布麻 ) [5] 而植物学界对罗布麻基原的种属存有争议, 在中国植物志中将罗布麻 A Venetum 归在罗布麻属, 白麻 P pictum 及大叶白麻 P hendersoni 则归白麻属 [6],FloraofChina( 植物分类数据库 ) 则取消了白麻属, 将白麻 P pictum 归入

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滨戎
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1 ５年月第７卷第期中国现代中药ＭＣＭＯ５Ｖ７Ｎ专题基于ＩＴＳＨ及ｍＫ序列的罗布麻资源分子系统学研究谭秀芳樊丛照李晓瑾李阳辛雅仙新疆医科大学药学院新疆乌鲁木齐８新疆维吾尔自治区中药民族药研究所新疆乌鲁木齐８摘要目的从分子生物学角度研究罗布麻属植物种间差异为确定新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准ＴＳＨ及ｍＫ序列对罗布麻白麻及大叶白麻５５份样品中的植物基原提供依据方法采用ＤＮＡ条形码Ｉ进行ＰＣＲ扩增并双向测序比较种内种间变异基于ＫＰ模型进行遗传距离分析并构建ＮＪ系统树结果罗布麻白麻及大叶白麻ＩＴＳ序列种内及种间ＫＰ遗传距离无显著差异ＮＪ树聚为一支罗布麻与白麻及大叶白麻之间Ｈ和ｍＫ序列种内最大ＫＰ遗传距离明显小于种间最小ＫＰ遗传距离ＮＪ树显示罗布麻与白麻及大叶白麻均单独聚为一支白麻与大叶白麻Ｈ和ｍＫ序列无差异ＮＪ树均为一支结论基于ＩＴＳＨ及ｍＫ序列鉴定结果新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准将药材罗布麻的基原定为大叶白麻Ｐｍ值得商榷关键词罗布麻ＤＮＡ条形码基原ＩＴＳＨｍＫＭＳｍＳＡｍＲＢＩＴＳＨｍＫＳｑＴＡＮＸＦＡＮＣｚＬＩＸＷＡＮＧＱＬＹＸＩＮＹｘＣＰｍＸＭＵＵｍｑ８ＣＸＩＣＭＭＥＭＵｍｑ８ＣＡＯＴＡｍｗｍｍｍＵｍＬｍＭＦｍＡｍｍＰｍｍＰｗｍｑｗｍＤＮＡＩＴＳＡＨｍＫＧｗＮＪｗｋｍｍＫＰｍＲＴＩＴＳｑｗｗＮＪＴｗｗｗＡｍｗＡｍｍｗＮＪＮｗｗＰｍＰＮＪＣＩｑＰｗＵｍＬｍＵＭＳＸＵＡｍＲＫｗＡｍｍＤＮＡＩＴＳＨｍＫ７４８９５罗布麻ＡｍｍＬ系夹竹桃科新疆维吾尔自治区中药维吾尔药饮片炮制规范Ａ罗布麻属多年生宿根草本植物药用部中收载罗布麻基原为罗布麻Ａｍ４新位为花和叶具有抗氧化降压抗抑郁强心疆维吾尔自治区维吾尔药材标准收载罗布麻抗菌等作用中华人民共和国药典版及基原则为大叶白麻Ｐｍ俗称大花罗基金项目乌鲁木齐市科技局科技攻关项目Ｇ４通信作者李晓瑾研究员研究方向中药资源学Ｔ９９５４Ｅｍｘｘｍ９９７

