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1 第 37 卷第 2 期西南师范大学学报 ( 自然科学版 ) 2012 年 2 月 Vol.37 No. 2 JournalofSouthwestChinaNormalUniversity(NaturalScienceEdition) Feb 文章编号 : (2012) EMS 诱变越橘的研究 郑文娟, 石佳, 任广炼, 李政, 李凌 西南大学园艺园林学院, 重庆 摘要 : 用甲基磺酸乙酯和聚乙二醇处理蓝丰越橘组培苗茎尖, 筛选诱变处理的最佳组合和模拟干旱处理的临界浓度, 并应用主成分及隶属函数分析法对诱变前后的蓝丰 达柔组培苗进行耐旱性和耐水淹能力评价. 结果表明 : 诱变处理的最佳组合为 3%EMS 处理 4h, 聚乙二醇的临界浓度为 10%; 通过主成分分析, 耐旱性指标可归纳成叶绿素因子和渗透调节因子 2 个主成分, 越橘的耐旱性由强到弱为 : 未经处理的达柔 未经处理的蓝丰 诱变处理后的蓝丰 诱变处理后的达柔 ; 耐水淹能力指标可归纳成叶绿素因子 抗氧化酶因子和渗透调节因子 3 个主成分, 越橘的耐水淹能力由强到弱为 : 诱变处理后的达柔 未经处理的达柔 诱变处理后的蓝丰 未经处理的蓝丰. 关键词 : 甲基磺酸乙酯 ; 越橘 ; 主成分分析 ; 隶属函数分析中图分类号 :Q 文献标志码 :A 越橘是杜鹃花科 (Ericaceae) 越橘属 (Vaccinium.SPP) 多年生落叶 常绿灌木类果树 [1], 因其果实成熟 后为蓝紫色, 又被称为蓝莓 蓝浆果. 越橘果实柔软多汁, 风味醇美, 有特殊香气, 富含熊果苷 花青苷和 抗氧化成分 (VA VC VE), 具有明目 防止脑神经衰老 提高人体免疫力 防癌 改善微循环等功效 [2], 既 可鲜食又宜于加工, 还可用于天然食用色素的提取, 被誉为 21 世纪功能性保健浆果. 甲基磺酸乙酯 (Ethylmethanesulfonate, 简称 EMS) 是一种具有高效性 稳定性的化学诱变剂 [3-4], 它可直接引起 DNA 点突变及染色体损伤, 并且诱变效果远远高于自发诱变和电离辐射, 被广泛应用于作 [5] 物诱变育种中. 越橘喜酸性土壤, 为浅根系树种, 根系集中分布在 10~60cm 土层内, 严重制约了越橘在干旱及半干 旱地区的栽培推广. 重庆地区夏季长时间的高温伏旱天气严重影响越橘的栽培推广, 而同为西南地区的成 都, 夏季经常出现连续几天的暴雨天气, 长时间的水淹也影响越橘的正常生长. 目前, 国内外对越橘在水 [6-7] 分胁迫下的反应尚无系统的研究. 因此, 获得耐旱 耐水淹型越橘对其在西南地区的栽培推广具有重 要意义. 本实验应用化学诱变剂 EMS 处理越橘组培苗茎尖 [8-9], 并用 PEG 6000 模拟干旱条件初步筛选处理 后的组培苗, 再对所得的植株进行水分胁迫, 通过测定部分生理指标, 评价处理前后植株群体的耐旱性及 耐水淹能力, 以期为越橘水分胁迫研究以及育种工作奠定基础. 1 材料与方法 1.1 材料 诱变材料为取自本学院的北高丛蓝丰 (Vacciniumcorymbosumcv.Bluecrop) 达柔 (Vaccinium dar- 1 收稿日期 : 作者简介 : 郑文娟 (1986 ), 女, 重庆长寿人, 硕士研究生, 主要从事园林植物生物技术与遗传育种研究. 通信作者 : 李凌, 教授, 硕士生导师.

