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1 204 国际中医中药杂志 2016 年 3 月第 38 卷第 3 期 Int J Trad Chin Med, March 2016, Vol. 38, No.3 脂联素基因近侧启动子区单核苷酸多态性与 2 型糖尿病患者中医证型相关性研究论著杨国宗苏小惠吴小芳戴秀娟杨丽阳潘诚志摘要目的探讨血清脂联素 (adiponectin, APN) 基因启动子区域单核苷酸多态性频率与 2 型糖尿病 (type 2 diabetes, T2DM) 患者中医证候的关系方法将符合入选标准的 120 例 T2DM 患者按中医辨证分型分为气阴两虚组 42 例阴虚燥热组 38 例阴阳两虚组 40 例, 另选取 50 例正常体检者为健康对照组, 采用 PCR 扩增技术筛选脂联素基因 (adiponectin gene, apm1) 启动子多态性位点, 采用日本日立全自动化生化分析仪测定患者 TG TC LDL-C HDL-C, 并计算胰岛抵抗指数 (insulin resistance index, HOMA-IR) 结果阴虚燥热组患者血清 APN 水平 [(6.98±1.23)µg/ml 比 (2.55±0.78)µg/ml (3.48± 0.22)µg/ml] 高于气阴两虚组及阴阳两虚组 (P < 0.05),TG(4.48 ± 0.87)mmol/L LDL-C(4.98 ± 0.42)mmol/L TC(5.36±0.79)mmol/L 高于气阴两虚组 (3.25±0.75)mmol/L (4.02±0.69)mmol/L (3.12± 0.52)mmol/L 及阴阳两虚组 (3.18±0.69)mmol/L (4.09±0.71)mmol/L (3.22±0.78)mmol/L(P<0.05); 不同证型 T2DM 患者血清 HOMA-IR HDL-C 水平比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) 阴虚燥热组 apm g/c 基因型中 GG 基因型 [78.95%(30/38) 比 42.86%(18/42) 35.00%(14/40)] 显著高于气阴两虚组及阴阳两虚组 (P<0.05), 气阴两虚组及阴阳两虚组 apm g/c 基因型中 GG 基因型高于健康对照组 (P<0.05) GG 基因型血清 APN 水平 [(7.02±1.23)µg/ml 比 (3.25±0.78)µg/ml (2.42±0.22)µg/ml, F=8.123] 显著高于 GC 型及 CC 型 (P<0.001), 其他指标比较差异无统计学意义 (P>0.05) 结论 T2DM 患者阴虚燥热型与 apm g/c 基因多态性有关,aPM G/C 基因多态性可在一定程度上反映 T2DM 患者中医证候分型, 并通过影响患者胰岛素抵抗动脉斑块及血清 APN 水平, 影响 T2DM 发生发展关键词血清脂联素 ; 单核苷酸多态性 ;2 型糖尿病 ; 中医证候 Association of single nucleotide polymorphisms in the proximal promoter region of the adiponectin gene with TCM syndromes in patients with type 2 diabetes Yang Guozong *, Su Xiaohui, Wu Xiaofang, Dai Xiujuan, Yang Liyang, Pan Chengzhi. * Department of Detecting Laboratory, Chinese Traditional Medicine Hospital in Zhangzhou, Zhangzhou , China Corresponding author: Yang Guozong, yanguozong@163.com Abstract Objective To investigate the relationship of serum adiponectin (APN) gene promoter region single nucleotide polymorphism (SNP) frequency and type 2 diabetes mellitus (T2DM). Methods 120 cases of T2DM were divided into Yin Deficiency Syndromes(n=42), Yin hot (n=38), yin and yang (n=40) and 50 cases of normal volunteers were select as the control group. The diponectin gene (apm1) promoter polymorphisms of each group were detected with polymerase chain reaction amplification (PCR). Results Serum APN Yin hot levels in patients with T2DM (6.98 ± 1.23 µg/ml) were lower than Qi and yin (2.55 ± 0.78 µg/ml) and yang group (3.48 ± 0.22 µg/ml) (P<0.05), and TG, LDL-C, TC (4.48 ± 0.87 mmol/l, 4.98 ± 0.42 mmol/l, 5.36 ± 0.79 mmol/l) were higher than Qi and yin (3.25 ± 0.75 mmol/l, 4.02 ± 0.69 mmol/l, 3.12 ± 0.52 mmol/l) and yang group (3.18 ± 0.69 mmol/l, 4.09 ± 0.71 mmol/l, 3.22 ± 0.78 mmol/l)(p<0.05). Yin hot type apm g/c genotype of the GG genotype was significantly higher than the proportion of Qi and yin DOI: /cma.j.issn 基金项目 : 漳州市自然科学基金项目 (ZZ2012J39); 福建省卫生厅中医药科研课题 (wztn201310) 作者单位 : 福建省漳州市中医院检验科 ( 杨国宗吴小芳潘诚志 ), 糖肾科 ( 苏小惠戴秀娟杨丽阳 ) 通信作者 : 杨国宗, yanguozong@163.com

2 国际中医中药杂志 2016 年 3 月第 38 卷第 3 期 Int J Trad Chin Med, March 2016, Vol. 38, No and yang group (P<0.05), while the yin and yang and yin and yang group apm g/c genotype the proportion was higher in GG genotype (P<0.05). GG genotype was significantly lower than serum APN type CG and CC genotype (P<0.05), whereas no significantdifference in other indexes (P>0.05). Conclusion T2DM patients Yin hot type inherent relationship with apm g/c polymorphism, apm g/c polymorphism may reflect R2DM Disease Syndromes typing a certain extent, and by influence insulin resistance in patients with arterial plaque and serum APN levels, thereby affecting T2DM disease occurrence and progression. Key words Serum adiponectin; Single nucleotide polymorphism; Type 2 diabetes; TCM symptoms 2 型糖尿病 (type 2 diabetes, T2DM) 为环境因素及遗传因素共同作用引起的慢性终生性疾病 [1] 中医认为 T2DM 属血瘀痰浊等范畴, 多因痰浊致瘀痰瘀互结, 沉积血脉所致 [2] 动脉粥样硬化肥胖脂质代谢紊乱高血压等是引起 