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1 第 56 卷第 1 期厦门大学学报 ( 自然科学版 ) Vol.56 No 年 1 月 JounalofXamenUnvesy (NaualScence) Jan.2017 do: /j.ssn 综述 简化基因组测序技术及其在海洋生物研究中的应用 边力, 王军 * ( 厦门大学海洋与地球学院, 福建厦门 ) 摘要 : 传统开发遗传标记的方法通常会消耗大量的人力 物力和时间, 伴随着高通量测序技术的飞速发展, 一种高效的标记开发技术即简化基因组测序技术开始得到广泛应用. 简化基因组测序技术可以在一次实验中获得成千上万的遗传标记, 建库过程简易, 成本较低. 其通过实验手段降低基因组的复杂度, 仅对部分基因组进行测序, 随后在该部分获得的基因组开发分子标记. 基于酶切的简化基因组测序技术可分为三大类 : 简化代表库测序 限制性酶切位点相关 DNA 测序和低覆盖度的分型测序. 在海洋生物研究中, 简化基因组测序技术已被广泛应用于群体遗传学 系统进化学 适应性进化 遗传图谱构建及数量性状位点定位等研究领域. 关键词 : 简化基因组测序 ; 海洋生物 ; 基因分型 ; 限制性酶切位点相关 DNA 测序中图分类号 : Q341 文献标志码 : A 文章编号 : (2017) 遗传标记是存在于生物不同群体 不同个体间 可遗传的具多样性的内在特征, 它是群体遗传学及 分子系统进化等研究的基础. 在过去的几十年中, DNA 分子标记技术得到了长足的发展, 从 20 世纪 80 年代初的限制性片段长度多态性 (esconfaḡ menlenghpolymophsm,rflp) [1], 到目前应用十 分广泛的微卫星 DNA(mcosaeleDNA) [2] 以及单 核苷酸多态性 (sngle nucleode polymophsm, SNP) [3], 基于不同技术手段开发的分子标记层出不 穷. 目前,DNA 分子标记在种类上已经基本可以满足 研究的需要, 然而随着高通量测序技术 (nexgeneaonsequencng,ngs) 的飞速发展, 研究人员更加关注标记数量上的提升, 即如何从高通量的测序 结果中获得更多标记. 标记数量的提升意味着其覆 [4] 盖度和分辨率的提升,Luka 等曾提出如果有一 种简单 可靠的分子技术可以在一次实验中获得数 百个覆盖整个基因组的分子标记, 那么这无疑是研 究群体遗传基因组学最为理想的实验技术. 近些年 发展起来的简化基因组测序 (educed-epesenaon sequencng) 技术即为一种十分有前景的 可以在一 次实验过程中获得成千上万标记的技术, 并且可以 广泛应用于非模式生物 ( 未完成全基因组测序的物 种 ) 的研究. 利用传统的实验方法开发微卫星 DNA 和 SNP 通常是非常繁琐和耗时的, 一般会涉及到多次的引 物设计 PCR 扩增以及基因克隆, 并且每次的实验过 程只能够针对一个标记. 在基因分型时, 虽然可以选 择多种不同的方法, 但整个分型过程仍然是繁琐复 [5] 杂甚至昂贵的.21 世纪初开发的 SNP 芯片技术可 以在很大程度上提高基因分型的效率, 然而其开发 的过程十分耗时耗力, 且因为芯片开发过程中使用 的样本仅来源于少量的群体, 在对新的群体检测时 结果会出现偏差, 所以该技术并不十分适用于新的 群体或遗传距离较远群体的研究. 相比较而言, 本文 中所介绍的基于 NGS 的简化基因组测序技术可以 集标记开发 测序和分型于一次实验过程中, 且一次 实验可包括大量样品并检测出成千上万的可用标 记. 同时, 随着 NGS 成本的逐步降低, 大部分实验室 均可以承受简化基因组的测序工作. 简化基因组测 序技术另外一个优点就是仅需如酶切 连接 PCR 等 基本的实验技能, 即便是刚刚接触分子实验的科研 人员也可以在经过一段时间的学习后构建起合格的 收稿日期 : 录用日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ; ) * 通信作者 :junw@xmu.edu.cn 引文格式 : 边力, 王军. 简化基因组测序技术及其在海洋生物研究中的应用 [J]. 厦门大学学报 ( 自然科学版 ),2017,56(1):3-12. Caon:BIANL,WANGJ.Theeduced-epesenaonsequencngechnqueandsapplcaonsnmaneogansms[J].JXamenUnvNaSc,2017,56(1):3-12.(nChnese) hp : jxmu.xmu.edu.cn

2 4 厦门大学学报 ( 自然科学版 ) 2017 年 测序文库. 本文中将首先介绍简化基因组测序技术相对于 传统方法所具有的优势, 接着介绍基于酶切的几大类 简化基因组实验技术, 最后对该技术在海洋生物领域 的研究进展进行一定的总结. 1 简化基因组测序技术用于开发分子标记的优势 1.1 NGS 原理带来的效率提高 分子标记开发的一般思路是寻找不同个体间同 [6] 源序列存在的差异. 在传统的 Sange 法测序中, 通 过对不同的同源位点设计引物进行 PCR 反应, 可以直 接获得不同个体在该同源位点的序列, 进而寻找可用 的分子标记. 与 Sange 法不同, 基于 NGS 的测序方法 并不会刻意地对某些同源位点进行基于 PCR 的扩增 富集, 而是通过实验处理将整个基因组打断, 对于打 [7] 断后形成的 DNA 片段进行富集测序. 