2 布麻 ) [5] 而植物学界对罗布麻基原的种属存有争议, 在中国植物志中将罗布麻 A Venetum 归在罗布麻属, 白麻 P pictum 及大叶白麻 P hendersoni 则归白麻属 [6],FloraofChina( 植物分类数据库 ) 则取消了白麻属, 将白麻 P pictum 归入罗布麻属, 而未记载大叶白麻 P hendersoni [7] 这种学术分歧直接影响新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准对罗布麻基原表述的权威性和准确性, 因此, 进一步明确罗布麻种属, 对维吾尔药材标准的制定及维吾尔药材的标准化现代化具有重要的意义 [8] DNA 条形码鉴定技术应用于物种鉴定已成为 [9 10] 植物学界共识,Kres 等建议将核基因 ITS 序列及叶绿体间隔区 psba trnh 作为条形码, 对开花植物进行鉴定 ; 中国植物条形码工作组建议将 ITS/ITS2 作为种子植物核心条形码 [11] [12 14] ; 陈士林等建立了以 ITS/ITS2 为主体,psbA trnh 为辅的中药材鉴定体 [15 17] 系,Lahaye 等证明叶绿体基因 matk 序列在某些类群中种间种下的系统进化研究提供了一定的价值张 [18 19] 卫明等基于 ITS trnl 和 trnl F 序列, 鉴定了罗布麻白麻及大叶白麻 ITS 序列不能将三者区分 ;trnl 和 trnl F 序列可区分罗布麻与白麻为进一步明确罗布麻各种之间的关系, 本研究采用 DNA 条形码 ITS psba trnh 及 matk 序列, 进一步检测分析三者之间的差异, 为明确维吾尔药材罗布麻的基原, 提供科学依据 1 材料与方法 1 1 实验材料本研究的 55 份实验样品叶片收集于新疆各地及药材市场, 样品由新疆维吾尔自治区中药民族药研究所王果平副研究员鉴定凭证标本保存于新疆中药民族药研究所标本馆 ( 新疆 XTNM), 实验所获得的单倍型序列已提交至 GenBank, 详见表 1 植物名标本号采集地罗布麻 A venetum 表 1 实验材料信息 GenBank 号 ITS psba trnh matk 奇台县 KP KP KP 阿勒泰市 KP KP KP 轮台县铁热克巴扎乡 KP KP KP 巴州焉春县永宁镇 KP KP KP 阿勒泰 KP KP KP 洛浦县 KP KP KP 昌吉县阜康北庭 222 团 KP KP KP 新疆乌兰乡五队 KP KP KP 博湖县壹干诺尔乡 KP KP KP 巴州焉春县 KP KP KP 巴州市轮台县布拉克乡 KP KP KP 焉耆县包尔海 KP KP KP 新疆阳霞赛曼勒村第二组 KP KP KP 轮台县铁热克巴扎乡 KP KP KP 洛浦县 KP KP KP 于田县 KP KP KP 策勒县 KP KP KP 昌吉县吉木萨尔新地乡 KP KP KP 白麻民丰县 KP KP KP P pictum 二道桥药材市场 KP KP KP 二道桥药材市场 KP KP KP 阿勒泰市 KP KP KP152499

3 表 1( 续 ) GenBank 号植物名标本号采集地 ITS psba trnh matk 白麻新疆北大渠县 KP KP KP P pictum 轮台县铁热克巴扎乡 KP KP KP 巴州市轮台县草湖乡 KP KP KP 奇台县红旗农场 KP KP KP 吉木萨尔县五彩湾加油站 KP KP KP 昌吉木垒乡胡杨林 KP KP KP 阜康县北庭 222 团 KP KP KP 巴州市轮台县 KP KP KP 巴州市轮台县布拉克乡 KP KP KP 田市洛浦县 KP KP KP 和田市 KP KP KP 于田县 KP KP KP 于田县 KP KP KP 民丰县 KP KP KP 民丰县 KP KP KP 安徽雷允上国药有限公司 KP KP KP 安徽贺林中药饮片有限公司 KP KP KP 毫州是中正中药材饮片公司 KP KP KP 二道桥药材市场 KP KP KP 轮台阳霞镇齐草布鲁克 KP KP KP 二道桥药材市场 KP KP KP 大叶白麻 P hendersoni 和静开泽村 KP KP KP 和静协比尔不乎乡 KP KP KP 和田市洛浦县杭桂乡 KP KP KP 和田市洛浦县恰尔巴格乡 KP KP KP 和田市洛浦县杭桂乡 KP KP KP 洛浦县什托格拉克乡 KP KP KP 新疆北大渠县 KP KP KP 新疆北大渠县 KP KP KP 和田市洛浦县杭桂乡 KP KP KP 和田市洛浦县杭桂乡 KP KP KP 和田市洛浦县多鲁乡 KP KP KP 巴州 KP KP KP 试剂 PCR 扩增所用引物由上海生工生物工程合成,DNA 提取试剂盒 DNA 聚合酶及 dntp 等均购自天根生化科技有限公司实验仪器 DNA 提取研磨仪 (GT 100), 北京格瑞德曼仪器设备有限公司 ; 离心机 (AnkerTGL 16C), 上海安亭科学仪器 ; PCR 扩增仪 ( PCR), 德国 AnAnalytikJena 公司 999

