[5] 物学的研究热点 ZhangL 等就利用 ISSR 分子标记技术对 87 个油桐树样本进行了遗传关系研究, 结 [6] 果显示样本呈明显的地理分化 MedhiK 等应用 RAPD 及 ISSR 两种分子标记技术研究了三种花椒属植物的遗传多样性, 发现 ISSR 具有较高的多态性条 [7] 带比

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殉奚
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1 ５年月第卷第期中国现代中药ＭＣＭＯ５ＶＮ专题北京地区野生柴胡种质资源的ＩＲ研究赵香妍刘长利薛文峰张夏楠罗容首都医科大学中医药学院中医络病研究北京市重点实验室北京９摘要目的通过ＩＲ分子标记技术考察北京地区野生柴胡不同种质资源之间的亲缘关系方法从条引物中筛选出８条合适的引物对北京地区不同产地采集的５份野生柴胡种质资源进行ＩＲ分析构建聚类系统树状图结果８条引物共扩增出条条带其中多态性条带条占８聚类分析显示北京地区野生柴胡遗传多样性较高并存在明显的种内遗传变异结论北京地区野生柴胡呈现一定的地域性分布趋势应加以保护初步认为百花山山腰及山脚柴胡值得推广种植研究为北京地区柴胡种质亲缘关系研究及栽培品种的选育奠定了基础关键词柴胡ＩＲ北京地区种质资源亲缘关系ＩＲＲＧｍｍＢｍＤＣＢＺＨＡＯＸＬＩＵＣＸＵＥＷＺＨＡＮＧＸＬＵＯＲＴＣＭＣＭＵＢＫＬｂＴＣＭＣＤＴＲＢ９ＣＯｂＴｋＢｍＡｂＢｂｍｑＩＲｑＭＥｗｍｍＢｗｍｂｍＩＲＰＣＲｍＢＡｂｍｂｗｍｂ８ｍＵＰＧＭＡｍＲｍ８ＴｗｗＢｍｗｂＣＴｂＢｍｍｍＢｘｂＩｍＢｍｗＴｍＢＴｂｗＢｂＫｗＢｍＩＲＢｍｍ８９５柴胡ＢＲｘ是被中国药典所收录的传源正在减少市场需求又在不断扩大因此迫切统常用大宗中药材之一具有疏散退热疏肝解郁需要开展野生道地柴胡的种质研究及良种选育工作升举阳气等功效药典规定柴胡为伞形科柴胡属植运用分子技术研究种质之间的遗传多样性及亲缘关物柴胡ＢｍＤＣ或狭叶柴胡Ｂｍ系有助于优良种质的筛选及培育ＩＲ简单序列重复区间扩增多态性Ｉｚｍｗ的干燥根但柴胡属作为伞形科最大的属其品种繁多文献记载表明市场ｍｑＲ具有快速高效高遗传多种之多依次为北柴胡狭流通的商品柴胡竟达样性高重复性高稳定性等特点其结合了叶柴胡膜缘柴胡锥叶柴胡小叶黑柴胡黑柴ＲＡＰＤ随机扩增多态性ＤＮＡ标记Ｒｍａｍ胡雾灵柴胡银州柴胡秦岭柴胡兴安柴胡等ＰｍＤＮＡ及Ｒ微卫星标记ｍ可见各地药用柴胡的品种非常混乱且野生柴胡资ｑＲ分子标记的优点是近些年分子生基金项目北京市自然科学基金资助项目首都中医药研究专项ＺＹ通信作者刘长利副教授研究方向中药材规范化生产及其药材质量调控研究Ｔ８９Ｅｍｍ８

2 [5] 物学的研究热点 ZhangL 等就利用 ISSR 分子标记技术对 87 个油桐树样本进行了遗传关系研究, 结 [6] 果显示样本呈明显的地理分化 MedhiK 等应用 RAPD 及 ISSR 两种分子标记技术研究了三种花椒属植物的遗传多样性, 发现 ISSR 具有较高的多态性条 [7] 带比例及较多的扩增条带数 ZhanQ Q 等利用 ISSR 和 SSR 分子标记构建北柴胡遗传图谱, 构建了包含 13 个连锁群 80 个位点的首张北柴胡遗传图谱, 为北柴胡性状基因定位及优种选育奠定了基础目前, 湖北保康陕西山西等地柴胡种质 ISSR 亲缘关系研究均有报道, 但迄今未见北京地区柴胡种质资源 ISSR 研究的报道, 且历史上北京地区燕山太行山一带是道地药材北柴胡的主要产区之一, 经本草考据和产地调查, 其原植物来源外观性状和内在质量均优于其它 [8], 因此, 北京地区柴胡优良种质筛选与研究显得尤为重要实验以北京产道地柴胡为材料, 通过 ISSR 分子标记技术对比考察柴胡种内及种间的亲缘关系, 为北京地区柴胡优良种质筛选及种苗繁育奠定理论基础 1 仪器与材料 1 1 仪器 VeritiPCR 仪 ( 美国 ABI),DYY 6D 电泳系统 ( 北京市六一仪器厂 ), 离心机 ( 美国,scilogex), 紫外凝胶成像分析仪 ( 法国,VILBER