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都炽蒋
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1 江苏农业学报 (Jiangsu J.of Agr.Sci.)ꎬ2017ꎬ33(5):1117 ~ 1123 h ttp: / / y x b.com 1117 刘子记 ꎬ 申龙斌 ꎬ 朱 doi: / j.issn 婕 ꎬ 等. 苦瓜 α 苦瓜素基因克隆与单倍型分析 [J]. 江苏农业学报 ꎬ2017ꎬ33(5): 苦瓜 α 苦瓜素基因克隆与单倍型分析刘子记 1 ꎬ 申龙斌 1 ꎬ 朱婕 2 ꎬ 牛玉 1 1 ꎬ 杨衍 (1. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 / 农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室 ꎬ 海南儋州 ꎻ 2. 海南大学热带农林学院 ꎬ 海南海口 ) 摘要 : 为了揭示苦瓜 α 苦瓜素基因的完整结构及单倍型 ꎬ 本研究以 35 份苦瓜初级核心种质为材料 ꎬ 克隆 α 苦瓜素基因 ꎬ 结果显示 ꎬα 苦瓜素基因全长 993 bpꎬ 包括 60 bp 的 5 UTRꎬ72 bp 的 3 UTRꎬ861 bp 的 ORFꎬ 无内含子序列 ꎬ 编码 286 个氨基酸 ꎬα 苦瓜素蛋白含有 RIP 蛋白保守结构域 ꎮ 系统进化分析结果表明 ꎬ 除苦瓜 RIP P 外 ꎬα 苦瓜素蛋白与胶苦瓜 3MRW_A 的亲缘关系最近 ꎬ 而与苦瓜 MAP30 蛋白的亲缘关系较远 ꎮ 通过比较 35 份苦瓜种质资源 α 苦瓜素基因序列 ꎬ 共发现 5 个 SNP 位点 ꎬ5 个 SNP 位点均位于编码区 ꎮ SNP 分组发现 ꎬ35 份苦瓜种质资源 α 苦瓜素基因共存在 5 种单倍型 ꎮ 5 种单倍型编码的氨基酸序列比对显示 ꎬ 共存在 1 个氨基酸变异位点 ꎬ 氨基酸变异位点对应于第 5 个 SNP 位点 ꎬ 第 1 第 2 第 3 第 4 SNP 位点并未引起氨基酸的改变 ꎮ 该结果为进一步研究 α 苦瓜素基因表达调控机制和不同单倍型编码蛋白功能差异奠定了基础 ꎮ 关键词 : 苦瓜 ꎻ α 苦瓜素基因 ꎻ 克隆 ꎻ 单倍型中图分类号 : S642.5 文献标识码 : A 文章编号 : (2017) The cloning and haplotype analysis of α momorcharin from bitter gourd LIU Zi ji 1 ꎬ SHEN Long bin 1 ꎬ ZHU Jie 2 ꎬ NIU Yu 1 ꎬ YANG Yan 1 (1.Tropical Crops Genetic Resources InstituteꎬChinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm En hancement in Southern ChinaꎬMinistry of Agricultureꎬ Danzhou ꎬChinaꎻ 2.Institute of Tropical Agriculture and ForestryꎬHainan Universityꎬ Haikou ꎬChina) Abstract: In order to reveal the whole gene structure and haplotype of α momorcharinꎬ 35 primary core germplasm of bitter gourd were used as materialsꎬ and the α momorcharin gene was cloned. The results showed that α momorcharin gene was 993 bp in lengthꎬ including 60 bp 5 UTRꎬ 72 bp 3 UTRꎬ and 861 bp ORFꎬ with no intronꎬ encoding 286 amino acids. α momorcharin protein contained a conserved domain of RIP protein. Phylogenetic analysis showed that in addition to P ꎬ the relationship between α momorcharin and 3MRW_A of Momordica balsamina was closestꎬ but the relationship between than α momorcharin and MAP30 was far. Five SNP loci