143 在严重感染脓毒症等所致应激状态下, 无糖尿病病史的患者出现应激性高血糖的发生率约为 50% 机体感染后出现血糖升高, 胰岛 β 细胞损伤是其重要原因 [1] 脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS) 是革兰氏阴性细菌细胞壁的成分, 其作用类似于内毒素 Tol 样受体 4

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癣宴干
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1 142 脓毒症 Tol 样受体 4 在脓毒症大鼠胰岛中的表达葛勤敏王晓边帆潘曙明摘要目的研究 Tol 样受体 4(TLR4) 在脓毒症大鼠胰岛中的表达变化及其对血糖的影响方法 SPF 级 SD 雄性大鼠腹腔内注射脂多糖 (LPS)5mg/kg, 间隔 3h 注射第 2 次, 制备脓毒症模型大鼠被随机 ( 随机数字法 ) 分为正常对照组 (n=5) LPS 组 (n=5) 抗 TLR4 抗体组 (n=5) 和抗 TLR4 抗体 +LPS 组 (n=5), 分别采用 RT PCR 法 Western blot 法和免疫组化法检测大鼠胰岛 TLR4 的表达大鼠给药处理 6h 后行葡萄糖静脉试验 (IVGTT) 测定静脉全血葡萄糖和胰岛素水平, 计算胰岛素血糖曲线下面积 (AUC) 结果正常组大鼠胰岛细胞有 TLR4 表达,LPS 处理大鼠 6h 后胰岛组织中 TLR4 蛋白和 mrna 的表达升高, 与对照组比较差异具有统计学意义 (P<0 01), 注射抗 TLR4 抗体预处理后用 LPS 刺激,LPS 诱导的 TLR4 蛋白及 mrna 水平的升高均被抑制 (P<0 01) LPS 处理后与正常对照组比较, 大鼠 IVGTT min 血糖明显升高, min 胰岛素分泌降低 (P<0 01) 抗 TLR4 抗体干预后能降低 30~120 min 血糖的升高, 改善 LPS 对胰岛素分泌的抑制 (P<0 01) 结论脓毒症大鼠胰岛细胞 TLR4 表达升高,LPS TLR4 系统可能是应激性高血糖的发生机制关键词脓毒症 ; 脂多糖 ; 胰岛 ;Tol 样受体 4; 大鼠 ; 胰岛 β 细胞 ; 胰岛素分泌 ; 应激性高血糖 TLR4expresiononpancreaticisletbetacelofsepticratanditssignificanceGeQinmin,WangXiao, BianFan,PanShuming.DepartmentofEmergency,XinhuaHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchool ofmedicine,shanghai200092,china Corespondenceauthor:PanShuming, drshumingpan@gmail com Abstract Objective ToinvestigatetheTollikereceptor 4(TLR4)expresiononpancreaticislet beta celofsepticratanditsefectsonglucoseregulation.methods SDmalesepticratsweremadewith LPSintra abdominalinjectioninadoseof5mg/kgbodyweightanditrepeatedonce3hlater.ratswere randomly(randomnumber)dividedintofourgroupsrandomly(n=5ineach):normalcontrolgroup,lps group,lpsantibodygroupandplswithlpsantibodygroup.theexpresionandproteinleveloftlr4were measuredbyrt PCR,Western blotandimmunochemistryanalysisrespectively.ivgtt (intra venous glucosetoleranttest)wasusedtomeasuretheglucoseandinsulinlevels6hoursafterlpsadministrationand aswelasincontrolgroup,andthentheiraucwerecalculated.results