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1 608G614 4/2016 草业科学 PRATACULTURALSCIENCE 第 33 卷第 4 期 Vol.33,No.4 DOI: /j.n.1001G G0472 廖丽, 王晓丽, 刘建秀, 刘洋, 白昌军, 徐毓皎, 张欣怡, 王志勇. 地毯草种质资源 ISSR 标记遗传多样性分析. 草业科学,2016,33(4): 608G614. LaoL,WangXL,LuJX,LuY,BaCJ,XuYJ,ZhangXY,WangZY.AnalyofgndvryofAxonopuompruung ISSR markr.praauluralsn,2016,33(4):608g614. 地毯草种质资源 ISSR 标记遗传多样性分析廖丽 1, 王晓丽 1, 刘建秀 2, 刘洋 1, 白昌军 3, 徐毓皎 1, 张欣怡 1 1, 王志勇 (1. 热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室海南大学农学院, 海南海口 ; 2. 江苏省中国科学院植物研究所, 江苏南京 ;3. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所, 海南儋州 ) 摘要 : 地毯草 (Axonopuompru) 是华南地区使用的多年生草本植物, 本研究通过 ISSR 标记对华南地区 64 份地毯草种质资源的遗传多样性和亲缘关系进行分析. 结果表明,25 对 ISSR 引物共扩增出 208 条清晰谱带, 大小在 300~ 1500bp, 其中多态性条带有 196 条, 多态性比率为 94.23%,25 对引物扩增条带数在 4~15 条, 平均每对引物 8.32 条, 遗传相似系数是 0.46~0.99. 通过 UPGMA 方法对 64 份地毯草材料进行聚类分析. 结果表明, 来自相同采集地区的材料并没有完全聚在一类, 供试材料间出现较大的遗传差异. 本研究结果可为今后开展地毯草种质资源遗传保护品种鉴定新品种选育提供基础. 关键词 : 地毯草 ; 种质资源 ;ISSR; 遗传多样性中图分类号 :S540.3 文献标识码 :A 文章编号 :1001G0629(2016)4G0608G07 AnalyofgndvryofAxonopuompru ungissr markr LaoL 1,WangXaoGl 1,LuJanGxu 2,LuYang 1,BaChangGJun 3, XuYuGjao 1,ZhangXnGy 1,WangZhGyong 1 (1.KyLaboraoryofProonandDvlopmnalUlzaonofTropalCropGrmplam Rour, MnryofEduaon,ColgofAgronomyHananUnvry,Hakou570228,Chna; 2.InuofBoany,JanguProvnandChnAadmyofSn,Nanjng210014,Chna; 3.TropalPaurRarhCnr,ChnAadmyofTropalAgruluralSn,Danzhou571737,Chna) Abra:AxonopuompruprnnalhrbaouplanandudnouhChna.Gndvryof64 arpgraaon(ulvar)waanalyzdunghissr markr.thrulhowdha25issrprmg rgnrad208dnband(300~1500bp),196 (94.23%)ofwhhwrpolymorphband.ThnumG brofobrvdbandrangdfrom4o15,whavragof8.3.thgnmlaryofnbwn0. 46~0.99.UnwghdparGgroupmhodwharhmman(UPGMA)lurd64aon(ulvar) nohrgroup,andnoalamplfromhamrgonblongdohamgroup.issr markrhapog nalnmarkrgadbrdngandhamnofgndvrynwldgrmplamrourofarg 收稿日期 :2015G08G24 接受日期 :2015G12G08 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ); 海南省自然科学基金项目 (310031) 第一作者 : 廖丽 (1981G), 女, 江西乐安人, 副教授, 博士, 研究方向为植物种质资源遗传多样性与质量评价.EGmal:laol@hanu.du.n 通信作者 : 王志勇 (1979G), 男, 江西乐平人, 副教授, 博士, 研究方向为热带草坪草种质资源遗传多样性与遗传育种. EGmal:wangzhyong@hanu.du.n hp: ykx.lzu.du.m