2 第 2 期 郑文娟, 等 :EMS 诱变越橘的研究 103 rowi.camp) 越橘组培苗, 用蓝丰筛选各种实验条件. 化学诱变剂甲基磺酸乙酯 (EMS) 为美国 SIGMA 公 司生产. 1.2 PEG 6000 临界浓度的筛选 采用聚乙二醇 (PEG 6000) 模拟干旱胁迫, 配制 PEG 浓度为 0%,5%,10%,15% 和 20% 的 MS 培养 基, 切取生长健壮的蓝丰组培苗茎尖 ( 长约 5 mm), 分别接种于上述培养基中.25d 后观察继代苗生长 情况. 1.3 EMS 处理越橘茎尖 用 0.01mol/L,pH=4.8 高压灭菌后的磷酸缓冲液分别配制浓度为 1%,3%,5% 的 EMS 溶液, 以磷 酸缓冲液作对照, 以 CK 表示. 切取长度约 5 mm 的蓝丰组培苗茎尖用不同浓度的 EMS 溶液分别浸泡 1 h,2h,3h,4h, 处理过程中不断震荡. 无菌水冲洗 5~6 次, 接种于 MS 培养基上.25d 后观察茎尖的生长 情况并统计死亡率. 将经半致死浓度处理 25d 的蓝丰 达柔组培苗接种于 10% 的 PEG 培养基中进行初步筛选,25d 后转 接于正常培养基中, 待其长至 4~5cm 高 ( 约 30~40d) 时进行生根处理, 生根炼苗后, 移栽于 8cm 8cm 规格的小塑料钵中, 进行水分和养分管理. 1.4 植株耐性比较 胁迫条件的选择 以未经 EMS 处理的蓝丰作为胁迫条件选择试验的材料, 待植株生长到 12~16 片真叶时对其进行干 旱 淹水胁迫处理.(1) 干旱胁迫 : 以根际水分胁迫为主, 处理前先浇透水, 处理开始后停止浇水. 当土壤 含水率为 70%,50%,30% 时, 早晨 8 点, 随机取植株功能叶片保存于 4 保温盒中, 进行生理指标测定. 正常浇水时, 土壤含水率约为 70%, 故将其作为干旱胁迫的空白对照.(2) 淹水处理 : 处理开始后, 一直保 持塑料钵中土面以上 2cm 高的水位, 直至实验结束. 于处理开始后 0,3,6,12,24 和 48h 随机取植株功能 叶片, 测定植株的生理指标, 以未经淹水处理的植株作为空白对照 ( 即处理 0h) 耐性指标的筛选 (1) 干旱胁迫 : 当土壤含水率为 50% 时, 测定蓝丰 达柔经 EMS 处理前后各植株群体功能叶中叶绿 [10-14] 素 丙二醛 脯氨酸 可溶性糖含量以及超氧化物歧化酶活性.(2) 淹水处理 : 于处理开始后 12h, 随 机取各类植株功能叶片, 测定各项生理指标. 1.5 测定方法 氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶 [15] ; 硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛 [15] ; 茚三酮比色法测定脯氨 [16] [15] [17] 酸 ; 蒽酮比色法测定可溶性糖 ; 分光光度法测定叶绿素. 1.6 数据处理 用 Excel(Ofice2003) 和 SPSS( 版本 11.5) 软件进行方差分析, 并用主成分分析和隶属函数法评价 2 种 越橘诱变前后耐旱性 耐水淹能力强弱. 隶属函数计算方法 : 如果某指标与抗性成正相关,R(Xi)= (Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin); 如果某指标与 抗性成负相关,R(Xi)=1-[(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)]. 其中,R(Xi) 为测定指标的隶属函数值,Xi 为某参试材料某一指标测定值,Xmax,Xmin 为所有供试材料 该指标测定值的最大值和最小值. 2 结果与分析 2.1 PEG 6000 临界浓度的确定 经不同浓度 PEG 处理后, 蓝丰组培苗生长缓慢或不能正常生长, 有的叶片边缘出现干枯现象, 产生大 量玻璃化苗. 由表 1 可知, 随着 PEG 浓度的升高, 组培苗的玻璃化率先升高后降低, 分化率逐渐降低, 当 PEG 浓度为 15% 时, 玻璃化率最高. 最终确定 PEG 模拟水分胁迫的临界浓度为 10%.

