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1 视网膜色素上皮基础与临床 何世坤赵明威陈有信主编 北京

2 内容简介本书涉及与视网膜色素上皮 (RPE) 相关的基础理论及临床诊疗进展 基础理论包括 RPE 的生理学 组织胚胎学 解剖学 细胞生物学 分子生物学 药理学 毒理学等, 临床诊疗进展包括 RPE 的临床检查及 RPE 相关疾病的发病机制和诊治特点 涉及的疾病包括与 RPE 有关的肿瘤 炎症 变性 物理损伤 增殖性玻璃体视网膜病变 年龄相关性黄斑变性等 此外, 还专门介绍了 RPE 移植 基因治疗在 RPE 相关眼底病中的最新应用进展 为方便广大研究人员进行此方面研究, 本书还特别介绍了与 RPE 有关的实验研究方法 本书适合眼底病专科医师 眼科研究人员 研究生阅读, 对于相关的细胞生物学及分子生物学等领域的基础研究人员也有一定参考价值 图书在版编目 (CIP) 数据视网膜色素上皮基础与临床 / 何世坤, 赵明威, 陈有信主编. 北京 : 科学出版社, ISBN 7 唱 03 唱 唱 9 Ⅰ 畅视 Ⅱ 畅 1 何 2 赵 3 陈 Ⅲ 畅眼色素上皮视网膜疾病诊疗 Ⅳ 畅 R774 畅 1 中国版本图书馆 CIP 数据核字 (2005) 第 号责任编辑 : 黄敏 / 责任校对 : 李奕萱责任印制 : 刘士平 / 封面设计 : 陈敬版权所有, 违者必究 ; 未经本社许可, 数字图书馆不得使用 ===============!"# $ 16!" ================ 科学出版社发行各地新华书店经销 倡 2005 年 8 月第一版开本 : / 年 8 月第一次印刷印张 : 20 插页 :16 印数 : 字数 : 定价 :88 畅 00 元 ( 如有印装质量问题, 我社负责调换枙科印枛 )

3 序 近年来的临床和基础研究表明, 视网膜色素上皮 ( R P E) 在眼底疾患的发病中起着非常重要的作用, 如增殖性玻璃体视网膜病变 年龄相关性黄斑变性以及一些眼底变性类疾患的发病均与 R P E 有关, 这些疾病严重威胁人们的视觉健康 R P E 的临床与基础研究已成为当今眼科研究领域的热点, 研究成果十分丰富, 新的知识和技术不断出现 本书正是紧跟国际上 R P E 研究领域的发展趋势, 围绕 R P E 相关的临床和基础撰写而成的学术专著 目前, 国内尚无全面介绍和阐述 R P E 及相关临床和基础研究的书籍出版, 国外已出版的有关 R P E 的专著也为数不多 本书难能可贵的是将有关 R P E 的基础与临床融会贯通, 并专门介绍与 R P E 有关的实验方法 相关疾病的临床诊疗特点 基因治疗在相关眼底病中的应用 最新的基因及蛋白质晶片 R P E 移植等, 这些内容几乎涵盖了目前国内外有关 R P E 研究的全部内容, 具有较高的学术及出版价值, 并填补了国内此专业领域的学术出版空白 本书作者何世坤教授, 长期在美国一流眼科研究所从事与 R P E 相关的研究工作, 发表论文数十篇, 并多次在国际会议上交流其研究成果 由于他还兼任枟中华眼科杂志枠海外编委和枟眼科研究枠杂志副主编的职务, 因此对国内有关 R P E 研究的现状也十分了解 另外两位作者赵明威 陈有信博士长期从事眼底病的临床与基础研究工作, 并且均在美国一流实验室进行过有关 R P E 的基础研究, 有比较丰富的临床经验, 又熟悉 R P E 研究的最新动态及研究技术, 本书的很多内容就是他们自己的研究成果, 这就保证了本书的学术水平 相信本书将成为广大眼科临床工作者和相关研究人员的实用参考书, 借以推动我国有关 R P E 的临床与基础研究工作向更深入的方向发展 祝贺枟视网膜色素上皮基础与临床枠的出版并乐于以此为序 张承芬 2004 年 10 月 i

4 前 言 视网膜色素上皮细胞 (R P E) 具有多种复杂的细胞生物学功能, 包括视网膜生理屏障功能 感光细胞的营养代谢 视网膜黏附功能 免疫调节作用以及视网膜下新生血管抑制作用等 很多临床常见的严重致盲性眼底疾病, 如老年黄斑变性 增殖性玻璃体视网膜病变等, 其发病机制与 R P E 细胞有着极为密切的关系 对这些疾病发病机制的阐明, 将对人类的防盲 治盲有着重要意义 近年来随着科学技术的发展, 对 R P E 的研究有了长足进步, 例如 R P E 基因遗传性缺陷与视网膜色素变性的关系 ;R P E 与增殖性玻璃体视网膜病变 年龄相关性黄斑变性的关系 ; 其他诸如生长因子 细胞因子等在 R P E 的表达 凋亡调控 R P E 移植在治疗某些眼底病中的作用以及基因治疗在与 R P E 相关眼病中的应用等 所有这些研究成果都是在近十几年来发生的, 并且逐渐形成了眼科基础研究领域的新的热点, 极大推动了视网膜病的基础研究与临床眼底病在治疗上的进展 正因为如此, 我们以多年来对 R P E 的研究工作以及眼科临床实践为基础, 收集了国内外当今有关 R P E 研究的最新进展, 编写成枟视网膜色素上皮基础与临床枠一书 任何疾病的有效治疗都建立在对该病发病机制了解的基础上, 因此, 本书突出了与视网膜色素上皮有关的眼底病最新发病机制的阐述, 而对于一般见于其他书刊传统的常规临床治疗措施并没有重复论述, 对一些新的检查法与正在实验中的治疗措施 ( 例如基因疗法 细胞移植 ) 做了简要介绍, 以达到跟踪当前世界眼科领域对 R P E 研究的现状 由于目前我国眼科实验研究较薄弱, 所以, 我们专门介绍了与 R P E 有关的实验方法 在各章节中既有当前此领域发表的研究成果汇总, 又有我们个人的经验与认识, 以求对读者有所借鉴与参考 本书所收录的内容是近年来在视网膜色素上皮研究领域中所取得的最新进展, 有些内容尚没有公开发表 因此, 本书的出版将为国内眼科工作者提供目前有关 R P E 研究的最新信息, 必将推动国内有关 R P E 基础与临床研究的进展, 使此方面研究尽快与国际接轨 何世坤赵明威陈有信 2004 年 9 月 iii

5 目 录 序 前言 第一章视网膜色素上皮细胞生物学 1 第一节视网膜色素上皮的研究历史 1 第二节视网膜色素上皮胚胎学 3 第三节视网膜色素上皮结构与组织学 4 第四节视网膜色素上皮细胞骨架 9 第五节视网膜色素上皮功能 16 第六节视网膜色素上皮黑色素 23 第七节视网膜色素上皮与感光细胞外节段的更新 28 第八节生长因子及细胞因子在视网膜色素上皮的表达 31 第九节视网膜色素上皮黏附分子 48 第二章视网膜色素上皮与感光细胞 64 第一节感光细胞外基质的生物学特点 64 第二节正常视网膜黏附的机制 69 第三节视网膜下液的调控及浆液性脱离的机制 75 第四节视网膜色素上皮与视网膜浆液性脱离的病理生理 82 第五节视网膜色素上皮对视网膜脱离及复位的反应 87 第三章药物与视网膜色素上皮 93 第一节视网膜色素上皮药理学 93 第二节视网膜色素上皮毒理学 99 第四章光与视网膜色素上皮 107 第一节光对视网膜及视网膜色素上皮的损伤 107 第二节激光与视网膜色素上皮 111 第五章视网膜色素上皮细胞的凋亡 115 第一节细胞凋亡的形态及生化特征 115 第二节细胞凋亡的诱导及抑制因子 116 第三节细胞凋亡的信号传递 121 第四节细胞凋亡的基因调控 123 第五节与视网膜色素上皮细胞凋亡有关的眼底病变 125 第六节视网膜色素上皮细胞凋亡检测方法 126 v

6 vi 视网膜色素上皮基础与临床 第六章与视网膜色素上皮有关的实验方法 129 第一节视网膜色素上皮细胞生物学实验方法 129 第二节视网膜色素上皮细胞形态学研究 133 第三节视网膜色素上皮细胞分子生物学实验方法 134 第四节某些与视网膜色素上皮有关的眼底病变动物模型的制备 137 第七章视网膜色素上皮的临床检查法 143 第一节视网膜色素上皮眼底自发荧光检测 143 第二节视网膜光学相干断层扫描 147 第三节视网膜色素上皮的临床电生理 148 第四节眼底荧光素血管造影与吲哚青绿血管造影 156 第八章年龄相关性黄斑变性 165 第一节概述 165 第二节年龄相关性黄斑变性的危险因素 165 第三节年龄相关性黄斑变性发病机制 167 第四节年龄相关性黄斑变性的临床特征 185 第五节年龄相关性黄斑变性的治疗 192 第九章视网膜色素上皮相关的免疫及感染性眼底病变 200 第一节视网膜色素上皮对免疫反应的调节 200 第二节视网膜色素上皮的炎症与感染 204 第十章增殖性玻璃体视网膜病变 212 第一节构成 PVR 膜的细胞成分 213 第二节 PVR 膜细胞外基质的构成 218 第三节 PVR 膜中 RPE 细胞外基质受体的表达 219 第四节基质金属蛋白酶及组织金属蛋白酶抑制因子 220 第五节生长因子与细胞因子在 PVR 形成中的作用 220 第六节免疫因子在 PVR 形成中的作用 222 第七节 PVR 的药物治疗展望 222 第十一章视网膜色素上皮先天异常及肿瘤 227 第一节视网膜色素上皮先天异常 227 第二节视网膜色素上皮相关肿瘤 231 第十二章与视网膜色素上皮相关的营养不良性疾病 235 第一节遗传学基础 235 第二节视网膜色素变性 236 第三节视网膜色素上皮及黄斑营养不良 242 第四节 Bruch 膜异常 246 第五节脉络膜营养不良 247 第六节代谢异常性视网膜营养不良 249

7 目录 vii 第十三章其他与视网膜色素上皮相关的眼底疾病 255 第一节中心性浆液性脉络膜视网膜病变 255 第二节急性后极部多灶性鳞状色素上皮病变 260 第三节多灶性脉络膜视网膜病变综合征 262 第四节脉络膜新生血管形成 269 第十四章视网膜移植 281 第一节神经视网膜的移植 282 第二节视网膜色素上皮移植 284 第十五章基因疗法在视网膜色素上皮相关疾病中的应用 297 彩图