2 第 4 期廖丽等 : 地毯草种质资源 ISSR 标记遗传多样性分析 609 pgra. Kyword:Axonopuompru;grmplam;ISSR;gndvry Corrpondng:WangZhGyong EGmal:wangzhyong@hanu.du.n 地毯草 (Axonopuompru), 别名大叶油草, 属禾本科地毯草属多年生草本植物, 暖季型草坪草. 其中地毯草属约有 40 个种, 在我国主要分布在热带和亚热带等气候温暖湿润地区, 但是地毯草不耐寒, 气温变低时叶色就会呈现紫红色, 植株枯黄, 影响观赏价值和使用价值 [1]. 目前世界各国对地毯草种质资源的研究还只停留在一些简单的调查上, 还没有把性状的鉴定与控制性状的基因以及基因的传递和变异规律的研究结合起来, 但在地毯草属的形态多样性 [2G4] 抗逆 [5G9] [10G11] 性分子标记等方面的研究较多. [12] 目前,ISSR 标记技术具有操作简单成本低快速灵敏多态性高所需 DNA 量少以及无需预知研究对象的基因组序列等优点, 同时也具有 SSR 的稳定性. 且 ISSR 标记技术已经广泛地应用于品种鉴 [13] [14G17] 定遗传多样性分析等研究, 然而, 地毯草种质 [10G11,18] [19] 资源分子标记研究甚少. 席嘉宾等利用 15 个野生地毯草品系建立了 ISSR 的反应体系并进行了遗传多样分析. 本研究在此基础上, 利用 ISSR 标记对国内外 63 份野生地毯草种质和 1 份育成品种的遗传多样性和亲缘关系进行研究, 为今后地毯草种质开发利用提供基础. 1 材料与方法 1.1 试验材料 64 份材料分别来源于中国的海南广州广西云南福建和贵州以及澳大利亚 ( 表 1), 种植在海南大学儋州校区农学院基地并统一管理. 1.2 基因组 DNA 的提取和检测地毯草基因组 DNA 的提取参照改良的 CTAB 法 [20], 并做了适当的修改. 取 DNA 原液 5μL, 加入 1 μl 的上样缓冲液, 混匀, 然后用 0.8% 琼脂糖凝胶进行电泳检测 ( 其中电泳缓冲液为 0.5 TBE, 电压 3~4 V m -1 电泳 30 mn), 最后稀释成 50ng μ L -1 备用. 1.3 ISSRGPCR 扩增体系 ISSR 反应体系 (20μL) 和扩增程序为 [16,19] :2μL 10 bufr(100 mmol L -1 TrGHClpH8.3,500 mmol L -1 KCl,15 mmol L -1 MgCl2);1.8μL2.5 mmol L -1 dntp,1μl50ng 模板 DNA;1μL10 μmol ml -1 ISSR 引物 ( 表 2);1μL5 U μ L -1 Taq DNA 聚合酶 ; 无菌去离子水补至 20μL.PCR 反应程序为 :94 预变性 5mn,94 变性 45,45~55 退火 1mn,72 延伸 90, 共 45 个循环 ; 最后 72 延伸 7mn,4 保存. 1.4 ISSRGPCR 扩增产物凝胶电泳检测扩增结束后, 取扩增产物 8.5μL 与 2μL6 LoadngBufr(TaKaRa) 混匀, 在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳, 电压 4V m -1, 时间 1.5~2h, 电泳缓冲液为 0.5 TBE, 电泳结束后取出凝胶, 在凝胶成像仪上检测照相, 进行分析. 1.5 数据处理与分析根据 ISSR 扩增出来的电泳图谱进行人工读带, 对电泳图谱上清晰可辨且可重复出现的条带记为 1, 无则记为 0, 从而生成原始数据矩阵, 根据 UPGMA (Unwghd Par Group Mhod wh Arhm ManClurAnaly) 法对数据进行遗传相似性聚类分析. 遗传相似系数 (GS)=2Nj /( N+N j ), 式中,N j 为第 j 个品种的扩增条带数目,N 为第个品种的扩增条带数,Nj 代表第 j 个品种间共有的扩增 [21] 条带数. 2 结果与分析 2.1 ISSR 标记对地毯草种质扩增的多态性分析本研究按最佳反应程序及体系最终从 ISSR801 到 ISSR900 共 100 对引物中筛选出 25 对稳定性好多态性高条带清晰且重复性好的引物, 用于 64 份地毯草种质的扩增.25 对引物共扩增出 208 条条带清晰谱带, 大小在 300~1500bp, 其中多态性条带有 196 条, 单对引物扩增条带数在 4~15 条, 平均每对引物 8.32 条, 多态性比率为 94.23%( 表 2). 引物 ISSR 811 扩增产物的多态性条带数为 15 条, 其多态性最丰富, 但是 ISSR856 的扩增产物图谱最清晰 ( 图 1). 2.2 遗传相似性分析相似系数是用来比较群体或个体间亲缘关系的远近程度, 相似系数越高, 则说明材料间亲缘关系越近, 遗传背景一致性越强.64 份地毯草种质遗传相似系 hp://ykx.lzu.du.n

