亦为单靶点检 测 流式可以进行单细胞的研究 但是对于细胞 要求比较高 难以针对贴壁细胞进行研究 对于 多样品 多靶点的综合研究 上述的仪器设备均 存在局限性 而高内涵技术能够弥补这些常规 仪器的不足 操作简便而功能全面 成为我们研 究的重要武器 在显微镜 电泳 酶标仪和流式 细胞仪等设备的基础上 开展高内涵技术 可大 大提高我们的研究效率与水平 编辑 了解了高内涵技术的这么多优点 刘老师再给我们介绍一下它的应用吧 刘 高内涵在药物毒性评价 药效筛选与 机制研究等各方面中有广泛的应用 我们目前 主要进行了中药成分的毒性评价 抗细胞凋亡 药效筛选与药物调节 NF-κB 活性机制研究等 15

15 实验室自动化 及细胞成像 中医药研究中的重要方法 高内涵技术 访上海中医药大学刘成海研究员 农历己丑年正月初五 当人们还沉浸在新年的喜悦 中 忙碌着四处拜年时 上海中医药大学肝病研究 所的工作人员却已经投入紧张的工作中了 研究员 刘成海老师说 一年之际在于春 我们搞科研工 作的 春节长假正是我们静心梳理 潜心钻研的好 时机 普普通通的一句话 却清楚地折射出了一位 刘 没错 就是这样 编辑 那么高内涵技术有哪些技术特点 呢 刘 高内涵技术可以以活体细胞为模型 实时 动态地进行观测 适合于成分与复合物等 多种形式的样品 它具有多通道 多靶点 高通 量的特点 即在一次实验中 不仅可以同时检测 大量的样本 保持传统高通量筛选的特性 而 且针对每一个样本可设计多达 6 个的多靶点同 步分析 通过一次实验 可在线同时获得细胞的 多项变化指标 来进行药效的综合评价和相互 影响评价 既提高了获取数据的效率 又增加了 数据的准确性与可靠性 科研学者身上所肩负的那种责任和使命 我不禁被 编辑 那就是说在同一时间做了许多事 情 事半功倍了对吧 这种崇尚知识的态度和敬业勤勉的精神所感动 带 着这份感动 我们开始了此次关于高内涵在中医药 领域中应用的采访 刘 可以这么说 编辑 刘老师 您从事肝病研究多久了 刘 从接触学习到不断尝试 始终在肝病 领域 临床科研 科研临床 不觉间已是 20 多个 春秋虚度 编辑 这么多年的工作 带给您最大的感 受是什么 刘 中医药是我们祖先千百年医疗实践 的智慧结晶 是我国独具原创特色的优势学科 之一 学习好中医药基本理论知识 为广大病患 解除病痛 传承和发扬这项伟大的事业 是令人 自豪的事业 然而 随着当今社会生活与科学技 术的发展 中医药也需要与时俱进 在现代化进 程中 中医药的研究显得相对滞后 如何采用先 进的技术 建立适合中医药学复杂特点的创新 研究方法 发现中药有效物质 科学评价中药毒 性 阐明中药作用机理等 以促进创新药物及其 中医药理论的发展 是时代赋予我们的重大使 命与机遇 编辑 中医药学理论博大精深 在研究方 法与手段上有哪些特点呢 刘 自主创新 方法先行 作为我国原 创的中医药学 其科学思维与方法论较之西方 医学有其明显的特点 也正是由于这种特点 中 医药学作为一门完整的学科在历史长河中逐渐 形成与发展壮大 中医注重 整体观念与辨证论 14 治 中药是在中医理论指导下的具体应用 其 本身具有有效物质多组分 作用机制多环节等 特点 因此 在采用现代科技手段研究中药时要 充分考虑中药这种 二多 的复杂特点 以组学 为主的系统生物学方法为中医药研究提供了良 好的技术 而对于中药研究 高通量 高内涵 多 靶点 多通道的分析方式是较好的重要研究方 法之一 也体现了复杂多变与整体联系的系统 生物学特点 事实上 不仅对中医药的研究 对现代生 物学研究 往往也是一种系统的工程 例如细胞 信号通路的研究 就如同一张复杂的蜘蛛网 彼 此关联 此渗透 环环相连 缺一不可 我们实 验室使用的高内涵活细胞分析系统就是采用这 类分析模式进行研究的工具 编辑 您提到了高内涵分析 能具体跟我 们介绍一下什么是高内涵技术吗 刘 高 内 涵 技 术 最 早 是 由 美 国 Cellomics 公司提出 它是一种集合了微孔板 读数 荧光成像术 流式细胞术与生物信息学的 综合技术 可在保持细胞结构和功能完整性的 前提下 尽可能同时检测被筛样品对细胞形态 生长 分化 迁移 凋亡 代谢途径及信号转导等 多个环节的影响 从单一实验中获取大量相关 的信息 确定其生物活性和潜在毒性等 编辑 也就是说高内涵技术在细胞学基 础上开发出的一种现代化的分析手段 是吗 编辑 在药物开发上 高内涵技术又有哪 些优势呢 刘 我们知道药物开发往往需要经历很 长时间的探索过程 这其中包括初筛 药效评 价 毒理分析 临床等复杂繁琐的过程 加大筛 选的范围与内容 提高候选药物的命中率 是缩 短药物研发时间与耗费的重要一环 高内涵技 术在药物开发方面最大的优势在于变 串行 研 究模式为 并行 研究模式 将以往耗时耗力的 连串工作同时使用仪器完成 使研究人员在新 药研究的早期阶段就能获得活性化合物对细胞 的多重效应的详细数据 提高药物后期开发的 成功率 减少了开发成本和时间 可以说 高内 涵技术标志着创新药物的研究策略和技术手段 进入了一个崭新的发展阶段 对于在创新药物 研究中应用系统生物学思想 建立后基因组时 代的药物研究新模式都具有重要意义 编辑 高内涵技术应用于中药的研究开 发上 例如对于成分更为复杂的中药 有哪些优 势呢 刘 我们知道中药有几大特点 第一 有 效物质的多样性 临床有效中药尤其是中药复 方 往往在部位 组分与成分各层次上具有多个 有效物质 这些物质可具有不同的药理活性特 点 第二 有效组分 成分 的协同配伍作用 一 个有效的中药 有其内在的有效组分 成分 的 配伍组合 这种组合不仅具有质的不同 而且往 往具有量的规定 即优化的量比组合 第三 毒 效相关性 复杂的中药成分 不仅具有有效物 质 也存在毒性物质 而且 由于应用范围与剂 量等的变化 毒效物质可相互转化 去粗存精 去毒增效 是我们 古为今用 创新研发中药的 重要目标 细胞水平的传统单靶点筛选模式 不尽适 合中药功能研究的复杂性与特殊性 例如 MTT 法即不适合黄酮类中药物质的细胞毒性评价 基于蛋白质分子水平的靶点筛选 由于多组分 成分的干扰 不适合提取物与部位的活性追踪 筛选等 基于动物水平的筛选 显然存在 高通 量 上的局限 因此 基于中药的这种复杂特性 我们十分需要在方法学上创新 高内涵筛选的 细胞水平 与微量 高效 综合等特点 适合复杂 中药的大样本 多组成 多水平的筛选评价研 究 是研究中药的理想技术方法之一 当然 我 们也需要在中药的细胞培养受试体系等方面改 进 如渗透压与 ph 值等 避免高内涵技术在中 药应用上的 水土不服 以 洋为中用 促进中 药研究发展 编辑 那么您觉得高内涵技术和其他的 一些现有设备技术有什么显著区别呢 刘 目前较为常用的研究手段包括 显 微镜 电泳 酶标仪和流式细胞仪等 这些都是 开展研究所必需的 有其优良的性能与应用特 点 但也具有其局限性 例如显微镜 尤其是激光共聚焦显微镜 可以很好的观察细胞的形态及其细胞内物质的 相互关系等 但是较难做到多通道 多靶点的高 通量定量数据分析 电泳和酶标仪获得的结果 往往是从多个细胞中获得的一个总数据 对于 具体的单个细胞不能逐个分析 亦为单靶点检 测 流式可以进行单细胞的研究 但是对于细胞 要求比较高 难以针对贴壁细胞进行研究 对于 多样品 多靶点的综合研究 上述的仪器设备均 存在局限性 而高内涵技术能够弥补这些常规 仪器的不足 操作简便而功能全面 成为我们研 究的重要武器 在显微镜 电泳 酶标仪和流式 细胞仪等设备的基础上 开展高内涵技术 可大 大提高我们的研究效率与水平 编辑 了解了高内涵技术的这么多优点 刘老师再给我们介绍一下它的应用吧 刘 高内涵在药物毒性评价 药效筛选与 机制研究等各方面中有广泛的应用 我们目前 主要进行了中药成分的毒性评价 抗细胞凋亡 药效筛选与药物调节 NF-κB 活性机制研究等 15