8 第一章视网膜色素上皮细胞生物学 视网膜色素上皮 (retinal pigment epithelium,rpe) 是眼内胚胎学上来自神经视网膜而分化成具有分泌功能的上皮细胞 虽然 RPE 没有感光及神经传导功能, 但是对感光细胞的存活与正常功能的维持是绝对必需的 虽然在解剖学上知道 RPE 的存在已有上百年, 但直至最近几十年才对其重要性有了更明确的认识 RPE 是一层特殊化的单层细胞, 位于神经视网膜与脉络膜之间 ( 彩图 1) 正常成年人 RPE 细胞的数量大约为 350 万, 其细胞密度从黄斑中心凹到周边视网膜逐渐减少 RPE 细胞的主要功能有 : 吞噬感光细胞外节段, 代谢视紫红质, 参与血唱视网膜屏障的构成, 合成黑色素及细胞外基质成分, 调节离子及代谢物质的转运 ( 表 1 唱 1) 表 1 唱 1 RPE 的功能汇总 与色素有关的功能 光适应与视觉识别 毒素结合功能 抗原的表达 与代谢有关的功能电生理反应修复与再生免疫反应调节整合素产生与调节 离子转运血唱视网膜屏障作用视网膜下液体转运生长因子 细胞因子 酶的生成视色素的代谢 ( 维生素 A 的吸收与储存 ) 新生血管因子与抑制因子的产生感光细胞外节段的吞噬与代谢脂褐质形成, 细胞外基质成分的合成与降解 c 波产生 E O G 反应增殖 迁移 第一节视网膜色素上皮的研究历史 在古代, 人类对视网膜及周围组织的解剖学概念是非常模糊的, 数百年前的学者多 1

9 2 视网膜色素上皮基础与临床数认为晶状体与玻璃体即是光感受器, 几乎没有人知道视网膜的作用 直到 17 世纪早期,Kepler 认为视网膜在感受光方面起关键作用, 当时认为 RPE 只是中层膜结构 最早对 RPE 进行组织学描述见于 18 世纪下半叶,M ondini 提出 RPE 是由黑色小球组成的带有膜的组织 后来爱尔兰著名的眼科病理学家 Jacobs 较为具体地指出 RPE 位于脉络膜与视网膜之间, 而且是从视神经一直延伸到睫状体 色素上皮一词最早见于 Jones (1833) 所发表的文章,Jones 在对人体摘除的眼球做了详细解剖观察后得出结论, 认为 RPE 是六角形膜状组织, 这种六角形细胞是靠黏质联结在一起, 细胞中含有色素颗粒 稍后,Pacini 的研究也证实了 Jones 的观察结果 至此, 数世纪以来视网膜与脉络膜之间的结构才大致得以阐明 就 RPE 的研究而言, 当时另外一个争论的焦点是关于 RPE 细胞的来源问题, 即 RPE 是来源于中胚层还是神经外胚层 H uschke 通过观察鸡胚的发育过程发现 RPE 来源于早期视泡, 但对其后如何形成 RPE 单层结构仍然不清楚 直到 1860 年,von Kollik 唱 er 对此研究取得突破性进展, 他认为 RPE 由眼杯外层演化而来, 实属视网膜结构的一部分, 从而纠正了流行多年的 RPE 胚层来源的错误概念 早年人们对 RPE 的研究仅限于解剖离体的眼球, 直到 19 世纪中叶眼底镜的问世使人们能在活体眼球上观察眼底, 从而使活体观察 RPE 成为可能 Eduard Jager 于 1855 年率先发表了正常眼底及数种视网膜病眼底图谱, 他认为眼底红黄色的产生与 RPE 的存在直接相关,Jager 也同时描述了色素上皮的萎缩 斑点与色素上皮的关系 以后随着照相技术的改进, 对视网膜下的增殖 萎缩性改变及色素迁移的观察更为容易, 也进一步加深了对 RPE 的认识 19 世纪下半叶, 对 RPE 的研究主要集中在显微结构上, 具有代表性的研究是 Külliker 的成果, 他准确地描绘了 RPE 典型的六角形结构 细胞直径与厚度 Külliker 的同事还进一步发现视网膜色素变性患者存在着来源于 RPE 的迁移现象 Kuhne 也是同时期对 RPE 研究做出过重要贡献的学者,Kuhne 较为详细地描述了 RPE 的绒毛与感光细胞的交互联结, 但这位学者最杰出的贡献是视紫红质在光照与黑暗条件下的转化与 RPE 的关联, 这是对感光物质周期变化中视网膜与 RPE 功能互相依赖的首次描述 之后,Kuhne 又成功地从 RPE 提取了视紫红质, 观察了 RPE 色素颗粒在光线明暗变化时的迁移现象 进入 20 世纪, 有关 RPE 的研究更趋深入, 感光细胞之间的细胞外间质成分就是在此时期得到了阐明 另外, 英国科学家 U sher 还发表了 RPE 在视网膜不同区分布状态的研究结果, 位于锯齿缘部的 RPE 直径为 60μm, 黄斑部位 RPE 直径 11 ~ 14μm, 其余部位视网膜 RPE 直径为 8μm, 微绒毛长度为 5μm 20 世纪 70 年代以来, 对 RPE 生理 生化 电生理等方面的研究报道日趋增多, 因此, 第一部关于 RPE 的专著在 1979 年由 Zinn 与 Karner 完成 近年来对 RPE 的研究多集中于有关细胞素 生长因子 神经因子 细胞外基质成分的产生方面以及这些因子对 RPE 功能的调节及其与某些眼底病的关联 另外, 在 RPE 基因调控 RPE 移植 RPE 对视网膜下腔免疫状态的调节以及 RPE 与增殖性 新生血管性眼底病变的关系等研究方面也取得了重要进展, 有关 RPE 的基因治疗的报道亦逐渐

10 第一章视网膜色素上皮细胞生物学 3 增多 相信随着科学的发展, 人们对 RPE 生理 病理生理认识的加深, 一定会为眼底病 的治疗开创新的局面 第二节视网膜色素上皮胚胎学 人眼在受孕后 18 天开始发育 大约在胚胎 3 周时, 前脑神经褶的两侧开始出现视 凹 胚胎 4 周时视凹变深, 在前脑两侧形成对称的囊状视泡隆起, 视泡远端逐渐变大, 离 开大脑, 形成视茎, 以后发育成视神经 视泡与外胚层接触诱导晶状体的产生 视泡下 方逐渐内陷形成视杯 视杯分为两层, 厚者为内层, 发育成视网膜内层 ; 外层为单层, 发 育成 RPE 层 RPE 层在 30 天左右开始分化, 妊娠后 35 天就可见 RPE 细胞内有色素颗 粒, 并能在一周内全部色素化, 这是人体在早期发育时最早能看到的色素 受孕 4 ~ 6 个 [1] 月,RPE 细胞的增殖率达到高峰, 与细胞增殖相应的拓扑酶的活性此时也最高 胚胎 第 10 周,RPE 开始出现顶部绒毛突起 大约第 6 周,RPE 的基底膜开始出现形成了第一 个可见的 Bruch 膜结构 随后第 12 周在脉络膜的参与下, 形成整个 Bruch 膜 在胚胎 发育期间,RPE 除了参与 Bruch 膜形成外, 也能调节巩膜的发育 在胚胎生发期, 很可能存在特异性信号, 诱导正在发育的眼杯形成 RPE 单层 有关 触发 RPE 细胞形态生发的实验不多,Rizzolo(1991) 经观察认为原位 RPE 上皮器官的发 [2] 育是逐步的, 邻近的组织至少提供了某些使 RPE 产生上皮化特性的分子 研究表明, RPE 极性化的发育可能与 β1 整合素的表达有关, 在发育的早期可见 β1 整合素分布于所 有 RPE 浆膜, 以后相继出现于外侧及底外侧膜 观察不同发育阶段的鸡胚 RPE 可见 Bruch 膜及结构成分能诱导 β1 整合素在底外侧膜呈极化分布, 这说明发育中的视网膜能 提供 RPE 形态生发的某些诱导信号 Na + 虽然基底膜与视网膜的某些因子能诱导发育中的 RPE 细胞极化, 但是还没有发现 唱 A T P 酶极化与这些因子有关 很可能 RPE 与其位于顶部接触的神经视网膜 的密切接触状态维持了 Na + 培养,Na + 唱 A T P 酶极化的分布 把处于发育期的 RPE 置于体外 唱 A T P 酶及钙黏附素就会迅速丧失, 这个观察提示 Na + 定分布可能借助于 RPE 和神经视网膜的接触 唱 A T P 酶的稳 随着发育生物学的研究进展, 也许更多的诱导 RPE 发育的信号会被揭示 就培养 的成人 RPE 而言, 似乎保持了大部分上皮细胞的特点, 在标准培养条件下, 有一些人体 的 RPE 能发育成良好的具上皮细胞特点的单层细胞, 包括钠泵的极化 然而, 某些 RPE 则不产生上皮细胞表现型, 或许这些细胞需要外源性信号刺激以逐步发生形态变化, 这 说明不同个体的 RPE 细胞完成形态变化的过程不同 随着发育的进行, 当 RPE 外部环 境不能提供 RPE 进一步发育的信号时,RPE 的发育就会终止在当时所处的阶段, 这也解 释了此后不同个体在体外培养时 RPE 细胞表现出的多形化特征, 有的 RPE 表现为融合 型, 有的为上皮型, 这说明胚胎发育时 RPE 的细胞生物学状态也影响了以后 RPE 的表 现型

11 4 视网膜色素上皮基础与临床 第三节视网膜色素上皮结构与组织学 RPE 由单层细胞构成, 顶部与神经视网膜接触, 底外侧部毗邻脉络膜, 基底部与 Bruch 膜紧密连接,RPE 的单层从视神经乳头旁开始一直延伸至锯齿缘 由于存在色素颗粒,RPE 呈棕色, 眼底色调可因 RPE 色素的变化而有所不同 ( 彩图 2) 视网膜周边部色调最深, 后极部则颜色变淡 RPE 与神经视网膜之间接触紧密, 二者之间的潜在空间称为视网膜下腔, 神经视网膜与视盘 锯齿缘部连接紧密, 其他部位的视网膜则相对容易与 RPE 分离 从横切面看 RPE 呈立方体构形, 正面观察则为六角形,RPE 细胞之间通过连接复合体连接 RPE 细胞在黄斑部的直径约为 10 ~ 14μm, 周边部则扁平且直径增大 尽管视网膜感光细胞分布密度不同, 但感光细胞与 RPE 细胞之间的比例基本维持在 1 45 RPE 顶部含有绒毛突起, 也有微管微丝, 色素颗粒的含量最多 RPE 细胞中间部位是细胞核 高尔基体 内质网 线粒体及溶酶体所在 ( 图 1 唱 1) RPE 基底膜皱褶能增加 RPE 吸收与分泌的面积 图 1 唱 1 RPE 细胞的主要解剖与生理特征 一 RPE 的表面结构特征 RPE 的形态近似六角形, 体外培养的 RPE 早期也有类似特征 ( 图 1 唱 2) 与所在区域 的视网膜功能相适应, 黄斑区的 RPE 细胞高且细窄 RPE 细胞顶部表面有很多绒毛突 起, 其功能为摄取脱落的感光细胞外节段 ( 图 1 唱 3) 此外, 顶部表面的细胞基质分子及神 经细胞黏附分子 (N 唱 CA M) 的表达与 RPE 及感光细胞之间的黏附有关 微绒毛的长度约 [3] 为 3 ~ 7μm, 每 30 ~ 50 个感光细胞之间有一个完整的 RPE 与之接触 RPE 细胞的极 化与其表面突起部位很多膜蛋白的表达有关 ( 表 1 唱 2)