were found by comparing the α momorcharin gene sequences of 35 bitter gourd germplasm. All of the five SNP loci were located in the coding region. Five haplotypes were found through SNP grouping in 35 bitter gourd germplasm. One amino acid mutation was found according to comparing the amino acid se quences encoded by the five haplotypesꎬ which was 收稿日期 : corresponding to the 5 th SNP lociꎬ the 1 stꎬ 2 ndꎬ 3 rd and 基金项目 : 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 ( th SNP loci did not cause amino acid changes. The results )ꎻ 国家自然科学基金项目 provides a basis for further study on the regulation mecha ( ) 作者简介 : 刘子记 (1982 )ꎬ 男 ꎬ 山东菏泽人 ꎬ 博士 ꎬ 副研究员 ꎬ 研究方向 : 蔬菜分子生物学及遗传育种 ꎮ ( E mail) liuziji1982@ nism of α momorcharin gene expression and the function difference of proteins encoded by different haplotypes. 163.com Key words: bitter gourdꎻ α momorcharin geneꎻ 通讯作者 : 杨衍 ꎬ(E mail)catasvegetable@ 126.com cloningꎻ haplotype

2 1118 江苏农业学报 2017 年第 33 卷第 5 期苦瓜 ( Momordica charantia L.) 又名锦荔枝赖葡萄 ꎬ 为葫芦科 ( Cucurbitaceae) 苦瓜属一年生草质藤本植物 ꎮ «本草纲目» 中记载苦瓜苦寒无毒除邪热解劳乏清心明目益气壮阳 ꎮ 大量研究结果表明 ꎬ 苦瓜含有多种活性成分 ꎬ 具有降血糖 [1] 抗癌 [2] 抗病毒 [3] [4] 增强免疫力等多种功效 ꎮ 核糖体失活蛋白 ( Ribosome inactivating pro teinsꎬrip) 是一类主要存在于植物中具有 RNA N 糖苷酶活性的毒蛋白 ꎬ 能够破坏延伸因子与核糖体的结合 ꎬ 将蛋白质的生物合成抑制在延伸阶段 [5] ꎮ RIP 包括 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 型 ꎬI 型 RIP 由分子量约为的单肽链蛋白组成 ꎻII 型 RIP 由一个类似 I 型 RIP 的酶活性 A 链和一个稍大的凝聚素 B 链组成 [6] ꎻIII 型 RIP 并不常见 ꎬ 仅在玉米和大麦中发现 [7] ꎮ 近年来 ꎬ 研究者从苦瓜中成功分离出了多种具有药用价值的化合物 ꎬ 包括 α 苦瓜素 β 苦瓜素 γ 苦瓜素 δ 苦瓜素和 MAP30 等 ꎬ 这些小分子蛋白均属于 Ⅰ 型 RIP [8] [9] ꎮ 其中 α 苦瓜素最早是由 Ng 等从苦瓜籽中分离出的一种分子量为的 Ⅰ 型 RIPꎬ 表现出多样的生物活性 ꎬ 作为具有开发价值的蛋白质 ꎬα 苦瓜素抗肿瘤抗病毒和抗真菌的活性受到研究者 [10] 的关注 ꎮ Ng 等的研究结果表明 α 苦瓜素具有抗 [11] 绒毛癌和 S180 肉瘤的活性 ꎮ 蔡秀清的研究结果证实重组表达 α 苦瓜素对增殖表皮癌细胞有明显 [12] 的生长抑制效应 ꎮ Pan 等的研究结果表明 α 苦瓜素具有预防和治疗鼻咽癌的功效 ꎮ Manoharan [13] 等研究发现 α 苦瓜素具有抗黑色素瘤和神经胶 [14] 质瘤的活性 ꎮ Zheng 等的研究结果表明 α 苦瓜 [15] 素具有抗 HIV 的活性 ꎮ 李双杰等的研究结果表明 α 苦瓜素能抑制急性柯萨奇 B3 病毒复制 ꎮ 魏周 [16] 玲等的研究结果证实异源表达 α 苦瓜素能够显著抑制烟草花叶病毒 ꎬ 激活植物防卫反应 ꎬ 且对植物 [17] 细胞无明显毒性 ꎮ Qian 等研究发现重组表达 α 苦瓜素蛋白可以增强水稻对稻瘟病菌的抗性 ꎮ [18] Wang 等研究结果表明重组表达 α 苦瓜素具有抑 [19] 制绿脓杆菌的活性 ꎮ 王书珍的研究结果证实重组表达 α 苦瓜素对尖镰孢腐皮镰孢和铜绿脓杆菌的生长有较强的抑制作用 