16 实验室用水 例如 我们采用高内涵技术 整合细胞核 膜通 透性以及溶酶体数量等三个方面的指标 观察 丹参多种成分多个剂量 丹参素钠 丹酚酸 A 二氢丹参酮 隐丹参酮 丹参酮 I 丹参酮 IIA 丹 酚酸 B 对人肝细胞株的毒性 结果发现这些成 分的细胞毒性剂量范围 为后续药效研究提供 用量等基础 进一步研究了其中部分成分对凋 亡发生时细胞核尤其是细胞线粒体跨膜电位等 的影响 并以流式细胞术等验证 发现了抗肝细 胞凋亡有效的丹参成分 此外 通过 NF-κB 细胞 内核转位 我们探讨了部分中药的作用机制等 这些工作结果将陆续整理发表 在近期将开展中药创新药物平台建设中 我们以高内涵技术为主 整合其他相关技术 将 建立中药有效物质活性追踪分离与评价的综合 方法 尤其是与植物化学家 药理数学家等合 作 基于多成分 多组合 多剂量 毒 - 效相关的 特征 建立中药发现与评价的综合细胞生物学 方法 为复杂中药研究进一步尝试新方法 并期 望有所贡献 编辑 这些成果就已经很令人瞩目了 刘 老师能不能再介绍一下国外关于高内涵技术的 应用呢 刘 国外在高内涵领域开展的时间较早 应用也更为广泛 几乎包含了细胞生物学研究 的各个领域 如 细胞增殖 药物对有丝分裂 细胞周期及其相关调节通路的影响都可用高内 涵技术进行检测 有丝分裂的研究 例如免疫 应答 炎症 组织内环境稳定性与血管生成等 有丝分裂指数可作为评价生长因子对细胞的刺 激潜能以及药物抗增殖活性的指标 细胞周期 研究 调节通路 其优点在于每种增殖标记物 可单独分析也可与其他标记物结合起来综合分 析 细胞运动 包括癌细胞的侵袭与转移 炎症 血管形成 创伤修复和胚胎发育等 细胞伸展 性 信号传导通路的研究 细胞毒性 包括细 胞凋亡 细胞坏死和遗传毒性等的安全评价 神经细胞的生长 蛋白质的相互作用研究 采 用共定位技术确定相互作用的蛋白定位 细胞 空间结构分析等等 相关的报道已超过 500 多 篇 很 多 发 表 在 高 端 的 杂 志 如 Nature Science 和 Cell 上 编辑 刘老师提到了高内涵系统平台 请 问这个系统是由哪些部分组成呢 生命离不开水 所有对生命科学和化学领 域的探索实验也就需要在水的环境中进行 为 了模拟生物体内或某种理想的化学反应环境 实验室对水的要求会达到非常高的水平 越来 越多的实验室工作人员开始关注实验中用水的 质量 并且逐步接受了采用专业的水纯化系统 为不同的实验提供有保证的纯水 还未使用但 希望通过水纯化系统简化实验过程和提高实验 水平的科研人员通常会对水纯化系统有着不同 的疑问 我们希望在这里能够给大家一个完整 的解答 刘 高内涵系统平台由以下几个部分组 成 硬 件 主 机 部 分 你 看 到 的 这 个 KineticScan 就 是 我 们 高 内 涵 平 台 的 主 机 部 分 它包含了活细胞培养室 液体处理工作站等 等附件 能够在长达 72 小时内对细胞进行连续 观察 准确控制温度 湿度和 CO2 浓度保证细 胞正常生长 并可实时增加药物或者培养基 设 定实验参数等 这是 2005 年的版本 刘老师指 着 仪 器 说 目 前 已 经 有 了 升 级 版 本 称 为 ArrayScan VTI, 它的功能更加强大 体积小巧 操作简便 速度也更快了 除了硬件部分 还包 含了软件 高内涵系统很大的特点在于应用丰 富 这都体现在了它的配套软件上 你看这里 刘老师指着电脑屏幕说 一共包含了 6 个大类 18 个小类的生物学应用全都包括在了系统软 件里面了 这些都是终身免费升级的 让我们紧 跟科技更新的潮流 再有配套的生物信息学软 件和内容丰富的试剂盒和细胞系等就构成了整 个的高内涵系统平台 培训和强大的售后服务 也是必不可少的 只有密切合作 共同开发 才 能够使我们的科研工作与时俱进 不断发展 编辑 通过您今天的介绍 我们对高内涵 系统有了更加深入地了解 十分感谢刘老师接 受我们的采访 也预祝你的科研工作一切顺利 刘 个人体会 仅供参考 不当之处 请 批评指正 希望我们今后能有更多的机会与同 行分享和交流研究应用的体会与经验 Q 自然界水当中存在哪些影响实验的杂质 A 自然界水或者城市自来水中的杂质大致可 以分为 无机离子 溶解于水的气体 颗粒物 胶 体 有机物 微生物和热原 Q 超纯水系统和纯水系统有什么区别 A 选 择 水 纯化系统的 依据的是您 的 应 用 包 括满足各种 不同的实验 工 作 的 要 求 超 纯 水 和纯水是通常的简称 按照国际通用的 ASTM 标准 试剂级用水按照水质从高到低可以分为 一 二 三级水 一级水就是我们通常所提到的 超纯水 最主要分辨参数就是水的电阻率 电阻 率大于 18 MΩ-cm 就达到了一级水的标准 纯 水涵盖的范围就比较广了 二级水和三级水都 可以称之为纯水 有针对无机离子实验的基础分析型系统 Analytical 针对有机分析实验的化学分析 型系统 UV 还有针对分子生物学的生化分析 型系统 UF 还有一款整合所有应用的综合系 统 UV/UF 纯水系统包含了二级水系统和三级水系 统 主要是满足部分对水质不敏感的实验 例如 二级水可以满足普通的细菌培养 BOD 实验 植物学研究等 而三级水系统主要用来清洗试 验器皿 培养箱或灭菌箱用水 纯水系统还有一 个重要的角色就是为超纯水系统提供进水 使 您免去经常购买桶装纯水的不便 Q 超纯水的各项指标的含义是什么 A 电阻率主要反应水当中离子的含量 离子 含量越低导致水的导电性越差 其电阻率越高 表明水质当中的离子杂质较少 Q 什么情况下需要超纯水系统 什么情况下需 要纯水系统 A 当您的工作或实验对水中的离子 有机物 或热原等都有极为严格的要求 例如使用高灵 敏度的无机分析仪器 离子色谱 或有机分析实 验 色谱 质谱分析 时 分子生物学实验 如 PCR 反转录 RNA 构建 DNA 文库时 超纯水 系统可以满足上述实验中对水的高要求 例如 Thermo Scientific Nanopure 系列中就分别 16 17