12 第一章视网膜色素上皮细胞生物学 5 图 1 唱 2 培养的 RPE 细胞呈六角形结构 RPE 在体外培养条件下增殖为单层细胞后可见其典型的六角形形态, 有人亦称为铺路石样形态 图 1 唱 3 RPE 细胞对感光细胞外节段的吞噬 超微结构显示脱落的感光细胞外节段被 RPE 吞噬 ( 箭头 ), 但仍没有消化, 外节段的片层结构清晰可见 表 1 唱 2 RPE 表面分子的表达 位 置 蛋 白 功 能 顶部表面 Na + 唱 A T P 酶 Na + 转运 N 唱 C A M 黏附于视网膜 αυβ5 整合素 吞噬 CD36 吞噬 外侧膜 Occluden 紧密连接 Cadherin Adherens 连接 Connexin 缝隙连接 底外侧膜 整合素 α3β1 α6β1 黏附于细胞 αυβ3 外基质或 Bruch 膜

13 6 视网膜色素上皮基础与临床 [4] 整合素 αυβ5 CD36 均表达于微绒毛, 主要参与 RPE 的吞噬 与其他上皮细胞不 同的另一显著特点是 Na + 唱 A T P 酶的分布 一般上皮细胞 Na + 唱 A T P 酶位于底 外侧膜, 而 RPE 细胞的 Na + 唱 A T P 酶则表达于细胞顶侧膜, 这种极化性分布对于 RPE 主动转运钠离子极为重要 RPE 的底外侧由膜折叠形成, 其长度约为 1μm( 图 1 唱 4), 底外侧膜除了维持 RPE 与 Bruch 膜黏附外, 也有整合素 α3β1 α6β1 αυβ3 的表达 RPE 侧膜主要功能是细胞之间的连接及细胞间信息的传递 图 1 唱 4 RPE 细胞的超微结构 A. OS : 感光细胞外节段 ;P : 黑色素 ;L : 溶酶体 ;N : 细胞核 ;B :Bruch 膜 ; 箭头所指为底外侧折叠处 B. M :R PE 微绒毛 ;J :R PE 紧密连接复合体 ;Mit : 线粒体 二 细胞连接复合体 RPE 侧膜连接复合体有两种, 一是紧密连接复合体, 二是黏附连接, 这些连接复合体 是构成视网膜屏障的重要结构, 它防止了某些大分子物质在视网膜下腔及脉络膜毛细血 管之间的交换 ( 图 1 唱 6) 紧密连接 (tight junctions) 是由邻近 RPE 细胞的咬合蛋白构成, 这种紧密结合是某些物质穿过细胞的最大阻力 紧密连接复合体也是将细胞内的分子 分割成顶部及基底部结构成分, 这些分子中的某些成分负责将脉络膜来的营养转运给视 网膜, 将代谢产物 水 离子转运到相反方向 紧密连接复合体在维持细胞膜极化状态中的作用不仅在其他上皮细胞中存在, 而且 经动物实验得到了证实, 例如 RCS 大鼠,RPE 连接复合体破裂常伴随血唱视网膜屏障通 [5] 透性的增加和缝隙连接复合体及 Na + 唱 A T P 酶的重新分布 此外, 细胞内的咬合蛋白也能与其他与 RPE 细胞连接有关的蛋白例如 ZO 唱 1 ZO 唱 2 [6] 形成连接复合体 这种复合体与肌动蛋白密切关联, 同时也是细胞间信号传递的通道 ( 彩图 3)

14 第一章视网膜色素上皮细胞生物学 7 [7] 邻近的 RPE 细胞之间形成粘连复合体, 约为 200 樻, 肌动蛋白纤维呈环形束状与黏 附连接复合体相连 黏附连接蛋白有多种, 已发现在 RPE 细胞表达的有 E 唱钙粘连素 N 唱 [8] 钙粘连素 钙粘连素是一种跨膜蛋白, 它所介导的黏附功能及信号传递系统的活化均 需钙离子的参与, 因此它是钙依赖性黏附蛋白 钙粘连素位于胞质内的蛋白集团能与链 状连接蛋白反应而形成一复合体 N 唱钙粘连素是环绕细胞的点状连接而不是完整的环 绕细胞的环, 对大鼠 RPE 的观察证实了这一点 鸡 RPE 细胞器官培养观察表明, 与钙粘 连素相连的纽带蛋白位于发育良好的细胞与细胞接触处 由于钙粘连素在上皮极化中的关键作用, 可以想像, 如果没有钙粘连素的参与,RPE 表面极化的发育就不可能完成 实验发现, 一般培养条件下, 培养的具有绒毛结构的 RPE 细胞并没有 Na + 唱 A T P 酶在顶部的极化, 也没有钠泵的存在 在已知的钙粘连 素中 E 唱钙粘连素 ( 又称 P) 与 Na + 唱 A T P 酶的极化状态分布密切相关 Janice 经过实 验证明,Na + 连素在决定 Na + [9] 唱 A T P 酶高度极化的分布表达与 E 唱钙粘连素的表达相一致 E 唱钙粘 唱 A T P 酶的表达及表达部位有决定性影响,RPE 缺乏 E 唱钙粘连素者 则没有钠泵极化的表达, 这也很可能是体外一般培养条件下 RPE 没有极化表现型的原 因 应用体外培养大鼠 RPE 细胞基因转导实验发现, 当有 E 唱钙黏附素表达时,RPE 才有 极化的钠泵出现, 这说明 E 唱钙粘连素都与上皮的极化诱导有关, 而且能造成 Na + A T P 酶的分布状态发生改变 唱 间隙连接复合体位于底外侧膜, 与连结蛋白 (connexin) 表达相关, 与细胞之间离子及 [10] 物质的交换有关 底外侧膜还有多个整合素的表达以介导细胞与细胞外基质的点状 黏附 此外, 在 RPE 细胞之间也可见桥胞小体 (desmosomes) 存在, 但此小体与 RPE 细 胞的极化尚无关联, 有时桥胞小体能与线粒体形成复合体, 但该复合体形成的意义还不 甚清楚 [11,12] 三 RPE 细胞的差异性 当 RPE 细胞从供体眼内分离出来置入体外培养后立即就有不同的表现型显示出来, 即使体内的原位单层细胞,RPE 的表现型也不是高度同源性的, 这包括细胞的镶嵌 大小 形态 细胞边缘的规律性 色素及脂褐素的含量均有所不同 显然,RPE 差异的分子生物学基础还没有阐明, 但体外观察显示所有培养的 RPE 在体外很快失去上皮的极化性, 除非应用特殊培养液, 否则极化的特征难以在体外恢复, 即使恢复极化特征, 也是缓慢而且是不完全的 已知上皮极化性的表达与上皮形态生发原 E 唱钙粘连素的存在有关 RPE 细胞在胚胎发育期是否及何时表达这种潜在的具有上皮生发作用的 E 唱钙粘连素还不清楚 然而,RPE 可能在缺乏内源性生发形成调节因子的情况下, 在某些发育因子的协助下发育成具有极化特点的上皮细胞 一旦 RPE 的表现型在胚胎期间形成, 以后在整个生命过程中就会一直维持这种最初的细胞形态 四 RPE 细胞的再生 正常成人 RPE 单层在体内相对静止, 无增殖现象, 如果将 RPE 从活体分离置于体

15 8 视网膜色素上皮基础与临床 外,RPE 就会进入增殖状态 即使没有极化状态, 亦可增殖形成单层 成人活体内 RPE 在受损或受到刺激后也能发生同样的增殖反应, 机械因素 化学因素 光学刺激均可能成 [1 3] 为 RPE 增殖的诱因,RPE 受损后增殖得快慢与否与损伤的范围及是否累及 Bruch 膜 有关 若损伤范围小,RPE 单层则很快会恢复, 如果损伤范围大且累及 Bruch 膜,RPE 单层的修复就会明显延迟 RPE 损伤及修复的程度可用裂隙灯生物显微镜 激光扫描眼 底检查或激光断层扫描来评估, 至于 RPE 受损后血唱视网膜屏障的损坏则需眼底荧光血 管造影证实 异常增殖的 RPE 常是多层化且表现为成纤维细胞样改变, 完全再生的 RPE 应有其正常的形态及连接复合体存在 Kerte 与其同事通过注射碘化钠破坏后极部 [13] RPE, 然后观察其修复增殖过程, 结果发现 RPE 再生是通过局灶性的 RPE 扩展及增殖来实现的, 兔眼单层 RPE 损伤修复后再生区的 RPE 有碱性磷酸酶的表达,Na + 唱 A T P 酶呈极性分布 视网膜脱离时可损伤 RPE 单层而导致 RPE 增殖, 如果失去控制, 则发展为增殖性玻璃体视网膜病变 [14] 五 RPE 的功能与上皮细胞特征的关联 RPE 细胞的极化性上皮结构是维持感光细胞正常功能的基础 当 RPE 受损, 单层 再生形成之后, 即使细胞的连续性被重新建立, 但其功能及上皮化的特征则要数周才能 恢复, 这就直接影响了 RPE 正常功能尤其是对感光细胞的支持, 说明极化状态与 RPE 的 功能正常发挥密切相关 缺乏极化时, 除了 RPE 内 Na + 唱 A T P 酶类转运功能失常 外, 还有其他的异常也随之发生 例如,RPE 表面极化状态破坏后, 某些正常情况下并不 表达的受体可暴露于细胞表面, 一旦与相应配体结合, 例如生长因子, 就可诱发 RPE 的 异常增殖与迁移 这说明细胞的接触与黏附形成是上皮细胞发挥正常功能的先决条件, 如果 RPE 缺乏完整性并丧失上皮极化的特性, 对感光细胞将会有极大的负面影响 [15] 六 外源性因子对 RPE 上皮特征的影响 很多证据显示, 外源性信号可能会影响 RPE 细胞上皮的形态, 例如激素 生长因子 细胞外基质成分能增加或减少 RPE 上皮型特征, 或影响 RPE 的极化 在培养的 RPE 细胞培养液中加入视黄酸或 bfgf 能增加 RPE 上皮化表现型, 而 PDGF NGF EGF 巨噬细胞产物能诱导 RPE 产生梭形改变 RPE 细胞在基底膜上为上皮样单层细胞, 但当暴露于玻璃体或异常增生胶原时, 原有的极化特点就会发生改变 研究证明, 成年人 RPE 细胞与感光细胞之间的交叉反应对于维持 RPE 表面某些分子的极化分布是必需的 大鼠原位状态下 RPE 的感光细胞交叉处有神经细胞黏附分子的存在, 但是当置入体外培养时, 神经细胞黏附分子 (NCA M) 则重新分布于底外侧膜, 这很可能是体外培养条件下 RPE 失去了与感光细胞接触之故, 说明 NCA M 也与维持极化有关 七 RPE 的胞质成分 RPE 的胞质成分 细胞器的分布也与上皮细胞的极化有关, 胞质中的黑色素颗粒为