3 104 西南师范大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 37 卷 表 1 越橘茎尖经 PEG 处理后的生长情况 PEG 浓度 /% 接种数 玻璃化率 /% 分化率 /% PEG 浓度 /% 接种数 玻璃化率 /% 分化率 /% EMS 处理浓度和处理时间的确定 经 EMS 处理后的越橘茎尖的生长能力明显比对照组弱, 表现在株高较矮 基部分枝能力减弱 叶片发 黄等方面 ( 图 1 图 2).EMS 对越橘茎尖的作用主要受处理浓度和处理时间两方面的影响. 由表 2 可知, 在 3%+4h 和 5%+1h 的处理组合下, 越橘茎尖的死亡率约为 50%. 考虑到高浓度的 EMS 会对植株造成很 大的损伤, 最终确定 EMS 处理越橘茎尖的最佳组合为 3%EMS 处理 4h. 表 2 越橘茎尖经 EMS 处理后的死亡率 /% EMS 浓度 处理时间 /(h) CK % % % 图 1 对照植株图 2 经 EMS 处理后的植株 2.3 胁迫条件的确定植物为了避免受到因胁迫而造成的伤害, 形成了抗氧化酶类保护系统, 超氧化物歧化酶 (SOD) 就是其中一种. 植物膜脂过氧化终产物 丙二醛含量的变化也可以反映出植物遭受伤害的程度. 作为渗透调节物质, 脯氨酸含量的变化也与植物遭受伤害的程度相关 苗期干旱胁迫条件的确定土壤含水率可以表示土壤的水分状况, 本实验在同一时间段进行, 所有参试植株都种植在同一栽培基质中, 可以排除季节和不同基质特性对植株的影响, 故土壤含水率可以作为植物耐旱性筛选的梯度指标. 由表 3 可知, 随着干旱胁迫的加强,SOD 活性先升高后降低. 这是因为干旱胁迫初期植物抗氧化酶类活动活跃,SOD 活性增强, 当土壤含水率为 50% 时, 其活性最高. 随着胁迫的进一步增强, 当土壤含水率为 30% 时, 抗氧化酶类保护系统可能遭受破坏,SOD 活性有所下降. 随着干旱胁迫的加强, 丙二醛和脯氨酸含量也呈现出先升高后降低的趋势. 当土壤含水率为 50% 时, 含量最高. 故选择土壤含水率为 50% 作为研究越橘苗期干旱胁迫的条件.

4 第 2 期 郑文娟, 等 :EMS 诱变越橘的研究 105 表 3 干旱胁迫对蓝丰叶片部分生理指标的影响 土壤含水率 SOD/(U/g) 丙二醛 /(umol/g) 脯氨酸 /(ug/g) 70% c 24.59c 66.44c 50% a 42.59a a 30% b 32.59b b 注 : 每一指标同列中不同小写字母表示差异显著 p<0.05, 下同 苗期淹水胁迫条件的确定 随着淹水处理时间的延长,SOD 活性和丙二醛含量均呈现出先升高后降低再升高的变化趋势, 当处理 时间为 12h 时,SOD 活性最低, 丙二醛含量也低 ; 脯氨酸含量先升高后降低, 当处理时间为 12h 时, 其含 量最高 ( 表 4). 故选择淹水处理 12h 作为研究越橘苗期淹水胁迫的条件. 表 4 淹水胁迫对蓝丰叶片部分生理指标的影响 处理时间 /h SOD/(U/g) 丙二醛 /(umol/g) 脯氨酸 /(ug/g) d 24.59f 66.44d c 44.84c 69.49c c 59.47b 87.00b e 43.02d 93.16a b 61.69a 92.41a a 32.83e 88.37b 2.4 越橘苗期耐旱性综合评价 应机制. 采用主成分分析能够避免多个指标的重复性和单一指标的片面性, 更能全面评价水分胁迫下越橘的适 干旱胁迫下方差分析 方差分析结果表明 ( 表 5), 越橘的 7 个耐旱性指标中, 重复间差异不显著, 材料间差异显著, 可以做主 [18] 成分分析. 表 5 干旱胁迫下的方差分析及 F 值检验 指标叶绿素 a 叶绿素 b 叶绿素总含量 SOD 丙二醛脯氨酸可溶性糖 种质资源间差异 ** ** ** ** ** 区组间差异 注 :F 检验, * 表示差异显著,p<0.05; ** 表示差异极显著,p<0.01, 下同 干旱胁迫下主成分分析 主成分分析能够排除多指标数据间的重叠性 [19-20], 较好地反应越橘的耐旱性. 由表 6 可知,1 2 两个主成分的累计贡献率已达 %, 表明它们在越橘的耐旱性评价中起主要作 用. 因此, 可以选取它们作为综合指标评价越橘的耐旱性 ( 表 7). 表 6 干旱胁迫下主成分分析结果 主成分特征值贡献率 /% 累积贡献率 /% 表 7 干旱胁迫下各因子载荷矩阵 指 标 叶绿素 a 叶绿素 b 叶绿素总含量 SOD 丙二醛 脯氨酸 可溶性糖 成分 成分 第一主成分对应较大的特征向量中,SOD 丙二醛和可溶性糖为负向标, 说明低活性的 SOD 活性 低