在此基础上, 简化基因组测序技术又通过一定的手段选取基因组 的一部分进行最终测序. 简化基因组测序技术可以通 过一次测序获得成千上万的同源位点, 而使用传统方 法就意味着成千上万次 PCR 反应. 这种基于 NGS 的 简化基因组测序技术的另一个优势就是标记的开发 和分型工作可以在一次实验过程中同时完成. 传统的 分子标记开发过程都是首先对大量潜在标记进行筛 选, 接着保留可用标记对分析群体进行标记位点的扩 增, 最后进行标记的分型, 每一步都需消耗大量的人 力 物力和时间. 因此, 简化基因组测序技术无论在获 得标记的数量上还是时间的消耗上都要明显优于传 统方法. 当然, 随着全基因组测序成本的不断降低, 或 许在不久的将来大部分实验室也可以负担起群体的 全基因组测序, 但近期来看, 简化基因组测序仍然是 最为适合分子标记开发的技术. 1.2 标签 技术带来的成本降低 简化基因组测序成本低的一个重要原因是其一 次测序反应即可包括数十个甚至上百个个体, 而为了 达到这样的目的就一定需要某种手段在得到的大量 数据中区分出每个个体 [8], 而该种手段就是在制备测 序文库的过程中为每个个体添加 标签 (bacode), 即 一小段的核苷酸序列. 每个 标签 都具有其独特的核 苷酸数量和组成, 通过后续识别这些 标签 就可以将 不同的个体鉴别出来. 添加 标签 可以通过 PCR 反 [9] [10] 应或连接反应来完成. 最为理想的 标签 首先应 尽可能短, 这样可以尽量少占用测序读长 ; 其次还要 有效地区分不同的个体 ; 最后还应有一定的抗干扰能 力, 即在出现测序错误的时候仍然可以保持相对准确 [11] 的鉴定. 通过分层级加 标签 的方法可以在同一个 测序文库中标记成百上千的个体 [12], 经过标记后的个 体就可以混合成为一个最终的测序文库. 虽然混合可 以降低成本, 但也有缺点 : 混合后的后续数据分析可 能会漏掉某些稀有等位基因, 同时制备文库的每个个 体的 DNA 量是否相近也会对后续分析产生影响 [13] ; 在缺少高质量参考基因组的情况下, 混合也使得基于 [14] 观察杂合度的后续数据筛选受到影响. 除了添加用 于识别每个个体的 标签 外, 还需要为每个 DNA 片 段添加适用于不同测序平台的 含有测序引物结合位 点的测序接头. 除了使用昂贵的文库制备试剂盒, 简化 基因组测序技术也可以通过简单的酶切 连接 PCR 来完成 标签 和测序接头的添加, 在具有一般配备的 分子实验室即可完成. 2 基于酶切的简化基因组测序技术 为了开发分子标记, 若对不同群体内的所有个体 都进行全基因组测序将是十分昂贵的, 而基于部分基 因组开发得到的分子标记已经可以满足大部分研究 的需要, 这是应用简化基因组测序技术的前提. 本文中 介绍的基于酶切的简化基因组测序技术, 可分为三大 类 : 简化代表库, 其包括简化代表库测序 (educed-epesenaonlbaessequences,rrls) 和简化多态序列复杂度测序 (complexy educon of polymophc sequences,crops); 限制性酶切位点相关 DNA 测序 (esconse-assocaeddnasequencng,rad-seq); 低覆盖度的分型测序, 包括基于测序的基因分型 (genoypngbysequencng,gbs) 和多元鸟枪法基因分型 (mulplexedshogungenoypng,msg)( 表 1). 2.1 简化代表库 简化代表库的基本思想为选取酶切后的部分片 段, 实现对基因组的简化 ; 此时不同个体所保留的酶 切片段各不相同, 但所有个体保留的片段集合可以 对基因组有较好的覆盖, 基于此进行测序并开发分 子标记. 主要包括两种技术, 分别是 RRLs 和 CRoPS RRLs RRLs 最早被用于建立人类基因组的 SNP 图 [15] [16] 谱.VanTassel 等在 2008 年首次系统地阐述 了结合 NGS 的 RRLs 技术, 其基本实验流程是首先 hp : jxmu.xmu.edu.cn

3 第 1 期边力等 : 简化基因组测序技术及其在海洋生物研究中的应用 5 表 1 [7] 不同简化基因组测序技术的对比 Tab.1 Compasonofdfeeneduced-epesenaonsequencngechnques [7] 操作要求和适用范围 RRLs CRoPS RAD-seq GBS MGS 初始 DNA 量 25μg ( 所有样品混合 ) 300ng ( 单个样品 ) 300ng ( 单个样品 ) 100ng ( 单个样品 ) 10ng ( 单个样品 ) 是否需要 PCR 否 a 是是是否 a 是否需要参考基因组否否否是 b 是 b 是否适用于多倍体 / 含大量重复序列的基因组 否是是是是 多态性检测能力 高 高 最高 中等 中等 测序片段来源 单酶切 双酶切 酶切及机械随机打断 单酶切或双酶切 单酶切 基因组复杂度降低来源片段长度选择 PCR 引物中的选择性位点 片段长度选择 酶切及接头连接反应 片段长度选择 片段测序深度 高 (20~30 ) 中等 (5~10 ) 高 ( 约 30 ) 低 低 ( 可低至约 1 ) 测序位置 片段两端 完整片段 片段两端 片段两端 完整片段 是否使用 标签 否 是 是 是 是 在数量性状位点 (QTL) 和分子辅助育种上的适用度 低低中等高高 注 :a.rrls 和 MSG 根据具体的研究要求可增加 PCR 反应 ;b.gbs 和 MSG 倾向于有参考基因组的研究, 但在没有参考基因组时同样适用. 