TheTLR4proteinandmRNA expresedonpancreaticisletbeta celofnormalratweresignificantlyup regulated6hoursafterlps administration,whileitsup regulationcouldbeinhibitedwhenlpsantibodywasusedinadvance(p< 0 01).Ratbloodglucoselevelswerehigherat10,30,60and120mininLPSgroupandinsulinlevels werelowerat30,60,120mincomparedwithnormalcontrol(p<0 01).LPSantibodyimprovedthe insulinsecretionandthenbloodglucoseleveldistinctlydecreasedduring30-120minperiodafterlps chalengeprovedbyivgtttest.conclusions TLR4expresionup regulatedonpancreaticisletbeta cel ofsepticratandlps TLR4systemmightbeamechanismofstreshyperglycemiagenesis. Keywords Sepsis;Lipopolysaccharides;Islet;Tol likereceptor4;rat;pancreaticβ cels; Insulinsecretion;Streshyperglycemia DOI: /cma j isn 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ); 上海市自然科学基金 (14ZR ) 作者单位 : 上海, 上海交通大学医学院附属新华医院急诊科通信作者 : 潘曙明, drshumingpan@gmail com

2 143 在严重感染脓毒症等所致应激状态下, 无糖尿病病史的患者出现应激性高血糖的发生率约为 50% 机体感染后出现血糖升高, 胰岛 β 细胞损伤是其重要原因 [1] 脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS) 是革兰氏阴性细菌细胞壁的成分, 其作用类似于内毒素 Tol 样受体 4 (tollikereceptor4, TLR4) 是作为 LPS 受体复合体的跨膜成分, 在很多细胞中发挥作用, 尤其是在免疫细胞如单核细胞和巨噬细胞中 TLR4 高表达但在胰岛素敏感的细胞如脂肪细胞和肌细胞中, 也有内源性 TLR4 的表达 [2] 前期研究发现胰岛 β 细胞株 INS 1 表达 TLR4 [3], 本研究进一步探讨大鼠胰岛组织中 TLR4 的表达及 LPS 对其表达的影响, 以期发现应激性高血糖的可能内分泌机制 1 材料与方法 1 1 实验动物与分组 SPF 级 6~8 周雄性 SD 大鼠 20 只, 体质量 250~300g, 由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供大鼠腹腔内注射 LPS5mg/kg, 间隔 3h 注射第 2 次, 制备脓毒症模型大鼠随机 ( 随机数字法 ) 分为正常对照组 LPS 组 ( 即脓毒症组 ) 抗 TLR4 抗体组和抗 TLR4 抗体 +LPS 组对照组在相同时点注射无菌等容积生理盐水 ; 抗 TLR4 抗体组尾静脉注射抗 TLR4 单克隆抗体 (500μg/kg), 间隔 3h 注射第 2 次 ; 抗 TLR4 抗体 +LPS 组 : 每次 LPS 注射前 15min 尾静脉注射抗 TLR4 单克隆抗体 500 μg/kg 1 2 主要试剂 LPS(Sigma 公司, 美国 );TLR4 抗体 (Santa Cruz 公司, 美国 ), 辣根过氧化物酶 (Horseradish Peroxidase,HRP) 标记山羊抗鼠二抗 (CST 公司, 美国 ),SABC 试剂盒 DAB 显色试剂盒 ( 武汉博士德 ), 胰岛素放免试剂盒 (DiagnosticSystems Laboratories 公司, 美国 ),SurestepLifescan 血糖仪及试纸 ( 强生公司, 美国 ),BCA 蛋白浓度测定试剂盒 ( 碧云天生物科技 ),PCR 试剂盒 (TaKaRa 公司, 日本 ), 引物合成 : 上海英骏生物技术有限公司 1 3 