ꎮ 以往研究多集中在重组表达 α 苦瓜素蛋白及其生物活性方面 ꎬ 而对其完整基因结构和单倍型分析的研究鲜有报道 ꎮ 本研究拟通过 NCBI 数据库获得 α 苦瓜素基因编码序列 ꎬ 通过与苦瓜基因组序列进行比对寻找目标区域 ꎬ 在目标区域两侧设计引物 ꎬ 获取完整的 α 苦瓜素基因序列 ꎬ 分析基因结构及编码蛋白结构 ꎻ 通过同源比对构建系统进化树 ꎬ 分析 α 苦瓜素蛋白与其他 RIP 蛋白的亲缘关系 ꎻ 比较不同苦瓜种质资源 α 苦瓜素基因序列 ꎬ 分析 α 苦瓜素基因单倍型 ꎬ 并对不同单倍型编码的蛋白质序列进行分析 ꎬ 以期为研究 α 苦瓜素基因表达调控机制和不同单倍型编码蛋白功能差异提供依据 ꎮ 1 材料与方法 1.1 材料供试苦瓜材料共 35 份 ꎬ 来源于苦瓜初级核心种质库 [20] ꎬ 其中 3 份 ( 种质编号 :Y5 Y7 Y16) 来自日本 ꎬ3 份 ( 种质编号 :Y39 Y43 Y50) 来自中国广东 ꎬ1 份 ( 种质编号 :Y58) 来自中国江西 ꎬ5 份 ( 种质编号 : Y60 Y66 Y69 Y72 Y77) 来自中国海南 ꎬ4 份 ( 种质编号 :Y83 Y85 Y87 Y90) 来自泰国 ꎬ3 份 ( 种质编号 :Y96 Y100 Y101) 来自中国云南 ꎬ1 份 ( 种质编号 :Y108) 来自中国湖南 ꎬ4 份 ( 种质编号 : Y112 Y113 Y115 Y121) 来自中国广西 ꎬ5 份 ( 种质编号 : Y122 Y124 Y131 Y134 Y139) 来自中国福建 ꎬ3 份 ( 种质编号 :Y140 Y141 Y144) 来自斯里兰卡 ꎬ3 份 ( 种质编号 :Y146 Y147 Y153) 来自印度 ꎮ 不同苦瓜种质资源农艺性状遗传多样性及核心种质亲缘关系分析结果见文献 [21]ꎮ 试验于 2016 年 9 月初在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所试验基地进行 ꎬ 将供试苦瓜种子用 50 温水处理 30 minꎬ 常温浸种 12 h 后 ꎬ 播种于营养钵中 ꎬ 按照常规方法管理 ꎮ 待苦瓜长至 3 叶 1 心时 ꎬ 摘取叶片贮于 -20 冰箱备用 ꎮ 1.2 方法 [22] 基因组 DNA 提取采用改良的 CTAB 法提取待测苦瓜材料的基因组 DNAꎮ α 苦瓜素基因组序列分离根据 GenBank α 苦瓜素编码序列 X 比对苦瓜基因组序列 [23] ꎬ 该编码序列对应于 Scaffold_175ꎬ 为了获得完整的 α 苦瓜素基因组序列 ꎬ 利用软件 Primer 5.0 在编码序列的两侧设计引物 ( 表 1)ꎬ 获取编码序列在内的 1 kb 左右的序列 ꎮ 以苦瓜材料 Y5 基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增 ꎬ 采用离心柱型琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 ( Omega gel extraction kitꎬ 美国 ) 回收目的条带 ꎬ 将目的条带连接到北京全式金生物技

3 刘子记等 : 苦瓜 α 苦瓜素基因克隆与单倍型分析 1119 术有限公司的 peasy T5 载体上 ꎬ 转化感受态细胞 Trans1 T1ꎬ 筛选出阳性克隆 ꎬ 委托广州英韦创津生物科技有限公司测序 ꎮ 表 1 扩增 α 苦瓜素基因引物序列 Table 1 The primer sequence used for amplifying α momorcharin 引物名称正向引物序列 (5 3 ) 反向引物序列 (5 3 ) AlphaTD1 GCAAAGCCATGAGGGT AAGGGAAATAAAACAC AlphaTD2 GCGGTACAACATGAGA GTTGTAGTTGCTACCTC AlphaTD3 TCCAAAAGCAAAGCCATGAGGG TGATAAAGGGAAATAAAACACACTT PCR 反应体系为 20 μlꎬ 其中包括 12 μl Premix Taq TM ( 宝生物工程有限公司产品 )ꎬ1 μmol / L 引物 ꎬ 150 ng 模板 DNAꎮ 扩增程序为 94 预变性 5 minꎻ 94 变性 1 minꎬ55 退火 1 minꎬ72 延伸 1. 5 minꎬ35 个循环 ꎬ72 终延伸 10 minꎬpcr 产物于 10 保存 ꎮ 20 μl 扩增产物与 3 μl 上样缓冲液 2 μl UltraPower DNA 染料混合经 1.5% 琼脂糖凝胶于 110 V 电泳 30 minꎬ 显色进行带型统计 ꎮ α 苦瓜素基因生物信息学分析利用在线软件 FGENESH( http: / / linux1. softberry. com / berry. pht ml? topic = fgenesh&group = programs&subgroup = gfind) 和 GENSCAN ( http: / / genes. mit. edu / GEN SCAN.html) 分析 α 苦瓜素基因结构 ꎮ 利用在线软件 ProtParam ProtScale SignalP4. 