3 610 草业科学第 33 卷表 1 供试材料 Tabl1 Exprmnalmaral 序号品系 ( 种 ) 来源序号品系 ( 种 ) 来源 No. Aon(p) Orgn No. Aon(p) Orgn 1 A2 海南儋州 Danzhou,Hanan 33 A82 广西扶绥 Fuu,Guangx 2 A3 海南定安 Dng an,hanan 34 A83 福建厦门 Xamn,Fujan 3 A4 海南定安 Dng an,hanan 35 A84 福建漳浦 Zhangpu,Fujan 4 A5 海南儋州 Danzhou,Hanan 36 A86 福建长泰 Changa,Fujan 5 A7 海南白沙 Baha,Hanan 37 A87 广西大新 Daxn,Guangx 6 A15 海南琼海 Qongha,Hanan 38 A88 广西扶绥 Fuu,Guangx 7 A16 海南三亚 Sanya,Hanan 39 A94 广西崇左 Chongzuo,Guangx 8 A19 海南文昌 Wnhang,Hanan 40 A95 格林纳达 Grnada 9 A23 海南万宁 Wannng,Hanan 41 A97 云南腾冲 Tnghong,Yunnan 10 A25 广西贵港 Gugang,Guangx 42 A98 广东怀集 Huaj,Guangdong 11 A28 海南澄迈 Chngma,Hanan 43 A99 广东怀集 Huaj,Guangdong 12 A30 海南琼中 Qongzhong,Hanan 44 A100 广东佛岗 Fogang,Guangdong 13 A34 海南乐东 Ldong,Hanan, 45 A101 广西桂平 Gupng,Guangx, 14 A37 海南儋州 Danzhou,Hanan, 46 A102 海南屯昌 Tunhang,Hanan 15 A38 海南海口 Hakou,Hanan 47 A103 海南五指山 Wuzhhan,Hanan 16 A41 云南勐海 Mngha,Yunnan 48 A105 海南昌江 Changjang,Hanan 17 A42 海南乐东 Ldong,Hanan 49 A106 广西合浦 Hpu,Guangx 18 A45 广东英德 Yngd,Guangdong 50 A107 广西合浦 Hpu,Guangx 19 A46 澳大利亚 Aurala 51 A108 广西合浦 Hpu,Guangx 20 A47 云南河口 Hkou,Yunnan 52 A111 广西玉林 Yuln,Guangx 21 A49 贵州册亨 Chng,Guzhou 53 A113 广东雷州 Lzhou,Guangzhou 22 A51 福建漳浦 Zhangpu,Fujan 54 A114 海南海口 Hakou,Hanan 23 A52 广西梧州 Wuzhou,Guangx 55 A116 广东茂名 Maomng,Guangdong 24 A54 广东惠州 Huzhou,Guangdong 56 A118 广东电白 Danba,Guangdong 25 A57 福建漳州 Zhangzhou,Fujan 57 A120 广西玉林 Yuln,Guangx 26 A58 广东广州 Guangzhou,Guangdong 58 A121 广东雷州 Lzhou,Guangdong 27 A59 福建南靖 Nanjng,Fujan 59 A122 广东徐闻 Xuwn,Guangdong 28 A63 云南芒市 Mangh,Yunnan 60 A123 广东廉江 Lanjang,Guangdong 29 A67 云南芒市 Mangh,Yunnan 61 A126 广东遂溪 Sux,Guangdong 30 A70 云南瑞丽 Rul,Yunnan 62 A139 海南琼中 Qongzhong,Hanan 31 A72 云南瑞丽 Rul,Yunnan 63 A140 广西上思 Shang,Guangx 32 A81 福建长泰 Changa,Fujan 64 A141 海南五指山 Wuzhhan,Hanan 数范围为 0.46~0.99. 遗传相似系数最高的是来自广西合浦的 A107 和 A108 品系, 相似系数为 0.99, 表示亲缘关系最近 ; 亲缘关系最远的是来自广东惠州的 A54 品系和广东遂溪的 A126 品系, 其遗传相似系数为 0.46, 表明这些种质具有比较高的遗传多样性. 2.3 ISSR 标记的聚类分析用 UPGMA 法对 64 份地毯草材料进行聚类分析 ( 图 2), 从绘出的树状聚类图可以看出, 在遗传相似系数 0.74 处, 将 64 份地毯草种质材料分为 3 类 : 第 Ⅰ 类由 25 个材料组成, 分别来自海南 (A2 A3 A4 A5 A7 A15 A16 A37 A30 A38 A102 A141) 福建 (A57 A59 A81 A83 A84) 广东 (A45 A58 A99) 广西 (A82) 云南 (A47 A63) 贵州 (A49) 和澳大利亚 (A46); 第 Ⅱ 类也包括 25 个材料, 分别来自海南 (A19 A114 A139 A105) 福建 (A51) 广东 (A98 A113 A118 A116 A121 A123 A122 A126 A100) 广西 hp://ykx.lzu.du.n