4 1 2 方法 1 2 1DNA 提取及检测称取干燥叶片 30mg,DNA 提取研磨仪 1000r min -1 研磨 2min, 植物 DNA 提取试剂盒提取总 DNA,1% 琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 的质量 1 2 2PCR 扩增及测序 ITS psba trnh 及 matk 序列 PCR 扩增引物反应体系及反应条件参见中药 DNA 条形码分子鉴定 [20],PCR 扩增产物经琼脂糖电泳检测并纯化后, 使用 ABI3730XL(Applied BiosystemsCo,USA) 测序仪进行双向测序 1 3 数据处理测序峰图用 CodonCodeAlignerV4 0 4(Codon CodeCo,USA) 校对拼接, 去除引物区将所有序列由软件 MEGA5 1(molecularevolutionarygenetics analysis) 分析比对 [21], 基于 K2P 模型分析种内和种间变异 [22] 选择不同单倍型序列, 用邻接 (NJ) 法构建系统聚类树, 使用 bootstrap(1000 次重复 ) 检验各分支的支持率 [23] 2 结果 2 1 序列信息及变异结果罗布麻白麻和大叶白麻实验样本的 ITS 序列长度变化范围为 bp, 单倍型数分别为 ,GC 含量为 61 0~61 3%;psbA trnh 序列长度变化范围为 bp, 单倍型数分别为 3 5 1,GC 含量为 34 4~36 5%;matK 序列长度均为 bp, 单倍型数分别为 3 4 1,GC 含量为 34 2% ~34 6%, 详见表 2 植物名样本数表 2 样品 ITS psba trnh 及 matk 序列特征 ITS psba trnh matk 长度 bp 单倍型 GC 含量 (%) 长度 bp 单倍型 GC 含量 (%) 长度 bp 单倍型 GC 含量 (%) 罗布麻 ~ ~ ~ ~ ~ 白麻 ~ ~ ~ ~34 4 大叶白麻 ~ ~ 种内及种间 K2P 距离分析罗布麻白麻及大叶白麻种内 K2P 距离如表 3 所示, 罗布麻 ITS 序列种内最大 K2P 距离为 0 004, 平均值为 ; 白麻 ITS 序列种内最大 K2P 距离为 0 003, 平均值为 0 001; 大叶白麻种内最大 K2P 距离为 0 004, 平均值为罗布麻 psba trnh 序列种内最大 K2P 距离为 0 003, 平均值为 0 002; 白麻 psba trnh 序列种内最大 K2P 距离为 0 007, 平均值为 0 004; 大叶白麻 psba trnh 序列种内无变异罗布麻 matk 序列种内最大 K2P 距离为 0 001, 平均值为 ; 白麻 matk 序列种内最大 K2P 距离为 0 006, 平均值为 0 003; 大叶白麻 matk 序列种内无变异表 3 ITS psba trnh 及 matk 序列种内 K2P 距离比较植物名 ITS( 平均 ) psba trnh( 平均 ) matk( 平均 ) 罗布麻 0~0 004(0 0013)0~0 003(0 002)0~0 001(0 0006) 白麻 0~0 003(0 001) 0~0 007(0 004)0~0 006(0 003) 大叶白麻 0~0 004(0 001) 0 0 罗布麻与白麻种间 ITS 序列种间最小 K2P 距离为 0, 平均值为 0 009; 罗布麻与大叶白麻 ITS 序列种间最小及平均 K2P 距离均为 0 007; 白麻与大叶 1000 白麻 ITS 序列种间最小 K2P 距离为 0, 平均值为罗布麻与白麻种间 psba trnh 序列种间最小 K2P 距离为 0 007, 平均值为 0 009; 罗布麻与大叶白麻 psba trnh 序列种间最小及平均 K2P 距离均为 0 004; 白麻与大叶白麻 psba trnh 序列种间最小 K2P 距离为 0, 平均值为罗布麻与白麻种间 matk 序列种间最小 K2P 距离为 0 004, 平均值为 0 006; 罗布麻与大叶白麻 matk 序列种间最小 K2P 距离为 0 004, 平均值为 0 005; 白麻与大叶白麻 matk 序列种间最小 K2P 距离为 0, 平均值为 0 002, 详见表 4 2 3DNA 条形码 ITS psba trnh matk 序列种内及种间变异结果实验样本的 ITS 序列总变异位点数为 18, 包括 13 个碱基变异及 5 个插入 / 缺失变异, 罗布麻白麻及大叶白麻种内变异位点数分别为 ( 图 1); psba trnh 序列中总变异位点数为 27, 包括 4 个碱基变异和 23 个插入 / 缺失变异, 罗布麻白麻及大叶白麻种内变异位点数分别为 2 2 0, 罗布麻与白麻大叶白麻在 178bp 位点的 A C 及 287bp 位点的 G A 存在信息变异位点 ( 图 2);matK 序列中总变异