实验方法静脉葡萄糖耐量试验 (IVGTT) 大鼠给药处理 6h 后行葡萄糖静脉试验评估胰岛 β 细胞分泌功能从大鼠腹股沟处依次切开皮肤皮下筋膜, 分离出股静脉, 结扎静脉远端后剪开一小口, 插入三通导管, 抽取空腹血后, 推入 50% 葡萄糖 (0 5g/kg), 于 min 分别采血 1mL, 即刻测定静脉全血葡萄糖, 余血标本分离出血清, 贮于 -20 冰箱待测胰岛素试验期间于各点采血后, 输入同等量的 0 9% 生理盐水以保持血容量恒定, 并定时推入肝素 (100U/mL) 抗凝静脉葡萄糖试验结束后即刻处死大鼠, 取胰尾组织, 保存于 -80, 供免疫组化及提取蛋白 RNA 检测大鼠原代胰岛组织中 TLR4mRNA 的表达采用 SYBRGreenPCR 试剂盒检测,TLR4 引物 : 上游 5 TTCCTCTCCTGCGTGAGAC 3 ; 下游 5 TTCATAGGGTTCAGGGACAG 3 GAPDH: 上游 5 TGAAGGTCGGTGTGAACGGAT 3 ; 下游 5 CAGGGGGGCTAAGCAGTTG GT 3 25μL 体系, 反应条件 :94 5min;94 30s;67 30s 72 30s,35 个循环 ;72 10min 采用 ABI2720 软件进行结果分析胰岛组织 TLR4 蛋白的表达取 1g 左右胰腺组织, 提取蛋白, 用 BCA 法测定蛋白质浓度, 蛋白保存于 -80 电泳前按 4 1 体积与上样缓冲液混合, 沸水变性 10min, 于 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜后 5% 脱脂奶粉封闭 1h, 按加入 TLR4 一抗,4 孵育过夜 TBST 冲洗 10min 3 次, 按加入 HRP 标记山羊抗鼠二抗, 室温孵育 1h,TBST 冲洗 10min 3 次, 显色 Image Lab 软件分析条带灰度值 TLR4 的免疫组化检测用 SABC 法, 胰岛组织切片脱蜡封闭抗原热修复 ; 滴加 TLR 单克隆一抗 ( 稀释度为 1 100); 滴加 HRP 标记山羊抗鼠二抗, 滴加 SABC 试剂,DAB 显色 ; 复染 ; 封片镜下观察 TLR4 染色阳性反应物质呈棕色 1 4 计算方法胰岛素血糖曲线下面积计算 (AUC): 采用近似梯形的计算公式, 如 0~10min 血糖 AUC=1/2 (0min 值 +10min 值 ) +5min 值 ;0~120min 胰岛素 AUC=1/2(0min 值 +120min 值 ) +5min 值 +10min 值 +30min 值 +60min 值 1 5 统计学方法 SPSS19 0 软件进行统计学分析计量资料用均数 ± 标准差 (x±s) 表示两组间比较成组 t 检验, 组间比较用单因素方差分析以 P<0 05 为差异具

144 有统计学意义 2 结果 2 1 大鼠胰岛 TLR4 的表达胰腺组织切片免疫组织化学染色后, 免疫阳性反应物质显色为棕色, 在大鼠胰岛细胞细胞质中呈弥散性分布正常组大鼠胰岛细胞有 TLR4 表达, 呈浅棕色, 见图 1A LPS 处理大鼠 6h 后, 胰岛可见较多阳性细胞, 呈深棕色, 见图

01), 见图 4 单独抗 TLR4 抗体不影响 TLR4 的表达 (P > 0 05), 大鼠提前注射抗 TLR4 后用 LPS 刺激, 大鼠胰岛组织阳性细胞较 LPS 组少, 呈浅棕色, 见图 1C 图 1D;LPS 诱导的 TLR4 蛋白及 mrna 水平的升高均被抑制, 差异具有统计学意义 (P<

ImmunochemistrystainingofTLR4inratislet( 200) 明显升高, 差异具有统计学意义 (P<0 01) Fig2 图 2 Western blot 印迹检测 TLR4 蛋白水平表达 ThelevelsofTLR4proteinmeasuredbyWestern

组比较, b P<0 05 图 3 各组胰岛细胞 TLR4 蛋白表达的比较 Fig3 ThecomparisonofTLR4proteinexpresionbetweengroups 2 2 LPS 对大鼠胰岛素分泌功能的影响 2 2 1 血糖大鼠行静脉葡萄糖试验,LPS 组与正常对照相比在 10 30