T2DM 的独立危险因素脂联素 (adiponectin, APN) 是由脂肪细胞生成及分泌的细胞因子, 脂联素基因 (adiponectin gene, apm1) 存在 11377G/C 基因多态性, 与肥胖脂质代谢紊乱及胰岛素抵抗有密切关系 [3-4] 本研究将通过对 T2DM 患者不同证候患者 apm g/c 基因型进行检测, 分析 T2DM 患者不同中医证候中 apm g/c 基因型的变化及其对 T2DM 患者的影响, 旨在从基因水平探求中医证的本质, 为 T2DM 的易感人群防治提供依据 1 资料与方法 1.1 研究对象选择 2014 年 1-12 月漳州市中医院就诊患者 [5] 120 例均符合 T2DM 诊断标准及中医辨证分型 [6] 标准 ; 均获得伦理医学委员会通过并签署知情同意书排除肝肾心功能不全恶性肿瘤 I 型糖尿病及免疫功能缺陷性疾病患者 120 例 T2DM 患者中男性 62 例女性 58 例 ; 年龄 42~82 岁, 平均 (62.8±5.2) 岁按辨证分型将患者分为阴虚燥热组 38 例 ; 气阴两虚组 40 例 ; 阴阳两虚组 42 例另选择 50 例常规例行体检者设为健康对照组, 经糖耐量测试血糖均正常, 且符合本研究入选及排除标准其中, 男性 28 例女性 22 例 ; 年龄 40~ 85 岁, 平均 (61.9±4.8) 岁 1.2 辨证分型标准依据文献 [6] 相关标准制定, 由本院 2 位副主任中医师, 及 1 位全国名老中医进行中医证型的判定 1 阴虚燥热 : 主症可见易饥多食口渴引饮心烦失眠 ; 次症为心悸怔仲急躁易怒头晕目眩, 舌红苔黄, 脉细数 2 气阴两虚 : 主症可见心悸气短倦怠乏力头晕耳鸣 ; 次症为遗精早泄心烦失眠面色苍白, 舌淡少苔, 脉细数 3 阴阳两虚 : 主症可见形寒肢冷精神萎靡大便泄泻 ; 次症为腰酸耳鸣, 舌淡苔白, 脉沉迟细 1.3 研究方法本研究主要通过检测 T2DM 患者的生化指标及 APN 水平测定患者胰岛素抵抗指数 (insulin resistance index, HOMA-IR) 及 apm g/c 基因多态性, 探讨血清 APN 基因启动子区域单核苷酸多态性频率与 T2DM 患者中医证候的关系检测仪器及试剂 : 流式细胞仪 XL 型 ( 美国 Coulter 公司 );TGL-16B 台式高速低温离心机 ( 上海安亭科学仪器厂 ); 水平电泳槽 DYCP 31( 国营华东电子管厂 ); 超净工作台 SW-CJ-IF 型 ( 苏州净化公司 );DU530 型紫外分光光度计 ( 美国 College 仪器设备公司 );Thermo Px2 型 PCR 仪 ( 美国 Thermo 公司 ); 彩色多普勒超声 ( 美国飞利浦公司 ) APN 测定试剂 ( 美国 R&D 公司 );PCR 反应缓冲液 ( 美国 Sigma 公司 );Taq DNA 聚合酶 (Rockland 公司 ); 乙二胺四乙酸 (EDTA,Sigma 公司 );Taq DNA 聚合物 ( 上海生物科技有限公司 );DNA 标记物 ( 上海生物科技有限公司 );PCR 引物 [ 生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司 ];DNA

3 206 国际中医中药杂志 2016 年 3 月第 38 卷第 3 期 Int J Trad Chin Med, March 2016, Vol. 38, No.3 引物由北京天一生物技术公司提供 ;DNA 探针 (5 -TGCCGCC GCCCGGTGGTGCCCTCGTC-3 ) 由北京赛百盛生物技术公司提供相关指标检测 :1 血脂水平 : 抽取患者静脉血 3 ml, 采用日本日立全自动化生化分析仪测定患 1.4 统计学方法采用 SPSS 17.0 软件进行数据分析计量资料呈正态分布, 方差齐时采用方差分析, 以 x s 示 ; 计数资料以百分率表示, 采用 χ 2 检验 P<0.05 为差异有统计学意义表者 TG TC LDL-C HDL-C 2 HOMA-IR= 空腹胰岛素 (fasting insulin, FINS) FPG/ APN 检测方法 : 抽取患者静脉血 3 ml, 经离心处理后留取上清液, 采用 ELISA 法测定患者血清 APN 水平, 试剂盒由上海凯博生化试剂有限公司提供, 操作过程严格按照试剂盒说明书进行操作 apm g/c 基因多态性测定 : 空腹抽取各组静脉血 3 ml, 经离心处理后留取上清液, 采用 EDTA 二钾抗凝全血标本, 用日本 TOYOBO 磁珠法 DNA 提取试剂盒提取 DNA, 操作过程严格按照试剂盒说明进行, 将 DNA 标本于 -80 冰箱保存分别在 IL-10 突变型及野生型引物上游 3 端 -2 位置引入错配碱基 G ( 突变引物 :5 - GCGGGCCGCCGTGTGGGGGG-3,( 野生引物 : 5 -GCGGGCCGCCGTGTGGGGG C-3 ) 反应条件 :42 反转录 30 min, 随后将温度变为 95 将 DNA 变性 2 min, 然后于 55 中 15 s 72 中 30 s 以及 95 中 30 s 反复循环扩增, 并在退火阶段收集荧光信号采用荧光定量 PCR 仪测定 Tap Man 探针上的 FAM 荧光信号等位基因频率 =(2 纯合子 + 杂合子 )/(2 受体人数 ) 按照 Hardy-Weinberg 平衡法对群体代表样本进行分析 2 结果 2.1 各组脂联素水平及相关指标比较阴虚燥热组血清 APN TG LDL-C TC 水平高于气阴两虚组 (t 值分别为 ,P<0.05) 及阴阳两虚组 (t 值分别为 ,P<0.05); 阴虚燥热组 HOMA-IR TG LDL-C TC HDL-C 水平 (t 值分别为 ) 气阴两虚组(t 值分别为 ) 阴阳两虚组(t 值分别为 ) 均高于健康对照组 (P<0.05) 不同证型 T2DM 患者血清 HOMA-IR HDL-C 水平比较, 差异无统计学意义 (P>0.05), 见表各组 apm g/c 基因位点不同基因型比较阴虚燥热组 apm g/c 基因型中 GG 基因型明显高于气阴两虚组及阴阳两虚组 (χ 2 值分别为 ,P<0.05), 而气阴两虚组及阴阳两虚组 apm g/c 基因型中 GG 基因型高于健康对照组 (χ 2 值分别为 ,P<0.05), 见表 2 表 1 各组 T2DM 患者 APN 水平及相关指标比较 ( x s ) 组别例数 APN(µg/ml) TG(mmol/L) TC(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C(mmol/L) HOMA-IR 阴虚燥热组 ±1.23 abc 4.48±0.87 abc 5.36±0.79 abc 4.98±0.42 abc 1.80± ±0.21 气阴两虚组 ±0.78 a 3.25±0.75 a 4.02±0.69 a 3.12±0.52 a 1.82± ±0.42 阴阳两虚组 ±0.22 a 3.18±0.69 a 4.09±0.71 a 3.22±0.78 a 1.83± ±0.39 健康对照组 ± ± ± ± ± ±0.40 F 值 P 值注 T2DM:2 型糖尿病 ;APN: 脂联素 ;HOMA-IR: 胰岛素抵抗指数 ; 与健康对照组比较, a P<0.05; 与气阴两虚组比较, b P<0.05; 与阴阳两虚组比较, c P<0.05

4 国际中医中药杂志 2016 年 3 月第 38 卷第 3 期 Int J Trad Chin Med, March 2016, Vol. 38, No 表 2 各组 T2DM 患者 apm g/c 基因位点不同基因型比较 [ 例 (%)] 组别例数 GG 型 GC 型 CC 型阴虚燥热组 38 30(78.95) abc 6(15.79) 2( 5.26) 气阴两虚组 42 18(42.86) a 12(30.00) 12(30.00) 阴阳两虚组 40 14(35.00) a 14(35.00) 12(30.00) 健康对照组 50 0(0) 8(16.00) 42(84.00) χ 2 值 P 值 <0.001 <0.001 <0.001 注 T2DM:2 型糖尿病 ; 与健康对照组比较, a P<0.05; 与气阴两虚组比较, b P<0.05; 与阴阳两虚组比较, c P< 型糖尿病不同 apm g/c 基因型脂联素水平及相关指标比较 GG 基因型血清 APN 水平显著高于 GC 型及 CC 型 (P<0.05) 其他指标比较差异无统计学意义 (P>0.05), 见表 3 3 讨论 APN 是由脂肪细胞特异性产生的蛋白质, 主要由 2 个内含子及 3 个外显子组成, 其基因位于 3q27 号染色体上 [7] 多项研究指出 [8],APN 基因多态性与抗炎抗氧化抗动脉粥样硬化密切相关 