4 第 4 期廖丽等 : 地毯草种质资源 ISSR 标记遗传多样性分析 611 表 2 ISSR 分析所用的引物序列和扩增结果 Tabl2 PrmrqunandamplfdrulofISSRanaly 引物名称 Prmr 引物序列 Prmr qun (5-3 ) 退火温度 Annalng mpraur/ 扩增条带总数 Toalnumbr ofband 多态性条带数 Numbrof polymorph band 多态性比率 Prnagof polymorpb band/% ISSR807 (AG)8T ISSR809 (AG)8G ISSR811 (GA)8C ISSR815 (CT)8G ISSR816 (CA)8T ISSR823 (TC)8C ISSR824 (TC)8G ISSR825 (AC)8T ISSR826 (AC)8C ISSR827 (AC)8G ISSR836 (AG)8YA ISSR840 (GA)8YT ISSR844 (CT)8RC ISSR851 (GT)8YG ISSR855 (AC)8YT ISSR856 (AC)8YA ISSR857 (AC)8YG ISSR859 (TG)8RC ISSR860 (TG)8RA ISSR873 (GACA) ISSR878 (GGAT) ISSR880 (GGAGA) ISSR888 BDB(CA) ISSR895 AGAGTTGGTAGCTCTTGATC ISSR899 CATGGTGTTGGTCATTGTTCC 合计 Toal 平均 Avrag (A94 A101 A106 A107 A108 A111 A120 A140) 和云南 (A72 A97 A95); 第 Ⅲ 类包括 14 份种质, 分别来自海南 (A23 A28 A34 A42 A103) 广东 (A54) 广西 (A52 A87 A88 A25) 云南 (A41 A63 A67 A70) 和福建 (A86), 从聚类结果来看, 来自相同采集地区的材料并没有完全聚在一类, 供试材料间出现较大的遗传差异. 3 讨论与结论 [13] 由于 ISSR 标记具有较好的稳定性和多态性. ISSR 标记在研究植物遗传多样性方面被认为是一种非常有效的方法并具有很大的应用潜质 [12,22G24]. 在本研究中, 通过 ISSR 标记分析了 64 份地毯草种质, 显示出了丰富的多态性, 这表明 ISSR 标记用于研究地 [19] 毯草遗传多样性的可行性, 这与席嘉宾等对野生地毯草的研究结果一致. 在本研究中,25 对 ISSR 引物共获得了 196 条多 [2] 态性条带, 多态性比率为 94.23%; 席嘉宾等用优化的 ISSR 反应体系分析中国野生地毯草种质, 得到的 [16] 多态性比率为 89.67%;Wang 等用 ISSR 标记分析狗牙根的遗传多样性, 多态性比率为 86.7%, 以上结果都显示了 ISSR 标记具有丰富的遗传多样性. hp://ykx.lzu.du.n

5 ６１２草业科学图１６４份材料 DNA 用 I SSR８５６引物扩增图谱 F １ I SSRf ng rp r n amp l f dw hp r m rno ８５６ n６４dnao fa ompr u g 图２６４份地毯草种质的 I SSR 聚类分析结果 F ２ UPGMA l u rana l ba doni SSRg n d n among６４a ompr u a on g y //ykxl h zu du n p: 第３３卷

6 第 4 期廖丽等 : 地毯草种质资源 ISSR 标记遗传多样性分析从 64 份地毯草的聚类分析结果来看, 具有相同或相近地理来源的材料被聚在了一类, 但也有不同来源的材料被聚在一类. 这种现象也出现在其它种类中 [11,16G18,25]. 出现这种现象的原因主要有以下 4 个方面 :1) 有相同地理来源的材料虽然来自相同的环境, 但由于育种材料和选择方向的复杂性, 可能会出现遗传差异比较大的类型, 因此, 相同地理来源的材料被归入不同的类群 ;2) 受环境的影响, 在长期适应环境的过程中物种也会出现性状趋同的现象, 造成不同性状间的交叉 ;3) 地毯草属于多倍体 [20], 在决定遗传分化中起了重要作用 [18], 因此, 为了进一步了解不同地毯草种质间的关系, 在本研究的基础上, 还需进一步分析地毯草的倍性, 因为倍性分布可能取决于环境的影响, 或者基因型的进化和历史发展 [26G28]. 