LOURMAT), MM400 混合型球磨仪 ( 德国,Retsch), 微量移液器 ( 德国,BRAND) 1 2 试剂 DNA 提取所用试剂购自天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司,TaqDNA 聚合酶 (Takara),100bpDNA Ladder(NEB), 引物由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司合成 1 3 实验材料实验所用柴胡样品共计 15 份 ( 表 1), 所有样品均于 2014 年 6~9 月采收于北京房山延庆门头沟等京郊山区样品由北京中医药大学刘春生教授和首都医科大学刘长利副教授鉴定各产地样品分别取其幼嫩无虫害的叶片, -80 保存备用表 1 实验材料及来源编号样品物种名称采集地及其经纬度与海拔 1 柴胡 Bupleurumchinense 北京房山区十渡镇六合村 E N m 2 柴胡 Bupleurumchinense 北京市房山区七渡村南孤山寨路边 E N m 3 雾灵柴胡 Bupleurumsibiricumvar jeholense 北京市房山区霞云岭乡百草畔高山草甸 E N m 4 柴胡 Bupleurumchinense 北京市房山区河北镇檀木港村将军坨 E N m 5 柴胡 Bupleurumchinense 北京市房山区蒲洼乡富合村 E N m 6 雾灵柴胡 Bupleurumsibiricumvar jeholense 北京市门头沟区百花山国家级自然保护区山顶草甸 E N m 7 柴胡 Bupleurumchinense 北京市门头沟区百花山国家级自然保护区山脚 E N m 8 柴胡 Bupleurumchinense 北京市门头沟区百花山国家级自然保护区山腰 E N m 9 柴胡 Bupleurumchinense 北京市海淀区西山国家森林公园 E N m 10 柴胡 Bupleurumchinense 北京市延庆区松山国家级自然保护区 E N m 11 柴胡 Bupleurumchinense 北京市延庆区松山国家级自然保护区 E N m 12 柴胡 Bupleurumchinense 北京市平谷区镇罗营镇 E N m 13 柴胡 Bupleurumchinense 北京市平谷区大华山镇 E N m 14 柴胡 Bupleurumchinense 北京市平谷区王辛庄镇 E N m 15 柴胡 Bupleurumchinense 北京市密云区雾灵山西门 E N m 1009

2 试验方法 2 1 基因组 DNA 提取取植物新鲜叶片约 30mg, 液氮研磨成粉末, 利用植物基因组提取试剂盒提取样本的总 DNA 提取的 DNA 于 1% 琼脂糖凝胶上电泳检测 10min, 以 2000bpDNAMarker 为分子标记, 在凝胶扫描仪下观察并拍照 2 2ISSR PCR 实验中 ISSR PCR 反应体系为 :25μL 反应体系 : 含有 10 PCRbufer2

3 2 试验方法 2 1 基因组 DNA 提取取植物新鲜叶片约 30mg, 液氮研磨成粉末, 利用植物基因组提取试剂盒提取样本的总 DNA 提取的 DNA 于 1% 琼脂糖凝胶上电泳检测 10min, 以 2000bpDNAMarker 为分子标记, 在凝胶扫描仪下观察并拍照 2 2ISSR PCR 实验中 ISSR PCR 反应体系为 :25μL 反应体系 : 含有 10 PCRbufer2 5μL,MgCl 2 (25mmol L -1 ) 2 5μL,dNTPmix(2 5mmol L -1 )3 5μL,TaqDNA 聚合酶 (5U μl -1 )0 2μL, 引物 (10pmol μl -1 ) 1 5μL,DNA 模板 2 0μL 扩增程序为: 预变性 94 5min;94 1min,52 ( 因引物不同而异 [9] )45s,72 2min,45 个循环 ; 最后 72 延伸 7min 以 ddh2o 为阴性对照 PCR 扩增产物用 2% 