976 新乡医学院学报 htp:// 年第 32 卷征 (sicksinussyndrome,sss) 扩张型心肌病 (dilated cardiomyopathy,dcm) 及婴儿猝死综合征 (sudden infantdeathsyndrome,sids

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宥叔瞿
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1 第 32 卷第 11 期 2015 年 11 月新乡医学院学报 JournalofXinxiangMedicalUniversity Vol.32 No.11 November 欁欁本文引用 : 高洁, 史瑞明, 吕颖, 等. 钠通道重叠综合征相关基因 SCN5A 在 H9C2 细胞中的表达 [J]. 新乡医学院学报,2015,32(11): 钠通道重叠综合征相关基因 SCN5A 在 H9C2 细胞中的表达欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁基础研究高洁, 史瑞明, 吕颖, 张军波, 马爱群, 孙超峰 ( 西安交通大学医学部第一附属医院心血管内科, 环境与疾病相关基因教育部重点实验室, 陕西省分子心脏病学重点实验室, 陕西西安 ) 摘要 : 目的构建表型重叠家系相关基因 SCN5AdelQKP 突变型真核表达载体, 研究其在 H9C2 细胞中的表达方法一步法定点诱变技术构建 SCN5A 基因 delqkp 突变型真核表达载体, 电穿孔方法将野生型和突变型质粒转染至 H9C2 细胞, 应用实时荧光定量聚合酶链反应 (RFQ PCR) 及 Westernblot 技术检测其 mrna 及蛋白表达情况结果琼脂糖凝胶电泳法及 DNA 直接测序法均表明定点突变成功,RFQ PCR 及 Westernblot 结果显示, 野生组突变组和混合组 SCN5A 基因 mrna 相对表达量分别为 1.089± ±0.840 和 1.069±0 492,3 组 SCN5A 基因 mrna 相对表达量比较差异无统计学意义 (P>0.05) 野生组突变组和混合组 SCN5A 蛋白在 H9C2 细胞的相对表达量分别为 3.781± ±0.176 和 3.714±0.198,3 组 SCN5A 蛋白相对表达量比较差异无统计学意义 (P>0.05) 结论成功构建钠通道基因 delqkp 突变型真核表达载体并转染至 H9C2 细胞, 该突变未引起钠通道在细胞膜的异常表达, 为进一步功能研究提供了研究基础及方向关键词 : 钠通道 ;SCN5A 基因 ; 重叠综合征 ;H9C2 细胞中图分类号 :Q786 文献标志码 :A 文章编号 : (2015) Expresionofsodium channeloverlapsyndromescn5ageneinh9c2cel GAOJie,SHIRui ming,lyuying,zhangjun bo,maai qun,sunchao feng (DepartmentofCardiovascularMedicine,theFirstAfiliatedHospitalofXi anjiaotonguniversityhealthsciencecenter;keyla boratoryofenvironmentandgenesrelatedtodiseases,ministryofeducation;keylaboratoryofmolecularcardiologyof ShaanxiProvince,Xi an710061,shaanxiprovince,china) Abstract: Objective ToconstructtheeukaryoticexpresionvectorofdelQKP mutantofSCN5Achannel, andtoexploretheexpresionofthismutationinh9c2cels.methods