对狗牙根 (Cynodon daylon) [29] 和类地毯草 (A.affn) [18] 遗传多样性和倍性的研究也得到了类似结果.4) 地毯草是多年生禾本科草和异型杂交繁育体系, 也可导致丰富的遗传变异 [16,18], 另外, 有大的生态隔离也是必要的, 例如 : 琼州海峡就可导致海南省和其它省份间种质的高变异, 这种地理分布可以显著影响一个物种的遗传多样性. 613 参考文献 (Rfrn) [1] 席嘉宾, 陈平, 郑玉忠, 杨中艺. 中国地毯草野生种质资源调查. 草业学报,2004,13(1):52G57. XJB,ChnP,ZhngYZ,YangZY.AnnvgaonofAxonopuomprugrmplamrournChna.AaPraaulG uralsn,2004,13(1):52g57.(nchn) [2] 席嘉宾, 陈平, 刘长春, 郑玉忠, 杨中艺. 中国地毯草野生种质资源的形态特征和生物学特性的变异研究. 四川草原,2004(12): 32G37. XJB,ChnP,LuCC,ZhngYZ,YangZ Y.Sudyon morphologalandbologalvaraonofdfrnwldarpgra. JournalofShuanGraland,2004(12):32G37.(nChn) [3] 廖丽, 陈玉华, 赵亚荣, 王晓丽, 白昌军, 王志勇. 地毯草种质资源形态多样性. 草业科学,2015,32(2):248G257. LaoL,ChnY H,ZhaoYR,WangXL,BaCJ,WangZY.MorphologydvryofAxonopuomprugrmplam.PraaG uluralsn,2015,32(2):248g257.(nchn) [4] 廖丽, 黄小辉, 胡化广, 白昌军, 王志勇. 地毯草种质资源耐盐性初步评价. 草业科学,2012,29(5):704G709. LaoL,HuangX H,HuH G,BaCJ,WangZY.PrlmnaryvaluaonofalolranofAxonopuompru.Praaulural Sn,2012,29(5):704G709.(nChn) [5] 廖丽, 黄小辉, 白昌军, 王志勇. 地毯草对铝胁迫响应及临界浓度的研究. 热带作物学报,2011,32(7):1235G1239. LaoL,HuangX H,BaCJ,WangZY.SudyonrponofAxonopuompru (Sw.)Bauv.oalumnumrandrG alalumnumonnraon.chnjournaloftropalcrop,2011,32(7):1235g1239.(nchn) [6] MaL,KnworhyK E,LuHJ,ChrryR.Gnvarablyofrproduvranommonarpgra.Horn,2014, 49(7):856G858. [7] Smh M A,WhmanPC.Evaluaonofropalgrannranghadundroonuanop.AgruluralSn, 1983,19(2):153G161. [8] 张静, 廖丽, 白昌军, 王志勇. 地毯草耐铝性初步评价. 草业科学,2012,29(11):1671G1677. ZhangJ,LaoL,BaCJ,WangZY.PrlmnaryvaluaononalumnumolranofAxonopuompru.PraauluralSG n,2012,29(11):1671g1677.(nchn) [9] Uddn M K,JuramAS,ImalM R.Growhrponofghropalurfgrapoalny.AfranJournalofBohG nology,2009,8(21):5799g5806. [10] WangXL,LY,LaoL,ZhangXY,BaCJ,WangZY.IolaonandhararzaonofmroalmarkrforAxonopu ompru (Sw.)Bauv.(Poaa)ung454qunnghnology.Gnand MolularRarh,2015,14(2):4696G [11] WangXL,LaoL,ZhangX Y,BaCJ,WangZY.GndvryofAxonopuompru (Sw.)Bauv.grmplambad onmplqunrpamarkr.horsn,2015,50(6):797g800. [12] ZwzE,RafalkA,LabudaD.Gnomfngrprnngbymplqunrpa(SSR)anhordpolymrahanraG hp://ykx.lzu.du.n

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