17 实验室用水 生命离不开水, 所有对生命科学和化学领域的探索实验也就需要在水的环境中进行 为了模拟生物体内或某种理想的化学反应环境, 实验室对水的要求会达到非常高的水平 越来越多的实验室工作人员开始关注实验中用水的质量, 并且逐步接受了采用专业的水纯化系统为不同的实验提供有保证的纯水 还未使用但希望通过水纯化系统简化实验过程和提高实验水平的科研人员通常会对水纯化系统有着不同的疑问, 我们希望在这里能够给大家一个完整的解答 Q: 自然界水当中存在哪些影响实验的杂质? A: 自然界水或者城市自来水中的杂质大致可以分为 : 无机离子 溶解于水的气体 颗粒物 胶体 有机物 微生物和热原 Q: 超纯水系统和纯水系统有什么区别? A: 选择水纯化系统的依据的是您的应用, 包括满足各种不同的实验工作的要求 超纯水和纯水是通常的简称, 按照国际通用的 ASTM 标准, 试剂级用水按照水质从高到低可以分为一 二 三级水 一级水就是我们通常所提到的超纯水, 最主要分辨参数就是水的电阻率, 电阻率大于 18 MΩ-cm 就达到了一级水的标准 纯水涵盖的范围就比较广了, 二级水和三级水都可以称之为纯水 有针对无机离子实验的基础分析型系统 (Analytical) 针对有机分析实验的化学分析型系统 (UV) 还有针对分子生物学的生化分析型系统 (UF), 还有一款整合所有应用的综合系统 (UV/UF) 纯水系统包含了二级水系统和三级水系统, 主要是满足部分对水质不敏感的实验, 例如二级水可以满足普通的细菌培养 BOD 实验 植物学研究等 ; 而三级水系统主要用来清洗试验器皿 培养箱或灭菌箱用水 纯水系统还有一个重要的角色就是为超纯水系统提供进水, 使您免去经常购买桶装纯水的不便 Q: 超纯水的各项指标的含义是什么? A: 电阻率主要反应水当中离子的含量, 离子含量越低导致水的导电性越差, 其电阻率越高, 表明水质当中的离子杂质较少 Q: 什么情况下需要超纯水系统? 什么情况下需要纯水系统? A: 当您的工作或实验对水中的离子 有机物 或热原等都有极为严格的要求, 例如使用高灵敏度的无机分析仪器 ( 离子色谱 ) 或有机分析实验 ( 色谱 质谱分析 ) 时 ; 分子生物学实验, 如 PCR 反转录 RNA 构建 DNA 文库时, 超纯水系统可以满足上述实验中对水的高要求, 例如 Thermo Scientific Nanopure 系列中就分别 17

18 TOC 的意思是总有机碳 (Total Organic Carbon), 是反映水当中总有机物含量的一个指标 热原含量是指包括细菌内毒素 病毒 细胞内源性酶在内的生物杂质,Thermo Scientific 通过专门设计的超滤技术可以将分子量大于 5000 道尔顿的生物大分子全部滤除 Q: 我想购置超纯水系统, 但是目前实验室空间不够, 怎么办? 能用自来水进水吗? A:Thermo Scientific 纯水系统是紧凑型设计, 不会占用过多的空间 ( 具体某个型号的尺寸请参考产品规格 ) 如果用户没有多余的台面和地面放置超纯水系统, Thermo Scientific 水纯化系统还为用户准备了一个方案就是将纯水系统挂置于墙面, 最大限度的利用空间 并且挂墙用的一系列配件均为标准配置 超纯水系统原则上是不能用自来水直接作为进水的, 进水的水质要求是经过预处理的水, 如蒸馏水 去离子水或反渗透水 用户可以根据自己的条件和应用选择桶装预处理水作为进水 也可以选择二级水系统或三级水系统为超纯水系统提供进水 Q:H2O SELECT 服务具体有什么内容? 对我们购买水纯化系统有何意义? A:Thermo Scientific 水纯化系统在全世界推广增值服务 H2O SELECT 这项服务的目的就是帮助用户了解实验室的现有水质情况, 可以是自来水的水质, 也可以是预处理桶装水的水质 了解使用 Thermo Scientific 纯水系统的过程中更换耗材的频率, 这个频率与用户的进水水质和每日用水量密切相关 H2O SELECT 服务的具体操作流程是 : 首先用户可以向当地的 Thermo Scientific 水纯化系统的代理商或致电 Thermo Fisher Scientific 索取 H2O SELECT Kit; 用户拿到 Kit 后填写纯水应用 每日用水量 现有进水条件等相关使用信息, 然后将您要检测的水装入 Kit 当中提供的无菌瓶中 ; 最后将装有待测水的无菌瓶和填写好的使用信息表交还给代理商或 Thermo Fisher Scinetific 两周后我们会提供一份清华大学出具的水质测试报告, 以及 Thermo Scientifc 水纯化系统产品专家根据用户使用信息得出的耗材更换周期的建议 Q: 超纯水系统可以直接用于 PCR 实验和 RNA 实验吗? 是否仍然需要用 DEPC 去除核酸酶? A:Thermo Scientific Nanopure 系列超纯水系统中的 UF 型号 ( 生化分析型超纯水系统 ) 和 UV/UF 型号 ( 综合分析型超纯水系统 ) 具备超滤功能可以去除水中的大于 5000 道尔顿的大分子蛋白质和各种酶 ( 包括 DNase 和 RNase) 用户无需再用 DEPC 处理即可以进行分子生物学实验 Q: 水纯化系统的使用需要注意哪些问题? 是否需要定期维护? A:Thermo Scinetific 的水纯化系统是免维护产品, 用户只需要根据产品的提示来更换耗材即可, 并且耗材的设计便于用户快速更换 水纯化系统的内部清洁也无需用户手动进行, 产品的自动循环功能在待机状态下也能保证管路中水质不会降低 ; 产品的冲洗功能可以通过一键式操作来完成 使用过程中需要用户注意的有 2 点 : 第一是保证水纯化系统始终处于开机状态, 在不使用的情况下可以将系统设置于待机状态 第二, 如果用户为超纯水系统提供进水水源的是桶装水, 请保证桶装水使用时间不要太长避免水质下降, 并且保证桶装水中水位不可过低以避免气体进入超纯水系统 18

19 NUNC UpCell TM 最新细胞培养表面 单个细胞 组织工程细胞的温度诱导性收获 编译 : 陈筱潇唐剑 实验室耗材 新型温度诱导细胞收获 UpCell TM 表面特殊设计使贴壁细胞在温度变化条件下快速从 Nunc TM UpCell TM 培养表面脱落 避免了使用酶法 ( 胰酶 ) 和细胞刮刀分离贴壁细胞对细胞的伤害, 从而保持了细胞的活性和细胞表面受体及抗原的完整性 即使是其他方法非常难以分离的贴壁细胞类型和连续细胞层, 也可以从 Nunc UpCell 表面轻松脱落分离 从 Nunc UpCell 表 面收获的细胞层可以叠放培养以创造三维组织模型和共培养, 细胞片可以在体内自然地附着于其他细胞片或细胞表面 Nunc UpCell 产品表面是一层特殊的均一的共价 - 固相 poly-nipaam 或 poly-pipaam 多聚物薄层 温敏材料 环境温度 37 时该表面为轻度疏水性, 适合细胞的贴附和生长, 而在低于 32 时该表面为转变为亲水性, 表面将结合水分子并膨胀, 从而将贴壁的细胞连同细胞下层细胞外基质 (ECM) 一同释放出来 被完整保留的细胞下层 ECM 确保收获到的连续细胞层具有完整的细胞极性 细胞 - 细胞连接 细胞层 - 细胞层间立体连接, 以及细胞层与移植点之间的连接 ( 无需纤维蛋白胶或缝合 ) 从而在无需支架和外源性材料的条件下就能建立三维组织模型和共培养, 大大简化了细胞培养和组织工程技术 特点及优势 1. 保护细胞表面蛋白 : 在细胞传代 单细胞分析及细胞移植研究中, 利用 UpCell 表面可以收获高活力及表面蛋白完整的细胞 不含胰酶 - 保护了细胞表面蛋白不用刮取 - 获得高的细胞活力最少的传递时间快速 干净 简单 - 只需降低温度使用酶消化法进行细胞收集, 例如胰酶消化法, 会导致细胞表面蛋白的降解 这些蛋白在细胞之间及细胞和环境间的相互作用方面非常重要 例如, 细胞表面蛋白涉及在细胞与胞外基质 其他细胞 生长因子及其他可溶性介质的应 答反应中 一些细胞表面蛋白在维持细胞内的离子平衡方面发挥作用, 而另一些细胞表面蛋白被用作抗原或标志物应用于细胞分析和富集实验中 19

