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浦郎
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1 生物多样性 2008, 16 (6): Biodiversity Science doi: /SP.J http: // 野生和养殖大鲵群体遗传多样性的微卫星分析 1 孟彦 1 杨焱清 2 张燕 1* 肖汉兵 1 ( 中国水产科学研究院淡水生态与健康养殖重点开放实验室, 湖北荆州 ) 2 ( 农业部淡水生物多样性保护与利用重点开放实验室, 湖北荆州 ) 摘要 : 中国大鲵是世界上最大的两栖动物并且为我国特有, 现在该物种野生种群急剧下降, 而人工养殖种群逐渐增多为了对大鲵 (Andrias davidianus) 群体进行遗传多样性的本底调查, 本文用 10 对微卫星引物对 28 尾野生大鲵和 16 尾人工养殖的大鲵样本进行了遗传多样性分析结果表明, 在 10 对引物中有 7 对检测到多态位点, 野生群体和养殖群体的观察等位基因数分别为 5 8 和 4 6, 期望杂合度分别为 0.81 和 0.75, 说明本实验中研究的大鲵的遗传多样性水平较高通过人工养殖群体和野生群体的比较发现, 人工养殖群体存在较大的等位基因丢失现象, 并且遗传多样性水平低于野生群体以上结果将为大鲵的人工繁育和遗传多样性的保护利用提供一定的理论依据关键词 : Andrias davidianus, 微卫星标记, 等位基因, 多态信息含量 A comparison of genetic diversity between wild and cultured populations of the Chinese giant salamander, Andrias davidianus, based on microsatellite analyses Yan Meng, Yanqing Yang, Yan Zhang, Hanbing Xiao * 1 Key Laboratory of Freshwater Ecology and Healthy Aquaculture, Chinese Academy of Fishery Sciences, Jingzhou, Hubei Key Laboratory of Freshwater Biodiversity Conservation and Utilization, Ministry of Agriculture, Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Jingzhou, Hubei Abstract: The Chinese giant salamander (Andrias davidianus) is world s largest amphibian and is endemic to China. Wild populations of the species have declined drastically, while domesticated populations have increased in recent years. To estimate genetic variation in the Chinese giant salamander, we analyzed ten microsatellite loci of 44 individuals from two wild and one domesticated populations. A total of 52 alleles were found from seven loci shown to be polymorphic. The number of alleles ranged from 6 to 9 (mean 7.4). The polymorphism information content (PIC) of all populations at all loci exceeded 0.54 except the YQY at GS134 (0.3750), suggesting high polymorphism at microsatellite markers. Compared with the wild populations, some alleles in the domesticated population were drifted and the PIC was lower. Our results may provide a theoretical basis for conservation and exploitation of giant salamanders in China. Key words: Andrias davidianus, microsatellite DNA markers, allele, PIC 大鲵 (Andrias davidianus) 俗称娃娃鱼, 是我国特有的两栖动物, 也是国家二级保护动物主要分布于长江黄河和珠江水系, 遍布于全国 17 个省市自治区, 大部分栖息地位于长江中上游流域, 包括湖南河南四川和陕西等地大鲵是水生到陆生的过渡物种, 因其在生物进化方面的独特地位而备受关注但是, 从 20 世纪 50 年代开始, 由于生存环境恶化以及人为捕杀等原因, 许多分布区的大鲵种群数量锐减乃至濒危或灭绝 (Wang et al., 2004; Yoshinao et al., 2006) 近年来, 人工养殖大鲵的种群数量逐年递增如何保护现存仅有的野生种群, 采取科学的繁殖配对措施以避免近交衰退和遗传多收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 农业科技成果转化项目 (05EFN ) 和国家科技支撑计划专项 (2006BAD03B08-04) 和国家科技基础条件平台专项 (2006DKA ) * 通讯作者 Author for correspondence. xhb@yfi.ac.cn