的琼脂糖凝胶电泳分离检测 ( 电压 83 V, 120min) 在凝胶扫描仪下观察并拍照 ( 见图 1) 2 3 数据分析对产生了多态性扩增的电泳结果统计各样品的电泳条带, 按相同迁移位置上有扩增条带 ( 不论强弱 ) 计为 1, 无带计为 0, 得到全部样品的 ISSR 图谱的 0/1 数据矩阵, 用 NTSYS2 10 软件计算个体间的相似系数, 进行 UPGMA 聚类分析, 构建聚类系统树状图 M 为 100bpDNAladder,1~15 为材料编号同表 1,0 为阴性对照图 1 引物 808ISSR 扩增结果 3 结果 3 1 引物筛选利用 4 个样本对 43 条加拿大 BritishColumbia 大学提供的 ISSR 引物进行筛选, 共初步筛选出 15 条可扩增出 3 条以上电泳条带的引物作为实验有效引物, 再利用全部样本进行复筛, 最终, 确定 8 条有效引物 ( 见表 2) 表 2 有效引物及其扩增结果编号碱基序列退火温度 / 统计位点多态位点数多态位点百分率 (%) 844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC AGAGAGAGAGAGAGAGC GAGAGAGAGAGAGAGAC TCTCTCTCTCTCTCTCA GAGAGAGAGAGAGAGAYT GAGAGAGAGAGAGAGAYC CTCTCTCTCTCTCTCTRG GACAGACAGACAGACA 野生柴胡 ISSR 遗传多样性从初筛的 15 条引物中筛选出 8 条多态性好条带清晰的引物, 用于 15 个实验样本的 PCR 扩增, 大部分扩增片段大小在 100~1500bp 表 2 表明,8 条引物共扩增出 130 条条带, 其中多态性位点 114 个, 每个引物扩增位点为 14~20 个, 平均个, 其中多态性位点 8~18 个, 平均个, 多态性比率为 87 7% 这说明供试样本存在较大的遗传变异遗传相似系数遗传相似系数是评价物种及居群间亲缘关系的重要指标, 其值越大, 说明亲缘关系越近, 反之, 则越小 15 份北京野生柴胡的样本之间相似系数在 0 571~0 813 之间 ( 见表 3), 其中, 来自房山区将军坨的 4 号北柴胡样本与延庆松山自然保护区的 10 号北柴胡样本亲缘关系最近, 相似系数为而北京市房山区百草畔山顶草甸的 3 号雾灵柴胡样品则与房山区蒲洼乡富合村的 5 号北柴胡样本亲缘关

4 系最远, 遗传相似系数为说明同一物种生活在相近环境中, 亲缘关系较近, 不同物种生活在不同生态环境中, 亲缘关系较远且 15 份样本均采自北京各郊区, 地理位置较近, 所以样本亲缘关系大都较近, 而由于品种生活环境或基因交流等原因致使一些样本亲缘关系较远表 3 ISSR 标记 15 份样本之间的相似系数和遗传距离编号注 : 下三角为相似系数, 上三角为遗传距离 3 4 北京地区野生柴胡聚类分析利用 ISSR 标记数据计算 15 份野生柴胡间的遗传相似系数, 并采用 UPGMA 法构建了北京地区野生柴胡的遗传关系聚类图 ( 图 2), 显示实验样本可分为两大组, 第一组共 14 份样品, 包括除 5 号样品的所有样品, 并分为二个亚类, 第一亚类包括 1 号来自房山区六合,4 号来自房山将军坨,10 号 11 号来自延庆松山,12 号来自平谷区镇罗营镇,6 号 8 号 7 号来自门头沟区百花山,9 号来自海淀区西山森林公园,3 号来自房山百草畔第二亚类包括来自房山区十渡孤山寨的 2 号样品, 来自平谷区大华山镇与王辛庄镇的号样品, 以及来自密云雾灵山的 15 号样本而第二组则只有来自房山区蒲洼乡富合村的 5 号样本 4 讨论 [10] 葛亚莹等利用 ISSR 分子标记技术对 41 个丽穗凤梨品种进行遗传多样性研究,12 条引物共扩增出 132 个位点, 其中多态性位点 125 个, 多态位点百分率达 94 70%, 表明 ISSR 标记具有较高的多态图 2 15 份北京野生柴胡聚类图 [11] 性检测水平刘君等则对 9 种狗牙根进行鉴定分析, 结果显示 ISSR 可有效揭示 9 种狗牙根的亲缘关 [12] 系并可用于构建指纹图谱 FeicuiZhao 等利用 RAPD 和 ISSR 技术研究乌头属 4 种植物的遗传多样性, 发现两种方法均适用于乌头属植物的分析, 但 [13] 其中 ISSR 更具有较高的多态性 JunLiu 等则利用 ISSR 及 SRAP( 相关序列扩增多态性,Sequence RelatedAmplifiedPolymorphism) 两种方法分析 89 份 1011