20 2. 构建 3D 组织模型使用 UpCell 表面可以实验细胞片的收集, 并通过具有正常细胞功能及胞外基质的细胞堆积实现组织模型的构建 无需支架 - 构建 3D 组织模型时无需外源物质均匀的细胞分布 - 控制细胞在 3D 空间的分布混合细胞类型及构造 3D 共培养的无限可能只需收集并叠放细胞片层在组织工程中, 典型的 3D 组织模型或移植体的构建方法是将细胞悬液接种于一个预制 的支架中 用于存放于工程化组织中的支架材料并不是来源于细胞, 而常常是来自于其它种属的异源物质, 比如多聚乳酸 (PLA), 多聚羟基乙酸 (PGA), 藻酸盐, 凝胶及胶原蛋白等 使用支架进行组织工程学研究经常会出现各种问题, 这些问题包括不均匀的细胞分布及如何控制不同细胞类型的空间分布等 经过细胞移植后, 由于支架材料的外源问题还会导致宿主的炎症反应及纤维组织的形成 应用 1. 单细胞操作从具有 UpCell 表面的 Thermo Scientific Nunc 培养器皿上收获的单细胞悬浮物可被应用于 : 体外分析, 如流式细胞分析特定细胞类型的纯化作为传代步骤之一被重新接种于 UpCell 表面或传统培养器皿应用于细胞移植研究 2. 细胞片操作从具有 UpCell 表面的 Thermo Scientific Nunc 培养器皿上收获的细胞片可被应用于 : 体外分析, 例如电子显微镜观察重新接种于 UpCell 表面或传统培养器皿应用于不同的移植模型叠放于其它细胞片顶部 ( 参看下一节, 组织模型 - 细胞膜片工程学 ) 使用 UpCell 表面可以收集保持细胞极性的细胞片, 并通过正常的细胞连接和胞外基质连系 将您的细胞生长于 UpCell 表面的培养器皿上直至汇合, 使用我们提供的膜 ( 目前只有 Cat.No 孔板和 cm 培养皿具有 ), 降低温度, 然后收获细胞片 培养时依赖锚定的细胞最初与来源于培养基的吸附于培养器皿表面的蛋白相结合, 随后会在培养过程种产生并堆积出亚细胞基质 (Brevig et al., 2006; Kushida et al., 1999; Pompe et al., 2003) 培养的细胞通过细胞连接及这些由细胞沉积出的基质维系 传统的酶法或机械法细胞收集会破坏这些细胞 - 细胞 细胞 - 基质以及细胞 - 亚细胞基质间的连接, 并破坏细胞的完整性和极性 应用 20

21 UpCell 表面后, 细胞可以以互相接触的细胞片的形式从培养器皿上分离 亚细胞基质及膜提供了分离细胞片操作时必要的机械强度 之上 完全无需支架! 细胞片间的叠放研究, 也称为细胞膜片工程学, 最早由 Okano 及其同事 (Yamada et al., 1990; Yang et al., 2005 and 2007) 开展 收获的细胞片上的保存完整的胞外基质提供了细胞叠放所必须的粘附性 在移植模型中, 这些基质具有天然胶一样的功能, 可以使上层细胞片与下层接合细胞片或接合点进行结合, 而无需使用纤维蛋白胶或缝合 3. 组织模型操作 - 细胞膜片工程学在具有 Thermo Scientific Nunc UpCell 表面培养器皿上构建的细胞片可被用于 : 体外分析, 例如功能性组织特异性检测体外培养, 例如 3D 共培养应用于不同的移植模型, 移植之前或移植过程中细胞各片层间叠放使用 UpCell 表面可以收集处于叠放状态的细胞片以利于 3D 组织模型的构建 在 UpCell 表面培养器皿上生长细胞至汇合状态, 收集细胞片, 然后将细胞片转移至另一细胞片 更多 NUNC UpCell 产品及订购信息, 请登录 : 完整细胞培养产品线及服务, 请登录 : 21

22 环境控制 / 样品制备和保存 碳纤维 包括碳素纤维和石墨纤维 碳素纤维是有机纤维经 1000 ~ 2300 处理后, 含碳量为 85 ~ 95% 的纤维 ; 石墨纤维是有机纤维经 2300 以上处理, 含碳量在 98% 以上的纤维 在希腊神话中, 人类社会的进程依次为黄金时代 白银时代 青铜时代和黑铁时代 那么, 下一个时代, 难道是 碳纤时代 将人类社会归于几种材料未免牵强, 却揭示了一个真理 材料的发展和人类的生活 甚至于一个国家和民族的兴衰息息相关 历史上这类例子比比皆是 古罗马贵族爱用铅制餐具, 公共水务系统也用铅作水管 考古发现古罗马墓中尸骨上常有硫化铅黑斑点 铅摄入过量导致的慢性铅中毒可能是古罗马帝国崩溃的原因之一 ; 中世纪欧洲从中国进口了大量瓷器 此前这些国家使用陶器 玻璃器 金银器等 但这些器皿都有其局限性 当时西方人觉得瓷器太神奇, 直到后来西方传教士到了中国才了解了其 神秘 的原材料 高岭土 在材料上的无知还闹出了许多令人啼笑皆非的故事 西方殖民者曾经大量用玻璃珠和非洲当地土著进行贸易交换黄金 钻石 ; 二战时欧洲女性疯狂追逐美国伞兵, 只为了能得到一块她们前所未见过的布料 当时杜邦公司刚刚推出的用于制作降落伞的尼龙布 现代炼钢技术起源于 15 世纪的荷兰, 在 18 世纪英国工业革命时达到颠峰, 从此开始了钢铁及其各种合金 ( 铝合金等 ) 在材料界独领风骚两百年的辉煌历程 直到 20 世纪 50 年代初应火箭 宇航及航空等尖端科学技术的需要, 各种复合材料, 包括碳纤开始登上历史的舞台 其实, 这不是碳纤的处子秀 1879 年, 爱迪生以油烟与焦油 棉纱和竹丝试制碳丝, 实现持续照明 45 小时 但由于当时生产工艺的限制, 最终逐渐被钨丝电灯所替代, 碳纤的研究及应用从此进入半个世纪的蛰伏 直到 1950 年, 美国 W right--patterson 空军基地重新开始研制黏胶基碳纤维 这一次碳纤抓住了历史机遇, 开始了迅猛的发展 1959 年日本大阪工业试验所的进藤昭男发明了 PAN 基碳纤维 1965 年日本群马大学 的大谷杉郎发明了沥青基碳纤维 ( 目前世界上生产 应用的碳纤维中,PAN 基碳纤维占 90% 以上 下面的介绍以 PAN 基碳纤维为主 ) 80 年代初期, 高性能及超高性能的碳纤维相继出现, 同时, 碳纤维的生产工艺不断精进, 各种碳纤维复合材料不断涌现 在强度 刚度 重量 疲劳特性等有严格要求的领域, 在要求高温 化学稳定性高的场合, 碳纤维复合材料都颇具优势, 被喻为 材料之王 碳纤维增强树脂基复合材料 (CFRP) 为其中典型代表, 具有密度低 高比强 高比模 耐疲劳 抗蠕变 耐高温 耐腐蚀 耐磨损 导电 导热 热膨胀系数小 自润滑和吸能抗震等一系列优异性能, 使其在许多领域得到广泛应用 下表列出了 CFRP 与其他复合材料性能特性数据 就其综合性能而言, 以 CFRP 最好 密度 (Density) : 物质单位体积内所含的质量, 单位是 g/cm 3 拉伸强度 (Tensile strength): 试样拉伸至断裂时的最大拉伸应力, 单位为 MPa 杨氏模量 (Young's modulus ): 弹性材料承受正向应力时会产生正向应变, 定义为正向应力与正向应变的比值 杨氏模量大 说明材料的形变小, 单位为 MPa T-800: 东丽公司碳纤维型号 22