1 TMHMM JPRED4 PSIPRED InterPro 分析 α 苦瓜素基因编码蛋白的氨基酸序列亲疏水性信号肽跨膜结构等 ꎮ 根据 α 苦瓜素蛋白序列在线进行 Blastp 同源性搜索 ꎬ 获得与 α 苦瓜素相似度较高的其他物种的蛋白序列 ꎬ 采用 MEGA6.06 软件基于邻近相连法绘制系统进化树 ꎬ 并进行 Bootstrap 检测 ꎬ 系统树分支的置信度 ꎬ 采用重复抽样分析方法 ꎬ 重复抽样次数为次 ꎮ α 苦瓜素基因单倍型分析以不同苦瓜种质基因组 DNA 为模板 ꎬ 扩增 α 苦瓜素基因 ꎬ 目的片段经回收连接转化测序 ꎬ 采用 BioEdit 软件进行多序列比对分组 ꎬ 分析 α 苦瓜素基因单倍型 ꎮ 2 结果与分析 2.1 α 苦瓜素基因全长的克隆从 NCBI 数据库中获得 α 苦瓜素基因相关片段 X ꎬ 通过与苦瓜基因组序列比对 ꎬ 序列对应于 Scaffold_175ꎬ 为了获得完整的 α 苦瓜素基因序列 ꎬ 利用软件 Primer 5.0 在对应序列的两侧设计引物 ꎬ 其中引物 AlphaTD3 能够在供试苦瓜材料 Y5 中成功扩增 ꎬPCR 扩增产物经回收克隆测序 ꎬ 共获得 bp 的序列 ꎬ 序列经 FGENESH 基因结构分析 ꎬ 结果表明 ꎬα 苦瓜素基因 cdna 全长 993 bp( 图 1)ꎬ 包括 60 bp 的 5 UTRꎬ72 bp 的 3 UTRꎬ861 bp 的 ORFꎬ 无内含子序列 ꎮ 为了提高分析的准确性 ꎬ 本研究另外采用 GENSCAN 软件再次进行 α 苦瓜素基因结构分析 ꎬ 其预测的 α 苦瓜素基因 CDS 序列及编码的氨基酸序列同 FGENESH 预测结果完全一致 ꎮ CDSo 是编码序列 ꎻPolA 是多聚腺苷酸 ꎻTSS 转录起始位点 ꎮ 图 1 α 苦瓜素基因结构 Fig.1 The structure of α momorcharin gene

4 1120 江苏农业学报 2017 年第 33 卷第 5 期 2.2 α 苦瓜素基因编码氨基酸序列的生物信息学分析经 FGENESH 分析 ꎬ α 苦瓜素基因 ( Y5) 编码 286 个氨基酸 ꎮ ProtParam 软件分析结果表明 ꎬα 苦瓜素蛋白分子式为 C 1422 H 2252 N 382 O 419 S 4 ꎬ 氮端为 Metꎬ 相对分子质量为 ꎬ 理论等电点 ( pi ) 为 9 13ꎬ 负电荷残基 ( Asp+Glu) 为 24 个 ꎬ 正电荷残基 (Arg+Lys) 为 28 个 ꎬ 脂肪系数为 ꎬ 总平均亲水性为 0 016ꎬ 不稳定指数为 29 33ꎬ 属于稳定蛋白 ꎬ 半衰期大于 10 hꎮ 经 ProtScale 软件分析 ꎬ8 个高分值峰 (Scale> 1 0)ꎬ 分别分布在 6 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 260 等区域 ꎬ 这些区域属于高疏水性 ꎬ11 个低分值峰 (Scale< 0)ꎬ 分别分布在 30 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 282 等区域 ꎬ 这些区域属于高亲水区域 ꎬ 推测该蛋白为亲水性蛋白 ꎮ SignalP4 1 分析结果表明 α 苦瓜素蛋白具有信号肽 ꎬ 属于分泌蛋白 ꎬ 切割位点位于第 23 和 24 氨基酸之间 ꎮ 采用 TargetP1.1 对 α 苦瓜素蛋白进行亚细胞定位预测 ꎬ 结果显示 α 苦瓜素蛋白定位在分泌路径 ( SP 值为 0 934)ꎮ 经 TMHMM 程序分析 ꎬα 苦瓜素蛋白不含跨膜结构域 ꎮ 结合 JPRED4 和 PSIPRED 预测 α 苦瓜素蛋白二级结构显示 ꎬα 苦瓜素蛋白包含有 13 处 α 螺旋 ꎬ12 处 β 折叠 ꎬ3 处 β 转角 ꎮ 该蛋白 24 ~ 265 区间具有核糖体失活蛋白结构域 ꎮ 经 UniProtKB 分析 ꎬα 苦瓜素蛋白存在 1 个 RNA N 糖苷酶活性位点 ꎬ 位于第 183 位点 ꎮ 2.3 α 苦瓜素蛋白系统进化树分析 α 苦瓜素 ( Y5) 蛋白质序列经 NCBI 数据库比对 ꎬ 结果表明 ꎬ 与苦瓜 P 的序列相似度为 100%ꎬ 与胶苦瓜 ( Momordica balsamina ) 的 RIP ( 3MRW _ A ) 相似度为 94%ꎬ 与苦瓜 MAP30 ( AAB ) 相似度为 53%ꎬ 与无棱丝瓜 ( Luffa aegyptiaca)β 丝瓜素 ( CAA ) 相似度为 67%ꎬ 与无棱丝瓜 (Luffa aegyptiaca) α 丝瓜素 (Q ) 相似度为 70%ꎬ 与有棱丝瓜 ( Luffa acutangula) RIP (P ) 的相似度为 72%ꎬ 与栝楼 ( Trichosanthes kirilowii)karasurin RIP(P ) 相似度为 63%ꎬ 与栝楼天花粉蛋白 ( TCS) ( AAA ) 的相似度为 64%ꎬ 与南瓜 (Cucurbita moschata)rip(3bwh_a) 的相似度为 59%ꎬ 与异株泻根 ( Bryonia dioica) RIP (P ) 的相似度为 67%ꎮ 利用 MEGA6.06 软件 ꎬ 将 α 苦瓜素蛋白 (Y5) 与其他 10 种 RIP 蛋白进行系统发育树构建 ꎬ 结果 ( 图 2) 表明 ꎬα 苦瓜素 (Y5) 蛋白与苦瓜 P 胶苦瓜 3MRW_A 核糖体失活蛋白聚为一组 ꎬ 亲缘关系最近 ꎮ 栝楼 P 和 AAA ꎬ 丝瓜 CAA Q 和 P 分别聚为一组 ꎬ 这些 RIP 可能由种内基因重复产生 ꎮ α 苦瓜素蛋白 (Y5) 与苦瓜 AAB 蛋白的亲缘关系较远 ꎬ 表明 α 苦瓜素蛋白与 MAP30 蛋白虽同属 RIPꎬ 但分化时间较早 ꎮ 与 MAP30 相比 ꎬ 栝楼天花粉蛋白 AAA 与 α 苦瓜素的亲缘关系较近 ꎮ 图 2 Fig.2 苦瓜 α 苦瓜素 (Y5) 与其他物种 RIP 蛋白的系统进化分析 Phylogenetic relationship among α momorcharin ( Y5) and RIP proteins from other plants

5 刘子记等:苦瓜 α 苦瓜素基因克隆与单倍型分析２.４ α 苦瓜素基因单倍型分析以ＡｌｐｈａＴＤ３为引物ꎬ以其余３４份苦瓜种质基因组ＤＮＡ为模板进行扩增ꎬ回收目的片段进行测序ꎬ以 α 苦瓜素( Ｙ５) 为参考序列进行比对ꎬ在 α 苦瓜素基因组区域共发现５个ＳＮＰ位点ꎬ分别是２６７位点的Ｔ / Ａꎬ ３０６位点的Ｃ / Ａꎬ ３１２位点的Ａ / Ｇꎬ ８４０位点的Ａ / Ｃꎬ ９０３位点的Ｔ / Ｇꎬ５个ＳＮＰ位点１１２１位点的Ｔ / Ａꎻ第三组共包括２个ＳＮＰ位点ꎬ分别是２６７位点的Ｔ / Ａꎬ ９０３位点的Ｔ / Ｇꎻ第四组共包括５个ＳＮＰꎬ 分别是２６７位点的Ｔ / Ａꎬ ３０６位点的Ｃ / Ａꎬ ３１２位点的Ａ / Ｇꎬ ８４０位点的Ａ / Ｃꎬ ９０３位点的Ｔ / Ｇꎻ第五组共包括４个ＳＮＰꎬ分别是２６７位点的Ｔ / Ａꎬ ３１２位点的Ａ / Ｇꎬ ８４０位点的Ａ / Ｃꎬ ９０３位点的Ｔ / Ｇꎮ 其中来源于日本的资源均属于第均位于编码区( 图３) ꎮ 通过ＳＮＰ分组发现ꎬ３５份苦一组ꎬ来源于广西和斯里兰卡的资源均属于第三组ꎬ 中Ｙ５Ｙ７Ｙ１６Ｙ３９Ｙ５８属于第一组ꎻ Ｙ４３Ｙ５０以 α 苦瓜素( Ｙ５) 编码的蛋白质序列为参考ꎬ对瓜种质资源 α 苦瓜素基因共存在５种单倍型ꎮ 其来源于印度的资源均属于第四组ꎮ Ｙ９０Ｙ１０１Ｙ１０８Ｙ６０Ｙ６６属于第二组ꎻ Ｙ１１３５种单倍型编码的蛋白质序列进行比对ꎬ结果 ( 图Ｙ１３４属于第三组ꎻ Ｙ７７Ｙ８３Ｙ９６Ｙ１３１Ｙ１３９Ｈ / Ｑꎬ氨基酸变异位点对应于第５个ＳＮＰ位点ꎬ第Ｙ１１５Ｙ１４０Ｙ１４１Ｙ１４４Ｙ１００Ｙ１１２Ｙ１２１Ｙ１２２Ｙ１４６Ｙ１４７Ｙ１５３属于第四组ꎬＹ６９Ｙ７２Ｙ８５Ｙ８７Ｙ１２４属于第五组ꎬ第二组存在１个ＳＮＰ位点ꎬ ２６７图３Ｆｉｇ.３３ＴｈｅＳＮＰｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆ α ｍｏｍｏｒｃｈａｒｉｎｇｅｎｅｉｎｂｉｔｔｅｒｇｏｕｒｄｇｅｒｍｐｌａｓｍ和抗肿瘤 [３０] 功效ꎬ吸引了众多研究者的广泛关注和深入研究ꎮ 苦瓜性味苦寒ꎬ具有清心涤热明目解毒之功效ꎮ α 苦瓜素是从苦瓜籽中提取的蛋白ꎬ属于Ｉ型ＲＩＰ解酶 ꎬ具有Ｎ糖苷酶 [２７] 免疫抑制１第２第３第４ＳＮＰ位点并未引起氨基酸的改变ꎮ 不同苦瓜种质 α 苦瓜素基因ＳＮＰ分布讨论 [２４] ４) 显示ꎬ共存在１个氨基酸变异位点ꎬ为第２８１位 [２８] [２５] ＲＮＡ水解酶 [２６] ＤＮＡ水等活性ꎬ具有显著的抗病毒 [２９] 为了进一步明确 α 苦瓜素基因的完整结构ꎬ本试验从苦瓜中克隆出全长 α 苦瓜素基因序列ꎬ包括６０ｂｐ的５ＵＴＲꎬ７２ｂｐ的３ＵＴＲꎬ８６１ｂｐ的ＯＲＦꎬ 以往研究多集中在编码区序列ꎬ本研究获取的 α 苦