3 144 有统计学意义 2 结果 2 1 大鼠胰岛 TLR4 的表达胰腺组织切片免疫组织化学染色后, 免疫阳性反应物质显色为棕色, 在大鼠胰岛细胞细胞质中呈弥散性分布正常组大鼠胰岛细胞有 TLR4 表达, 呈浅棕色, 见图 1A LPS 处理大鼠 6h 后, 胰岛可见较多阳性细胞, 呈深棕色, 见图 1B, 胰岛组织中 TLR4 的表达升高,TLR4 蛋白相对表达量为 (0 80±0 69), 与对照组 (0 37±0 40) 相比, 显著升高 (P<0 01), 见图 2 图 3;mRNA 表达为 (2 87±3 72), 与对照组 (1 00±1 20) 相比, 表达增加有统计学意义 (P<0 01), 见图 4 单独抗 TLR4 抗体不影响 TLR4 的表达 (P > 0 05), 大鼠提前注射抗 TLR4 后用 LPS 刺激, 大鼠胰岛组织阳性细胞较 LPS 组少, 呈浅棕色, 见图 1C 图 1D;LPS 诱导的 TLR4 蛋白及 mrna 水平的升高均被抑制, 差异具有统计学意义 (P< 0 01), 见图 2 图 3 图 4 A: 正常对照组 ;B:LPS 组 ;C: 抗 TLR4 抗体对照组 ;D: 抗 TLR4 抗体 +LPS 组图 1 TLR4 在各组大鼠胰岛中的免疫组织化学染色 ( 200) Fig1 ImmunochemistrystainingofTLR4inratislet( 200) 明显升高, 差异具有统计学意义 (P<0 01) Fig2 图 2 Western blot 印迹检测 TLR4 蛋白水平表达 ThelevelsofTLR4proteinmeasuredbyWestern blotineach group 与对照组比较,aP<0 01; 与 LPS 组比较, b P<0 01 图 4 各组胰岛细胞 TLR4mRNA 表达的比较 Fig4 ThecomparisonofTLR4mRNAexpresionbetweengroups 与对照组比较, a P<0 01; 与 LPS 组比较, b P<0 05 图 3 各组胰岛细胞 TLR4 蛋白表达的比较 Fig3 ThecomparisonofTLR4proteinexpresionbetweengroups 2 2 LPS 对大鼠胰岛素分泌功能的影响血糖大鼠行静脉葡萄糖试验,LPS 组与正常对照相比在 min 大鼠的血糖抗 TLR4 抗体干预后, 与 LPS 组相比能降低 30~ 120min 血糖的升高 (P<0 01), 抗 TLR4 抗体能改善 LPS 诱导的血糖异常 LPS 处理后, 胰岛素分泌降低, 与正常对照组相比, min 差异具有统计学意义 (P<0 01), 抗 TLR4 抗体干预后能改善 LPS 对胰岛素分泌的抑制 (P<0 01), 见图 5 表 1

4 145 A: 大鼠行静脉葡萄糖试验血糖水平 ;B: 大鼠胰岛 β 细胞的胰岛素分泌图 5 大鼠 IVGTT 试验结果 Fig5 TheresultsofratIVGTT 血糖曲线下面积 0~10min(29 34± 1 49)vs.(26 65±1 46),P<0 05;0~30min (43 01±1 78)vs.(37 17±1 95),P<0 01; 0~120min(58 44±1 89) vs.(46 79±3 05), P<0 01, 即 LPS 组均大于正常对照组 ;0~30min (40 07±1 87) vs. (43 01±1 78),P<0 05; 0~120min(51 32±3 03) vs. (58 44±1 89), P<0 01;LPS+ 抗 TLR4 抗体组均小于 LPS 组胰岛素曲线下面积 :0~30min(36 78±2 60) vs. (47 21±1 70),0~120min(71 99±1 73) vs. (123 60±1 86) LPS 组均小于正常对照组 (P< 0 01);0~30min(46 13±1 03) vs (36 78± 2 60) 0 ~ 120 min ( ± 1 70) vs. (71 99±1 73)LPS+ 抗 TLR4 抗体组均大于 LPS 组 (P<0 01) 见表 1 3 讨论重症感染患者多存在应激性高血糖, 高血糖的发生与感染后神经内分泌系统激活和炎性介质过表 1 大鼠 IVGTT 试验结果 (x±s) Table1 ResultsofratIVGTT(x±s) 组别时间 (min) 正常对照组血糖值 (mmol/l) 4 49± ± ± ± ± ±0 64 胰岛素 (μiu/ml) 10 28± ± ± ± ± ±1 10 血糖 AUC 26 65± ± ± ±3 05 胰岛素 AUC 22 75± ± ± ±1 86 LPS 组血糖值 (mmol/l) 5 25± ± ± ± ± ±0 50 胰岛素 (μiu/ml) 11 16± ± ± ± ± ±1 02 血糖 