对样本进行限制性内切酶的酶切, 并将不同样本的 酶切片段进行混合, 随后进行酶切片段长度的选择, 接着连接测序接头, 最后进行上机测序.RRLs 的建 库方法一般可以保留初始酶切产生片段, 即基因组 的 1%~10% [7]. 在最为简化的 RRLs 实验过程中, 测序时可以只对酶切片段的两端进行测序, 当然也 可以通过调整实验方法对获得的整个酶切片段进行 [17] 测序. [16] 早期的 RRLs 技术将群体内的所有个体都进 行了混合, 因而只能对整个群体的群体遗传参数进行 估计. 为了计算群体内个体间的遗传参数, 就需要为每 个个体在混合前添加 标签 用以区分. 获得的测序片 段根据是否有高质量的参考基因组进行不同的处理 : 当存在参考基因组时, 可以将获得的测序片段比对到 基因组上进而寻找 SNP 标记, 与基因组重测序技术相 似 [18] ; 当不存在参考基因组时, 首先需要对获得的测 序片段进行 denovo 拼接, 以拼接后的片段作为参考 序列进行比对寻找 SNP. 目前,RRLs 技术已广泛地应 [19-21] [22] 用于 SNP 的开发 遗传多样性研究以及性状 [23] 关联分析 CRoPS 2007 年提出的 CRoPS [24] 在文库制备的过程中结 合了扩增片段长度多态性 (AFLP) 的方法, 通过 2 种 限制性内切酶 (Hpa Ⅱ 和 Mse Ⅰ) 来打断 2 个玉米自 交系的基因组 DNA, 随后经过连接接头和 2 轮的 AFLP 扩增, 为 2 个自交系分别添加用以区分的 标 签, 最后将 2 组样品混合上机测序.CRoPS 技术适用 于基因组含有大量重复序列且 ( 或 )DNA 多态性较低 [7] 的物种, 如经过选育的农作物品种. 目前,CRoPS 技 [24-25] 术已被应用于玉米 SNP 的开发以及群体遗传学 [26-27] 研究. 2.2 RAD-seq RAD-seq 技术是近些年发展最为迅猛 应用最为 [28] 广泛的一种简化基因组测序技术, 其基本实验流程 为 : 用限制性内切酶打断基因组, 酶切产生黏性末端, 进行第一次连接反应, 连接带有 标签 及一端测序结 合位点的接头 P1, 随后将所有酶切片段混合, 机械随 机打断并选择长度合适的片段, 最后进行 PCR 扩增并 上机测序. 由于随机打断, 剩余片段的末端存在 3 种可 能 :1) 两端均为 P1 接头 ;2) 一端为 P1 接头, 一端为 随机打断后的末端 ;3) 两端均为随机打断后的末端. 此时进行第二次连接反应, 连接带有另一端测序结合 位点的接头 P2.P2 接头是经过精心设计的, 它的末端 核苷酸序列不互补而呈 Y 字形岔开, 这保证了在进 行 PCR 时只有一端为 P1 另一端为 P2 的片段会被扩 增 ( 两端均为 P1 的片段也会被扩增, 但不会被测 hp : jxmu.xmu.edu.cn

4 6 厦门大学学报 ( 自然科学版 ) 2017 年 序 ) [29]. 在几种简化基因组测序技术中,RAD-seq 开发 出的标记数量最多且具有最高的密度, 因而应用范围 十分广泛, 尤其在缺乏高质量参考基因组的情况下, RAD-seq 是进行简化基因组构建的首选. 不过最为经 典的 RAD-seq 方法也有其缺点, 即建库的的步骤较多 ( 机械随机打断, 末端修复, 两次连接反应 ), 这提高了 建库的成本 时间及对实验技能的要求. 目前 RAD-seq 技术广泛地应用于系统进化研究 [30-32] 群体遗传学研 [33-35] [36-37] [38] 究 适应性进化研究 遗传图谱建立及性 [39-40] 状关联分析. 针对经典 RAD-seq 建库中存在的缺点, 近几年发 [7] 展出多种衍生 RAD-seq 技术. 本文中选取其中的双 酶切 RAD 测序 (ddrad-seq) ⅡB 型限制性内切酶 RAD 测序 (Ⅱ BdgesRAD,2b-RAD-seq) ezrad 测序 (ezrad-seq) 和特异位点扩增片段测序 (specfclocusamplfedfagmensequencng,slaf-seq) 进行 简单的介绍. ddrad-seq [41] 的第一个特点是其省去了机械随 机打断及末端修复这两个步骤, 相应地使用了两个限 制性内切酶进行双酶切. 这样做有两点好处 :1) 机械 随机打断步骤伴随着大量 DNA 片段的丢失, 所以 RAD-seq 初始的样品 DNA 量需要达到 300ng, 而 ddrad-seq 只需 100ng 甚至更低, 这对于一些难以提 取 DNA 的样品来说十分关键 ;2) 建库成本低, 经过 推算 ddrad-seq 的建库成本约为 RAD-seq 的 20%. ddrad-seq 的第二个特点是其添加 标签 的技术可 将大量的样本集中于一个混合样中, 其 标签 分为两 类 : 第一类 标签 位于连接接头上, 通过连接反应将 标签 添加到每个个体 ; 第二类 标签 位于测序接头 上, 通过 PCR 反应添加, 因而每个样本均具有两个 标 签. 在后续数据分析时, 通过比对两个 标签 来区分 不同的个体, 这不仅增加了准确性, 而且可以同时标 记数百个个体. 