16 第一章视网膜色素上皮细胞生物学 9 椭圆或圆形 ( 见本章第六节 ), 黑色素颗粒长度为 2 ~ 3μm, 直径 1μm, 主要位于顶侧区, 脂褐质则积聚于底外侧区, 内质网膜散布于整个细胞质 RPE 细胞核直径约 8 ~ 12μm, 通常位于底部, 有时可见双核存在 顶部及底侧区线粒体分布最多, 其他的细胞质成分如溶酶体 吞噬体则没有特殊的分布 八 细胞骨架 RPE 的细胞骨架主要有三种成分构成, 即肌动蛋白纤维 ( 直径 7nm) 微管 (25nm) 与中型纤维 (10nm) 肌动纤维与微管处于动态变化之中, 可发生聚合或解聚合反应, 微管的主要功能是协助细胞内结构物质的运动及参与有丝分裂 肌动蛋白与细胞的运动及形状改变有关, 而中型纤维与细胞核 细胞膜相连组成细胞的结构支架 RPE 细胞能表达 Ⅰ 型角质蛋白 ( 酸性 ) Ⅱ 型 ( 中性 ) 及 Ⅴ 型中型纤维 角质蛋白的表达变化很大, 随着细胞的分化 极化状态以及培养条件而变, 培养的 RPE 角质蛋白亚型 18 及 19 的表达常见于 RPE 处于迁移状态时 ( 见本章第四节 ) 九 细胞外基质 RPE 细胞能主动合成或降解细胞外基质成分 RPE 细胞基质的沉着也是极化性的, 例如 Bruch 膜含有 Ⅳ 型胶原, 与层粘连蛋白 (laminin) 一起形成 RPE 的基底膜, 此膜作为血唱视网膜屏障的构成之一, 其蛋白质为阴性电荷, 可能对来自脉络膜血循环的大分子物质有滤过作用 RPE 的顶部则被感光细胞之间的基质 (interphotoreceptor matrix,ipm ) 所包绕 IP M 是由 RPE 及感光细胞所分泌, 感光细胞之间的基质主要由三种蛋白构成, 即感光细胞间脂糖结合蛋白 视黄醛结合蛋白 (RBP) 及转甲状腺素 这三种蛋白均涉及视黄醛的转运 IP M 也是与黏附有关的分子的储存处, 例如纤维连接蛋白 N 唱 CA M 及大分子层粘连蛋白, 它们都能在 IP M 中被发现 细胞外基质成分能将细胞的信号传递给细胞内, 因此是很多信号传递系统的介导者, 细胞外基质通过改变 RPE 的信号传递系统而影响细胞的吞噬 增殖 迁移及分化 正常情况下存在于细胞外基质的基质金属蛋白酶 ( matrix metalloproteinases, M M Ps) 与基质金属蛋白抑制酶 (tissue inbibitor matrix metalloproteinases, TIM Ps) 保持着平衡状态 RPE 能在顶端合成及分泌 M M Ps 以及 TIM Ps 正常 RPE 能表达膜结合型 M M P M M P2 以及 TI M P1 TIM Ps( 见本章第九节 ) 第四节视网膜色素上皮细胞骨架 最近 15 年来, 遗传学与分子生物学技术的进展使许多细胞骨架 (cytoskeleton) 成分 的鉴定与定性成为可能, 对 RPE 细胞骨架结构与功能的研究也取得了很大进展 细胞 骨架与细胞分裂 细胞运动 胞质成分的转运 mrn A 的移位及细胞外形的维持有密切关

17 10 视网膜色素上皮基础与临床联 另外, 细胞骨架成分与细胞质相连的某些特殊化蛋白参与了膜结构蛋白的维持 细胞膜的融合及细胞的黏附 RPE 细胞很多功能的发挥都依赖于正常细胞骨架的存在, 所以,RPE 细胞骨架对正常视功能的维持具有重要作用 细胞骨架结构主要有三种, 即肌动蛋白 中型纤维 微管及与这些纤维相关的蛋白成分 肌动蛋白与微管是分子运动的轨道及细胞结构的支架, 中型纤维提供了细胞机械强度与抗牵拉功能 正是由于细胞骨架的存在, 细胞膜才会有张力并具一定外形, 所以, 细胞骨架是将细胞膜 细胞质 细胞器及核连接 固定在一起的主要结构 一 肌动蛋白的结构与功能 肌动蛋白在细胞结构与功能上都发挥着重要作用, 肌动蛋白纤维是细胞膜蛋白的附 着处, 是维持细胞外形的基础结构之一 肌动蛋白与肌球蛋白的交叉运动促使胞质成分 的转运与细胞的收缩运动 当肌动蛋白成束时, 它可产生一个很强的支架以维持细胞的 伸展或影响细胞的外形 某些糖水解酶 肌动蛋白的信使 mrn A 也能与肌动蛋白结合 因此, 肌动蛋白对细胞内酶及 RN A 的局限化起了一定介导作用 另外, 一些细胞功能的 发挥也依赖于肌动蛋白, 例如细胞运动 形态改变 细胞器转运 细胞吞噬 吞饮和细胞质 分裂与细胞黏附等 [16] 目前我们所知的肌动蛋白的功能主要是来自对 F 唱肌动蛋白纤维的研究 F 唱肌动 蛋白是由肌动蛋白单聚体聚合而成, 这种肌动蛋白具有极性结构特点, 它的一端是正极, 一端是负极 因为肌球蛋白只能朝肌动蛋白纤维的正向运动, 所以, 肌动蛋白在细胞内 的分布方向对于依赖于肌动蛋白运动的细胞来说具有关键性作用 细胞的运动取决于肌动蛋白骨架结构的重组及分子原动力的产生, 除肌动蛋白自身 外, 很多与肌动蛋白功能相关的肌动蛋白结合蛋白也参与了肌动蛋白对细胞运动的调 节 肌动蛋白结合蛋白的结构 强度 稳定性均不尽相同, 正是因为肌动蛋白结合蛋白的 变异及与肌动蛋白的交叉联结才能使细胞对多种信号刺激发生反应 由于肌动蛋白能对细胞外多种刺激及环境变化做出反应, 所以, 应用特定药物特异 性调节肌动蛋白的合成而间接得知肌动蛋白与细胞功能关联 最常用的用于肌动蛋白 [17] 研究的药物是细胞松弛素, 细胞松弛素能与肌动蛋白纤维的阳极结合, 因而可防止肌 动蛋白的装配 如果细胞的某一功能被细胞松弛素阻断, 由此可推断此功能的正常发挥 需要肌动蛋白的装配 细胞松弛素只能阻断处于动态状态下的肌动蛋白纤维, 对于已与 结合蛋白结合了的肌动纤维几乎没有影响 在极化的 RPE 细胞, 肌动蛋白位于底外侧膜及顶部突起, 肌动蛋白束环绕 RPE 细胞 顶部并与 RPE 之间的带状连结体接合 实验发现细胞松弛素能诱导培养中分化良好的 RPE 产生间隙, 说明阻断肌动蛋白纤维可造成上皮完整性的损害 由于肌动蛋白参与了 RPE 细胞发挥多种正常功能, 所以细胞松弛素对 RPE 的许多功能都有一定影响, 例如, 细胞松弛素能抑制 RPE 的吞噬功能, 能抑制 RPE 色素颗粒的移动以及影响 RPE 的 迁移 肌动蛋白在体内的更新是体外的 100 倍, 肌动蛋白的更新对于细胞运动极为重要,

18 第一章视网膜色素上皮细胞生物学 11 因此, 肌动蛋白纤维的染色就成为研究 RPE 骨架变化的重要手段 常用的染色法是采 用与肌动蛋白具有高度亲和力的药物毒伞素 (phalloidin) 荧光标记染色法来观察 F 唱肌动 蛋白的分布与形态 ( 彩图 4) 近年来, 备受人们注意的是 α 唱平滑肌肌动蛋白 (α 唱 S M A) 在 RPE 的表达 α 唱平滑肌肌 动蛋白主要由平滑肌细胞表达, 正常 RPE 细胞只有在体外培养条件下有少量的细胞 α 唱 SM A 染色为阳性, 体内原位状态下 α 唱 SM A 为阴性 但是在病理状态下, 周围环境有异 常细胞外基质成分或生长因子过度分泌时,RPE 细胞 α 唱 S M A 的表达就会明显增加 ( 彩图 5) 已知 T GF 唱 β 能诱导 RPE 发生转化, 其中一个重要的表现型的改变就是 α 唱 S M A 的表 [18] 达增加 我们的实验发现, 培养的 RPE 细胞经 T GF 唱 β 刺激 5 天, 大多数的细胞 α 唱 SM A 的表达就会成为阳性 ( 彩图 6),RPE 细胞 α 唱 SM A 阳性的比率与 T GF 唱 β 暴露的时 间呈正比, 增殖性玻璃体视网膜病变标本中迁移的 RPEα 唱 SM A 免疫染色为阳性而且 T GF 唱 β 的表达也很强, 这说明 T GF 唱 β 是引起 RPE 细胞转化成为具有更强收缩与运动功 能的细胞的主要因子 此外, 纤维连接蛋白 结缔组织生长因子 ( connective tissue grow th factor,c T GF) 也能增加 α 唱 SM A 的表达 所以, 检查 RPE α 唱 SM A 可作为 RPE 细 胞发生转化的标志之一 二 肌球蛋白超级家族 肌球蛋白能沿着肌动蛋白运动, 虽然肌球蛋白超级家族很大, 但是所有肌球蛋白都 有一共同特征, 即带有 A T P 及肌动蛋白活化的 A T P 酶 肌球蛋白的尾部变化较大, 尾 部与附着 聚合及纤维形成有关 目前发现的肌球蛋白有 11 种, 同一种细胞中可有不同 类型的肌球蛋白存在 首先被发现的是第一类肌球蛋白, 此类肌球蛋白有特殊化的头部, 但尾区短不形成 多聚体及纤维 一类肌球蛋白的功能主要是参与细胞的吞噬 运动, 维持肠上皮的绒毛 结构 第二类肌球蛋白一般称之为常规肌球蛋白, 因为它能在骨骼肌与其他细胞形成原 纤维 这类肌球蛋白与胞质移动 细胞收缩有密切关系, 所以它对所有活细胞的移动影 [19] 响最大 第三类肌球蛋白目前只发现了一种, 称为果蝇 Nina C 蛋白 此种肌球蛋白 位于感光细胞末端, 除了有依赖肌动蛋白的运动器外还有激酶区 Nina C 蛋白的突变能 使视网膜光反应性发生改变及视网膜变性 第四类肌球蛋白仅在棘阿米巴属发现, 其功 能尚不清楚 第五类肌球蛋白具有第二类 第三类肌球蛋白的特征, 其中某些基因的突 变能导致神经系统的异常 第六类肌球蛋白已从果蝇中分离成功, 与颗粒物质沿着肌动 蛋白纤维运输有关 与视功能研究有关的肌球蛋白是第七类, 最近研究证明第七类肌球蛋白基因缺陷可 [20] 导致 Usher 综合征发生, 其症状为耳聋及感光细胞变性 肾及 RPE 均有七类肌球蛋 白的表达, 但其确切功能尚在研究之中 应用免疫组化染色证明 RPE 细胞能表达肌球蛋白 Ⅰ Ⅱ 及 Ⅶ RPE 的肌球蛋白大 部分分布于底外侧膜,Ⅱ 型肌球蛋白则在 RPE 肌动蛋白纤维束周围有很丰富的表达, 肌 球蛋白 Ⅶ 免疫染色反应主要集中在 RPE 顶部肌动蛋白丰富区, 提示这种肌球蛋白可能