6 1122 江苏农业学报 2017 年第 33 卷第 5 期图 4 Fig.4 不同 α 苦瓜素基因单倍型编码蛋白质 The protein sequence of α momorcharin with different haplotypes 瓜素基因 5 UTR 和 3 UTR 区可为研究 α 苦瓜素基因的表达调控奠定基础 ꎮ α 苦瓜素蛋白结构分析发现 ꎬα 苦瓜素蛋白存在核糖体失活蛋白结构域和 1 个 RNA N 糖苷酶活性位点 ꎬ 进一步证明该蛋白属于核糖体失活蛋白 ꎮ 将 α 苦瓜素蛋白 (Y5) 与其他 10 种 RIP 蛋白进行系统进化分析 ꎬ 结果表明 ꎬ 苦瓜 α 苦瓜素 ( Y5) 蛋白与苦瓜 P 胶苦瓜 3MRW_A 聚为一组 ꎬ 亲缘关系最近 ꎮ 其中 P 为已报导的 α 苦瓜素蛋白序列 [31] ꎬα 苦瓜素 (Y5) 与 P 的相似性达 100%ꎬ 进一步验证了本研究克隆的基因为 α 苦瓜素基因 ꎮ 与葫芦科其他植物的 RIP 蛋白相比 ꎬα 苦瓜素 (Y5) 蛋白与丝瓜 RIP CAA Q 和 P 的亲缘关系较近 ꎬ 而与苦瓜 MAP30 蛋白的亲缘关系较远 ꎮ 通过分析 35 份苦瓜种质 α 苦瓜素基因序列 ꎬ 共发现 5 个 SNP 位点 ꎬ5 个 SNP 均位于编码区 ꎬ 通过 SNP 分组发现 ꎬ35 份苦瓜种质资源共存在 5 种单倍型 ꎮ 其中来源于日本的资源均属于第一组 ꎬ 来源于广西和斯里兰卡的资源均属于第三组 ꎬ 来源于印度的资源均属于第四组 ꎮ 该研究结果表明 ꎬα 苦瓜素基因 SNP 变异与来源地存在一定关系 ꎬ 但同样存在来源地相同 ꎬSNP 变异不同的情况 ꎬ 这可能是由于长期引种和人工选择的原因造成的 ꎮ 与以往发表的 α 苦瓜素部分基因序列 (X [31] HE AY ) 相比 ꎬ 其中第 2 第 5 SNP 位点从未报道 ꎬ 第 1 SNP 位点在 X 和 AY 中存在 ꎬ 第 3 SNP 位点在 AY 中存在 ꎬ 第 4 SNP 位点在 AY 中存在 ꎮ 对 α 苦瓜素 5 种单倍型编码的蛋白质序列进行比对 ꎬ 结果显示 ꎬ 共存在 1 个氨基酸变异位点 ꎬ 氨基酸变异位点对应于第 5 SNP 位点 ꎮ 该氨基酸变异位点是否影响 α 苦瓜素蛋白的功能特性还有待于进一步研究 ꎮ 参考文献 : [1] YANG S Jꎬ CHOI J Mꎬ PARK S Eꎬ et al. Preventive effects of bitter melon ( Momordica charantia) against insulin resistance and diabetes are associated with the inhibition of NF κb and JNK path ways in high fat fed OLETF rats [ J]. J Nutr Biochemꎬ 2015ꎬ 26 (3): [2] ZHANG C Zꎬ FANG E Fꎬ ZHANG H Tꎬ et al. Momordica Cha rantia lectin exhibits antitumor activity towards hepatocellular car cinoma [J]. Invest New Drugsꎬ 2015ꎬ 33(1): [3] MCGRATH M Sꎬ HWANG K Mꎬ CALDWELL S Eꎬ et al. GLQ223: an inhibitor of human immunodeficiency virus replication in acutely and chronically infected cells of lymphocyteand mononuclea phagocyte lineage [J]. Proc Natl Acad Sci USAꎬ 1989ꎬ 86(8): [4] PANDA B Cꎬ MONDAL Sꎬ DEVI K Sꎬ et al. Pectic polysaccha ride from the green fruits of Momordica charantia ( Karela): struc tural characterization and study of immunoenhancing and antioxi dant properties [ J]. Carbohydr Resꎬ 2015ꎬ 401: [5] STIRPE Fꎬ BARBIERI Lꎬ BATTELLI M Gꎬ et al. Ribosome inac tivating proteins from plants: present status and future prospects [ J]. Nature Biotechnologyꎬ 1992ꎬ 10(4): [6] GIRBES Tꎬ FERRERAS J Mꎬ ARIAS F Jꎬ et al. Descriptionꎬ dis tributionꎬ activity and phylogenetic relationship of ribosome inacti vating proteins in plantsꎬ fungi and bacteria [J]. Mini Reviews in Medicinal Chemistryꎬ 2004ꎬ 4(5): [7] 李建国. 