2b-RAD-seq 利用 ⅡB 型限制性内切酶 ( 如 Bsa X Ⅰ Alf Ⅰ) 对基因组进行酶切打断, 完整的建库过程 十分简便, 省去了传统 RAD-seq 的机械随机打断步 骤, 获得的酶切片断具有相同的长度, 十分适合于连 [42] 锁图谱的构建以及群体遗传研究. ezrad-seq 最为显著的特点是在进行限制性酶 切后, 后续的建库过程利用 Ilumna 公司的 TuSeq 文库构建试剂盒来完成, 建库过程得到了极大的简 化, 研究人员仅需在实验室进行初始的酶切反应, 后 续的建库过程可以将酶切产物送交商业测序公司完 成, 这为缺少相应实验仪器的研究人员提供了极大的 [43] 便利. SLAF-seq 在进行酶切前, 会利用生物信息学方 法对酶切结果进行模拟, 根据研究需要选择最为合适 的限制性内切酶, 这可以有效地避开基因组中的重复 序列, 增加测序得到的有效读序, 提高分子标记的开 发效率, 开发的 SNP 分子标记稳定性好, 在基因组中 [44] 分布均匀. 2.3 低覆盖度的分型测序 前两大类技术旨在通过对基因组的简化, 将余下 的可用位点与测序能力相匹配, 一次测序就可以为每 一个样本提供尽可能高的覆盖度以及测序深度, 再通 过个体间的比对来开发标记. 而低覆盖度分型测序在 寻找标记时运用了不同的策略, 它对每个样本的覆盖 度和测序深度都较低, 但通过统计学方法仍可以比较 准确地开发标记. 在低覆盖度的分型测序中, 每个个体 所覆盖的位点是不同的, 为了开发标记需要比对不同 样本的位点, 而某些位点并未被所有样本所覆盖, 这 时就需要利用隐马尔可夫模型 (hdden Makov model,hmm) 进行位点估计, 再用估测的位点进行标 [45] 记开发. 一般来说,HMM 会利用具有较高覆盖度 和测序深度的位点, 或者可以比对到参考基因组上的 位点, 去估测那些未覆盖到此位点的个体. 在群体的父 本母本遗传信息已知的情况下, 低覆盖度的分型测序 是非常有效的标记开发工具, 同时该方法可以极大地 提高实验中的样品数量, 主要包括两种分支技术, 分 别是 GBS 和 MSG GBS [46] Elshe 等首先提出的 GBS 的实验流程为 : 利 用限制性内切酶分别打断所有个体基因组 ; 随后连接 反应连接接头 (GBS 使用两类接头 : 一类是含有一端 测序结合位点以及 标签 的接头, 另一类是仅含有另 一端测序结合位点的普通接头 ), 连接反应后会得到 3 种片段, 分别为两端均连接有 标签 接头的片段 两 端均连有普通接头的片段以及一端连有 标签 接头 而另一端连有普通接头的片段 ; 将连接后的所有样本 片段混合, 并在 Ilumna 测序平台上进行桥式扩增, 只有片段长度小于 1000bp 且两端分别连有 标签 接 头和普通接头的片段才可以进行有效地扩增, 这一步 骤实际上会丢弃掉许多片段, 不过保留下来的片段仍 然足够满足大部分研究的需要 ; 最后对扩增后的片段 进行测序.GBS 相较于其他简化基因组测序技术具有 相对简单的建库步骤, 省去了包括机械随机打断 片 段长度选择 末端修复等步骤, 这很大程度地节约了 hp : jxmu.xmu.edu.cn

5 第1期 边 力等:简化基因组测序技术及其在海洋生物研究中的应用 人力和物力;同时基于低覆盖度的分型测序策略, GBS 可以在一次实 验 中 对 大 量 的 样 本 进 行 同 时 测 序. GBS 技术最适合应用于 有 高 质 量 参 考 基 因 组 的 物 种,即 便 没有参考基因组 也 可 以 通 过 denovo 拼 接,以 拼 接 后 的片段作为 参 考 序 列 来 开 发 标 记. 目 前,GBS 技 术 在 构建遗传图谱 [47] 群体遗传学 [48-49]及适应性进化 [50-52] 方面有着广泛应用. 7 3 简化基因组测序技术在海洋生物 领域的应用 3.1 在海洋生物群体遗传学上的应用 传统的分子标记开 发 方 法 相 对 低 效,最 终 应 用 到 群体遗传研究的标 记 数 量 十 分 有 限,对 群 体 结 构 的 解 释能力也受到限制,而 简 化 基 因 组 测 序 可 以 高 效 地 开 MSG [ ] Ando l f a o 等 53 提出的 MSG 与 GBS 大 体 相 似, 发出成千上万的可 用 标 记,对 群 体 结 构 的 估 测 能 力 也 其实 验 流 程 为:酶 切 打 断 基 因 组 后,连 接 反 应 加 接 头 大大提升. 本 研 究 组 与 美 国 特 拉 华 大 学 Ga f f ney 课 题 (MSG 连接反应中的接 头 均 为 含 有 标 签 的 接 头,因 此连接后酶 切 片 段 的 两 端 均 为 标 签 接 头);随 后 混 皮 克 湾 的 4 个 群 体 96 尾 美 洲 狼 鲈 (Mo one ame cana)进行遗传结构 分 析,开 发 出 579 个 SNPs, 每个个体所覆盖的 位 点 均 不 相 同,因 而 需 要 亲 本 的 基 收集了 17 个 采 样 点 共 计 586 只 美 洲 龙 虾 (Homau s 合所有样品,选择长度,添加测序接头,上机测序. 