2 534 生物多样性 Biodiversity Science 第 16 卷样性丢失, 已成为目前大鲵保护和养殖中面临的关键问题为了解决这些问题, 首先必须摸清现有大鲵种群的遗传结构但是有关该方面的研究不多, 且主要集中在线粒体 DNA 基因组序列 (Murphy et al., 2000; Lin et al., 2003; 陶峰勇等, 2005, 2006; 方耀林等, 2006), 得到的结果是大鲵的遗传多样性水平较低由于大鲵线粒体 DNA 变异小, 提供的变异信息量有限, Murphy 等 (2000) 对来自 6 个地方大鲵的 mtdna Cyt b 和同工酶进行分析后, 指出应该用更多的 DNA 指纹技术如微卫星方法对大鲵进行更深入的分析迄今还没有见到有关大鲵核基因组遗传变异的报道微卫星 DNA 标记不仅具有极高的个体特异性可重复性, 而且能够对整个基因组进行标记, 可提供丰富的多态位点及基因座位杂合度和纯合度等遗传信息, 目前已经广泛应用于水生生物研究 (Liu & Cordes, 2004; Dimitry et al., 2006) 和濒危物种的保护遗传学研究中 ( 黄磊和王义权, 2004) 本文利用微卫星标记对野生大鲵和人工养殖的大鲵种群进行多样性分析, 以期从整个基因组层面探讨其遗传背景, 为大鲵资源保护和人工繁育提供本底资料 1 材料与方法 1.1 材料于 2005 年取野生大鲵样本共 28 尾其中 18 尾取自长江水产研究所 ( 这些个体来自汉水流域, 后在长江水产研究所大鲵繁育基地养殖, 记作 CJY); 另外 10 尾取自浙江永强农业技术发展有限公司 ( 原产地不详, 但均为野生大鲵, 记作 YQY) 随机取繁殖子一代个体 16 尾 ( 其中包括 YQY 后代及该养殖公司其他野生大鲵的后代, 记作 YQR) 全部来源于浙江永强农业技术发展有限公司大鲵养殖公司从每尾大鲵尾部取少量肌肉置于 95% 乙醇中保存, 带回实验室备用 1.2 基因组 DNA 提取用生理盐水或 STE 缓冲液浸泡组织以去除乙醇, 然后剪碎组织, 放入 1.5 ml 离心管, 每管加 150 μl STE 15 μl 10 mg/ml 的蛋白酶 K 和 40 μl 10% 的十二烷基硫酸钠 (SDS), 于 50 水浴 4 6 h 后利用常规酚抽提法提取基因组 DNA, 并用琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 1.3 引物合成及 PCR 扩增 10 对引物采用自主开发的大鲵微卫星引物序列 ( 表 1), 由北京赛百盛生物公司合成 PCR 扩增采用 15 µl 反应体系, 包括 1.5 µl 10 buffer, 0.2 µl 10 µm dntps, 10 µm 上下游引物各 0.4 µl, 0.3 µl 5 U/µL Taq DNA 聚合酶, 0.5 µl 模板 DNA, 11.7 µl 双蒸水反应条件为 : 94 预变性 3 min; 94 变性 30 s, 退火 30 s, 72 复性 30 s, 共 35 个循环 ; 72 延伸 10 min, 最后 4 保存扩增产物用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测 1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染用浓度为 12% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行检测取 5 μl PCR 产物, 加入 3 μl 上样缓冲液, 混匀后上样, 插入 100 bp 标准 marker 150 V 电压电泳 5 6 h, 硝酸银染色拍照 1.5 数据分析利用 POPGENE32 进行统计分析, 计算微卫星位点的等位基因频率 (allele frequency, P) 有效等位基因数 (N e ) 观察杂合度(observed mean heterozygosity, H o ) 和期望杂合度 (expected heterozygosity, H e ) 和多态信息含量 (polymorphism information content, PIC) Shannon 指数 (I) 固定指数(F) 不同参数的主要计算方法如下 (Bostein, 1980): 多态信息含量 : PIC = n n 1 n pi 2 pi p j i= 1 i= 1 j= i+ 1 其中 p i p j 分别为第 i 和第 j 个等位基因在群体内的频率, n 为等位基因数 2 结果 2.1 PCR 扩增及等位基因频率 10 对微卫星引物均可以很好地扩增出条带而利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后发现除 GS82 GS17 和 GS120 外, 其余 7 对引物都呈现不同程度的多态性从对各引物的等位基因频率进行统计分析的结果 ( 表 2) 可以看出, 对于每对引物而言, 野生样本 (CJY 和 YQY) 的等位基因数都要高于或等于子代群体 (YQR), 这说明在子代群体中, 7 个位点的等位基因都存在不同程度的丢失现象例如引物 GS122, 其等位基因数在野生群体 CJY 和 YQY 中均为 6, 而在子代群体 YQR 中则仅为 4, 并且引物 GS78 和 GS105 的等位基因在子代群体中也有减少的趋势