19 12 视网膜色素上皮基础与临床与 RPE 吞噬有关 最近应用多聚酶链反应技术发现了 11 种肌球蛋白的 mrn A 在 RPE 有表达, 虽然这些肌球蛋白仅代表了此类肌球蛋白运动区的一部分, 但至少说明了它在 RPE 的表达 在 RPE 视网膜中所发现的 11 种肌球蛋白中, 其中 4 种具有一定特异性表达, 其中 X 型肌球蛋白只选择性在 RPE 表达 ;IXB 在 RPE 的表达远远高于其他组织 ;Ⅶ A 型表达见于视网膜及 RPE ; 但 Ⅲ 型肌球蛋白在 RPE 的表达则很低 很显然, 某些肌球蛋白在 RPE 的存在与 RPE 的某些特殊功能有关 三 细胞微管 微管是一种相对坚硬 在细胞内起着支撑及通道作用的多聚体, 微管由 α β 亚单位 组成, 直径约 25nm, 也有阳极及阴极端 阴极端通常位于微管结构的中心, 但是微管的 装配是在阳极发生聚合反应 胞质微管及微管游离亚单位共同存在一种稳定状态, 然而 这种稳定是相对的, 微管的阳极可自发性由慢慢延伸变为快速变短, 这样反复循环, 这种 循环的动力来自于游离的微管亚单位与 G T P 的结合 由于动态的不稳定性, 细胞内的 很多微管长短不对称 并不是所有微管都是动态的, 很多细胞存在着与微管相关的蛋 白, 此种蛋白可与微管表面结合而抑制其装配 微管的运动动力来自动力蛋白, 动力蛋白是活化的微管 A T P 酶, 大多数动力蛋白都 朝微管正极方向运动, 而非动力蛋白则朝负极运动 动力蛋白存在于大多数细胞中, 根 据结构与序列的不同, 动力蛋白大致可分为 7 种, 因此称为动力蛋白家族 细胞内的很 多功能例如轴浆的转运 巨噬细胞溶酶体的延伸 色素颗粒的运动等均与此蛋白有关 应用多聚酶链反应技术, 数种动力蛋白已从 RPE 中分离鉴定成功, 其中 FK1F2 是在 [21] RPE 中表达最丰富的动力蛋白, 此蛋白的分子质量约为 80kDa, 能介导 RPE 细胞内物 质从底向顶部的运动 非动力蛋白 (dyneisin) 也称阴极运动蛋白 其功能与若干微管的负极方向运动有 关, 如轴浆反流 内分泌泡的移位及色素的极性运动 阴极运动蛋白也存在于 RPE, 但其 具体功能仍在探讨之中 培养的 RPE 细胞经免疫染色可清楚地看到微管的结构 ( 彩 图 7) 微管的装配可受数种药物的影响, 例如细胞松弛素能与游离的微管异构二聚体结 合, 从而阻断微管的装配而抑制细胞分裂 细胞松弛素只能对处于不稳定状态的微管发 挥作用, 而对稳定状态的微管则没有影响 另外一种能作用于微管的药物是 Taxol [16], 此药可与微管结合而使微管稳定化, 从而阻断细胞的分裂, 临床用于治疗肿瘤及增殖性 病变 四 中型纤维 中型纤维是细胞骨架中的第三类纤维成分, 大多数动物细胞均具有这种纤维 因为 此种纤维的直径处于纤细的肌动蛋白与较粗的肌球蛋白之间, 因此称之为中型纤维 根

20 第一章视网膜色素上皮细胞生物学 13 据分子序列的同源性 免疫反应交叉性与其表达部位的差别, 中型纤维可分为五类, 第一 类与第二类分别为酸性及碱性角质蛋白, 主要在上皮细胞中表达 ; 第三类包括波形蛋白 结合蛋白 胶质纤维酸性蛋白 外周蛋白, 多见于起源于间质的细胞 ; 第四类主要在神经 系统表达, 属神经纤维的亚单位 ; 第五类为层粘连蛋白, 见于所有的有核细胞, 为核膜组 成部分, 在基底膜也有表达 中型纤维在分子大小及电荷方面变化很大, 但是它们最基本的结构是蛋白单聚体组 成的长形纤维分子, 其头部终端是氨基酸可变区, 尾端为羧基, 它没有极化分布的特点 中型纤维主要是给细胞与组织提供机械性张力, 能防止细胞机械性损伤, 稳定细胞 结构 就上皮细胞而言, 中型纤维主要由 Ⅰ 型 ( 酸性 ) 及 Ⅱ 型 ( 碱性 ) 角质蛋白构成 ( 彩图 8), 角质蛋白与桥粒相连, 由此加强了细胞与细胞及细胞与层粘连蛋白之间的连接, 此种 连接现象已在牛 鼠及人 RPE 细胞得到证实 [22] 免疫组化分析表明, 中型纤维在 RPE 的表达随物种 生长环境的改变而有所不同 鸡的 RPE 仅有波形蛋白而没有角质蛋白表达, 两栖类 大鼠与兔 RPE 只有角质蛋白而没 有波形蛋白表达, 其他哺乳动物如鼠 牛 人类 RPE 具有细胞角质蛋白及波形蛋白 这 些发现提示中型纤维的表达随物种的不同而有所不同 体外培养条件下,RPE 细胞角质蛋白的表达与体内有所不同, 原位状态的 RPE 没有 波形蛋白表达, 但在培养条件下角质蛋白合成降低而波形蛋白表达增加 ; 延长培养时间, 所有细胞似乎都有波形蛋白的表达 ( 彩图 9 彩图 10) 人 RPE 细胞在体内只有 8 18 两 种角质蛋白表达, 若将人 RPE 置于体外培养, 就会出现角质蛋白 及波形蛋白 的表达 除上述列举的角质蛋白在 RPE 表达外, 一些并不常见的角质蛋白 也能在培养的 RPE 细胞中检出, 但是角质蛋白 8 18 的表达见于正常及活化的 RPE [23] 细胞, 角质蛋白 18 的表达可能更具有病理意义 其他一些正常情况下并不表达的角 质蛋白例如 7 19 只有在增殖的 RPE 才会出现, 可能对鉴别正常与活化的 RPE 有一定 意义 角质蛋白的表达受许多生长因子的影响, 例如,T GF 唱 β VEGF H GF 均在一定程度 上影响角质蛋白的表达, 实验证明,RPE 生长于不同的细胞外基质成分, 对角质蛋白的影 响也有所不同, 例如纤维连接蛋白 Ⅰ 型胶原能使 RPE 的正常表现型发生改变, 表现为 角质蛋白 18 的表达下降, 肌动蛋白纤维重新分布, 但平滑肌肌动蛋白的表达明显升高 RPE 的中型纤维也与肌动蛋白 微管 角质蛋白发生交叉反应, 这些纤维之间的连接 构成了 RPE 细胞的骨架网络, 这种网络对于维持 RPE 细胞的正常结构是必需的 ( 一 ) 上皮细胞的极化 五 细胞骨架与细胞功能的关联 上皮细胞的特殊功能依赖于膜的不对称性及细胞器的极化分布, 因此, 细胞骨架是 上皮细胞极化的建立与维持的关键 研究表明, 上皮细胞高尔基小泡后的转运主要依赖于微管, 尽管细胞松弛素可打断

21 14 视网膜色素上皮基础与临床 细胞骨架肌动蛋白, 但并不影响高尔基小泡在胞质中的转运, 这说明直接转运并不依赖 于肌动蛋白纤维 已有研究证明, 肌动蛋白及微管与某些细胞内吞饮有关, 阻断微管可 抑制内吞饮及细胞顶部极化膜蛋白的分布 RPE 细胞的特点之一是反向极化, 这是 RPE 细胞与其他上皮细胞不同的主要特征, RPE 细胞的 Na + 唱 A T P 酶不是在细胞底侧而是位于顶部 但是,RPE 细胞肌动蛋白 的分布类似于其他极化细胞, 在细胞培养的早期通过局部黏附借助肌动蛋白而扩展, 肌 动蛋白的应力纤维含有纹状肌球蛋白 Ⅱ, 能使细胞从一个局部黏附向另外一个局部黏附 扩展, 当培养的细胞融合成片后, 肌动蛋白纤维重新结合, 应力纤维也随之消失, 重组的 肌动蛋白纤维主要集中于微绒毛及连接复合体处 α 唱肌动蛋白即肌动蛋白的结合蛋白能与肌动蛋白纤维交叉结合附着于细胞膜 α 唱肌 动蛋白主要位于 RPE 底部折叠处 另外一种血影蛋白也分布于 RPE 底部, 能与肌动蛋 白纤维交叉联结, 对细胞质的稳定性有一定协助作用 sin [24] 另外, 在 RPE 细胞中还发现了另外一种肌动蛋白的结合蛋白, 称之为 Ezrin/mol 唱 这种肌动蛋白结合蛋白分布于 RPE 的微绒毛, 它的功能对于微管附着于浆膜起 着联结作用 在不同的刺激因素作用下, 这种蛋白能发生磷酸化而参与细胞骨架的重新 排列, 调节 RPE 的信号传递 如同另外的极化上皮细胞, 微管在 RPE 的分布也很有顺序, 培养的 RPE 细胞微管蛋 白位于近细胞顶部呈极性分布 在 RPE 的顶部突起中, 微管的方向性是很有规律的, 即 负极朝向细胞顶部, 正极朝向 RPE 底部 这些观察结果说明在依赖于微管的转运中, 从 顶部向底部的运动是正向运动, 而从底部向顶部侧是负向运动 ; 也说明微管是 RPE 细胞 保持极性的结构基础之一 ( 二 ) 细胞骨架与 R P E 特殊结构的关联 RPE 依赖于细胞骨架维持细胞器与胞质成分的非对称状态, 底侧部没有细胞器, 小 的过氧化体位于底部, 色素颗粒多位于顶部, 所有这些特殊细胞成分的分布均与细胞骨 架有关 [25] 1. 绒毛突起 RPE 细胞表面的突起不仅提供了极化上皮的特点, 而更重要的是 与 RPE 的一些特殊功能有关, 例如视网膜的黏附 外节段的吞噬 色素颗粒的移动 而 这些功能的发挥依赖于细胞骨架的存在, 特别是肌动蛋白, 否则, 这种绒毛突起就难以维 持 哺乳动物的 RPE 细胞顶部肌动蛋白与肌球胆白组成的纤维束与细胞表面突起平行 排列, 这种结构特点为 RPE 提供了更强的机戒性支持 此外,RPE 表面的突起也参加了 视网膜的黏附, 如果将 RPE 与感光细胞分离, 杆细胞的外节段仍与 RPE 黏附, 这说明 RPE 与感光细胞间的黏附甚至比 RPE 与 Bruch 膜的黏附还强 [2 6] 2. 连接复合体 所有上皮细胞肌动蛋白所在的位置带状连接素都很丰富,RPE 细胞更是如此 肌动蛋白纤维不仅提供了细胞间黏附的机械张力, 而且与收缩性有关 肌动蛋白在 RPE 顶部末端形成纤维对连接复合体起着机械性稳定作用 如果应用细胞 松弛素处理 RPE, 紧密连接及黏附连接复合体均会被破坏, 而使血唱视网膜屏障破裂 这 说明骨架结构也与连接复合体的完整存在关系密切