TheeukaryoticexpresionvectorofdelQKP mutantofscn5agenewasconstructedbysite directedmutagenesismethod,thewildtypeandmutationalplasmidweretrans fectedintoh9c2celsbyelectroporationmethod.themrnaandproteinexpresionsofthemutantweretestedbyreal time fluorescentquantitationpolymerasechainreaction(rfq PCR)andWesternblotanalysisrespectively.Results Agarosegele lectrophoresisanddnadirectsequencingshowedthatthesite specificmutagenesiswassuccesful.theresultsofrfq PCR andwesternblotshowedthattherelativeexpresionofscn5amrnainwildgroup,mutationgroupandmixedgroupwas , and respectively,andtherewasnosignificantdiferenceintherelativeexpres sionofscn5amrnaamongthethreegroups(p>0.05).therelativeexpresionofscn5aproteininh9c2celsinthewild group,mutationgroupandmixedgroupwas , and respectively,andtherewasno significantdiferenceintherelativeexpresionofscn5aproteinamongthethreegroups(p>0.05).conclusions SCN5A delqkp mutanteukaryoticexpresionvectorissuccesfulyconstructedandtransfectedintoH9C2cels.Themutant doesnotafecttheexpresionofsodiumchannelincelmembrane.thisprovidesabasisanddirectionforfurtherstudy. Keywords: sodiumchannel;scn5agene;overlapsyndrome;h9c2cel 心脏电压门控钠通道是一类跨膜蛋白质, 其开 DOI: /xxyxyxb 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( 编号 : ) 作者简介 : 高洁 (1981-), 女, 陕西铜川人, 博士研究生在读, 主要从事离子通道病研究通信作者 : 孙超峰 (1965-), 男, 陕西咸阳人, 博士, 主任医师, 主要从事离子通道病及心脏电生理研究 ;E mail:doctorsun01@126.com 马爱群 (1957-), 男, 湖北鄂州人, 博士, 主任医师, 主要从事离子通道病及心力衰竭研究 ;E mail:maaiqun@medmail.com.cn 放可引起细胞外钠离子内流, 形成心肌动作电位的快速上升支, 在维持正常心脏节律及传导中起关键作用编码心脏钠通道的 SCN5A 基因突变会导致通道的蛋白表达及门控功能异常, 从而引起长 QT 综合征 3(longQTsyndrometype3,LQT3) Brugada 综合征 (Brugadasyndrome,BrS) 心脏传导性疾病 (cardiacconductiondisease,ccd) 病态窦房结综合