23 碳纤维原料生产工艺目前, 人们还不能直接用碳或石墨来抽成碳纤维 只能采用一些含碳的有机纤维 ( 如腈纶丝 ) 做原料 生产 PAN 基碳纤维时, 聚丙烯腈纤维 母体 首先要通过聚合和纺纱工艺加工成聚丙烯腈 然后放入氧化炉中在 200 到 300 摄氏度进行氧化 另外还要在碳化炉中, 在温度为 1000 到 2000 摄氏度间进行碳化制成碳纤维 氧化预反应中氧是环化反应的催化剂,聚丙烯原丝加热形成热稳定性的梯形结构 碳化和石墨化都是在氮气中进行的 碳化反应是使非碳元素藉分子间交链反应挥发出来 在热处理过程中,大量气体挥发后形成更多的石墨层状结构,强度增大 模量增加 导电性提高 纤维由白色依次变为黄色 棕黄色 黑色 最后经过上浆等表面处理即可制成碳纤维原料 碳纤维原料主要有四种产品形式 : 纤维丝 布料 预浸料和切短纤维 碳纤维原料与树脂 金属 陶瓷等基体复合, 做成碳纤维树脂复合材料 碳纤维金属复合材料 碳纤维陶瓷复合材料等各种复合材料 碳纤维产品的制造工艺 : 使用碳纤维材料, 制造商可以按照具体的应用生产一系列的碳纤维产品 其生产工艺主要有 : 缠绕成型法 树脂转注成型法 (RTM) 薄片缠绕法等 缠绕成型法 : 将树脂附在纤维丝上, 将它们缠绕在一个芯儿上, 然后进行塑化或硬化处理 这种工艺主要用于制造压力容器和轧滚 树脂转注成型法 : 将布料放入一个模型中, 然后用树脂浸泡, 可以用来生产卡车和划艇的车身部分 薄片缠绕法 : 将预浸料坯缠绕在一个芯儿上, 在高压釜中给预浸料加热 加压和塑化成型而成的 用这种方法可以用于制成高尔夫球棒 钓鱼杆 飞机元件等的制造 过去薄片缠绕法是应用最广泛的生产工艺 随着应用的需要, 纤维缠绕成型法得到了更加广泛的发展 因为该法的制成品具有更好的材料性能 例如, 导弹 载人飞船 航天飞机等在再入大气层时飞行器鼻锥受到强激波压力及极限高温, 所以必须选择能够承受再入环境苛刻条件的材料和预制工艺 纤维缠绕成型法即用于生产上述产品的再入鼻锥 碳纤维应用 : 碳纤维复合材料应用于很多的领域 主要的应用包括 : 体育运动器材例 ( 如高尔夫球棒 钓鱼杆 滑雪板等 ) 航空应用包括导弹 飞机元件如尾翼 横梁 刹车系统等 ( 波音 787 和空客 380 上就大量使用碳纤复合材料 ) 交通工具 ( 轿车 卡车 帆船 自行车 赛车等 ) 及医疗设备 压力容器 土木工程和建筑材料 ( 如日本在阪神地震后用碳纤维布对高层建筑物 桥梁等进行加固处理 ) 能源 其它新的工业应用上 对生物学研究人员来说, 碳纤维复合材料一个有意义的应用是用于制造离心机转头 Fiberlite ( 从 2008 年起被 Thermo Fisher Scientific 收购 ) 是目前世界上唯一生产碳纤转头的公司 与传统铝合金转头相比, 碳纤转头的重量轻, 只有传统铝 * 数据来源 : 日本碳纤产业协会合金转头重量的 40%, 操作更方便 而且可有效降低离心机马达的负荷, 延长其使用寿命 碳纤转头具有更好的抗化学腐蚀性能 耐高温高压 ( 灭菌功能 ), 而且从上述碳纤转头制造工艺决定了碳纤转头是可修复的 同时, 由于金属含量极低 (T800 中金属含量仅为 %), 所以与金属转头不同, 碳纤转头没有 金属疲劳 现象, 可以长期安全使用 目前 Fiberlite 已开发了第二代碳纤转头, 与第一代转头上使用的薄片缠绕法不同, 它的制造工艺为纤维缠绕成型法,T800 碳纤材料也在新一代碳纤转头上得到应用 Thermo Fisher Scientific 最新推出应用 Fiberlite 新一代碳纤转头的台式离心机, 敬请垂询 第一代 ( 图右 ) 及第二代 ( 图左 ) 碳纤转头 23

24 碳纤复合材料广泛应用于人们日常生活的各个方面 K (汽车) 氢燃料电池质子交换膜 碳纤维用于生产质子交换膜 为氢燃料电池 提供稳定 节约成本的材料 推动这一绿色 能源在汽车等领域的发展 D E L S (汽车)用作一次结构件 可用作汽车一次结构件 如车体面板 发动 机集体 连杆等 B C A M 家用电器 碳纤维用于机器元件 家用电器 微机 及与 半导体相关的设备的复合材料的生产 可以 用来起到加固机体 防静电 和电磁波防护 的作用 G N N F H O M 家用电器 J O 玩具 被褥及地毯 碳纤维具有良好的保温性 绝缘性 无菌 无 味 可用作多种日用品 I L P K R P Q A 运动服 高级运动服装的面料 如著名的 鲨鱼 皮 泳衣 吸水后可膨胀 通气性提高 浮力增加 B D 干燥时 吸水后 网球拍 碳纤网球拍轻而坚 刚性大 应变小 可降低 球与球拍接触时的偏离度 同时 CFRP 的 阻尼性好 可延长肠线与球的接触时间 使 网球获得较大的加速度 例如 木制 / 钢制 /CFRP 球拍的接触时间分别为 4.33 毫秒 4.09 毫秒 4.66 毫秒 相 对应的球的初速度则分别为 1.38 千米 时 千米 时和 千米 时 C 赛车 用石墨纤维长丝制成的管材可用来制造比 赛车或通用自行车的车架, 其特点是重量 轻 比钢制架可减重 50% 左右 使自行车的 总重量减轻 15% 此外 碳纤维增强复合材 料在体育用品方面还可以制造滑雪板 洋弓 箭 跳竿 冰球棒 游 艇 赛艇 赛艇桨 帆船桅杆 登山用品以及滑翔机 人力飞机等 24 高尔夫球杆 用 CFRP 制成的高尔夫球棒 可减轻重量约 10 一 40 根据动量守恒定律 可使球获得 较大的初速度 另一方面 CFRP 具有高的阻 尼特性 可使击球时间延长, 球被击得更远 E 钓鱼竿 碳纤维增强复合材料制成的钓鱼竿比 GFRP 制品或竹竿都要轻得多 使其在撒竿时消耗 能量少 而且撤竿距比后者远 20% 左右 用 碳纤维增强塑料还可以制成渔具的卷铀 其 重量不超过 l40 克 但它的疲劳强度高 耐摩擦 因而使用寿命长 F 标记牌 碳纤维对日晒及天气变化具有极好的耐受 性 可用于制作永久性标记牌 纯化饮用水 碳纤维可用作水龙头式或容器式纯水装置 为日常生活提供安全的饮用水 G 天然气压缩罐(CNG) 应用碳纤维的抗震 强度高等优点可生产压 力容器 主要用在公交汽车的受压天然气 (CNG) 罐上 Q 室内装潢及加固 应用碳纤维作为室内建筑用料 如天花板及 主梁加固 用做隔音墙及厨房操作台面等 H 土木工程和建筑材料 碳纤维布用于土木工程和建筑材料对高层 建筑物 桥梁等进行加固处理 I 汽车 功能性零件 碳纤维开始被应用于汽车领域 用做尾部 沸腾器 传动轴 燃料箱 板弹簧 活塞等的 材料 R S J (汽车)刹车系统 C/C 复合材料具有极高的比强度 比模 量 耐高温性能 可用作汽车 飞机等的刹 车装置 碳酸发生器 用碳纤维加工制作的碳酸发生器可以溶解 空气中的 CO2, 水中 CO2 可富集到高于 1,000 ppm 的水平 达到与泡 温泉 一样的 效果 污水处理 中空碳纤维作为膜生物反应 器可处理工业及生活污水 横切面 膜表面 25