22 第一章视网膜色素上皮细胞生物学 15 [27] 3. 细胞骨架与 RPE 的迁移 迁移中的 RPE 细胞骨架与非迁移细胞有很大区别, 尤其是肌动蛋白 纤维, 表现为迁移区基底前沿部肌动蛋白应力纤维及 短束纤维增加, 这些肌动蛋白与其相连的辅助蛋白, 如纽带蛋白是产生细胞迁移的动力纤维 肌动蛋白 重组与表达增加是 RPE 发生迁移的基础 ( 图 1 唱 5) 体外创伤实验表明, 当迁移过程启动后, 肌动纤 维重组为应力纤维, 新的中等纤维如角质蛋白 亦开始表达 创伤前 RPE 的六角形结构显示良好, 但创伤后创伤边缘的 RPE 变为扁平 创伤区边缘迁 移活跃的 RPE 可因细胞松弛素的应用而受到抑制, 这说明 RPE 的迁移依靠肌动蛋白的应力纤维来实 现 在创伤愈合反应中, 小的创伤靠 RPE 的扩展来 修复, 如果创伤范围较大, 在 RPE 扩展的同时还伴有 RPE 的迁移与增殖 ( 表 1 唱 3) 图 1 唱 5 细胞迁移的模式细胞与基质附着后,A. 细胞的前方部分在肌动蛋白及细胞骨架作用下向前伸展 ; B. 伸展的部分即与局部基质黏附 ;C. 继而细胞后部收缩 ; D. 完成细胞迁移的循环 表 1 唱 3 RPE 细胞对创伤的反应与创伤面积大小的关系 创伤宽度 (μ m) 扩展 迁移 增殖 < > > 抗 β1 整合素抗体 [2 8] 4. 细胞骨架与 RPE 的吞噬 吞噬是细胞的主动运动过程, 在此过程中相对大的 颗粒 ( 直径 > 0.5μm) 的摄入通常需要肌动蛋白的聚合反应, 吞噬体与细胞表面的受体结 合产生的信号激活肌动蛋白的局部聚合反应, 使吞噬功能得以发挥, 随后吞噬体的转运 与溶酶体的融合则依赖于微管 吞噬有两种形式, 但都依赖于肌动蛋白的聚合反应 一种是被吞噬物表面分子与吞 噬细胞表面受体结合以伪足拉链式将颗粒摄入, 巨噬细胞的吞噬就是如此 另外一种是 吞饮 RPE 对感光细胞外节段的吞噬就是一种高度特异性 类似于拉链式的吞噬 在吞 噬暴发时,RPE 表面出现由肌动蛋白纤维网组成的伪足, 把感光细胞外节段卷入, 并被平 行排列的肌动纤维包围, 当被吞噬物进入胞质后这些纤维就消失了, 随后吞噬体与溶酶 体结合 这些观察说明, 在吞噬反应中肌动蛋白与微管都是必需的结构 [29,30] 5 畅细胞骨架与 RPE 色素的迁移 色素的聚积与分散可以发生在单个 RPE 细 胞, 当把 RPE 细胞放置于载玻片时,RPE 能产生放射状排列的尖部突起, 这种突起的产 生是肌动蛋白聚合的反应 当色素颗粒在 RPE 细胞移动时, 也有类似的反应 连续摄 像发现,RPE 色素颗粒的迁移是双向式的, 色素颗粒聚积时的表现与分散时有很大的不 同, 这种不同说明聚积与分散是依赖于不同的动力机制, 很可能色素颗粒的运动依赖于 肌动蛋白与微管的参与, 动力蛋白极可能是色素颗粒在 RPE 细胞内迁移的动力蛋白

23 16 视网膜色素上皮基础与临床实验发现, 细胞松弛素的处理不仅影响 RPE 色素颗粒的迁移, 而且能抑制顶部突起的回缩, 因为 RPE 顶部突起含有肌动蛋白纤维, 细胞松弛素可经由抑制肌动蛋白的功能而影响色素颗粒的转运 第五节视网膜色素上皮功能一 维持与视网膜的黏附 维持视网膜的黏附力有两种, 即被动黏附与主动黏附 被动黏附因素主要有玻璃体 视网膜液体梯度 感光细胞之间黏附分子以及脉络膜渗透压 主动黏附主要由 RPE 对视网膜下腔水及离子的主动转运产生 此外, 存在于 RPE 顶端处的 N 唱 CA M 也对视网膜黏附起了一定作用 ( 参见第二章 ) 二 吞噬脱落的感光细胞外节段 RPE 最重要的功能之一, 就是摄入及消化脱落的感光细胞外节段, 并参与感光细胞 外节段的更新 ( 见本章第七节 ) RPE 吞噬感光细胞外节段通过两种机制来实现, 一是非 特异性吞噬, 例如 RPE 对外源性异物颗粒的吞噬 ; 二是特异性吞噬, 通过受体介导, 例如 [31] 对感光细胞外节段的吞噬 特异性吞噬类似巨噬细胞的吞噬, 包括以下几个过程 : 即 识别 黏附 ( 受体介导 ) 摄入 ( 跨膜信号的传递及具有收缩功能蛋白的参与 ) 及降解 [ 酶的 水解 ( 图 1 唱 6)] 图 1 唱 6 RPE 细胞对乳胶颗粒 (A) 及感光 细胞外节段的吞噬 (B) 图示表明 RPE 对乳胶颗粒的吞噬是一种非特异 性吞噬, 只能借助绒毛突起将异物卷入 ; 而对感 光细胞外节段的吞噬则是受体介导的过程 1 畅识别与黏附 RPE 与感光细胞外节段 有紧密的接触, 呈犬牙交错状态 只有当外节 段与 RPE 紧密接触并且视网膜结构完整者, 外 节段才能发生脱落 研究发现, 吞噬功能有缺 陷的小鼠 (mi vit ) 就是因为 RPE 与感光细胞外节 [32] 段的接触异常而引起 体外培养条件下对 RPE 的吞噬功能已有广泛研究, 大部分研究都 涉及了吞噬初期的启动机制,RPE 的这种功能 很类似吞噬细胞及多核粒细胞 此外, 实验还 发现应用细胞松弛素处理能阻断外节段的脱落 及 RPE 顶端区伪足的形成, 这说明外节段的脱 落与伪足的黏附有关 实验表明, 外节段与 RPE 的结合并不足以启动吞噬过程, 例如从 RCS 大鼠分离的 RPE 细胞仍能与 ROS 结合, 但不能吞噬外节段, 原因是这种有基因突变的 RCS 大鼠 RPE 缺乏特异性吞噬所需的信号传导, 同时也说明黏附与摄入是吞噬过程中完全不同的 两个部分 最近对上皮细胞吞噬中细胞与细胞之间黏附的研究已集中于细胞表面特异性受体,

24 第一章视网膜色素上皮细胞生物学 17 例如 RPE 细胞表面有类似于巨噬细胞的 Fc 片段受体及补体 C3 受体 另外一种重要的 吞噬受体是甘露糖受体系统, 免疫电镜也确实发现在 RPE 的顶端及微绒毛部有甘露糖 受体的存在, 这些受体参与了上皮细胞对可溶性及颗粒性含有甘露糖配体的摄入 Boyle [33 ] 等人报道, 在抗甘露糖受体的抗体存在的情况下,80 % 的外节段的吞噬可被抑制 同 样, 如果外节段与纯化的甘露糖受体蛋白预先孵育一定时间,93 % 的外节段吞噬会被 抑制 另外一种存在于吞噬细胞膜表面的受体是 CD36( 彩图 11), 对巨噬细胞而言, 此受体 称之为净化剂受体, 能介导氧化后 LDL 的吞噬, 也可吞噬损伤后的红细胞及凋亡体 [34] Ryeom 研究发现,RPE 细胞表面有 CD36 存在, 能介导外节段的吞噬 将黑色素细胞 以 CD36 cdn A 传染后, 该细胞对碘唱 125 标记的外节段的结合明显增加, 如果将黑色素细 胞与抗 CD36 抗体事先孵育, 则这种结合可降低 61 % 我们与 Ryeom 几乎同时发现了 [35] CD36 在 RPE 的表达 我们的实验结果表明,T GF 唱 β 能刺激 RPE 对 CD36 的表达 ( 彩 图 12A),CD36 表达的增加与吞噬外节段的增加是一致的 ( 彩图 12B),T GF 唱 β 刺激后 RPE 细胞所吞噬的外节段在 RPE 的吞噬体处 CD36 也是增加的, 应用抗 CD36 抗体能减 少 T GF 唱 β 所诱导的 RPE 细胞对外节段的吞噬 RCS 大鼠吞噬能力下降与 RPE 细胞 CD36 表达缺乏是一致的 除了甘露糖 CD36 这两种已发现的受体与外节段吞噬有关外, 整合素 αυβ5 也可能 [36] 参与了外节段的吞噬过程 免疫染色证明,αυβ5 位于 RPE 的顶部表面, 特别是在外节 段被黏附 结合的阶段,αυβ5 起了重要作用 至于 αυβ5 与 CD36 在外节段的吞噬中是否 有协同作用, 还需要实验来证明 但这两种受体至少是分别参与了外节段的吞噬过程, 尤其是外节段与 RPE 的结合 2 畅吞噬体的摄入外节段与 RPE 表面受体结合后, 围绕于外节段表面的浆膜随即 脱去, 进入胞质而形成吞噬体 此阶段有显著的细胞骨架成分的重组, 特别是微绒毛内 的微小纤维涉及最初阶段吞噬物的摄入, 在外节段附着处肌动蛋白网形成像伪足样突 起, 将外节段包裹继而摄入 在这个过程中, 一般认为与细胞膜结合的 G 蛋白参与了跨 膜的信号传递, 刺激了与收缩运动有关的细胞内蛋白的装配, 由此提供了将黏附的外节 段摄入的动力 一旦进入细胞质内, 吞噬的外节段就会转运给微管 实验发现, 在秋水 仙素存在的情况下, 尽管外节段能与 RPE 结合, 但不能进入到细胞质而停留在顶端区 此外, 能影响 ca M P 信号传递系统的药物也能选择性抑制吞噬体的进入而不影响黏附结 [37] 合 RCS 大鼠就是因为其 RPE 缺乏摄入外节段的功能而使外节段碎屑堆积于视网膜 下腔 一些生长因子对视网膜细胞发育 分化 存活有影响者, 也能调节感光细胞外节段的 [3 8] 吞噬 T GF 唱 β1 afgf 通过细胞内信号传递系统调节吞噬过程, 胰岛素及 IGF1 能刺激 RPE 增强对外节段的吞噬 实验发现, 胰岛素的作用是通过增加肌动蛋白的聚合而影响 吞噬功能的 [39] 3 畅吞噬体的降解 外节段被吞噬进入 RPE 细胞后, 通过微管的转运到达底外侧 的溶酶体 溶酶体与吞噬体的相互反应分为两个阶段 首先, 小溶酶体与吞噬体结合, 然后大溶酶体经由像孔样结构与吞噬体结合 在溶酶体酶的作用下, 外节段被分解成小