2 976 新乡医学院学报 htp:// 年第 32 卷征 (sicksinussyndrome,sss) 扩张型心肌病 (dilated cardiomyopathy,dcm) 及婴儿猝死综合征 (sudden infantdeathsyndrome,sids) 等一系列遗传性心律失常疾病 [1 3] 最初学者认为这些疾病是具有不同表型特征的独立的临床疾病, 但是近年来研究显示, 单个基因 SCN5A 突变可以引起 2 个及以上的表型同时存在, 被称为钠通道重叠综合征或 SCN5A 疾病本研究室发现 1 个同时表现有 LQT3 CCD 及 DCM 的表型重叠家系, 经过基因筛查, 确定突变基因为编码 Na + 通道 α 亚基的 SCN5A 基因突变 delqkp [4] 目前, 这种复杂的基因型表型关系的临床分子生物学和生理学有效信息非常有限, 其发生机制尚不完全清楚为了深入了解其发病机制, 更好地实现个体化风险评估, 进而提出个体化的临床处理策略, 本研究拟对该表型重叠家系的突变基因进行表达研究 1 材料与方法 1.1 材料野生型人 pegfp SCN5A 质粒 (pegfp SCN5A WT) 及 DH5α 菌种系本研究室保存,H9C2 大鼠心肌细胞 ( 源于 BD1X 大鼠胚胎心脏组织的克隆细胞株亚克隆 ) 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库 / 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心定点突变试剂盒购自美国 Stratagene 公司, 去内毒素质粒提取试剂盒购自德国 Qiagen 公司,NEPA21 电穿孔仪购自日本 NepaGene 公司, 引物合成及测序由北京奥科生物技术有限公司提供, 兔抗人 Nav1.5 抗体购自以色列 Alomone 公司, 辣根过氧化物酶 (horseradishperoxidase,hrp) 标记的山羊抗兔二抗购自美国 Santa 公司,ChemiDocXRS 凝胶成像系统购自美国 BIO RAD 公司,iQ TM 5 多重实时荧光定量聚合酶链反应 (real timefluorescent quantitationpolymerasechainreaction,rfq PCR) 仪购自美国 BIO RAD 公司 1.2 pegfp SCN5A delqkp 真核表达载体的构建及鉴定应用定点突变方法在 pegfp SCN5A WT 质粒中缺失 CAGAAGCCC 共 9 个碱基, 构建 pegfp SCN5A delqkp 真核表达载体按照定点突变试剂盒的引物设计要求, 设计引物序列 : 正义链为 5 GGCTCCAAGAAGCCCATC CCACGGCCCC 3 ; 反义链为 5 CAGGGGCCGTGG GATGGGCTTCTTGGAGCC 3 按照试剂盒说明进行操作提取突变质粒后, 应用 8g L -1 琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆, 并进行测序 1.3 野生型和突变型 SCN5A 基因真核表达载体的扩增将 -70 甘油保存的菌种融化后, 在 Luria Bertani 固体培养基上画线,37 培养箱正置 30min 后, 倒置过夜培养至长出单菌落挑选典型单菌落, 置入 100mL 摇菌瓶, 放入恒温培养摇床 (37 180r min -1 ) 培养 12~14h, 肉眼可见溶液浑浊按照 1 50 的比例将菌液移至 250mL 摇菌瓶, 放入恒温培养摇床 (37 150r min -1 ) 培养 2~4h, 肉眼可见试管浑浊按照去内毒素质粒提取试剂盒步骤提取质粒, 测定其 DNA 浓度及纯度分装质粒 DNA(1g L -1 ),-20 储存备用 1.4 细胞电穿孔转染及分组在含体积分数 10% 胎牛血清的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基中培养 H9C2 细胞电穿孔当天使细胞处于对数生长期消化终止吹打离心收集细胞加入无血清基本必需培养基 (opti minimum esentialmedium,opti MEM) 重悬, 吹打混匀, 重复 2 次第 2 次 Opti MEM 重悬时调整为每 90μL 含个细胞加入 10μL 质粒 DNA 混合, 将细胞 /DNA 混合液分装至电转杯中, 每杯 100μL 设置电转染参数, 执行电转程序电转完成后将悬液转移至含有 2mL 预热的完全培养基的 6 孔板中, 放入孵箱 48h 后进行后续试验实验分为 3 组 : 野生组 ( 转染野生型 SCN5A 质粒 pegfp SCN5A WT) 突变组 ( 转染突变型 SCN5A 质粒 pegfp SCN5A delqkp ) 和混合组 ( 按照 1 1 比例混合转染 pegfp SCN5A WT/pEGFP SCN5A delqkp ) 1.5 总 RNA 抽提及 RNA 质量鉴定采用 TRIzol 法提取总 RNA 应用微量紫外分光光度计测定吸光度 (A), 定量 RNA 浓度及 A 260 /A 280 比值用变性琼脂糖凝胶进行 RNA 样品电泳,BIO RAD 凝胶成像系统分析电泳结果 1.6 RFQ PCR 检测突变对 SCN5A 基因 mrna 表达的影响按照反转录试剂盒说明将其反转录为 cdna 并稀释, 进行 RFQ PCR SCN5A 基因引物序列 : 正义链为 5 CCCTGTCTGAGCCACTCCGTAT 3, 反义链为 5 TCTTCAGGGCGTCCATCTCC 3, 产物长度为 159bp 内参 GAPDH 的引物序列 : 正义链为 5 AGGTCCACCACTGACACGTT 3, 反义链为 5 GC CTCAAGATCATCAGCAAT 3, 产物长度为 310bp