5 106 西南师范大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 37 卷 含量的丙二醛和可溶性糖有利于越橘耐旱, 而叶绿素 a 叶绿素 b 叶绿素总含量为正向标, 说明叶绿素含 量高有利于越橘耐旱, 故称该主成分为叶绿素因子. 第二主成分中, 脯氨酸为较大的正特征向量. 脯氨酸是一种渗透调节物质, 高浓度的脯氨酸能够使植 物保持从外界继续吸水 维持细胞膨压等生理过程, 故称该主成分为渗透调节因子 干旱胁迫下隶属函数分析 第一主成分已经代表了 % 的越橘耐旱性信息, 故选第一主成分中的较大特征向量 : 叶绿素 a 叶绿素 b 叶绿素总含量 SOD 丙二醛 可溶性糖 6 个指标进行隶属函数分析, 评价越橘的耐旱性. 根据 隶属函数平均值的大小 ( 表 8), 得到越橘耐旱性由强到弱的顺序为 :DCK LCK LE DE. 表 8 干旱胁迫下越橘隶属函数值 材料 叶绿素 a 叶绿素 b 叶绿素总含量 SOD 丙二醛 可溶性糖 隶属函数平均值 LCK LE DCK DE 注 :LCK 表示未经 EMS 处理的蓝丰,LE 表示经 EMS 处理后的蓝丰,DCK 表示未经 EMS 处理的达柔,DE 表示经 EMS 处 理后的达柔, 下同. 2.5 越橘苗期耐水淹能力综合评价 淹水胁迫下方差分析 方差分析结果表明 ( 表 9), 越橘的 7 个耐水淹指标中, 实验材料间均差异极显著, 重复间差异不显著, 可以进行主成分分析. 表 9 淹水胁迫下的方差分析及 F 值检验 指 标 叶绿素 a 叶绿素 b 叶绿素总含量 SOD 丙二醛 脯氨酸 可溶性糖 种质资源间差异 ** ** ** ** ** ** ** 区组间差异 淹水胁迫下主成分分析 由表 10 可知, 前 3 个主成分的累积贡献率已达 100%, 表明它们能够全部反映出越橘的耐水淹信息. 因此, 选取前 3 个主成分作为综合指标评价越橘的耐水淹能力 ( 表 11). 表 10 淹水胁迫下主成分分析结果 主成分 特征值 贡献率 /% 累积贡献率 /% 表 11 淹水胁迫下各因子载荷矩阵 指标 叶绿素 a 叶绿素 b 叶绿素总含量 SOD 丙二醛 脯氨酸 可溶性糖 成分 成分 成分 第一主成分贡献率为 %, 对应较大的特征向量中,SOD 为负向标, 说明低活性的 SOD 活性有 利于越橘耐水淹, 而叶绿素 a 叶绿素 b 叶绿素总含量 可溶性糖为正向标, 说明叶绿素和可溶性糖含量 高有利于越橘耐水淹, 称该主成分为叶绿素因子. 第二主成分贡献率为 %, 对应较大的特征向量中,SOD 为正向标, 可溶性糖为负向标. 水分胁 迫下, 抗氧化酶类活动活跃, 清除植物体内多余的活性氧, 以保证植物正常的生理生化代谢, 称该主成分

6 第 2 期 郑文娟, 等 :EMS 诱变越橘的研究 107 为抗氧化酶因子. 第三主成分贡献率为 %, 对应较大的特征向量有丙二醛 脯氨酸. 其中丙二醛为负向标, 丙二 [21] 醛是膜脂过氧化产物, 也是衡量植物受损害程度的生理指标. 脯氨酸为正向标, 故称该主成分为渗透调 节因子 淹水胁迫下隶属函数分析 第一 二两个主成分的累积贡献率已达 %, 表明这两个主成分在越橘的耐水淹能力评价中起主 要作用. 选这两个主成分中的较大特征向量 : 叶绿素 a 叶绿素 b 叶绿素总含量 SOD 可溶性糖 5 个指 标进行隶属函数分析, 评价越橘的耐水淹能力. 根据隶属函数平均值的大小 ( 表 12), 得知越橘耐水淹能力 由强到弱的顺序为 :DE DCK LE LCK. 表 12 淹水胁迫下越橘隶属函数值 材料 叶绿素 a 叶绿素 b 叶绿素总含量 SOD 可溶性糖 隶属函数平均值 LCK LE DCK DE 结论与讨论 EMS 作为一种化学诱变剂, 被广泛应用于各种植物的诱变育种中, 特别是一些农作物, 如水稻 小麦 [22] 玉米 马铃薯 大豆等. 