核糖体失活蛋白的研究进展 [ J]. 分子植物育种 ꎬ 2005ꎬ3(4): [8] 孟尧 ꎬ 姚兴川 ꎬ 王殊睿 ꎬ 等. 抗 α 苦瓜素单克隆抗体的制备与鉴定 [J]. 生物医学工程学杂志 ꎬ2011ꎬ28(6): [9] NG T Bꎬ WONG C Mꎬ LI W Wꎬ et al. Isolation and characteriza tion of a galactose binding lectin with insulinomimetic activities [J]. Int J Pept Protein Resꎬ 1986ꎬ 28(2): [10] NG T Bꎬ LIU W Kꎬ SZE S Fꎬ et al. Action of alpha momorcharinꎬ a ribosome inactivating proteinꎬ on cultured tumor cell lines [ J]. Gen Pharmacolꎬ 1994ꎬ 25(1): [11] 蔡秀清. α 苦瓜素在毕赤酵母中表达及生物活性分析 [ D]. 海口 : 华南热带农业大学 ꎬ2005. [12] PAN W Lꎬ WONG J Hꎬ FANG E Fꎬ et al. Preferential cytotoxicity of the type I ribosome inactivating protein alpha momorcharin on

7 刘子记等 : 苦瓜 α 苦瓜素基因克隆与单倍型分析 1123 human nasopharyngeal carcinoma cells under normoxia and hypoxia [J]. Biochem Pharmacolꎬ 2014ꎬ 89(3): [13] MANOHARAN Gꎬ JAISWAL S Rꎬ SINGH J. Effect of αꎬ β mo morcharin on viabilityꎬ caspase activityꎬ cytochrome c release and on cytosolic calcium levels in different cancer cell lines [ J]. Mol Cell Biochemꎬ 2014ꎬ 388(1 / 2): [14] ZHENG Y Tꎬ BEN K Lꎬ JIN S W. Alpha momorcharin inhibits HIV 1 replication in acutely but not chronically infected T lympho cytes [ J]. Pharmacologica Sinicaꎬ 1999ꎬ 20(3): [15] 李双杰 ꎬ 王佐 ꎬ 邓晖 ꎬ 等. 苦瓜素对柯萨奇 B3 病毒核糖核酸的作用及其机制 [J]. 实用儿科临床杂志 ꎬ2004ꎬ19(7): [16] 魏周玲 ꎬ 彭浩然 ꎬ 潘琪 ꎬ 等. 核糖体失活蛋白 ( α MC) 亚细胞定位及对 TMV 的抑制作用 [ J]. 中国农业科学 ꎬ2017ꎬ50(5): [17] QIAN Qꎬ HUANG Lꎬ YI Rꎬ et al. Enhanced resistance to blast fungus in rice ( Oryza sativa L.) by expressing the ribosome inacti vating protein α momorcharin [J]. Plant Sciꎬ 2014ꎬ 217 / 218: 1 7. [18] WANG Sꎬ ZHANG Yꎬ LIU Hꎬ et al. Molecular cloning and func tional analysis of a recombinant ribosome inactivating protein ( al pha momorcharin) from Momordica charantia [ J]. Appl Microbiol Biotechnolꎬ 2012ꎬ 96(4): [19] 王书珍. 重组核糖体失活蛋白 alpha 苦瓜素的生物学活性分析 [D]. 武汉 : 武汉大学 ꎬ2013. [20] 刘子记 ꎬ 牛玉 ꎬ 朱婕 ꎬ 等. 苦瓜核心种质资源构建方法的比较 [J]. 华南农业大学学报 ꎬ2017ꎬ38(1): [21] LIU Z Jꎬ NIU Yꎬ ZHU Jꎬ et al. Study on genetic diversity of agro nomic traits and genetic relationships among core collections of bit ter gourd[j]. Agricultural Science & Technologyꎬ 2016ꎬ 17(5): [22] 刘子记 ꎬ 牛玉 ꎬ 杨衍. 