由于 因组或参考基因组信息,利用 HMM 来 估 测 某 些 个 体 缺失的位点基因型. MSG 的优势在于其建库流程相对 简单,所需的初始样本量可以低至 10ng. MSG 技术现 已应 用 于 遗 传 图 谱 构 建 遗传学 [ 58] 性 状 关 联 分 析 [ 54] 及系统进化研究. [ 59] 群 体 [ 55 57] 组利用 ddrads eq 技 术 对 美 国 东 部 特 拉 华 湾 和 切 萨 [ ] 将 4 个 群 体 分 为 3 个 大 的 类 群(图 1). Bene s an 等 35 ame canu s),利 用 RADs eq 技 术 开 发 了 个 SNPs进行群体 遗 传 分 析,分 析 结 果 首 先 区 分 出 了 南 部类群和北部类群,接着在 2 个类群内部总计发现 11 个 独 立 的 具 遗 传 差 异 的 群 体,后 续 对 经 过 筛 选 的 3000个 SNPs进行验证, 80.8% 的 个 体 可 以 被 准 确 地 K 代表聚类数,即类群数; S a 92 B o_c B o_r Mu _R 分别代表了 4 个群体的名称,依次表示 S a on92, B oadc e ek, B oadk l lr ve,mu de k l lr ve ;在每个 K 的取值下,每个群体的 24 个个体由相应的 24 个柱形色块表示,每种颜色代表 1 个类群,每个柱形色块中不同颜色所占的比例代表了该个体隶属于相应类群的 后验概率,根据各个群体的颜色组成情况判断整体的遗传结构. 图 1 美洲狼鲈的 S uc u e软件分析结果(基于 579 个 SNPs) F.1 S uc u ep og amana l s s e su l f o M. ame cana ( ba s edon579snps) g y h xmu. xmu. edu. cn p: j

6 8 厦门大学学报 ( 自然科学版 ) 2017 年 [49] 划分入其采样地点.Nunez 等利用 GBS 技术对分布 于佛罗里达红树林区域的茉莉鳉鱼 (Poeclalapnna) 进行群体遗传分析, 发现群体间存在虽然小但是 显著的遗传差异, 而在群体内部则存在着较高的遗传 多样性. 利用传统方法开发出的分子标记分析认为大 西洋北部桡足类 (Cenopagesypcus) 不存在明显的 遗传结构, 而 Blanco-Becal 和 Buckln [34] 利用 RADseq 技术检测到群体具有明显的遗传结构.Duuy [60] 等对美国佛罗里达州南部海域不同群体的鹿角珊 瑚 (Acopoacevcons) 进行了 GBS 测序, 结果显 示虽然鹿角珊瑚的种群数量大幅下降, 但各个群体内 的遗传多样性仍然维持在较高水平, 这为保护此种重 要的造礁珊瑚提供了理论依据. 3.2 在海洋生物系统进化研究中的应用 简化基因组测序技术高效开发分子标记的能力 使得科研人员可以从基因组水平来研究不同物种间 的系统进化关系. 位于温带北太平洋的海鲫科 (Emboocdae) 鱼类具有适应辐射的进化方式,Longo 和 Benad [30] 利用 RAD-seq 技术在 22 种海鲫科鱼类中 得到 523 个 RAD 位点, 构建了高质量的系统进化树, 结果显示 : 在中新世中期 (1300 万 ~1800 万年 ) 海鲫 科鱼类分为两支, 一支适应沙底质的环境, 另一支适 应礁石底质的环境 ; 随后在中新世晚期 (800 万 ~ 1500 万年 ) 出现了海藻森林, 适应礁石底质的一支又 进一步分化为适应海藻森林的一支和其他环境的一 [61] 支.Heea 等利用 RAD-seq 技术对生活于深海热 液口的 7 个属的藤壶进行系统进化研究, 结果发现在 历史上这些藤壶曾至少 2 次大面积地生活于热液口 周围, 并证明西太平洋是最初的发源地, 随后开始了 [31] 向东并穿过南半球的扩张.Jones 等利用 RAD-seq 技术对中美洲的 26 种剑尾鱼 (Xphophous) 进行分 析, 得到了高质量的系统进化树, 且科研人员根据数 据预测出了可能出现杂交的种类. 3.3 在海洋生物适应性进化研究中的应用 简化基因组测序技术可以获得成千上万的标记, 通过异常值检验 (oulees) 可以检测出大量受到正 向选择的位点, 因而可以用于适应性进化研究. 为了估 计有机物以及重金属污染对北大西洋鳗鲡的影响, [37] Lapoe 等利用 RAD-seq 技术在北大西洋的欧洲 鳗鲡 (Angulaangula) 和美洲鳗鲡 (A.osaa) 中 开发分子标记, 通过随机森林算法找出可以将鳗鲡划 分为空白对照以及 污染 组的协变位点, 分别在 2 种 鳗鲡中找到了 142 和 141 个协变位点, 将这些位点与 34 种污染物浓度进行关联分析, 结果显示六氯联苯 153(PCB153) 4,4'- 滴滴伊 (4,4'-DDE) 以及硒污染物 与协变位点呈现相关性 ; 同时, 基因富集分析发现固 醇调控对于鳗鲡在污染环境中的生存具有重要意义. [52] Guo 等对分布在波罗的海不同盐度和不同温度的 10 个三刺鱼 (Gaseoseusaculeaus) 群体进行了 GBS 测序, 获得超过 3 万个 SNPs 来进行基因组的遗传变 异分析, 结果发现基因组不同区域的遗传多样性呈现 很大的差别, 并定位出了一些相对狭窄的受到选择的 基因组区域 ; 同时还证实了三刺鱼受到的正向选择与 盐度和温度相关, 并定位出了许多参与适应性进化的 候选基因. 3.4 在海洋生物遗传图谱及 QTL 定位上的应用 相较于传统的利用有限数量的 AFLP 或简单序 列重复 (SSR) 标记构建的遗传图谱, 简化基因组测序 技术拥有强大的开发分子标记的能力, 可以获得分辨 率更高的遗传图谱. 