5 香菇植株的遗传多样性, 结果发现这 2 种标记都能揭示材料间较高的遗传多样性, 而且 ISSR 标记的多态性又高于 SRAP 标记研究表明 ISSR 是一种有效的揭示品种间遗传多样性的实验技术, 实验中利用 8 条引物, 扩增出 130 条条带, 其中多态性位点 114 个, 每个引物平均扩增位点个, 多态性比率为 87 7%, 表明北京地区柴胡种质资源存在较大的遗传变异, 实验研究结果为北京地区野生柴胡种质亲缘关系研究奠定了基础 [14] XuL 等利用 ISSR 和 SP SRAP( 单引物相关序列扩增多态性, Single Primer Sequence Related AmplificationPolymorphism) 研究 100 份黑粉菌的亲缘关系, 发现生态环境的特异性质在样品分化过程中 [15] 起到了重要的作用 YuJ 等研究 15 个居群的长芒草的遗传多样性, 发现其与地理距离有很大关系, 并认为 ISSR 分子标记技术可有效可靠地评价长芒草 [16] 的遗传多样性卢萍等则利用 ISSR 技术研究了 6 个种群的小花棘豆的遗传多样性, 聚类结果表明, 生态地理条件相近的种群会优先聚集遗传聚类结果显示, 部分结果与上述研究结果相似,6 号 7 号 8 号均来源于门头沟百花山,9 号采自海淀区西山森林公园, 其生长环境与百花山山脚环境相类似, 所以显示出较近的亲缘关系, 号样品均来源于北京平谷区密云区, 也具有较高的相似性, 表明生态环境相近的聚为一类房山百草畔的 3 号雾灵柴胡样本与延庆松山的 11 号北柴胡样本聚在一起, 其原因可能由于柴胡雌雄蕊异熟的特性导致其异交授粉为主的繁殖方式, 一定程度上促进了居群间基因交流, 进而出现基因渐渗现象, 使得柴胡属植物的鉴定存在困难, 以此, 采用多种遗传分子标记方法与传统性状鉴定相结合的方法确定植物基源更为可靠此外, 来源于房山区蒲洼乡富合村的 5 号样本则可能是采集地地势相对较高, 且地处偏僻的山区, 基因交流相对较少, 所以自成一支由于经济利益的驱使, 人们对于野生柴胡资源的乱采滥挖现象日益严重, 从而使得野生柴胡资源遭到严重破坏, 药用资源得不到保障另外, 各地药用柴胡来源的复杂性造成了柴胡质量的不稳定性, 以至于临床疗效受到严重影响基于以上问题, 开展柴胡药材的质量研究及人工栽培优良种质筛选尤为重要, 而 ISSR 分子标记技术则能很好的揭示品种间的亲缘关系, 并为栽培品种的选育奠定基础贾 1012 [17] 金萍等通过对北柴胡样本的皂苷含量指纹图谱及 AFLP( 扩增片段长度多态性,AmplifiedFragment LengthPolymorphism) 分子标记研究, 认为柴胡的化学表型差异与其遗传差异具有一定的相关性, 且 AFLP 分子标记法可有效区分不同的柴胡种群而也 [18] 有学者表示皂苷含量较高且遗传多样性丰富的种质资源更具有推广的价值实验结果显示, 皂苷含量较高的西山森林公园的 9 号样本 ( 课题组已测定 ) 与门头沟百花山的 7 号 8 号样本亲缘关系较近 ( 见表 3), 初步认为百花山山脚与山腰的柴胡种质遗传多样性较好, 值得推广种植此外, 柴胡属植物由于基因渐渗出现的资源混乱的复杂问题, 则可利用 ISSR 等分子标记技术与标准药材进行亲缘关系研究, 并与形态鉴定结合的方式进行鉴定, 使得结果更加可靠, 进而提高用药效果 5 结论利用 ISSR 分子标记技术对北京地区野生柴胡的亲缘关系研究中,15 份样本扩增出 130 条条带, 其中多态性位点 114 个, 每个引物平均扩增位点个, 相似系数在 0 571~0 813 之间, 表明北京地区野生柴胡具有较高的遗传多样性, 并同时存在一定的种内遗传变异而利用 UPGMA 聚类分析, 则将 15 份材料进行分类, 聚类结果呈现出一定的地域性分布趋势综上, 北京地区野生柴胡应加以保护, 初步认为百花山山腰及山脚柴胡值得推广种植, 研究为今后开展北京地区柴胡种质亲缘性研究及栽培品种的选育奠定了基础参考文献 [1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 : 一部 [S]. 