3 第 6 期孟彦等 : 野生和养殖大鲵群体遗传多样性的微卫星分析 535 表 1 10 个大鲵微卫星座位的信息 Table 1 Information of ten microsatellite loci in Andrias davidianus 座位引物序列 Primer sequence (5' 3') 片段大小 Size (bp) GS82 GS17 GS120 GS134 GS66 GS132 GS96 GS78 GS105 GS122 F: CGTAGGGGTTACAAAATCA R: CAGTCTGTGCCATTCATTTC F: TTCTCATTTTGTTTCCTATTGC R: CACAGTAAGGACGCAGTAAAA F: TCTCATTTTGTTTCCTATTG R: GTTGGAAATTAAAGGCAC F: TTCTCACCAATATGCCACC R: TCAACTTTGCTGAAAATCCA F: GTGATTACAACTCGTGGACTG R: GTAGTCTTGGTGGGAGGGTAG F: CATACATCTACAACTACATCCGA R: TCTTCAAGCGAGCTTTTACT F: ACAGTAAGGACGCAGTAAA R: TCTAACCTACCACTCCTGCT F: ATTGGGGAGAAATAAAGTG R: GTGCTTGCACAACCTAATC F: CTTACATTTCGCACGGATTT R: ATGGCACATTGTAGGAGTTT F: TTCAGGAGGGACAGGGAGA R: TGCCCTTCTTTAGAGCTACTTCC 重复类型 SSR motif 退火温度 Annealing temperature ( ) 227 (AG) (CT) (CT) (GA) (GTGA) (AC) (AG) (TAGA) (AG) 5 (AG) (AG) 10 (AG) 5 (AG) 5 (AG) 5 (AG) 在两个野生群体中, 不同位点都有其特有的等位基因出现如在引物 GS105 中, CJY 群体含有等位基因 E, 而等位基因 A 和 F 则仅存在于 YQY 2.2 大鲵群体的遗传多样性分析不同群体的等位基因数杂合度 Shannon 指数 (I) 多态信息含量(PIC) 固定指数(F) 等遗传参数见表 3 对于研究的所有大鲵样本而言, 7 对多态引物检测到的等位基因数为 4 8 个不等, 平均观测等位基因数 (N a ) 在 CJY YQY 和 YQR 上分别为和 4.57, 而平均有效等位基因数 (N e ) 分别为和 3.87, 虽然在 CJY 和 YQY 群体中观测到的等位基因数相等, 但是有效等位基因数却不同 3 个群体的有效等位基因数由大到小顺序为 YQY> CJY>YQR, 养殖群体的等位基因数最少 3 个实验群体的多态信息含量都较高, 除了 YQY 群体在位点 GS134 的多态信息含量为外, 其余位点多态信息含量都高于 , 属于高度多态 3 个群体在 7 个多态位点的平均杂合度都高于 CJY YQY 和 YQR 3 个群体的平均期望杂合度分别为和 0.75, 野生群体的平均期望杂合度为 0.81, 野生群体的遗传多样性高于养殖群体而固定指数仅在 GS66 和 GS78 两个多态位点为正值, 其余均为负值, 说明了所有群体在大多数检测的多态位点杂合子过剩 3 讨论多态信息含量是基因丰富度的一个衡量指标, 反映了群体的遗传多样性水平本研究中, 7 对有多态位点的微卫星引物所检测到的多态信息含量几乎都大于 , 最高为 , 表明大鲵野生群体和人工养殖群体的遗传多样性均很丰富 Murphy 等 (2000) 对来自 6 个地方大鲵的 mtdna Cyt b 和同工酶进行分析后发现其遗传多样性较低陶峰勇等 (2005) 对来源于 4 个地理种群的 28 条大鲵进行 mt- DNA 控制区全序列分析, 最后根据地理分布将其分为珠江单元 ( 广西种群 ) 黄河单元( 河南种群 ) 和长江单元 ( 湖南和陕西种群 ), 并且得出这 3 个地理种群的单倍型多样性指数 (h) 和核苷酸多样度指数均较低, 而且珠江单元的值低于其他两个单元, 表明分析的 3 个单元的遗传多样性均较低, 而珠江单元的遗传

4 536 生物多样性 Biodiversity Science 第 16 卷表 2 7 个多态微卫星座位在 3 个大鲵群体中的等位基因频率 Table 2 Allele frequencies of seven polymorphic microsatellite loci among three Andrias davidianus populations 座位等位基因 Allele 群体 Population 座位等位基因 Allele 群体 Population CJY YQY YQR CJY YQY YQR GS122 A GS132 A B B C C D D E E F F GS134 A G B H C I D GS105 A E B F C G D GS66 A E B F C G D H E I F GS78 A G B H C GS96 A D B E C F D G E F 多样性最低以上研究结果通过对 mtdna 的分析都认为大鲵的遗传多样性水平低 Lin 等 (2003) 年对取自珠海某养殖场的大鲵亲本及其子代进行了 RAPD 分析, 发现亲本和子代的遗传多样性都低, 但是相比而言亲本的遗传多样性高于子代方耀林等 (2006) 在对来自汉水流域的 28 尾大鲵进行线粒体控制区长 757 bp 