图谱质量的提升也有利于更加准 确地进行 QTL 定位.Evee 和 Seeb [62] 利用 GBS 对 单倍体大鳞大麻哈鱼 (Oncohynchusshawyscha) 开 发 SNP 标记并构建遗传图谱,3534 个 SNPs 构建了 34 个连锁群, 这与单倍体大鳞大麻哈鱼的染色体数量 相同 ; 同时还定位出了 3 个耐热相关的 QTLs 以及 1 [39] 个与体型大小相关的 QTL.Shao 等借助 RAD-seq 技术对牙鲆 (Paalchhysolvaceus) 进行遗传图谱 的构建, 得到的 个 SNPs 定位到 24 个连锁群, 得到了目前分辨率最高的牙鲆遗传图谱 ( 总长为 cM( 遗传距离 ), 位点间平均距离为 0.47 cm); 同时定位出 9 个与抗鳗弧菌病相关的 QTLs, 并 由此继续定位出了 4 个与抗鳗弧菌病相关的基因. [54] You 等基于 MSG 构建了斜带石斑鱼 (Epnephelus coodes) 的遗传图谱, 共计开发出 4608 个 SNPs, 图 谱总长为 cM, 位点间平均距离为 0.34cM, 构 建的雌鱼和雄鱼遗传图谱总长分别为 和 [63] cM.Ao 等利用 RAD-seq 技术建立了大黄鱼 (Lamchhyscocea) 的高密度遗传图谱, 由此开发出 的 个高质量 SNPs 被定位到 24 个连锁群上, 图 谱总长为 cM, 位点间平均距离为 0.54cM, 为 [64] 目前分辨率最高的大黄鱼遗传图谱.Tan 等借助 2b-RAD-seq 技术构建了日本刺参 (Aposchopusjaponcus) 的高密度遗传图谱, 并定位出 1 个位于 5 号 [65] 连锁群上与生长性状相关的 QTL.Ren 等基于 RAD-seq 技术构建了杂色鲍 (Halosdvescolo) 的遗传图谱, 图谱总长为 cM, 位点间平均距 hp : jxmu.xmu.edu.cn

7 第 1 期边力等 : 简化基因组测序技术及其在海洋生物研究中的应用 9 离为 0.59cM, 定位到 15 个与生长性状相关的 QTLs. 4 展望 本文中首先介绍了简化基因组测序技术在开发分子标记方面所具有的优势, 随后简要列举了几种常见的简化基因组测序技术, 最后介绍了其在海洋生物群体遗传学 系统进化学 适应性进化和遗传图谱构建上的应用. 简化基因组测序技术的建库过程仍然不可避免地引入一些数据上的偏差, 因而开发相应的检测和修正偏差的方法十分必要 ; 在进行群体遗传和系统进化研究时, 针对不同物种或不同数据有相应的遗传进化模型, 需开发出适用于各种模型的分析工具 ; 同时需要开发相应工具将基因组量级的数据进行可视化 ; 随着当前转录组测序的大量开展, 可以将简化基因组与转录组测序相结合, 即对 cdna 进行简化基因组测序以辅助转录组的研究. 在海洋生物研究领域, 简化基因组测序技术也具有广阔的前景 : 对于某些珍贵的样品 ( 如深海物种 濒危物种 ), 研究人员可以得到的样品数是有限的, 传统的方法对于分子标记的开发能力在样品有限的情况下无法满足群体遗传和系统进化研究的需要, 因此简化基因组测序技术基于其强大的开发分子标记的能力在该领域会得到越来越多的应用 ; 在水产养殖领域, 随着简化基因组测序技术在构建遗传图谱上的应用, 越来越多与经济相关的 QTL 将被定位, 因此在分子辅助育种上也具有很大的潜力. 总之, 相比于全基因组测序, 成本相对低廉的简化基因组测序技术可以被大部分的实验室所承担, 帮助科研人员从基因组的水平来审视研究对象. 在海洋生物的研究发展中, 简化基因组测序技术将会扮演越来越重要的角色. 参考文献 : [1] BOTSTEIN D,WHITE R L,SKOLNICK M,eal.Consucon of a genec lnkage map n man usng esconfagmenlenghpolymophsms[j].amecan JounalofHumanGenecs,1980,32(3): [2] TAUTZD,RENZ M.Smplesequencesaeubquousepevecomponensofeukayocgenomes[J].Nuclec AcdsReseach,1984,12(10): [3] LANDERES.Thenewgenomcs:globalvewsofbology [J].Scence,1996,274(5287): [4] LUIKART G,ENGLANDPR,TALLMON D,eal.The poweandpomseofpopulaongenomcs:fomgenoȳ pngo genomeypng[j].naue Revews Genecs, 2003,4(12): [5] WANGDG,FANJB,SIAOCJ,eal.Lage-scaledenfcaon,mappng,and genoypng of sngle-nucleode polymophsmsnhehumangenome[j].scence,1998, 280(5366): [6] SANGERF,COULSON A R,BARRELLBG,eal.Clonngnsngle-sandedbaceophageasanadoapd DNAsequencng[J].JounalofMoleculaBology,1980, 143(2): [7] SINGH B,SINGH A.Hgh-houghpuSNPgenoypng [M] Make-asssed plan beedng:pncples and pacces.new Delh:Spnge,2015: [8] GLENN T C.Feld gudeo nexḡeneaon DNA sequences[j].moleculaecologyresouces,2011,11(5): [9] BINLADENJ,GILBERT M