热研一号油绿苦瓜种子纯度的 SSR 鉴定 [J]. 热带作物学报 ꎬ2013ꎬ34(11): [23] URASAKI Nꎬ TAKAGI Hꎬ NATSUME Sꎬ et al. Draft genome se quence of bitter gourd ( Momordica charantia) ꎬ a vegetable and medicinal plant in tropical and subtropical regions [ J]. DNA Resꎬ 2017ꎬ 24(1): [24] WANG H Xꎬ NG T B. Ribosome inactivating protein and lectin from bitter melon ( Momordica charantia) seeds: sequence com parison with related proteins [J]. Biochem Bioph Res Coꎬ 1998ꎬ 253(1) : [25] FONG W Pꎬ POON Y Tꎬ WONG T Mꎬ et al. A highly efficient procedure for purifying the ribosome inactivating proteins alpha and beta momorcharins from Momordica charantia seedsꎬ N termi nal sequence comparison and establishment of their N glycosidase activity [J]. Life Sciꎬ 1996ꎬ 59(11): [26] MOCK J Wꎬ NG T Bꎬ WONG R Nꎬ et al. Demonstration of ribo nuclease activity in the plant ribosome inactivating proteins alpha and beta momorcharins [ J]. Life Sciꎬ 1996ꎬ 59 ( 22 ): [27] WANG Sꎬ ZHENG Yꎬ YAN Jꎬ et al. Alpha momorcharin: a ribo some inactivating protein from Momordica charantiaꎬ possessing DNA cleavage properties [J]. Protein Pept Lettꎬ 2013ꎬ 20(11): [28] LEUNG S Oꎬ YEUNG H Wꎬ LEUNG K N. The immunosuppres sive activities of two abortifacient proteins isolated from the seeds of bitter melon ( Momordica charantia) [ J]. Immunopharmacologyꎬ 1987ꎬ 13(3): [29] MENG Yꎬ LIN Sꎬ LIU Sꎬ et al. A novel method for simultaneous production of two ribosome inactivating proteinsꎬ alpha MMC and MAP30ꎬ from Momordica charantia L. [ J]. PLoS ONEꎬ 2014ꎬ 9: e [30] BIAN Xꎬ SHEN Fꎬ CHEN Yꎬ et al. PEGylation of alpha momor charin: synthesis and characterization of novel anti tumor conju gates with therapeutic potential [ J]. Biotechnology Lettersꎬ 2010ꎬ 32(7): [ 31] HO W Kꎬ LIU S Cꎬ SHAW P Cꎬ et al. Cloning of the cdna of al pha momorcharin: a ribosome inactivating protein [ J]. Biochim Biophys Actaꎬ 1991ꎬ 1088(2): ( 责任编辑 : 陈海霞 )

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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