北京 : 中国医药科技出版社,2010:263. [2] 舒璞, 袁昌齐, 佘孟兰, 等. 中国柴胡属药用植物的数量分类研究 (Ⅰ )[J]. 西北植物学报,1998,18(2): [3] 潘胜利. 中药柴胡的药源调查及商品鉴定 [J]. 中药材, 1996,19(5): [4] 王有志, 张亚云. 中药柴胡的物种调查和鉴定 [J]. 中国药学杂志,1994,29(1): [5] ZhangL,Lu S,Sun D,etal.Genetic variation and geographicaldiferentiationrevealedusingissrmarkersin tungtree,verniciafordi[j].journalofgenetics,2014:1 5. [6] MedhiK,SarmahDK,DekaM,etal.Highgeneflowand genetic diversity in three economicaly important

6 ZanthoxylumSpp.ofUpperBrahmaputraValeyZoneofNE Indiausingmolecularmarkers[J].Metagene,2014,2: [7] ZhanQ Q,SuiC,WeiJH,etal.Constructionofgenetic linkagemapofbupleurum chinensedc.usingissr and SSRmarkers[J].ActapharmaceuticaSinica,2010,45(4): [8] 魏建和, 陈士林, 魏淑秋, 等. 北柴胡适生地分析及数值区划研究 [J]. 世界科学技术中医药现代化,2006,7 (6): [9] SuiC,WeiJH,Chen S L,etal.Establishmentand optimizationofissr PCR reactionsystem forbupleurum chinensedc[j].lishizhenmedmatermedres( 时珍国医国药 ),2008,19(8): [10] 葛亚英, 张飞, 沈晓岚, 等. 丽穗凤梨 ISSR 遗传多样性分析与指纹图谱构建 [J]. 中国农业科学,2012,45(4): [11] 刘君, 赵琴, 杨志民.ISSR 分子标记对 9 种狗牙根的鉴定分析 [J]. 草业学报,2012,21(6): [12] ZhaoFC,NieJH,ChenM Z,etal.Asesmentofgenetic characteristicsofaconitumgermplasmsinxinjiangprovince (China)byRAPD andissr markers.[j].biotechnology &BiotechnologicalEquipment,2008,8: [13] LiuJ,WangZR,LiC,etal.Evaluatinggeneticdiversity and constructing core colections ofchinese Lentinula edodescultivarsusingissr and SRA Pmarkers.