TP,BOLLBACKJP,eal. TheuseofcodedPCR pmesenableshgh-houghpu sequencngofmulplehomologamplfcaonpoducsby 454paalelsequencng[J].PLoSOne,2007,2(2):e197. [10] MEYER M,STENZEL U,HOFREITER M.Paalel aggedsequencngonhe454plafom[j].nauepoocols,2008,3(2): [11] HAMADY M,WALKERJJ,HARRISJK,eal.Eocoecngbacodedpmesalow hundedsofsamples obepyosequencedn mulplex[j].naue Mehods, 2008,5(3): [12] NEIMAN M,LUNDINS,SAVOLAINENP,eal.Decodngasubsanalseofsamplesnpaalelby massve sequencng[j].plosone,2011,6(3):e [13] CUTLER DJ,JENSEN JD.Topool,onoopool? [J].Genecs,2010,186(1): [14] HOHENLOHE P A,AMISH SJ,CATCHENJ M,e al.nexḡeneaonradsequencngdenfeshousands ofsnpsfoassessng hybdzaon beween anbow andwesslopecuhoaou[j].moleculaecologyresouces,2011,11(s1): [15] ALTSHULERD,POLLARA VJ,COWLESCR,eal. An SNP map of he human genome geneaed by educedepesenaonshogunsequencng[j].naue, 2000,407(6803): [16] VAN TASSELLCP,SMITH T P,MATUKUMALLI LK,eal.SNPdscoveyandalelefequencyesmaon bydeepsequencngofeducedepesenaonlbaes [J].NaueMehods,2008,5(3): [17] KERSTENS H H,CROOIJMANS R P,VEENENDAAL A,e al.lage scale sngle nucleode polymophsm dscoveynunsequencedgenomesusngsecondgeneaon hp : jxmu.xmu.edu.cn

8 10 厦门大学学报 ( 自然科学版 ) 2017 年 hghhoughpusequencngechnology:appledoukey [J].BMCGenomcs,2009,10(1):479. [18] NIELSEN R,PAULJS,ALBRECHTSEN A,eal.GenoypeandSNPcalngfom nexḡeneaonsequencng daa[j].nauerevewsgenecs,2011,12(6): [19] SANCHEZCC,SMITH TP,WIEDMANN R T,eal. Sngle nucleode polymophsm dscoveyn anbow oubydeepsequencngofaeducedepesenaonlbay[j].bmcgenomcs,2009,10(1):559. [20] ZOU X,SHIC,AUSTIN RS,eal.Genome-wdesngle nucleodepolymophsm andnseon-deleondscovey houghnexḡeneaonsequencngofeducedepesenaonlbaesncommonbean[j].moleculabeedng, 2014,33(4): [21] GUO G,DONDUPD,ZHANG L,eal.Idenfcaonof SNPsnbaley(HodeumvulgaeL.)bydeepsequencngofsxeducedepesenaonlbaes[J].TheCop Jounal,2014,2(6): [22] TANIGUCHIY,MATSUDA H,YAMADA T,eal. Genome-wdeSNPandSTR dscoveynhejapanese cesedbsandgenecdvesyamongfoundesofhe Japanesepopulaon[J].PLoSOne,2013,8(8):e [23] BOVO S,BERTOLINIF,SCHIAVO G,eal.Reduced epesenaonlbaesfom DNA poolsanalysed wh nexgeneaonsemconducobased-sequencngodenfysnpsnexemeanddvegenpgsfobackfa hckness[j].inenaonaljounalofgenomcs,2015, 2015: [24] VAN ORSOUW NJ,HOGERSR C,JANSSEN A,e al.complexy educon of polymophc sequences (CRoPS TM ):anovelappoachfolage-scalepolymophsm dscoveyncomplex genomes[j].plos