25 碳纤复合材料广泛应用于人们日常生活的各个方面 K (汽车) 氢燃料电池质子交换膜 碳纤维用于生产质子交换膜 为氢燃料电池 提供稳定 节约成本的材料 推动这一绿色 能源在汽车等领域的发展 D E L S (汽车)用作一次结构件 可用作汽车一次结构件 如车体面板 发动 机集体 连杆等 B C A M 家用电器 碳纤维用于机器元件 家用电器 微机 及与 半导体相关的设备的复合材料的生产 可以 用来起到加固机体 防静电 和电磁波防护 的作用 G N N F H O M 家用电器 J O 玩具 被褥及地毯 碳纤维具有良好的保温性 绝缘性 无菌 无 味 可用作多种日用品 I L P K R P Q A 运动服 高级运动服装的面料 如著名的 鲨鱼 皮 泳衣 吸水后可膨胀 通气性提高 浮力增加 B D 干燥时 吸水后 网球拍 碳纤网球拍轻而坚 刚性大 应变小 可降低 球与球拍接触时的偏离度 同时 CFRP 的 阻尼性好 可延长肠线与球的接触时间 使 网球获得较大的加速度 例如 木制 / 钢制 /CFRP 球拍的接触时间分别为 4.33 毫秒 4.09 毫秒 4.66 毫秒 相 对应的球的初速度则分别为 1.38 千米 时 千米 时和 千米 时 C 赛车 用石墨纤维长丝制成的管材可用来制造比 赛车或通用自行车的车架, 其特点是重量 轻 比钢制架可减重 50% 左右 使自行车的 总重量减轻 15% 此外 碳纤维增强复合材 料在体育用品方面还可以制造滑雪板 洋弓 箭 跳竿 冰球棒 游 艇 赛艇 赛艇桨 帆船桅杆 登山用品以及滑翔机 人力飞机等 24 高尔夫球杆 用 CFRP 制成的高尔夫球棒 可减轻重量约 10 一 40 根据动量守恒定律 可使球获得 较大的初速度 另一方面 CFRP 具有高的阻 尼特性 可使击球时间延长, 球被击得更远 E 钓鱼竿 碳纤维增强复合材料制成的钓鱼竿比 GFRP 制品或竹竿都要轻得多 使其在撒竿时消耗 能量少 而且撤竿距比后者远 20% 左右 用 碳纤维增强塑料还可以制成渔具的卷铀 其 重量不超过 l40 克 但它的疲劳强度高 耐摩擦 因而使用寿命长 F 标记牌 碳纤维对日晒及天气变化具有极好的耐受 性 可用于制作永久性标记牌 纯化饮用水 碳纤维可用作水龙头式或容器式纯水装置 为日常生活提供安全的饮用水 G 天然气压缩罐(CNG) 应用碳纤维的抗震 强度高等优点可生产压 力容器 主要用在公交汽车的受压天然气 (CNG) 罐上 Q 室内装潢及加固 应用碳纤维作为室内建筑用料 如天花板及 主梁加固 用做隔音墙及厨房操作台面等 H 土木工程和建筑材料 碳纤维布用于土木工程和建筑材料对高层 建筑物 桥梁等进行加固处理 I 汽车 功能性零件 碳纤维开始被应用于汽车领域 用做尾部 沸腾器 传动轴 燃料箱 板弹簧 活塞等的 材料 R S J (汽车)刹车系统 C/C 复合材料具有极高的比强度 比模 量 耐高温性能 可用作汽车 飞机等的刹 车装置 碳酸发生器 用碳纤维加工制作的碳酸发生器可以溶解 空气中的 CO2, 水中 CO2 可富集到高于 1,000 ppm 的水平 达到与泡 温泉 一样的 效果 污水处理 中空碳纤维作为膜生物反应 器可处理工业及生活污水 横切面 膜表面 25

26 使用纯铜内胆的 CO2 培养箱预防细胞培养中的污染 原文 : Imam El-Danasouri, DVM, Ph.D., HCLD. Director, Califonia Reproductive Laboratories, 1700 California Street #570, San Francisco CA Daniel Schroen, Ph..D. Senior Application Scientist, Thermo Fisher Scientific 编译 : 朱延文 CO2 培养箱可提供细胞培养的最佳生长环境, 但同时, 温度和湿度条件也适于污染微生物的生长 从易于消毒的表面, 外置水槽到热灭菌循环,Thermo Scientific 的 CO2 培养箱已证明可预防和清除污染 铜的抗菌作用早期人类文明的记录即已显示铜可以抑制许多不同的微生物的生长 综览现代文献, 也表明铜可以减慢或停止许多微生物, 包括细菌 真菌 藻类和酵母的生长 铜离子与污染物结合可阻断与微生物生命息息相关的重要的蛋白质代谢过程 例如, 纯铜可抑制细菌的菌落化, 这一结果最近也由位于英格兰 Porton Down 的应用微生物学研究中心 (CAMR) 报告 在这一研究中,CAMR 证实纯铜管道减少了军团病的致病因子军团嗜热肺炎杆菌的生长 CAMR 也是在生物污染方面验证了许多 Thermo Scientific 离心机转子的同一检测机构 CAMR 也清楚地用文献证明 Thermo Scientific 的培养箱中专利的 ContraCon 热灭菌循环可有效地杀灭细菌和真菌 有许多例子证明铜可以在日常产品中起到杀菌作用 例如 : 与水泥或油漆结合, 可阻止细菌和真菌生长 ( 如在潮湿的地下室 ) 在冷却水塔中减少细菌和藻类铜管道减少了军团嗜热肺炎杆菌的威胁黄铜 ( 铜锌合金 ) 用于加工冷却剂过滤器, 去除了细菌和藻类硫酸铜和铜螯合剂可在池塘和市政供水系统中控制水生的害虫含铜的杀虫剂可控制线虫和真菌 培养箱中的铜铜在许多设备中减少微生物的生长, 包括医用和科学仪器, 如培养箱 多年的经验显示, 将铜线 硫酸铜甚至铜币放入 CO2 培养箱的水槽中可显著抑制微生物生长 而纯铜表面可更显著地减少污染物的繁殖 Thermo Scientific 的 CO2 培养箱可装备纯铜的内表面 铜, 已在科学仪器中证实具有抗菌特性 由于铜离子不会挥发, 它们对在铜搁板上的培养瓶中培养的珍贵细胞不会有任何威胁 最近, 长期使用纯铜培养箱的 Imam El-Danasouri 博士接受了采访 除了在加州大学生殖实验室的职位, 您还有其他的职位吗? Imam El-Danasouri 博士 : 意大利 Chieti 大学 OB/GYN 教授 ; 位于意大利 Chieti 的欧洲生殖内分泌和不孕症研究所的首席科学家 ; 德国 Ulm 生殖内分泌研究所的首席科学家 请描述您使用 CO2 培养箱的经验? Imam El-Danasouri 博士 : 我已经用 CO2 培养箱来进行细胞培养及研究超过 25 年了 您使用 Thermo Scientific 的纯铜内胆培养箱的经验是什么? Imam El-Danasouri 博士 : 我第一次使用纯铜内胆培养箱是 1989 年在斯坦福大学医学 院 从那以后, 在我所管理的美国 德国和意大利的所有实验室都只使用纯铜内胆的培养箱 最近, 我为埃及开罗的埃及空军医院订购了 2 台新的纯铜内胆培养箱 为什么您选择纯铜内胆的 CO2 培养箱? Imam El-Danasouri 博士 : 培养箱内的感染对细胞是至关重要的 由于纯铜可抑制表面上的细菌生长, 纯铜内胆的培养箱减小了在培养箱内壁和水槽中污染的可能性 而对细胞培养基进行重金属检测, 未发现来自培养箱的铜离子 您用纯铜内胆培养箱培养过什么细胞? Imam El-Danasouri 博士 : 我已经培养过人和小鼠的细胞 还培养过其他类型的细胞, 包括来自猴子 牛和人的内膜细胞 上皮细胞和基质细胞 输卵管上皮细胞等 还成功地培养了许多其他细胞系 26