25 18 视网膜色素上皮基础与临床 的分子经弥散方式排出 RPE, 或是在细胞内被重新利用 RPE 细胞内的很多溶酶体酶 参与了外节段的降解, 其中最主要的降解视紫红质的酶是组织蛋白酶 D(cathepsin D), 另 外一种酶属半胱氨酸酶 组织蛋白酶 S, 也参与了外节段的水解 随着年龄增长,RPE 对吞噬的外节段的降解功能逐渐下降而形成脂褐质, 与此相反, 体外培养的 RPE 细胞这 种活性却不随培养代数的增加而减少 [40] 三 体外 RPE 对细胞外基质的吞噬 RPE 细胞除特异性吞噬感光细胞外节段以外, 还能吞噬细胞外基质 (ECM) 成分, 然而这种情形并不发生在正常的生理状态下, 当 RPE 周围环境发生改变,RPE 失去了正常情况下赖以接触的成分时, 例如增殖性玻璃体视网膜病变时,RPE 周围存在着过度表达的纤维连接蛋白 Ⅰ 型胶原 Ⅳ 型胶原及血小板反应素等,RPE 对这些细胞外基质的吞噬就成为 RPE 迁移的必要条件 据赵明威等人报道, 体外培养的 RPE 细胞对纤维连接蛋白包裹的聚苯乙烯微球的吞噬最强 ( 图 1 唱 7), 其次是 Ⅰ 型胶原及 Ⅳ 型胶原, 最弱者为血小板反应素 如果将 RPE 预先与抗 α5 β1 及 α5β1 单克隆抗体孵育,RPE 对纤维连接蛋白的吞噬就会被显著抑制 ( 图 1 唱 8), 这说明 RPE 对纤维连接蛋白的吞噬是受体介导的特异性反应过程 这些抗体对 RPE 吞噬纤维连接蛋白的抑制主要是在吞噬的黏附阶段 实验还进一步证实,RPE 对纤维连接蛋白的吞噬受多种细胞内信号传递系统的影响,PI 唱 3 蛋白激酶抑制剂处理后的 RPE 细胞对纤维连接蛋白的吞噬有中等程度的抑制 ( 图 1 唱 8), 而抑制作用最强的是酪氨酸激酶抑制剂 (genistein),pkc 抑制剂对纤维连接蛋白的吞噬没有明显影响, 有的甚至轻度增加 以上实验说明,RPE 对细胞外基质的吞噬是包括 PVR 在内的某些创伤愈合反应中的重要事件, 这对了解 PVR 的发生发展有重要意义 图 1 唱 7 RPE 对不同细胞外基质成分的吞噬 实验结果表明,RPE 对纤维连接蛋白的吞噬作用最强 F : 纤维连接蛋白 ; CI V :Ⅳ 型胶原 ; CI :Ⅰ 型胶原 ;T SP1 : 血小板凝集素 1

26 第一章视网膜色素上皮细胞生物学 19 图 1 唱 8 不同整合素对 RPE 吞噬纤维连接蛋白的影响 A. 当 RPE 事先经抗整合素抗体处理后,RPE 的吞噬指数有非常显著下降 ;B. 不同信号传递 系统对 RPE 吞噬的影响, 显示抑制 PI 唱 3 激酶及酪胺酸激酶能明显抑制 RPE 的吞噬, 而 P K C 抑制剂则增加 RPE 的吞噬 CC :calphostin C ;gen :genistein ;w ort :w ort mannin [41] 四 RPE 参与血唱视网膜屏障构成及对液体 离子的转运 解剖学上血唱视网膜外屏障由 RPE 构成,RPE 控制着液体及某些分子在外层视网膜 与脉络膜之间的交换 RPE 参与构成血唱视网膜外屏障的结构有两种 : 位于 RPE 细胞之 间的紧密连接复合体及某些呈极化状态分布的细胞蛋白质 紧密连接复合体能防止物 质从脉络膜弥散到 RPE, 所以, 某些物质的交换必须通过 RPE 细胞本身的转运 实验发 现, 紧密连接复合体的通透性随生理环境改变或某些药物处理后发生改变 就 RPE 自 身转运而言, 主要取决于转运蛋白的极化分布, 例如 Na + 唱 A T P 酶只出现在 RPE 细 胞的顶部膜, 与此酶相连的细胞骨架蛋白也分布在同一位置, 由此提供了物质转运的解 剖学结构基础 另外, 与转运功能密切相关的结构是顶部膜的绒毛及底外侧膜的内褶 (infoldings), 这种特异性膜结构极大增加了 RPE 对物质的交换与转运 其次, 存在于 RPE 外侧膜及底外侧膜的受体对某些特殊的营养物质, 例如视黄醛极其结合蛋白的转运 也是必需的, 这两种特异性蛋白包括细胞视黄醛结合蛋白和脱氢视黄醛结合蛋白, 前者 [ 42] 负责反视黄醇的转运, 后者负责顺视黄醇的转运 水及离子的转运是维持视网膜正常功能的重要条件,RPE 对水的转运保持了视网膜 黏附与眼压的平衡 离子转运主要靠顶部膜的 Na + 唱 A T P 酶, 除 Na + 离子外, 牛 黄酸 天门冬氨酸 谷氨酸的转运也受 RPE 的调控, 这些物质转运都是从视网膜向脉络 膜方向进行, 是一种 Na + 唱 A T P 酶依赖性的耗能转运 液体的转运并不受 Na + 唱 A T P 酶的影响, 因为应用哇巴因 (ouabain) 处理后的 RPE, 并不能阻断水从视网膜向脉络 膜方向移动 五 视黄醛代谢 对视黄醛的代谢是 RPE 最重要的功能之一 视黄醇或视黄醛亦称之为维生素 A,

27 20 视网膜色素上皮基础与临床 其基本结构相似, 只是在视觉物质代谢循环过程中不同阶段有不同的称呼而已 RPE 细 胞中有丰富的维生素 A, 其含量仅次于肝脏 维生素 A 的代谢起始于感光细胞外节段吸 [43] 收光子后脱氢, 顺视黄醛异构向反视黄醛转化, 这种变化发生在 RPE 细胞内, 是视觉 物质代谢的关键步骤 虽然人们早已认识到 RPE 涉及视蛋白的代谢, 但是维生素 A 在 RPE 细胞中如何代 谢却知道不多 Wald 首先发现视网膜内存在有维生素 A [44], 他发现光照后大多数维生 素 A 从神经视网膜内消失后, 被荧光标记的维生素 A 却出现在 RPE 内, 因此认为 RPE 是维生素 A 的摄取者 Dowling 在以后的实验中发现, 暗适应条件下, 视网膜内 95 % 的 维生素 A 在感光细胞外节段视紫红质中以脱氢的形式存在,RPE 及脉络膜内维生素 A 含量极少 光照可导致脱氢维生素 A 从视蛋白镶嵌中释放出来, 随之转化成维生素 A, RPE 细胞中维生素 A 水平迅速升高, 这一反应过程称之为漂白 光照后游离出来的维 生素 A 经由 RPE 顶端部分摄取 血循环中的维生素 A 能与血浆视黄醛结合蛋白结合经 由脉络膜血循环通过 RPE 底外侧膜特异受体进入 RPE, 所以 RPE 既是维生素 A 的储存 处又是代谢所在地 随着光照的延长, 整个视黄醛在视网膜的浓度就会下降 当暗适应 发生时, 维生素 A 在 RPE 的含量会显著下降, 而感光细胞内的浓度急剧升高 11 唱顺视 [45] 黄醛是视黄醛转化成视紫红质并作为视色素的结构部分, 视黄醛在 RPE 中的转化过 程由多种酶催化发生, 而位于感光细胞之间的视黄醛结合蛋白 (IRBP) 则是视黄醛在感光 细胞与 RPE 之间的转运蛋白 眼内组织细胞不能合成维生素 A,RPE 必须从血清中摄入维生素 A 血液中维生素 A 与其结合蛋白形成复合体, 由于这种复合体并不能穿过血唱视网膜屏障进入 RPE, 所以 必须有一种转运机制存在以便把维生素 A 输送进 RPE 应用放射同位素标记研究发 [46] 现,RPE 底外侧膜有视黄醛结合蛋白的结合位点, 这说明存在着受体介导的对维生素 A 的摄入 20 世纪 90 年代初, 不同的学者从 RPE 底外侧膜纯化 提取了两种膜蛋白 P63 及 P65 [47], 因此, 人们认为 P63/P65 很可能是视黄醛结合蛋白的受体, 通过这种受体 将维生素 A 摄入 RPE 细胞内 维生素 A 具有多种结合蛋白, 没有这些蛋白的存在, 维生素 A 的正常转运 代谢就 无法完成 维生素 A 在水溶液中不可溶并且不稳定, 高浓度下维生素 A 对细胞膜及细 胞器具有一定的毒性, 所以, 结合蛋白的存在能使维生素 A 成为可溶性维生素 A, 防止氧 化及酶的降解, 并能防止 RPE 细胞膜被维生素 A 溶解 此外, 这些结合蛋白具有参与维 生素 A 的转化与代谢的功能 维生素 A 结合蛋白主要包括血清维生素 A 结合蛋白 (ret 唱 inol 唱 binding protein, RBP) 细胞维生素 A 结合蛋白 (cellular retinol 唱 binding protein, CRBP) 以及 IRBP Wiggert 在 1975 年首先报道眼组织中视网膜 RPE 和角膜有维生素 [4 8] A 结合蛋白的存在 现已证明,CRBP 属于能与维生素 A 脂肪酸结合的超级基因蛋 白家族,CRBP 的主要功能是促进维生素 A 在细胞间的转运, 并对维生素 A 有保护作用 另外一种能与维生素 A 结合的蛋白质是维生素 A 酸结合蛋白 (cellular retinoic acid 唱 binding proteins,crabp), 维生素 A 酸结合蛋白除了在神经视网膜与 RPE 细胞表达 外, 也见于视网膜胶质细胞,CRABP 对视网膜神经的分化起调节作用 RPE 之所以能代 谢维生素 A 酸是与维生素 A 酸结合蛋白的功能紧密相关