第 11 期高洁, 等 : 钠通道重叠综合征相关基因 SCN5A 在 H9C2 细胞中的表达 977 反应条件 : 预变性 95 30s; 扩增变性 95 5s, 退火 60 15s; 延伸 72 10s; 共 40 个循环 ; 融解曲线 60 10s;71 个循环每个样本 3 个复孔, 重复试验 3 次

7 Westernblot 检测突变对 SCN5A 基因蛋白表达的影响提取蛋白, 应用二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后进行蛋白变性应用体积分数 8% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳, 转膜, 结合 1 200 稀释的兔抗人 Nav1.

个碱基, 提示缺失突变构建成功, 其他序列均未改变 ( 图 2) A: 野生型质粒测序结果 ;B: 突变型质粒测序结果 ( 突变型质粒缺失 CAGAAGCCC 共 9 个碱基, 导致其编码的 QKP3 个氨基酸缺失 ) 图 2 野生型 pegfp SCN5A WT 质粒和突变型 pegfp SCN5A

2 电穿孔法转染 H9C2 细胞应用电穿孔转染法将包含绿色荧光蛋白的野生型 SCN5A 质粒及突变型 SCN5A 质粒转入 H9C2 细胞,48h 后将细胞置于荧光显微镜下, 可见细胞发出绿色荧光 ( 图 3), 提示质粒转染成功 A:H9C2 细胞转染后 ;B:H9C2 细胞转染前 1: 野生型质粒 pegfp

3 第 11 期高洁, 等 : 钠通道重叠综合征相关基因 SCN5A 在 H9C2 细胞中的表达 977 反应条件 : 预变性 95 30s; 扩增变性 95 5s, 退火 60 15s; 延伸 72 10s; 共 40 个循环 ; 融解曲线 60 10s;71 个循环每个样本 3 个复孔, 重复试验 3 次取反转录聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,BIO RAD 凝胶成像系统分析电泳结果计算 SCN5A 基因的相对表达量 2 Ct, 比较 3 组 SCN5A 基因 mrna 的表达差异 1.7 Westernblot 检测突变对 SCN5A 基因蛋白表达的影响提取蛋白, 应用二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后进行蛋白变性应用体积分数 8% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳, 转膜, 结合稀释的兔抗人 Nav1.5 抗体, 结合 HRP 标记的山羊抗兔二抗, 利用 BIO RAD 凝胶成像系统照相比较 3 组 SCN5A 基因蛋白表达的差异 1.8 统计学处理应用 SPSS20.0 软件进行统计学分析, 实验数据以均数 ± 标准差 ( x±s) 珋表示, 组间比较用单因素方差分析, 两两比较采用 t 检验,P< 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 突变体 pegfp SCN5A delqkp 的鉴定琼脂糖凝胶电泳结果显示, 在 Marker 的 11000bp 处可见突变体与野生型 pegfp SCN5A 质粒的 DNA 条带, 提示二者的大小基本相同 ( 图 1) DNA 测序显示 pegfp SCN5A 的 1507~1509 处缺失 9 个碱基, 提示缺失突变构建成功, 其他序列均未改变 ( 图 2) A: 野生型质粒测序结果 ;B: 突变型质粒测序结果 ( 突变型质粒缺失 CAGAAGCCC 共 9 个碱基, 导致其编码的 QKP3 个氨基酸缺失 ) 图 2 野生型 pegfp SCN5A WT 质粒和突变型 pegfp SCN5A delqkp 质粒的测序图 Fig.2 SequenceanalysisofpEGFP SCN5A WT plasmid andpegfp SCN5A delqkp plasmid 2.2 电穿孔法转染 H9C2 细胞应用电穿孔转染法将包含绿色荧光蛋白的野生型 SCN5A 质粒及突变型 SCN5A 质粒转入 H9C2 细胞,48h 后将细胞置于荧光显微镜下, 可见细胞发出绿色荧光 ( 图 3), 提示质粒转染成功 A:H9C2 细胞转染后 ;B:H9C2 细胞转染前 1: 野生型质粒 pegfp SCN5A WT;2: 突变型质粒 pegfp SCN5A delqkp 图 1 野生型质粒 pegfp SCN5A WT 和突变型质粒 peg FP SCN5A delqkp 的琼脂糖凝胶电泳图 Fig.1 AgarosegelelectrophoresisofpEGFP SCN5A WT plasmidandpegfp SCN5A delqkp plasmid 图 3 电穿孔法转染 H9C2 细胞 Fig.3 H9C2celstransfectedbyelectroporation 2.3 SCN5A 基因突变 delqkp 对 SCN5A 基因 mrna 表达的影响 SCN5A 基因的 PCR 扩增产物电泳图见图 4 目的基因扩增条带位置与理论值相符野生组突变组和混合组的 SCN5A 基因的 mrna 相对表达量分别为 1.089± ±0 840 和 1.069±0.492,3 组 SCN5A 基因 mrna 相对表达量比较差异无统计学意义 (P>0.05)