本实验得出 :EMS 处理蓝丰茎尖的半致死组合是 3% 的 EMS 处理 4h. 在组培 苗模拟干旱胁迫方面,PEG 的最佳浓度为 10%, 此时, 蓝丰组培苗茎尖的玻璃化率接近 50%, 分化率 较高. 对蓝丰幼苗进行干旱和淹水胁迫, 通过其叶片部分生理指标的变化情况确定 : 土壤含水率为 50% 作为 研究越橘苗期干旱胁迫的条件 ; 淹水处理 12h 作为研究越橘苗期淹水胁迫的条件. 土壤含水率过高达不到 干旱胁迫的目的, 过低就会对植物造成一些不可逆转的损伤, 严重时会使植株因缺水而死亡. 同理, 淹水 胁迫时间过短就达不到胁迫的效果, 而时间过长就会造成植株叶片萎焉 脱落, 甚至死亡. 越橘耐旱性结果表明 : 未经 EMS 处理的越橘材料的耐旱性强于处理过的越橘材料 ; 就越橘的品种而 言, 达柔的耐旱性强于蓝丰 ; 而经 EMS 处理之后, 蓝丰的耐旱性却强于达柔, 这可能是因为 EMS 处理使 蓝丰群体中产生了一些耐旱性增强的变异体. 越橘淹水处理的结果表明 : 就不同品种而言, 不管是否经过 EMS 处理, 达柔的耐水淹能力都强于蓝 丰 ; 同一品种中, 经 EMS 处理后的材料的耐水淹能力强于未处理的材料. 这可能是因为经 EMS 处理之后, 越橘材料中出现了一些耐水淹能力增强的变异体. 参考文献 : [1] 刘庆忠, 赵红军. 越桔高效栽培与加工利用 [M]. 北京 : 中国农业出版社,2003:4. [2] 顾烟, 贺善安. 蓝浆果与蔓越桔 [M]. 北京 : 中国农业出版社,2001:3. [3] 徐冠仁. 植物诱变育种 [M]. 北京 : 中国农业出版社,1996: [4] 王长里, 付晶, 杨学举.EMS 诱导小麦突变体的研究及展望 [J]. 安徽农业科学,2008,36(19): [5] 张光灿, 贺康宁, 刘晓, 等. 黄土高原半干旱区林木生长适宜土壤水分环境的研究 [J]. 水土保持学报,2001, 15(4):1-51. [6] 马琳娜, 吴林, 李亚东, 等. 越橘水分胁迫研究进展 [J]. 安徽农业科学,2010,38(4): [7] DAVIESFS,JOHNSONCR.WaterStress,Growth,andCriticalWaterPotentialsofRabbiteye[J].JAmerSocHort Sci,1982,107(1):6-8. [8] 陈凌, 张文玲, 张敏, 等. 化学诱变剂 EMS 筛选越橘茎尖抗旱突变体的初步研究 [J]. 西南师范大学学报 : 自然科学版,2010,35(3):

7 108 西南师范大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 37 卷 [9] 张敏, 杨艳, 康兆茹, 等.EMS 诱变南高丛越橘及抗旱突变体的筛选 [J]. 西南师范大学学报 : 自然科学版,2011, 36(3): [10] 王支槐, 黄继承, 李坤培. 水分胁迫条件下不同甘薯品种的抗旱性初探 [J]. 西南师范大学学报 : 自然科学版,1986, 11(4): [11] 李莉, 钟章成, 缪世利, 等. 诸葛菜对水分胁迫的生理生化反应和调节适应能力 [J]. 西南师范大学学报 : 自然科学版,2000,25(1): [12] 邓胜兴, 曾明, 熊伟, 等. 干旱胁迫对柑橘叶片保护酶系统的影响 [J]. 西南大学学报 : 自然科学版,2009,31(2): [13] 倪书邦, 刘建福, 李道高, 等. 澳洲坚果花期水分胁迫效应的研究 [J]. 西南农业大学学报 : 自然科学版,2002,24(1): [14] 钱春, 刘素君, 尹克林. 水分胁迫对草莓膜保护系统的影响 [J]. 西南农业大学学报 : 自然科学版,2005,27(4): [15] 王学奎. 植物生理生化实验原理和技术 [M]. 北京 : 高等教育出版社,2006. [16] 李合生. 植物生理生化实验原理和技术 [M]. 北京 : 高等教育出版社,2000. [17] 熊庆娥. 植物生理学实验教程 [M]. 