One, 2007,2(11):e1172. [25] MAMMADOV J A,CHEN W,REN R,e al. DevelopmenofhghlypolymophcSNP makesfom hecomplexyeducedpoonofmaze[zeamaysl.] genomefousen make-asssedbeedng[j].theoecalandappledgenecs,2010,121(3): [26] GOMPERTZ,FORISTER M L,FORDYCEJA,eal. Bayesananalyssofmoleculavaancenpyosequences quanfes populaon genec sucue acoss he genomeoflycaedesbuefles[j].moleculaecology, 2010,19(12): [27] DEBACKER M,BONANTSP,PEDLEY KF,eal.GenecelaonshpsnannenaonalcoleconofPuccna hoana solaes based on newly denfed moleculamakesanddemonsaonofecombnaon [J].Phyopahology,2013,103(11): [28] BAIRD N A,ETTER PD,ATWOOD TS,eal.Rapd SNP dscovey and genec mappng usng sequenced RAD makes[j].plosone,2008,3(10):e3376. [29] DAVEYJW,BLAXTER M L.RADSeq:nexḡeneaon populaon genecs [J].Befngs n Funconal Genomcs,2010,9(5/6): [30] LONGO G,BERNARDIG.Theevoluonayhsoyof heemboocd sufpech adaon based on genomewderad sequencedaa[j].molecula Phylogenecs andevoluon,2015,88: [31] JONESJC,FAN S,FRANCHINIP,eal.TheevoluonayhsoyofXphophousfshandhesexualy seleced swod: a genome-wde appoach usng esconse-assocaeddnasequencng[j].molecula Ecology,2013,22(11): [32] TARIELJ,LONGO G C,BERNARDIG.Tempoand modeofspecaonnholacanhusangelfshesbasedon RADseq makes[j].moleculaphylogenecsandevoluon,2016,98: [33] DEAGLE B E,FAUX C,KAWAGUCHI S,e al. Anaccklpopulaongenomcs:appaenpanmxa, bugenomecomplexyandlagepopulaonszemuddy he wae [J].Molecula Ecology,2015,24 (19): [34] BLANCO-BERCIALL,BUCKLIN A.Newvewofpopulaongenecsofzooplankon:RAD-seqanalysseveals populaonsucueofhenohalancplankonccopepod Cenopages ypcus [J].Molecula Ecology, 2016,25: [35] BENESTAN L,GOSSELIN T,PERRIER C,eal.RAD genoypng eveals fne-scale genec sucung and povdespowefulpopulaonassgnmennawdelydsbuedmanespeces,heamecanlobse(homaus amecanus)[j].molecula Ecology,2015,24 (13): [36] BRIEUC M S,ONO K,DRINAN DP,eal.Inegaon ofandomfoeswhpopulaon-basedouleanalyses povdesnsghonhegenomcbassandevoluonof unmngnchnooksalmon (Oncohynchusshawȳ scha)[j].moleculaecology,2015,24(11): [37] LAPORTE M,PAVEYS,ROUGEUXC,eal.RADsequencngevealswhnḡeneaonpolygencseleconn esponseoanhopogencogancandmealconamnaonnnohalanceels[j].moleculaecology,2016, 25(1): [38] ZHANG N,ZHANGL,TAO Y,eal.Consuconofa hghdensysnplnkagemapofkelp (Sacchanajaponca)bysequencngTaq Ⅰ seassocaeddnaand hp : jxmu.xmu.edu.cn

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