978 新乡医学院学报 htp://www.xxyxyxb.com 2015 年第 32 卷 1: 野生组 SCN5A 基因 PCR 扩增产物 ;2: 突变组 SCN5A 基因 PCR 扩增产物 ;3: 混合组 SCN5A 基因 PCR 扩增产物 ;4:Marker;5: 内参 GAPDH 基因的 PCR 扩增产物图 4 SCN5A 基因的 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图 Fig.

4 SCN5A 基因突变 delqkp1507 1509 对 SCN5A 基因蛋白表达的影响 Westernblot 检测可见野生组突变组及混合组 SCN5A 基因蛋白均在 220000 处有条带表达 ( 图 5) 野生组突变组和混合组 SCN5A 基因蛋白在 H9C2 细胞的相对表达量分别为 3.781±0.221 3.466±0.176 和 3.

4 978 新乡医学院学报 htp:// 年第 32 卷 1: 野生组 SCN5A 基因 PCR 扩增产物 ;2: 突变组 SCN5A 基因 PCR 扩增产物 ;3: 混合组 SCN5A 基因 PCR 扩增产物 ;4:Marker;5: 内参 GAPDH 基因的 PCR 扩增产物图 4 SCN5A 基因的 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图 Fig.4 AgarosegelelectrophoresisofPCR productsof SCN5Agene 2.4 SCN5A 基因突变 delqkp 对 SCN5A 基因蛋白表达的影响 Westernblot 检测可见野生组突变组及混合组 SCN5A 基因蛋白均在处有条带表达 ( 图 5) 野生组突变组和混合组 SCN5A 基因蛋白在 H9C2 细胞的相对表达量分别为 3.781± ±0.176 和 3.714± 0 198,3 组 SCN5A 基因蛋白相对表达量比较差异无统计学意义 (P>0.05) 1: 野生组 ;2: 突变组 ;3: 混合组图 5 Westernblot 检测 SCN5A 蛋白的表达 Fig.5 ExpresionofSCN5A ProteindetectedbyWestern blot 3 讨论钠通道的功能性 α 亚单位分子量约为 , 包括胞质内 N 末端 4 个同源的结构域 (DI DIV) 和胞质内 C 末端 [2] 迄今已发现超过 150 个 SCN5A 基因突变, 其通过影响通道 mrna 表达 [5] 蛋白合成转运在细胞膜上的表达及门控特性等发挥致心律失常作用应用异源表达系统 ( 人胚肾 293 细胞中国仓鼠卵巢细胞 ) 进行突变基因体外表达的优点为转染效率高, 且可排除钠通道复合物及其他离子通道的影响但是因其不同于心肌细胞的内环境可能会影响通道的表达及功能, 因此作者选用哺乳动物表达系统 (H9C2 细胞乳鼠心肌细胞 ) 最初作者进行乳鼠心肌细胞的分离培养与转染, 由于每次实验需要重新培养心肌细胞, 批间差异较大, 此外原代细胞本身难以转染, 因此转染效率极为低下而 H9C2 心肌细胞类似于胚胎大鼠心肌细胞, 并且可分裂传代性质稳定, 已广泛应用于实验研究 [6] 因此本实验选用 H9C2 心肌细胞作为表达系统优化的非病毒转染法因其简单易操作及安全性高受到更多的关注据报道, 脂质体法转染原代心肌细胞的效率可高达 15% [7] 因此本实验首先尝试脂质体法, 通过多次调整细胞状态脂质体与质粒的比例转染时间及更换多种转染试剂等, 但是转染效率均不理想, 考虑与原代细胞本身难于转染钠通道质粒过大有关电穿孔转染法在最佳条件下对于原代细胞的转染效率更高 [8], 因此改用电穿孔转染法, 从而提高了转染效率由于本家系患者突变基因表现为杂合子, 因此本研究将野生型突变型及野生突变混合型 (1 1) 的钠通道质粒在 H9C2 细胞中进行表达实验结果显示, 与野生型钠通道相比, 突变型及混合型 SCN5A 基因 mrna 及蛋白表达量均无明显差异, 提示该突变未影响 SCN5A 基因 mrna 的表达及其在细胞内的转运和细胞膜的表达遗传性长 QT 综合征 (congenitallongqtsyn drome,lqts) 是由于编码心肌细胞离子通道蛋白的基因突变, 导致心肌细胞复极过程异常而引起的临床综合征根据突变基因的不同, 常染色体显性遗传的 LQTS 分为 LQT1~13, 而 LQT3 由 SCN5A 基因突变导致 [9], 其主要发生机制为突变导致钠通道快速失活障碍, 产生持续的钠电流, 从而引起动作电位延长, 属于功能获得性突变 [10] 其他发生机制还包括 : 通过加强 mrna 翻译转运至细胞膜的蛋白或减少蛋白降解等途径增加突变钠通道的表达从而增大钠电流峰值密度 ; 窗电流增加 ; 开放状态的失活延迟发生等 [11 14] 钠通道快速失活是由位于 DⅢ 和 DⅣ 结构域之间细胞内襻上的失活门与受体结合, 紧密关闭钠通道, 中止钠内流的过程已知导致 LQT3 的突变位点大多位于与快速失活有关的区域, 考虑其通过影响钠通道快速失活而产生持续钠电流 [15 16] 而本研究中 SCN5A 突变 delqkp 正位于失活门区域, 本实验未见钠通道 mrna 及蛋白表达增加, 因此作者推测突变钠通道通过改变蛋白构象, 影响钠通道失活门与受体的紧密结合, 引起