AUC 29 34± ± ± ±1 89 胰岛素 AUC 22 99± ± ± ±1 73 抗 TLR4 抗体组血糖值 (mmol/l) 4 04± ± ± ± ± ±0 77 胰岛素 (μiu/ml) 9 80± ± ± ± ± ±0 97 血糖 AUC 27 04± ± ± ±2 41 胰岛素 AUC 22 97± ± ± ±1 86 LPS+ 抗 TLR4 抗体组血糖值 (mmol/l) 4 83± ± ± ± ± ±0 43 胰岛素 (μiu/ml) 10 06± ± ± ± ± ±1 03 血糖 AUC 28 30± ± ± ±3 03 胰岛素 AUC 22 89± ± ± ±1 70 度释放有关, 机体存在高分解代谢和胰岛素抵抗, 而感染患者急性血糖升高能使机体血中胰岛素和炎性细胞因子急剧增加 [4], 血糖的异常与患者的病情进展和预后密切相关传统观点认为 LPS 可促进炎症因子 ( 如 IL 1 TNF α) 和其他活性分子的合成及释放, 从而间接影响胰岛 β 细胞有学者发现, 联合应用 LPS TNF α 和 γ 干扰素 (interferon γ,ifn γ) 处理新鲜分离的人和大鼠胰

5 146 岛组织, 可使位于胰岛的巨噬细胞活化, 产生内源性 IL 1, 引起胰岛 β 细胞功能损害 MODS 大鼠血糖的升高与胰岛 β 细胞的损害及胰岛素分泌不足相关, 机制可能与出现大量自由基炎症介质损伤及胰腺微循环障碍炎症细胞浸润有关 [5] 2 型糖尿病的人和动物胰岛中表达 TLR4 的巨噬细胞浸润增加,TLR4 的表达和胰岛素抵抗的加重密切相关 [6], 肥胖和 2 型糖尿病小鼠的胰岛中 TLR4 和炎症因子如白介素 6 (interleukin 6,IL 6) 表达升高 [7] 但 LPS 是否可直接作用于胰岛 β 细胞, 并导致其功能障碍尚不明确有文献证实 [3,8], 人大鼠原代胰岛 β 细胞和 HP62 细胞株表面有 TLR4 表达 ; 但研究 LPS 注射后的脓毒症大鼠胰岛上 TLR4 表达的调节及其对胰岛素分泌的影响报道较少研究证实 INS 1 细胞株上有 TLR4 的表达, LPS 对 INS 1 细胞活力有抑制作用,LPS 可能通过 INS 1 细胞表面的 TLR4 诱导其发生氧化应激甚至凋亡 [9] 但与细胞株比较, 体内实验和原代细胞更能模拟机体的生理和病理状态, 其变化能反映严重感染时机体应激性血糖升高的机制因此, 本研究通过制备脓毒症大鼠模型, 从体内实验观察 LPS 的直接作用对胰岛中 TLR4 表达的影响已确认的 TLRs 家族成员在人类有 10 个在小鼠有 13 个人和大鼠胰岛细胞中表达 CD14 和相 [10] 关分子如 TLR4 TLR2 和 Mb2 Liang 等发现 TLR4 通过加重氧化应激介导肥胖及糖尿病相关的内皮功能损伤, 敲除 TLR4 基因可以保护小鼠对抗肥胖诱导的胰岛素抵抗有学者用 100μg/LLPS 刺激 BRIN BD11 细胞株,24h 后该 β 细胞株的胰岛素分泌显著下降 [11] 本实验结果进一步证实, 原代胰岛细胞上存在 TLR4 的表达, 在一定作用时间和刺激浓度范围内,LPS 刺激可上调其受体 TLR4 蛋白和基因的表达, 使分泌胰岛素功能明显受到抑制 LPS 刺激的脓毒症大鼠采用静脉注射葡萄糖后, 血糖显著升高, 没有出现明显的胰岛素分泌高峰, 上述研究结果说明 LPS 可以配体形式直接作用于胰岛 β 细胞的 TLR4, 进一步导致细胞功能障碍, 胰岛素分泌抑制, 这一现象可部分解释感染后应激性高血糖的发生研究采用 TLR4 抗体阻断 LPS 作用后, 观察到与 LPS 组相比能降低 30~ 120min 血糖的升高 (P<0 01), 改善 LPS 诱导的血糖异常, 胰岛素分泌功能有改善, 进一步说明 LPS 通过对胰岛细胞的表面 TLR4 的直接作用, 影响细胞功能抑制 TLR4 可通过阻断炎性反应过程, 导致异体移植的胰岛存活 [12] 此外, 胰岛 β 细胞中还表达同样能识别 LPS 的 TLR2, 细菌产物可以上调该受体, 并增加免疫系统对感染的应答 [13] 因此, 本研究中 LPS 刺激后血糖升高胰岛素分泌障碍可能有部分 TLR2 参与, 其作用机制可能与放大 LPS 作用后的 TLR4 信号途径有关, 具体机制有待进一步研究探讨参考文献 [1] PreisigCM,RigbyMR.Hyperglycaemiaresultsfrom beta cel dysfunction in criticaly il children with respiratory