27 脐带血干细胞冷冻保存研究 作者简介 韩俊领副主任技师国家干细胞工程产业化基地 ; 协和干细胞基因工程有限公司, 天津市脐带血造血干细胞库联系电话 : 前言干细胞技术是当今生命科学领域最前沿的高新技术 年连续两年被 科学 杂志列为 人类十大科技进展 之首 再度入选 世界十大科技进展 自 1974 年 Knudtzon 等发现脐带血中富含造血干细胞以来, 有关学者对其进行了广泛而深入的研究 1988 年 Gluckman 等用 HLA 匹配同胞之间的脐带血移植治疗 Fanconi s 贫血获得成功后, 脐带血干细胞移植逐渐被专家和学者们所重视 脐带血作为新的造血干细胞的来源, 具有比外周血和骨髓干细胞更多的优势 随着脐带血干细胞移植的不断深入研究, 这一崭新的治疗方式已成为 21 世纪人类摆脱重大疾病的希望之剑 由中国医学科学院中国协和医科大学血 液学研究所血液病医院与上海望春花 ( 集团 ) 股份有限公司共同出资设立的协和干细胞基因工程有限公司, 拥有目前世界上规模最大的干细胞库之一 天津市脐带血造血干细胞库, 该库是首批通过国家卫生部执业验收的脐带血造血干细胞库 ( 卫脐血干细胞库字 [2002] 第 002 号 ), 也是首批通过亚洲脐带血库组织验收的脐带血造血干细胞库, 日处理脐带血能力 100 份, 设计储存量为 30 万份, 目前已存储 14 万份 今天, 我们有幸邀请了协和干细胞的韩俊领老师撰文介绍脐带血库的一些研究工作 包括脐血的分离 冷冻保存和检测的标准操作程序, 通过比较冷冻前后有核细胞的活力 有核细胞的回收率 CD34+ 细胞和 CFU-C 回收率等来评估冷冻保存对脐带血干细胞的影响 175 例脐带血干细胞冷冻保存研究 摘要 目的 : 研究冷冻 保存对脐带血干细胞功能的影响 方法 : 按标准操作规程进行脐带血的分离 冷冻保存和检测 在冷冻保存的不同时段, 将脐带血干细胞融化, 做相应的检测 通过比较冷冻前后有核细胞的活力 有核细胞的回收率 CD34+ 细胞和 CFU-C 回收率, 来评估冷冻保存对脐带血干细胞的影响 结果 : 融化后有核细胞 CD34+ 细胞 CFU-C 的回收率分别为 89.1% 93.0% 和 93.6%; 冷冻保存 0~2 年的脐带血干细胞的有核细胞 CD34+ 细胞 CFU-C 回收率分别为 88.0% 91.3% 102.2%; 保存 3~5 年的为 90.1% 87.8% 83.4%; 保存 6~7 年的为 89.9% 92.1% 84.9% 结论: 采用程控降温冷冻的脐带血造血干细胞, 冷冻前后无明显变化 ; 在深低温液态保存的脐带血干细胞的活性和功能, 不随年份的延长而发生明显改变 深低温冷冻的脐带血造血干细胞可以长期保存 关键词 脐带血造血干细胞 程控降温冷冻 深低温保存 27

28 自 1974 年 Knudtzon 等发现脐带血中富含造血干细胞以来, 有关学者对其进行了广泛而深入的研究 1988 年 Gluckman 等用 HLA 匹配同胞之间的脐带血移植治疗 Fanconi s 贫血获得成功后 [1], 脐带血干细胞移植逐渐被专家和学者们所重视 脐带血作为新的造血干细胞的来源, 具有比外周血和骨髓干细胞更多的优势, 如来源广泛 对供者无任何不良损害 无供者限制 移植物抗宿主病 (GVHD) 的发病率 [2~5] 和病毒感染率均较低 [6,7] 等 同时, 与以资料库方式储存的骨髓或外周血相比, 以实体库方式储存的脐带血, 可以避免移植时, 受供者健康 个人意愿等各方面的影响, 无法得到合适的干细胞的风 险 全世界已经进行了数千例的脐带血干细胞移植 [8], 植活成功率与成人无关骨髓移植无明显差异 [2,3] 对于已进入独生子女占优势的我国, 十余年的临床移植实践证明, 脐带血是重要的造血干细胞来源, 是解决造血干细胞供着危机的可行途径 有文献报道, 经冷冻后 15 年的脐带血复苏后仍然具有重建长期造血的能力, 并且与短期冷冻的脐带血相比, 无明显差异 [9] 本研究将冷冻保存期不同的脐带血融化, 通过冷冻前后各项检测指标的比较, 来评估程控降温冷冻和深低温液态长时间保存对脐带血干细胞功能的影响 1. 材料与方法 1.1 脐带血胎盘娩出前或胎盘娩出后, 在洁净状态下对脐带血进行迅速采集 选取采集时间短 无凝血 脐带血体积 ( 含抗凝剂 )>110ml 分离前细胞总数 >8X108 细胞活力 >98% 的合格脐带血作为实验材料 1.2 脐带血造血干细胞的富集按照标准操作规程, 通过两步离心的方法 (Thermo Scientific SORVALL RC-3BP), 去除大部分红细胞和多余的血浆, 将脐带血浓缩到 33ml 左右, 加入冷冻保护剂, 待冷冻 要求有核细胞的回收率 80% 1.3 脐带血造血干细胞的冷冻保存按照 Rubinstein 等的方法 [10], 依照本脐血库已验证的程控降温程序, 将加入冷冻保护剂的脐带血放入程控降温仪 (Forma Scientific, Forma Cryomed 7453) 中降温 待温度降至 -80 时, 将脐带血转移至自动填充液氮的液氮储存箱 (Forma Scientific, Forma Cryo ) 中保存 1.4 冷冻脐带血干细胞的复苏将深低温保存的脐带血干细胞, 放于 37~42 水浴中, 在 1 分钟内快速融化 1.5 脐带血样品的实验检测 有核细胞计数用血球计数仪 (sysmex kx-21) 进行细胞计数 有核细胞活力检测应用胎盘蓝拒染的方法检测细胞活力 CD34+ 细胞检测用低渗 NH4Cl 溶液溶解 RBC, 洗涤后收集 NC 用 ISHAGE 双标法标记 流式细胞仪 (FACSCaliburTM Becton Dicknison Immunocytometry Systems) 和相应的软件测出冷冻前后脐带血中的 CD34+ 细胞的百分数, 并计算出每份脐带血 CD34+ 细胞的绝对数 祖细胞集落生成率检测将细胞接种于 MethocultTM GF H4434 培养基 (Stem Cell Technologies,Canada) 中, 置于 CO2 培养箱 (Forma Scientific, Model 3111) 中, 培养 14 天后, 测定冷冻前后脐带血中 CFU-GM,BFU-E 和 CFU-GEMM 的产率和造血祖细胞集落总数 1.6 统计学分析对冷冻前后各检测项目的结果进行比较 结果用平均数 标准差及百分率表示, 采用 SSPS 软件进行统计学分析 2. 结果 2.1 脐带血融化检测结果为了评价脐带血冷冻保存的效果和质量, 选择了 175 份保存时间为 6 个月 ~7 年的脐带血进行冷冻复苏检验, 结果见表 1 融化后有核细胞 CD34+ 细胞 CFU-C 的回收率分别为 89.1% 93.0% 和 93.6%, 有核细胞的活力为 97.7% 28