５年月第７卷第期中国现代中药ＭＣＭＯ５Ｖ７Ｎ位点数为均为碱基变异罗布麻白麻及大叶ＣＡ变异４７位点的ＣＴ变异及

罗布麻大叶白麻白麻大叶白麻ＩＴＳ平均Ｈ平均ｍＫ平均９７９４８７７７４４５５４４罗布麻及白麻属ＮＪ树鉴定结果基于

５图图不同单倍型ＩＴＳ序列种内种间变异图４基于ＩＴＳ序列的ＮＪ鉴别树在图中显示分支支持率５次重复图不同单倍型Ｈ序列种内种间变异图

5 ５年月第７卷第期中国现代中药ＭＣＭＯ５Ｖ７Ｎ位点数为均为碱基变异罗布麻白麻及大叶ＣＡ变异４７位点的ＣＴ变异及４９５位点的７位点的白麻种内变异位点数分别为５８ＧＴ变异为信息变异位点图表４ＩＴＳＨ及ｍＫ序列种间ＫＰ距离比较植物名罗布麻白麻罗布麻大叶白麻白麻大叶白麻ＩＴＳ平均Ｈ平均ｍＫ平均９７９４８７７７４４５５４４罗布麻及白麻属ＮＪ树鉴定结果基于ＩＴＳ序列构建的ＮＪ树罗布麻白麻与大叶白麻聚为一支图４基于Ｈ及ｍＫ序列构建的ＮＪ树聚为两支罗布麻单独为一支而白麻与大叶白麻聚为一支图５图图不同单倍型ＩＴＳ序列种内种间变异图４基于ＩＴＳ序列的ＮＪ鉴别树在图中显示分支支持率５次重复图不同单倍型Ｈ序列种内种间变异图５基于Ｈ序列的ＮＪ鉴别树在图中显示分支支持率５次重复图基于ｍＫ序列的ＮＪ鉴别树在图中显示图不同单倍型ｍＫ序列种内种间变异次重复分支支持率５

6 3 讨论 3 1 标准基因片段的选择是建立物种 DNA 条形码的关键基于核糖体 ITS 序列的高度变异性及长度保守性, 已被广泛用于系统发育及亲缘关系的研究 [24] [25] 陈士林等对不同候选 DNA 条形码进行筛选, 结果表明叶绿体序列 psba trnh 在物种水平和属水平鉴定效率远高于叶绿体其他条形码候选序列 matk 基因位于叶绿体 trnk 基因的内含子中, 是叶绿体基因组的蛋白编码区中进化最快的基因之一, 为种间及种下的系统进化研究提供了一定的价值 [26 27] 因此, 本研究将 ITS psba trnh 及 matk 作为候选序列 3 2DNA 提取和 PCR 扩增的稳定性是 DNA 条形码技术应用的前提可从不同产地及不同批次的样品中均能稳定的获取 DNA 条形码序列是 DNA 条形码应用的基础 [28], 罗布麻药用部位为叶片, 与本研究样本取材一致, 有利于本研究 55 份实验样品的 DNA 提取及 PCR 扩增, 为顺利获得 ITS psba trnh 及 matk 序列奠定基础 3 3ITS 鉴定结果显示 : 罗布麻与白麻大叶白麻具有亲缘关系, 可能是源于种间杂交或自然变异演变为不同的种下等级, 因此, 新疆等地民间以白麻入药具有一定依据 [1,29] 罗布麻与白麻及大叶白麻的 psba trnh 及 matk 序列种内最大 K2P 距离小于种间最小 K2P 距离, 能准确鉴定罗布麻与白麻及大叶白麻, 为罗布麻药材的准确客观鉴定提供新的技术手段, 有利于药材市场的监测和管理而白麻与大叶白麻的 ITS psba trnh 及 matk 序列无差异, 所以, 新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准将罗布麻的基原定为大叶白麻 P hendersoni 值得商榷参考文献 [1] 王国强. 全国中草药汇编 [M]. 北京 : 人民卫生出版社, 2014,1: [2] XieW Y,ZhangX Y,WangT,etal.Botany,traditional uses,phytochemistry and pharmacology of Apocynum venetum L.(Luobuma):A review [J].Journal of Ethnopharmacology,2012,141(1):1 8. [3] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 : 一部 [S]. 北京 : 中国医药科技出版社,2010: [4] 新疆维吾尔自治区食品药品监督管理局. 新疆维吾尔自治区中药维吾尔药饮片炮制规范 [S]. 乌鲁木齐 : 新疆人民卫生出版社,2010: [5] 新疆维吾尔自治区食品药品监督管理局. 新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准 [S]. 乌鲁木齐 : 新疆人民卫生出版社.2010:1,8 15. [6] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志 [M]. 北京 : 科学出版社,1977,63: [7] FloraofChina 编委会.FloraofChina[M]. 科学出版社 & 密苏里植物园出版社,1995,16:179. [8] HebertP D N,CywinskaA,BalSL,etal.Biological identificationsthroughdna barcodes[j].proceedingsof theroyalsocietyoflondonseriesb BiologicalSciences, 2003,270(1512): [9] KresW J,WurdackKJ,ZimmerEA,etal.UseofDNA barcodestoidentifyfloweringplants[j].proceedingsofthe NationalAcademy ofsciencesusa,2005,102(23): [10]KresW J,EficksonDL.Atwo locusglobaldnabarcode forlandplants:thecodingrbclgenecomplementsthenon codingtrnh psbaspacerregion[j].plosone,2007,2(6): e508. [11] ChinaPlantBOLGroup.Comparativeanalysisofalarge datasetindicatesthatitsshouldbeincorporatedintothe corebarcode forseed plants[j].proceedingsofthe NationalAcademyofSciencesUSA,2011,108(49): [12] 陈士林, 郭宝林, 张贵君, 等. 中药鉴定学新技术新方法研究进展 [J]. 中国中药杂志,2012,37(8): [13] 陈士林, 姚辉, 韩建萍, 等. 中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则 [M]. 中国中药杂志,2013,38(2): [14] 陈士林, 姚辉, 宋经元, 等. 基于 DNAbarcoding( 条形码 ) 技术的中药材鉴定 [J]. 世界科学技术中医药现代化,2007,9(3):7 12. [15] LahayeR,vanderBankM,BogarinD,etal.DNAbarcoding the floras ofbiodiversity hotspots.proceedings ofthe NationalAcademy ofsciences USA,2007,105(8): [16] PlunketG M,SoltisD E,SoltisPS.Clarificationofthe relationshipbetween Apiaceaeand Araliaceaebased on matk andrbcisequencedata[j].americanjournalof Botancy,1997,84: [17] WilsonCA.PhyltogenyofIrisbasedonchloroplastmatK gene and trnk intron sequence data[j].molecular PhylogeneticsandEvolution,2004,33(2): [18] 张卫明, 彭雪梅, 陆长梅, 等. 基于 DNA 非编码区序列探讨罗布麻的分类问题 [J]. 西北植物学报,2007,27(5): [19] 彭雪梅, 张卫明, 王蔓丽等. 罗布麻及其易混品的 DNA 分子鉴定 [J]. 植物研究,2007,27(3):