[J]. JournalofBasicMicrobiology,2015,55(6): [14] XuL,LuY,YouQ,etal.Biogeographicalvariationand populationgeneticstructureofsporisorium scitamineum in MainlandChina:insightsfromISSRandSP SRAPmarkers. [J].TheScientificWorld,2014. [15] YuJ,JingZB,ChengJM.Geneticdiversityandpopulation structureofstipabungeana,anendemicspeciesinloes PlateauofChina,revealedusingcombinedISSR andsra Pmarkers.[J].GeneticsandMolecularResearch,2015,29 (2): [16] 卢萍, 赵萌莉, 韩国栋, 等. 内蒙古小花棘豆遗传多样性的 ISSR 分析 [J]. 西北植物学报,2007,27(6): [17] 贾金萍, 刘晓节, 邢婕等. 北柴胡药材种质资源的化学与遗传分析 [A]; 第十届全国中药和天然药物学术研讨会论文集 [C];2009 年. [18] 杨, 白杨, 胡继鹰. 保康柴胡种质资源的 ISSR 研究 [J]. 现代中药研究与实践,2013,27(2): ( 收稿日期 ) 檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿 ( 上接第 1007 页 ) [18] YaoH,SongJY,LiuC,etal.UseofITS2regionasthe universaldna barcodeforplantsandanimals[j].plos One,2010,5:e [19] XinT,LiX,YaoH,etal.SurveyofcommercialRhodiola productsrevealed speciesdiversity and potentialsafety isues[j].scirep,2015,5:8337. [20] 朱英杰, 陈士林, 姚辉, 等. 重楼属药用植物 DNA 条形码鉴定研究 [J]. 药学学报,2010,45(3): [21] 辛天怡, 李美妮, 宋经元. 川芎及其近缘物种的 ITS2 序列分析与鉴别研究 [J]. 中国现代中药,2011,13(12): [22] 殷秀梅, 罗, 刘美子, 等. 蛇床及其近缘物种的 ITS2 分子鉴定 [J]. 中国现代中药,2012,14(3):9 11. [23] 辛天怡, 姚辉, 罗, 等. 羌活药材 ITS/ITS2 条形码鉴定及其稳定性与准确性研究 [J]. 药学学报,2012,47(8): [24] YangP,LiXW,ZhouH,etal.MolecularIdentificationof ChineseMateriaMedicaandItsAdulterantsUsingITS2and psba trnhbarcodes:acasestudyonrhizomamenispermi [J].ChineseMed,2014,5: [25] HouDY,SongJY,ShiLC,etal.Stabilityandaccuracy asesmentofidentificationoftraditionalchinesematerial medica using DNA barcoding:a case study on Flos LoniceraeJaponicae[J].BiomedResInt,2013, [26] Tamura K,Stecher G,Peterson D,et al.molecular EvolutionaryGeneticsAnalysisversion6.0[J].MolBiol Evol,2013,30(12): [27] 韩建萍, 宋经元, 姚辉, 等. 中药材 DNA 条形码鉴定的基因序列比较 [J]. 中国中药杂志,2012,37(8): ( 收稿日期 ) 1013

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