29 表 1 冷冻前后脐带血检测结果比较 融化前 (±SD) 融化后 (±SD) 回收率 (%) 有核细胞总数 ( 108) 11.24± ± ±8.4 CD34+ 细胞总数 ( 105) 31.12± ± ±52.9 干 / 祖细胞总数 ( 105) 16.09± ± ±65.2 有核细胞活力 (%) 98.5± ± 冷冻保存时间对脐带血干细胞活力和功能的影响 为了评价冷冻保存时间对脐带血干细胞活力和功能的影响, 本研究中把融化标本按冷冻保存的年份分为 0~2 年 3~5 年和 6~7 年三组, 分别对各组的有核细胞 CD34+ 细胞 CFU-C 的回收率进行统计, 结果见表 2 冷冻保存 0~2 年的脐带血干细胞的有核细胞 CD34+ 细胞 CFU-C 回收率分别为 88.0% 91.3% 102.2%; 保存 3~5 年的脐带血干细胞的有核细胞 CD34+ 细胞 CFU-C 回收率分别为 90.1% 87.8% 83.4%; 保存 6~7 年的脐带血干细胞的有核细胞 CD34+ 细胞 CFU-C 回收率分别为 89.9% 92.1% 84.9% 表 2 不同冷冻保存年份脐带血融化结果的比较 0~2 (n=48) 3~5(n=77) 6~7(n=50) 有核细胞回收率 (%) 88.0± ± ±6.2 CD34+ 细胞回收率 (%) 91.3± ± ±24.6 干 / 祖细胞 (%) 102.2± ± ±33.7 有核细胞活力 98.1± ± ±2.8 将 6~7 年组和 0~2 年组有核细胞 CD34+ 细胞 干 / 祖细胞的回收率和活力相比较,P 值分别为 , 没有统计学差异 3. 讨论 脐带血是继骨髓和外周血后的另一重要的造血干细胞来源 随着世界各地区的脐血库储存规模日益扩大, 为适合造血干细胞移植的患者找到适合的脐带血提供了更多的机会 脐带血干细胞移植需要脐血库储存的脐带血达到一定的规模, 并能保持造血干细胞的活性和功能, 以备患者找到 HLA 相匹配的脐带血干细胞 造血干细胞的损伤与冷冻 储存温度 储存温度的波动和融化等因素有关, 这就使得以实体库方式储存的脐带血干细胞的冷冻和保存质量, 对于脐带血能否被有效地利用显得尤为重要 本 研究通过比较有核细胞 CD34+ CFU-C 的回收率, 证实融化后同冷冻前相比无明显变化, 这结果与国外文献报道相一致 [9,11], 证明了我们所设计的脐带血干细胞的程控降温冷冻程序, 能够有效的降低脐带血干细胞的冷冻损伤 通过比较保存年份对脐带血干细胞的影响, 验证了以液氮为冷冻源的深低温液态保存方式, 可以使脐带血干细胞的活性和功能得以很好地保存, 使其不随冷冻保存年份的延长而发生明显改变, 证明脐带血干细胞在深低温状态下可以长时间的保存 29

30 干细胞 21 世纪的耀眼明星 1. 什么是干细胞 (stem cells, SC)? 干细胞是具有自我复制和多向分化潜能 的原始细胞, 是机体的起源细胞, 是形成人体各种组织器官的祖宗细胞 干细胞可以对病变 衰老损伤的组织器官进行修复或替代, 是未来医学领域治疗多种疑难症状的主要原料和手段 2. 什么是造血干细胞? 造血干细胞是所有血细胞和免疫细胞的起源细胞, 具有自我更新 多向分化和归巢 ( 即定向迁移至造血组织器官 ) 潜能 它不仅可分化为红细胞 白细胞和血小板, 还可跨系统分化为多种组织器官的细胞, 是多能干细胞 造血干细胞主要存在于骨髓 胚胎肝 脐带血以及经动员的外周血中 3. 什么是脐带血造血干细胞? 脐带血是指新生儿脐带被结扎后存留在脐带和胎盘中的血液 这些血液中含有大量的造血干细胞, 与其他来源相比, 具有排斥反应小, 免疫原性低, 是临床治疗用干细胞的主要来源之一 4. 什么是胚胎干细胞 (Embryonic Stem cell,es) 当受精卵分裂发育成囊胚时, 内层细胞团 (Inner Cell Mass) 的细胞即为胚胎干细胞 胚胎干细胞具有全能性, 可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力 进一步说, 胚胎干细胞 (ES 细胞 ) 是一种高度未分化细胞 它具有发育的全能性, 能分化出成体动物的所有组织和器官, 包括生殖细胞 5. 什么是诱导性多能干细胞 (induced pluripotent stem,ips) 2007 年 11 月 20 日, 细胞 和 科学 杂志分别发表了日本和美国研究人员各自独立完成的一项研究, 研究人员首次利用人体皮肤细胞诱导分化出类胚胎干细胞, 这样得到的干细胞称为诱导多功能干细胞, 又名 ips 细胞 诱导性多功能干细胞 (ips) 首次在公众面前亮相, 它不仅被国际生命科学界誉为具有里程碑意义的创新之举, 而且多数人认为这一发现极有可能在若干年后问鼎诺贝尔奖 ips 细胞具有和胚胎干细胞类似的功能, 却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍, 因此在医疗领域的应用前景非常广阔 美国加州奥克兰市遗传学与社会学中心的政策分析家 Jesse Reynolds 说 : 这一重大突破将在干细胞研究的科学和政策领域引发一场大地震 6. 奥巴马放行干细胞研究 2009 年 3 月 9 日, 美国总统奥巴马在白宫签署行政命令 当日, 奥巴马签署行政命令, 宣布解除对用联邦政府资金支持胚胎干细胞研究的限制 2001 年 8 月, 美国时任总统布什宣布对胚胎干细胞研究设限, 规定联邦政府对胚胎干细胞研究的资助仅限于研究当时已有的胚胎干细胞, 不得资助从新胚胎中提取干细胞进而开展研究 近年来, 关于联邦政府是否应进一步支持胚胎干细胞研究的问题曾数次在美国引起激烈争论, 取消上述限制的呼声也日益高涨 等了 8 年, 美国科学家终于盼到了联邦经费补助, 用于胚胎干细胞研究, 来对抗疾病和伤残 奥巴马的行动将使国家卫生总署得以考虑科学家对研究数百种干细胞株所提出的要求, 并给予经费 美国的胚胎干细胞研究有望进入新阶段 30

31 胞采集/ 制备细胞扩增/ 分化细胞鉴定/ 分析细胞储存/ 运输盐平衡液细STEM CELL EXCELLENCE... 来自 ThermoFisher 的完整干细胞解决方案 仪器 & 设备 耗材 & 加样器 试剂, 培养基 & 细胞 软件 & 服务 离心机 水浴 移液器 / 枪头 人类干细胞 LIMS 培养箱 磁珠分离系统 尖底细胞培养管 鼠干细胞 添加剂 Finance 冰箱 培养皿 / 培养板 培养基 盐溶液 实验室服务 BSC 生物安全柜 CO2 培养箱 离心机纯水 过滤器培养板移液器腔室载波片培养瓶 / 培养皿 分化试剂培养基 / 血清 添加剂 sirna LIMS 技术支持 HCS 高内涵筛选微孔板读数仪洗板机磁珠分离系统电动加液器 培养皿 / 培养板移液器 / 枪头腔室载波片尖底细胞培养管 OptiCell 细胞培养板 检测试剂盒免疫组化试剂抽提试剂盒 染料酶 LIMS 实验室服务 冰箱存储架 液氮罐程控降温仪 冻存管 OptiCell 培养板条码存储 冻存基质 Bio-Repository LIMS

32 顾问陆明华主编王菁 高莹 上海上海浦东新区新金桥路 27 号 6 号楼电话 : 传真 : 北京北京安定门东大街 28 号雍和大厦西楼 7 层 室电话 : 传真 : 广州广州东风中路 号健力宝大厦 室电话 : 传真 : ( 中文 ) NL-LPGCHINA-0309 免费电话 ( 固定电话 ) ( 手机用户 ) 服务科学, 世界领先