序列进行测序分析后发现, 其单倍型多样性指数为 , 认为大鲵的遗传多样性水平较低上述研究结果均表明, 所研究的大鲵样本的遗传多样性较低通过对与中国大鲵亲缘关系相近的日本大鲵 (Andrias japonicus)mtdna 长 3,664 bp 片段的研究发现, 目前日本大鲵的遗传多样性也正在逐步降低, 作者分析认为原因在于野生大鲵具有一雄多雌的交配机制, 性成熟较晚, 寿命长以及生长在相对固定水域等 (Masafumi et al., 2008) 而本实验利用微卫星标记分析后发现无论是野生群体还是人工养殖群体的遗传多样性都比较丰富, 野生大鲵的的遗传多样性水平要高于人工养殖大鲵作者分析主要原因如下 : (1) 样本来源复杂本研究中所取的野生大鲵样本虽然属于两个固定的养殖地, 但是主要来源于汉水流域以及浙江永强养殖场从陕西湖南以及广西等不同地区收购来的个体, 并且样本数量相对也较大, 所以遗传多样性水平较高目前, 由于人为和自然因素的影响, 在原产地基本很难找到纯种的野生大鲵陶峰勇等 (2006) 认为在自然条件下, 洪水的冲击和气候的变化使得不同地理条件下的大鲵发生一定程度的基因流动从而增加了基因的

5 第 6 期孟彦等 : 野生和养殖大鲵群体遗传多样性的微卫星分析 537 表 3 3 个大鲵群体在 7 个微卫星基因座位上的等位基因数 (N a ) 有效等位基因数 (N e ) Shannon 指数 (I) 多态信息含量 (PIC) 固定指数 (F) 观察杂合度 (H o ) 和期望杂合度 (H e ) Table 3 Number of alleles (N a ), number of effective alleles (N e ), Shannon's information index (I), polymorphism information content (PIC), fixation index (F), observed heterozygosity (H o ) and expected heterozygosity (H e ) of seven microsatellite loci in three Andrias davidianus populations 位点群体 Population 等位基因数 N a 有效等位基因数 N e Shannon 指数 I 多态信息含量 PIC 固定指数 F 观察杂合度 H o 期望杂合度 H e 平均杂合度 Heterozygosity GS96 CJY YQY YQR GS122 CJY YQY YQR GS134 CJY YQY YQR GS66 CJY YQY YQR GS132 CJY YQY YQR GS78 CJY YQY YQR GS105 CJY YQY YQR 多样性 (2) 不同检测方法也会产生不同结果前人的研究主要集中在对核外基因序列 ( 线粒体 DNA 的 Cyt b 基因和控制区 ) 的多态性分析, 而本文是针对整个基因组开发微卫星引物进行群体间的遗传多样性分析为了更深入地探讨中国大鲵遗传多样性问题, 计划在后续的研究中用更多的微卫星引物对样本来源清晰样本数量更多的大鲵进行遗传多样性分析, 从根本上摸清其遗传结构野生群体 CJY 和 YQY 在不同的微卫星位点含有特异的等位基因引物 GS134 GS66 GS96 GS105 和 GS132 分别含有特异性的等位基因, 而且这些等位基因在子代中不存在由于大鲵品种资源的短缺造成不同地域大鲵资源的买卖现象非常普遍, 几乎很难找到不同地区大鲵的特异性标记那么, 这些特异性的等位基因是否可以作为不同来源大鲵的特异性分子标记有待于进一步研究, 但是这些等位基因至少可以为我们提供一个研究思路现在, 大鲵的人工养殖范围越来越广, 并且规模越来越大, 几乎全部采用人工养殖育苗, 随机取雌雄大鲵亲本进行交配本研究结果表明, 对于野生群体而言人工养殖子代的多态信息含量有所下降, 这说明人工养殖导致大鲵群体的遗传多样性水平下降遗传多样性水平的降低对生物的抗病力生长速度个体大小繁育性能等生物学特性都有直接的影响, 这对于开展大鲵的遗传多样性保护和合理开发利用是非常不利的加之过度捕捞生存环境破坏等原因, 野生资源急剧减少, 所以在以后的人工养殖中更要注意亲本间亲缘关系的选择, 尽可能扩大亲本的数量, 并且结合电子标签技术对大鲵进行编号, 开展系统的繁殖和选育, 最大程度地避免近交衰退和群体遗传多样性水平下降致谢 : 本研究受到中国海洋大学水产学院杨官品老师及其实验室研究人员, 中国水产科学研究院长江

6 538 生物多样性 Biodiversity Science 第 16 卷水产研究所汪登强老师梁宏伟老师的指点, 特此致谢参考文献 Dimitry AC, Bart H, Filip AMV (2006) Microsatellites and their genomic distribution, evolution, function and applications: a review with special reference to fish genetics. Aquaculture, 255, Fang YL ( 方耀林 ), Zhang Y ( 张燕 ), Yang YQ ( 杨焱清 ), Xiao HB ( 肖汉兵 ) (2006) Genetic diversity analysis of domesticated Chinese giant salamander (Andrias davidianus Blanchard). Freshwater Fisheries ( 淡水渔业 ), 36(6), (in Chinese with English abstract) Huang L ( 黄磊 ), Wang YQ ( 王义权 ) (2004) The application of microsatellite DNA markers in conservation genetics of endangered animals. Biodiversity Science ( 生物多样性 ), 12, (in Chinese with English abstract) Lin M, Huang J, Li Z, Yang XL, Huang JH, Zheng WD, Huang YP, Xue H (2003) RAPD analysis on the wild parents and second filial generation of artificial breeding of Andria davidianus. Journal of Shanghai Fisheries University ( 上海水产大学学报 ), 12(Suppl.), Liu ZJ, Cordes JF (2004) DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics. Aquaculture, 238, Masafumi M, Atsushi T, Liu WZ, Tomoko TU (2008) Reduced genetic variation in the Japanese giant salamander, Andrias japonicus (Amphibia: Caudata). Molecular Phylogenetics and Evolution, 49, Murphy RW, Fu JZ, Upton DE, Lema TD, Zhao EM (2000) Genetic variability among endangered Chinese giant salamanders, Andrias davidianus. Molecular Ecology, 9, Tao FY ( 陶峰勇 ), Wang XM ( 王小明 ), Zheng HX ( 郑合勋 ), Fang SG ( 方盛国 ) (2005) Genetic structure and geographic subdivision of four populations of the Chinese giant salamander (Andrias davidianus). Zoological Research ( 动物学研究 ), 26, (in Chinese with English abstract) Tao FY ( 陶峰勇 ), Wang XM ( 王小明 ), Zheng HX ( 郑合勋 ) (2006) Analysis of complete cytochrome b sequences and genetic relationship among Chinese giant salamanders (Andrias davidianus) from different areas. Acta Hydrobiologica Sinica ( 水生生物学报 ), 30, (in Chinese with English abstract) Wang XM, Zhang KJ, Wang ZH, Ding YZ, Wu W, Huang S (2004) The decline of the Chinese giant salamander Andrias davidianus and implications for its conservation. Oryx, 38, Yoshinao K, Satomi K, Tomohiro O, Naoko M, Osamu I, Noriaki S (2006) Molecular cloning of estrogen receptor alpha (Erα ; ESR1) of the Japanese giant salamander, Andrias japonicus. Molecular and Cellular Endocrinology, 257, Zhang ZW ( 张志伟 ), Cao ZM ( 曹哲明 ), Yang H ( 杨弘 ), Wang JL ( 王金龙 ), Cao JL ( 曹谨玲 ), Han YP ( 韩曜平 ), Wu TT ( 吴婷婷 ) (2006) Microsatellites analysis on genetic variation between wild and cultured populations of Ctenopharyngodon idella. Zoological Research ( 动物学研究 ), 27, (in Chinese with English abstract) ( 责任编委 : 周开亚责任编辑 : 时意专 )

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Microsoft Word - 李学军.doc 41 1 Vol.41, No.1 2010 1 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Jan., 2010 (Sarotherodon melanotheron) 5 * 1, 2 1 2 2 (1. 453007; 2. 201306) 5, 6, : (1) 6 5 22 49, 190 204, 190/190 204/204 270/223 270/243; (2)