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1 材料与方法 1 1 实验材料此研究中所使用的 16 份神香草属植物样本采自新疆不同地区, 包括 11 份硬尖神香草及 5 份大花神香草, 由新疆中药民族药研究所副研究员王果平鉴定, 凭证标本保存于新疆中药民族药研究所标本馆 ( 新疆 XTNM); 自市场收集 11 份神香草药材样品神香草

1 材料与方法 1 1 实验材料此研究中所使用的 16 份神香草属植物样本采自新疆不同地区, 包括 11 份硬尖神香草及 5 份大花神香草, 由新疆中药民族药研究所副研究员王果平鉴定, 凭证标本保存于新疆中药民族药研究所标本馆 ( 新疆 XTNM); 自市场收集 11 份神香草药材样品神香草年月第卷第期中国现代中药ＭＣＭＭＶＮ基础研究基于Ｉ序列的维吾尔药材神香草鉴定研究杨臖樊丛照李晓瑾昌吉职业技术学院药学院新疆昌吉新疆维吾尔自治区中药民族药研究所国家中医药管理局新疆中药民族药资源重点实验室新疆乌鲁木齐摘要目的采用ＤＮＡ条形码技术建立维吾尔药材神香草鉴别的方法方法使用ＤＮＡ条形码Ｉ序列建立了维吾尔药材神香草基原植物ＤＮＡ条形码

布麻 ) [5] 而植物学界对罗布麻基原的种属存有争议, 在 中国植物志 中将罗布麻 A Venetum 归在罗布麻属, 白麻 P pictum 及大叶白麻 P hendersoni 则归白麻属 [6],FloraofChina( 植物分类数据库 ) 则取消了白麻属, 将白麻 P pictum 归入

布麻 ) [5] 而植物学界对罗布麻基原的种属存有争议, 在中国植物志中将罗布麻 A Venetum 归在罗布麻属, 白麻 P pictum 及大叶白麻 P hendersoni 则归白麻属 [6],FloraofChina( 植物分类数据库 ) 则取消了白麻属, 将白麻 P pictum 归入