APN 是 T2DM 的保护因素,APN 水平下降与 T2DM 的发生及进展有密切关系 [9] 本研究结果显示,T2DM 患者血清 APN 水平显著低于健康对照组, 这与人体内存在脂肪 - 胰岛素内分泌轴, 脂肪组织在胰岛素抵抗中起到重要的作用, 而 APN 作为脂肪细胞分泌激素, 其水平下降与胰岛素分泌 [10] 减少相关南楠等研究指出, 中医证型与胰岛 [11] 素抵抗糖代谢及脂代谢有关列海涛等认为, 阴虚燥热 T2DM 患者 LDL-C TG 水平显著高于气阴两虚型本研究中阴虚燥热型 T2DM 患者血清 APN TG TC LDL-C 水平高于气阴两虚组 [12] 及阴阳两虚组的结果, 与赵灵燕等的结果相似, 而各组 HOMA-IR 比较差异无统计学意义 (P> 0.05) 提示血糖异常是 T2DM 各型共同的特征, 证型的归属不受血糖的影响, 但与脂类代谢密切相关本研究采用 PCR 测定 apm1 启动子区的基因多态性结果显示,aPM1 启动子区 G/C 等位基因多态性与 T2DM 的发生相关与健康对照组比较,T2DM 患者 G 等位基因携带的比例显著增高, 提示 G 等位基因可能是 T2DM 患者易感基因之一 11377G/C 基因型决定了 T2DM 患者 APN 水平本研究结果表明,GG 型患者 APN 水平显 [13] 著高于其他基因型, 这与 Matharoo 等一致, 但 [14] 与国外学者 Chung 等结果存在差异, 其可能原因是研究人群存在差异, 基因型受种族的影响较大此外,T2DM 是受多基因及多环境因素影响的疾病, 因此个体所处的环境也可能影响患者基因型本研究结果认为, 不同证候患者 11377G/C 基因型存在差异, 其中阴虚燥热组 apm g/c 基因型中 GG 基因型比例显著高于气阴两虚组及阴阳两虚组 (P<0.05) 由于不同证型患者不同层面整体功能存在差异, 阴虚燥热组患者证型与脂类代谢异常有关,APN 水平受 apm g/c 基因型影响, 而 APN 水平可影响脂质代谢及动脉粥样硬化, 因此 11377G/C 等位基因多态性可影响 T2DM 中医证型综上所述,T2DM 患者阴虚燥热证型与表 3 T2DM 患者不同 apm g/c 基因型 APN 水平及相关指标对比基因型例数 APN(µg/ml) TG(mmol/L) TC(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C(mmol/L) HOMA-IR GG 型 ±1.23 ab 3.82± ± ± ± ±0.45 GC 型 ± ± ± ± ± ±0.38 CC 型 ± ± ± ± ± ±0.41 F 值 P 值注 T2DM:2 型糖尿病 ;APN: 脂联素 ;HOMA-IR: 胰岛素抵抗指数 ; 与 GC 型比较, a P<0.05; 与 CC 型比较, b P<0.05

5 208 国际中医中药杂志 2016 年 3 月第 38 卷第 3 期 Int J Trad Chin Med, March 2016, Vol. 38, No.3 apm g/c 基因多态性有内在关系, 可从一定程度上反映 T2DM 患者的中医证候分型, 并通过影响血清 APN 水平, 进而影响 T2DM 病情发生及发展参考文献 [1] 李显丽, 张瑛, 杨莹, 等. 中国汉族人群 2 型糖尿病与脂联素基因 SNP 位点相关性的 Meta 分析 [J]. 中国糖尿病杂志, 2012,20(8): DOI: /j.issn [2] 杜仲海. 2 型糖尿病患者胰岛素抵抗与中医辨证分型的相关性研究 [J]. 中医学报,2014,29(7): [3] 王琴, 管世鹤, 童杨, 等. 脂联素启动子单核苷酸多态性频率及其水平与 2 型糖尿病的相关性 [J]. 安徽医科大学学报, 2013,48(1): [4] Choi JH,Min NY,Park SK,et al. Dual matrilineal geographic distribution of Korean type 2 diabetes mellitus-associated- 11,377G adiponectin allele[j]. Mol Med Rep,2014,10(6): DOI: /mmr [5] 中华医学会糖尿病学分会. 中国 2 型糖尿病防治指南 (2013 年版 )[J]. 