成都 : 四川科学技术出版社,2003:551. [18] 韩瑞宏, 卢欣石, 高桂娟, 等. 紫花苜蓿抗旱性主成分分析及隶属函数分析 [J]. 草地学报,2006,14(6): [19] 何晓群. 现代统计分析方法与应用 [M]. 北京 : 中国人民大学出版社,1998: [20] 陈建民, 庞新生. 统计数据分析理论与方法 [M]. 北京 : 中国林业出版社,2006:10. [21] 夏新莉, 郑彩霞, 尹伟伦. 土壤干旱胁迫对樟子松针叶膜脂过氧化 膜脂成分和乙烯释放的影响 [J]. 林业科学,2003, 36(3):8-12. [22] 李学宝. 甲基磺酸乙酯对水稻萌发种子的生理效应 [J]. 武汉植物学研究,1991,9(3): APreliminaryStudyofMutagenesisinBlueberryPlantswithEMS ZHENG Weṉjuan, SHI Jia, REN Guangḻian, LI Zheng, LI Ling SchoolofHorticultureandLandscapeArchitecture,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China Abstract:Theshoottipsofthetesṯtubeplantletsofblueberry (Vaccinium spp.)cultivarsbluecropand Darrow weretreated withems (ethylmethanesulphonate)atdiferentconcentrationsandsubjectedto PEG (polyethyleneglycol)-simulateddrought,todeterminetheoptimumchemicalmutagenesiscombinationandthecriticalpegconcentration.principalcomponentanalysisand membershipfunctionanalysis weremadetoevaluatethedroughtresistanceandwateṟloggingtoleranceofthematerialsbeforeandafter thetreatment.theresultsshowedthatthebestcombinationofchemicalmutagenesiswasemstreatment at3% andfor2handthecriticalpegconcentrationofsimulateddroughtwas10%.byprincipalcomponentanalysisand membershipfunctionanalysis,thefactorsofchlorophylandosmoticadjustmentwere showntobethetwoprincipalcomponentsandthedroughttoleranceoftheplantletsstudiedwereintheoṟ derofnoṉems-treateddarrow>noṉems-treatedbluecrop>ems-treatedbluecrop>ems-treateddaṟ row;andchlorophyl,antioxidantenzymesandosmoticadjustmentwerethethreeprincipalcomponents forwateṟloggingṟesistance,whichwasintheorderofems-treateddarrow>noṉems-treateddarrow> EMS-treatedBluecrop>noṉ EMS-treatedBluecrop. Keywords:ethylmethanesulphonate(EMS);blueberry;principalcomponentanalysis;membershipfunctionanalysis 责任编辑欧宾

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