28 第一章视网膜色素上皮细胞生物学 21 维生素 A 一旦进入 RPE 细胞就会进入活性代谢状态, 然而在任何代谢反应之前维 生素 A 必须靠细胞内的视黄醛脱氢结合蛋白 (cellular retinaldehyde binding protein, CRA LBP) 将其运输到特定代谢部位, 所以, 视黄醛脱氢结合蛋白是 RPE 细胞内的维生 素 A 运输蛋白 此外, 视黄醛脱氢结合蛋白只限于与顺视黄醛结合, 视黄醛脱氢结合蛋 白能控制 RPE 细胞 11 唱顺视黄醛的代谢通路, 而 11 唱顺视黄醛脱氢后可被用于构成视紫 红质或以脂化形式存在于 RPE 细胞内, 可见视黄醛脱氢结合蛋白在维生素 A 的细胞内 代谢中处于关键地位 RPE 与感光细胞之间维生素 A 的互换 转运基本上依赖于感光细胞间维生素 A 结 合蛋白 (interphotoreceptor retinoid 唱 binding protein, IRBP) IRBP 是一种大分子糖蛋 白, 由感光细胞合成 IRBP 能迅速与脂肪酸及维生素 A 结合, 因而可执行维生素 A 在 RPE 与感光细胞间的转运 Chen 及 Anderson 所提供的证据表明,RPE 细胞内的三酸 [49] 甘油是感光细胞间质脂肪酸的来源 此外,IRBP 的一个重要作用是防止维生素 A 在 转运时被氧化发生异构, 因此可起到类似缓冲液样保护作用 Jones 发现 11 唱顺视黄醛对 视杆细胞的外节段具有毒性作用, 在顺视黄醛存在的情况下感光细胞外节段就会失去电 [50] 生理刺激时的敏感性, 当顺视脱氢视黄醛与 IRBP 结合后视杆细胞对光的刺激又会恢 复 明适应时 IRBP 不仅能增加 RPE 细胞内视黄醇, 而且能促进 RPE 酯的形成增加 3 实验发现, 去除视网膜及玻璃体仅保留 IRBP, 将 H 标记的反视黄醇加入到 RPE 顶侧膜 表面, 结果发现 IRBP 比血清维生素 A 结合蛋白更能影响 RPE 细胞内视黄基酯的合成 暗适应时, 视黄醛从 RPE 移出经感光细胞间质进入感光细胞, 与视蛋白结合构成视紫红 质 Okajima [ 51] 认为,IRBP 不但能影响 RPE 对视黄醛的释放, 也能影响视紫红质在外节 段的合成 当缓冲液中有 IRBP 时, 视黄醛可从 RPE 中释放出来 ; 相反, 缓冲液中没有 IRBP 时, 视黄醛则不能从 RPE 中释放 更有趣的是, 所有这些释放出来的视黄醛都是 11 唱顺视脱氢视黄醛 这说明 IRBP 直接涉及视紫红质的再生, 而不仅是在 RPE 与感光 细胞间做视黄醛的转运 视黄醇脂化是视黄醛代谢的另外一个重要反应, 通过这个步骤不仅可产生稳定的能 储存的非毒性视黄醛, 而且提供了从反式视黄醛变为顺式视黄醛异构化的底物 反视黄 醛在感光细胞 /RPE 膜转化成顺视黄醛, 其反应的酶活性均在 RPE 细胞内 T rehan [52] 于 1990 年报道用带有溴乙酰的反视黄醛处理 RPE 细胞膜, 不仅抑制了 RPE 酶的活性, 也显著减少了顺视黄醛的产生, 这说明酯是异构酶的底物 就反视黄醛转化为顺视黄醛 的能量来源而言, 很可能是磷脂酰胆碱起了如同 A T P 样的作用 总之,RPE 通过摄入 代谢 储存维生素 A 而直接参与了视紫红质的代谢过程 众 多分布于 RPE 感光细胞及细胞间质的转运蛋白是维生素 A 代谢转换的重要工具 视 黄醛的转运是以视紫红质漂白开始, 视蛋白与视黄醛分裂 反视黄醛在感光细胞间质出 现为标志 视黄醛在 RPE 唱 IP M 唱视网膜感光细胞间循环通路已明了, 但是要完全阐明这 种复杂的生物反应机制还需更多的研究 大量证据表明,RPE 在视黄醛代谢中起着关键作用 因此,RPE 异常或视黄醛代谢 异常都有可能导致视功能障碍甚至失明 Smith 于 1994 年报道,Vitiligo 小鼠的肝脏及 [53] RPE 细胞内的视黄醛水平比正常小鼠明显降低, 这种小鼠具遗传性视网膜变性特点,

29 22 视网膜色素上皮基础与临床 其失明很可能与视黄醛代谢异常有关 此外,RPE 特异性的与视黄醛代谢有关的基因突 变导致视网膜变性的蛋白已经被发现 Maw 于 1997 年报道,CRA LBP 基因突变可导致 [54] 常染色体隐性遗传性视网膜色素变性 ;Gu 于 1997 年研究表明,RPE P65 基因突变能 [55] 引起早期发作性常染色体隐性遗传性视网膜变性 老化与环境因素也能干扰视黄醛在 RPE 中的代谢, 从而导致视网膜变性 虽然年 龄相关性黄斑变性的病因至今仍不清楚, 但是,RPE 功能的异常可能起了关键作用, 特别 是脂褐素积聚有可能直接干扰了视黄醛代谢 更重要的是, 脂褐素的光分解可导致超氧 化物形成, 从而加重对 RPE 的破坏, 可能是黄斑变性的诱导因素 [56] 六 RPE 的免疫调节作用 RPE 位于全身循环与神经视网膜之间, 除营养视网膜外, 其中一个重要功能就是调节局部免疫反应 正常眼内及视网膜下腔保持着免疫反应与免疫抑制的平衡状态,RPE 的血唱视网膜屏障结构能防止血流中的免疫活性细胞进入到视网膜下腔, 其次 RPE 还能主动分泌免疫抑制因子, 例如 T GF 唱 β T NF 唱 α 可溶性受体 IL 唱 2 受体, 这些主要由 RPE 分泌的因子能抑制局部炎症及免疫反应 而另一方面,RPE 有可能成为免疫反应的参与者, 虽然在正常情况下 RPE 并没有抗原表达现象, 但在 γ 唱干扰素的刺激下,RPE 可出现较强的 H LA 唱 DR 的表达, 从而加强免疫反应 如果血唱视网膜屏障破裂, 通过活化 RPE 的 CD59 CD48 而导致淋巴细胞的浸润 此外, 近年发现的 Fas 唱 FasL 系统反应通过细胞凋亡的方式调节局部炎症免疫反应 ( 参阅第十一章 ) 七 生长因子及黑色素 参阅本章第六节 第八节 [57] 八 RPE 的活化 损伤或周围环境变化可使 RPE 发生迁移 增殖, 形态发生改变, 成为成纤维细胞样或巨噬细胞样, 因为这些功能与形态的变化常伴随着某些基因表达的改变, 因此称之为 RPE 活化 能刺激 RPE 细胞发生活化的因素有物理性挫伤 化学性刺激 炎症 眼内积血 血唱视网膜屏障的破坏 周围细胞间质成分的变化 脉络膜血循环的改变等 其他刺激因子包括玻璃体 纤维连接蛋白 T GF 唱 β 以及来自血源性的刺激因子, 例如 PDGF 巨噬细胞 细胞因子 ( T NF IN F 唱 γ) 代谢产物在 Bruch 膜积聚或疣形成以及缺氧 RPE 的活化主要通过活化细胞因子 生长因子以及整合素受体的表达来改变 RPE 基因 功能及表现形 体外实验表明, 细胞形态的改变主要通过整合素受体信号系统调节, 当 RPE 细胞培养于三维立体结构的胶原中就变成成纤维细胞样, 而培养的底物富有纤维连接蛋白并处于二维结构者,RPE 细胞可变为巨噬细胞样 T N F 唱 α 或 T GF 唱 β 的刺激能使 RPE 对整合素的

30 第一章视网膜色素上皮细胞生物学 23 产生发生改变 能刺激 RPE 细胞增殖的生长因子有 PDGF T NF 唱 α IGF 和 VEGF RPE 细胞的迁移可受到 PDGF VEGF T N F 唱 α 及某些细胞外基质成分, 例如纤维连接蛋 白的刺激而增加,RPE 迁移的增强常伴有细胞骨架成分 ( 肌动蛋白 角质蛋白 ) 的重新组 合, 角质蛋白的特征性改变是角质蛋白 的表达增强 另外一种伴随 RPE 的迁移出 现的蛋白是 CD44 的表达 在 RPE 迁移时, 细胞外基质的降解是细胞迁移的必要条件, 一些生长因子如 T N F 唱 α VEGF 及某些整合素能增加 RPE 细胞组织金属蛋白酶的产生, 从而加强 RPE 的迁移 活化的 RPE 也能表达某些与白细胞黏附及浸润有关的分子, 例如 CD45 CD48 CD54 CD59 CD68 以及 ICA M 唱 1 受 T NF 唱 α IL 唱 1 刺激后 RPE 能产生单核细胞趋化因 子蛋白唱 1(MCP 唱 1) 及 IL 唱 8, 而使炎症反应效应扩大 RPE 周围环境的改变也能活化 RPE 产生更多生长因子, 例如缺氧能使 RPE 增加 VEGF 的产生 ;TGF 唱 β 能提高 RPE 胶原及平滑肌肌动蛋白的产生, 从而参与 PVR 膜的 形成 [58,59] 九 RPE 的衰老与死亡 随着年龄增加,RPE 会出现一些特征性改变, 例如细胞的大小 形状不规则,Bruch 膜有物质沉着及在胞质中出现脂褐素 脂褐素来自没有完全分解的感光细胞外节段, 随着年龄增加而增多 黄斑区脂褐素的含量比周边视网膜多, 但中心光反射区则较少 脂褐素含量的增加与细胞分裂 代谢活性降低有一定关联 脂褐素的颗粒直径大小约为 1.5μm, 主要位于底侧部 被 RPE 吞噬的感光细胞外节段含有多聚不饱和脂肪酸, 在周围高氧环境作用下能产生大量自由基, 自由基 过氧化物与不饱和脂肪酸交叉反应有助于形成脂褐素, 过量的脂褐素在 RPE 细胞内积聚可影响 RPE 正常代谢功能, 最终使感光细胞受损, 因此, 脂褐素的积聚与年龄相关性黄斑变性有一定关联 RPE 衰老的另外一个指征是细胞内酶含量的改变, 细胞自溶素 D 酸性磷酸酶 β 唱尿苷酸酶随着年龄增长而增加 ; 与此相反, 其他一些酶, 例如甘露糖酶 配糖酶随年龄增长而减少 此外, 整合素 β1 亚单位的表达也与年龄增加有关 实验发现, 将年长者的 RPE 培养于体外, 其与 Bruch 膜的附着力明显下降 RPE 细胞数量也会随年龄增长而减少, 研究证明 RPE 可发生凋亡, 特别是在 CD95 表达增加的情况下, 某些生长因子例如 T N F 唱 α IN F 唱 γ T GF 唱 β, 缺氧, 缺乏葡萄糖均可能诱发凋亡基因的表达, 使 RPE 发生凋亡 体外培养的 RPE 细胞每传代一次增殖率会减少 4 % 据文献报道,RPE 增殖率的下降与拓扑酶的表达下降有关 ( 参阅第九章 ) 第六节视网膜色素上皮黑色素 大多数活体生物细胞中都有黑色素的存在, 这些生物体包括细菌 植物和动物 黑 色素由含有聚合色素的间质蛋白构成 正是由于原始色素的存在, 脊椎动物才有不同特 征的颜色, 如黄色 红色 棕色及黑色 黑色素颗粒在眼内主要分布于 RPE 睫状体 虹膜