中华糖尿病杂志,2014,7(6): [6] 刘志龙, 李锡杰, 丁萍, 等. 2 型糖尿病中医证型的筛选研究 [J]. 世界中医药,2009,4(2): DOI: /j.issn [7] El-Shal AS,Zidan HE,Rashad NM. Adiponectin gene polymorphisms in Egyptian type 2 diabetes mellitus patients with and without diabetic nephropathy[j]. Mol Biol Rep,2014, 41(4): DOI: /s [8] 康庄, 赵惠珠, 苏恒, 等. 大理白族 2 型糖尿病与脂联素基因启动子 SNPs 的相关性 [J]. 实用医学杂志,2013,29(15): DOI: /j.issn [9] 康小龙, 唐孝龙, 何承辉, 等. 脂联素基因多态性与新疆地区哈萨克族 2 型糖尿病的相关性研究 [J]. 中国医科大学学报, 2012,41(5): DOI: /j.issn [10] 南楠, 金泽宁, 杨泽, 等. 脂联素基因多态性与 2 型糖尿病合并冠心病的关联研究 [J]. 首都医科大学学报,2012,33(4): DOI: /j.issn [11] 列海涛, 蓝志君, 周强, 等. 脂联素 rs 多态性在 2 型糖尿病中的研究 [J]. 医学检验与临床,2014,25(2):6-10. DOI: /j.issn [12] 赵灵燕, 毕力夫, 赵慧辉, 等. 147 例 2 型糖尿病患者中医辨证分型及临床指标相关性分析 [J]. 北京中医药大学学报,2013, 36(7): DOI: /j.issn [13] Matharoo K,Arora P,Bhanwer AJ. Association of adiponectin (AdipoQ) and sulphonylurea receptor (ABCC8) gene polymorphisms with Type 2 Diabetes in North Indian population of Punjab[J]. Gene,2013,527(1): DOI: /j. gene [14] Chung HF,Long KZ,Hsu CC,et al. Adiponectin gene (ADIPOQ) polymorphisms correlate with the progression of nephropathy in Taiwanese male patients with type 2 diabetes[j]. Diabetes Res Clin Pract,2014,105(2): DOI: /j.diabres ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 樊红雨 ) 读者作者编者本刊对图表格式的要求 1 图投稿时, 原稿若有图, 每幅图应分别按其在正文中出现的先后次序连续编码每幅图应冠有图题说明性的文字应置于图下方注释中, 并在注释中标明图表中使用的全部非公知公用的缩写照片图要求有良好的清晰度和对比度病理照片要求注明染色方法和放大倍数图中如有引自他刊者, 应注明出处电子版投稿中图片建议采用 JPG 格式 2 表格建议采用三线表 ( 定线表头线底线 ), 如遇有合计和统计学处理内容 ( 如 t 值 P 值等 ), 则砸此行上面加一条分界横线 ; 表内数据要求同一指标有效位数一致, 一般按标准差的 1/3 确定有效位数

357 P <. 5. TCD findings revealed that the contralateral vertebral artery systolic blood flow velocities in patients with phase Ⅰ Ⅱ and Ⅲ steal groups

357 P <. 5. TCD findings revealed that the contralateral vertebral artery systolic blood flow velocities in patients with phase Ⅰ Ⅱ and Ⅲ steal groups 356 TCD 212 3 215 4 TCD 45 TCD 8 Ⅰ 21 Ⅱ 11 Ⅲ 5 4 45 6 2 Ⅰ 12 9 Ⅱ 3 7 1 Ⅲ 3 2 r =. 78 P