and cardiovascularfailure:aprospectiveobservationalstudy[j].crit Care,2009,13(1):R27. [2] ReynaSM,Ghosh S,TantiwongP, etal.elevated tol like receptor4expresionandsignalinginmusclefrominsulin resistant subjects[j].diabetes,2008,57(10): [3] FundovaP,FundaD,OsterbyeT,etal.Functionalexpresionof CD14andTol likereceptorsonsubsetsofisletβcels[j].clin Immunol,2008,127(suppl1):S12. [4] 虞文魁, 李维勤, 李宁, 等. 急性高血糖对感染患者激素和细胞因子的影响 [J]. 中华急诊医学杂志,2005,14(2): [5] 石松菁, 林才经, 林兴盛. 多器官功能障碍综合征大鼠胰岛 β 细胞超微结构和功能的改变 [J]. 中华急诊医学杂志,2009, 18(10): [6] EhsesJA,PerenA,EpplerE,etal.Increasednumberofislet asociatedmacrophagesintype2diabetes[j].diabetes,2007, 56(9): [7] LadefogedM,BuschardK,HansenAM.Increasedexpresionof tol likereceptor4andinflammatorycytokines,interleukin 6in particular,inisletsfrom amousemodelofobesityandtype2 diabetes[j].apmis,2013,121(6): [8] Garay MalpartidaHM,MouroRF,MantovaniM,etal.Tol like receptor4(tlr4) expresioninhumanandmurinepancreatic beta celsafectscelviabilityandinsulinhomeostasis[j].bmc Immunol,2011,12:18. [9] GeQM,DuSC,BianF,etal.Efectsoflipopolysaccharideson TLR4expresioninINS 1ratinsulinomacels[J].CelMolBiol, 2011,57(Suppl): [10]LiangCF,LiuJT,WangY,etal.Tol likereceptor4mutation protectsobesemiceagainstendothelialdysfunctionbydecreasing NADPHoxidaseisoforms1and4[J].ArteriosclerThrombVasc Biol,2013,33(4): [11]KielyA,RobinsonA,McClenaghanNH,etal.Tol likereceptor agonistinducedchangesinclonalratbrin BD11beta celinsulin secretionandsignaltransduction[j].jendocrinol,2009,202 (3): [12] GoldbergA,ParoliniM,ChinBY,etal.Tol likereceptor4 suppresionleadstoisletalograftsurvival[j].fasebj,2007, 21(11): [13]Vives PiM,SomozaN,Fernandez AlvarezJ,etal.Evidenceof expresionofendotoxinreceptorscd14,tol lokrreceptorstlr4 andtlr2 andasociatedmoleculemd 2 andofsensitivityto endotoxin(lps) inisletbetacels[j].clinexpimmunol, 2003,133(2): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 何小军 )

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人