5 第 11 期高洁, 等 : 钠通道重叠综合征相关基因 SCN5A 在 H9C2 细胞中的表达 979 通道失活障碍, 无法中止钠内流, 导致出现 LQT3 表型 CCD 在体表心电图上表现为出现窦性停顿束支传导阻滞房室传导阻滞等 [17] 引起 CCD 的 SCN5A 突变通过减少细胞膜上钠通道的表达组装为无功能通道或改变门控特性等机制降低电流密度, 导致钠电流减少, 从而减慢冲动传导速率, 属于功能缺失性突变 [18 21] 目前已经发现近 10 个导致 LQT3 及 CCD 表型重叠的 SCN5A 突变, 如 P1332L T1620K 等大部分突变的电生理表现为既有晚钠电流这种功能获得性改变, 同时存在峰钠电流密度减少失活恢复损害及可用钠通道减少等功能缺失性改变然而,V1763M 和 V1777M 突变仅存在持续电流, 却没有功能缺失性生理特性 [22 23] 可见, 表型重叠综合征中特定 SCN5A 突变的临床表型和生理特性并非完全平行而本实验未见有钠通道的表达缺失, 考虑本突变可能通过影响门控特性而导致 CCD 表型近年研究表明,SCN5A 基因突变亦与 DCM 相关, 其可能的发病机制包括钠通道的表达减少或门控特性的多种改变 [24 25] 大部分引起 DCM 的 SCN5A 突变为功能缺失性改变, 表现为钠电流密度降低或钠电流的频率依赖性减小 [26 28], 小部分 SCN5A 突变为功能获得性改变, 表现为窗电流增加, 如 SCN5A 突变 R814W 及 R222Q [27,29] 而 SCN5A 突变 A1088V 则同时表现为频率依赖性钠电流减少及晚钠电流 [25] SCN5A 突变所致的 DCM 多与 BrS CCD 同时发生而本室发现的该表型重叠家系同时表现有 LQT3 CCD 及 DCM, 是已报道的首个引起扩张型心肌病的功能获得性突变位点本实验结果未见钠通道 mrna 及蛋白表达减少, 提示该突变可能通过改变细胞构象, 影响钠通道门控特性, 进而引起细胞内离子稳态失衡, 从而导致 DCM 表型本突变附近的突变位点, 例如 SCN5A 突变 delk1500 delkpq 等均导致不同的表型重叠, 提示该处基因在功能上具有更重要的作用因此需要对更多的表型重叠家系进行深入研究, 有助于疾病的诊断和治疗策略的制定综上所述, 本研究构建突变钠通道的真核表达载体, 并成功转染至 H9C2 细胞, 分子生物学研究显示与野生型钠通道相比, 突变钠通道的 mrna 及蛋白表达均无明显差异, 推测该突变可能通过影响钠通道构象而影响其功能, 从而导致多个临床表型本课题组将通过膜片钳技术进一步研究该突变的电生理特性, 为阐明该突变的发病机制及临床药物筛选奠定基础参考文献 : [1] RuanY,LiuN,PrioriSG.Sodiumchannelmutationsandarhyth mias[j].naturerevcardiol,2009,6(5): [2] RemmeCA.CardiacsodiumchannelopathyasociatedwithSCN5A mutations:electrophysiological,molecularandgeneticaspects[j]. JPhysiol,2013,591(Pt17): [3] WangDW,DesaiRR,CrotiL,etal.Cardiacsodiumchanneldys functioninsuddeninfantdeathsyndrome[j].circulation,2007, 115(3): [4] ShiR,ZhangY,YangC,etal.Thecardiacsodiumchannelmuta tiondelqkp isasociatedwiththeexpandingphenotypic spectrum oflqt3,conductiondisorder,dilatedcardiomyopathy, andhighincidenceofyouthsuddendeath[j].europace,2008,10 (11): [5] RookM B,EversM M,VosM A,etal.Biologyofcardiacsodium channelnav1.5expresion[j].cardiovascres,2012,93(1): [6] HeschelerJ,MeyerR,PlantS,etal.Morphological,biochemical, andelectrophysiologicalcharacterizationofaclonecel(h9c2) linefromratheart[j].circres,1991,69(6): [7] LouchW E,SheehanKA,WolskaBM.Methodsincardiomyocyte isolation,culture,andgenetransfer[j].jmolcelcardiol,2011, 51(3): [8] 隋娟, 张高丽, 李平法, 等. 电穿孔转染法与脂质体转染法对 K562 和 HepG2 细胞转染效率的影响 [J]. 新乡医学院学报, 2015,32(8): [9] ShimizuW.Clinicalandgeneticdiagnosisforinheritedcardiacar rhythmias[j].jnipponmedsch,2014,81(4): [10] DetaN,FrisoG,SalvatoreF.Themulti facetedaspectsofthe complexcardiacnav1.5proteininmembranefunctionandpatho physiology[j].biochim BiophysActa,2015,1854(10PtA): [11] ClancyCE,TateyamaM,LiuH,etal.Non equilibriumgatingin cardiacna + channels:anoriginalmechanismofarhythmia[j]. Circulation,2003,107(17): [12] MoreauA,KrahnA D,Goselin BadaroudineP,etal.Sodium overloadduetoapersistentcurentthatatenuatesthearhythmo genicpotentialofanovellqt3mutation[j].frontpharmacol, 2013,4:126. [13] CaloeK,SchmitN,GrubbS,etal.Multiplearhythmicsyn dromesinanewborn,owingtoanovelmutationinscn5a[j]. CanJPhysiolPharmacol,2011,89(10): [14] MaD,WeiH,ZhaoY,etal.Modelingtype3longQTsyndrome withcardiomyocytesderivedfrom patient specificinducedpluri potentstemcels[j].intjcardiol,2013,168(6):

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材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

976 新乡医学院学报 htp:// 年第 32 卷 征 (sicksinussyndrome,sss) 扩张型心肌病 (dilated cardiomyopathy,dcm) 及婴儿猝死综合征 (sudden infantdeathsyndrome,sids

976 新乡医学院学报 htp:// 年第 32 卷征 (sicksinussyndrome,sss) 扩张型心肌病 (dilated cardiomyopathy,dcm) 及婴儿猝死综合征 (sudden infantdeathsyndrome,sids