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1 流式细胞术在血液病中的应用进展 (selected topics) 艾迪康医学检验中心夏成青

2 主要内容 骨髓增生异常综合征 急性白血病微小残留检测 混合表型白血病的诊断 TCR Vβ 在 T 细胞肿瘤诊断中的应用 流式细胞免疫分型的局限性 PNH

3 骨髓增生异常综合征 急性白血病微小残留检测 混合表型白血病的诊断 TCR Vβ 在 T 细胞肿瘤诊断中的应用 流式细胞免疫分型的局限性 PNH

4 免疫表型常见异常情况 骨髓增生异常综合征

5 骨髓增生异常综合征 粒系发育异常

6 骨髓增生异常综合征 -- 粒细胞发育异常 (CD11b /CD16 CD11b+/CD16[+] CD11b+/CD16+ CD11b++/CD16++) was observed. Deviation from normal was defined as a difference that amounted to at least a half-log signal intensity in 1 parameter, although it must be recognized that the assessment is always at least partially subjective.

7 骨髓增生异常综合征 -- 粒细胞发育异常 Granulocytes were evaluated for SSC signal, abnormal CD13/CD16,CD56,CD33,CD64. The CD13/CD16 expression pattern was considered abnormal if a deviation of normal granulocytic maturation (CD13+/CD16 CD13[+]/CD16 CD13 /CD16[+] CD13 /CD16+ CD13+/CD16++) was observed (Fig. 1). Also, the CD11b/CD16 expression pattern was considered abnormal if a deviation of normal granulocytic maturation (CD11b /CD16 CD11b+/CD16[+] CD11b+/CD16+ CD11b++/CD16++) was observed. Cancer Volume 116, Issue 19, pages , 1 October 2010

8 骨髓增生异常综合征 单核细胞发育异常 (Left) Monocytes in normal bone marrow (BM) revealed no expression of cluster of differentiation 56 (CD56) (neural cell adhesion molecule). (Right) In myelodysplastic syndrome (MDS), strong CD56 expression was observed Cancer Volume 116, Issue 19, pages , 1 October 2010.

9 骨髓增生异常综合征 红系发育异常

10 骨髓增生异常综合征 红系细胞发育异常 Figure 3. (Left) In normal bone marrow (BM), the majority of erythrocytes had strong expression of cluster of differentiation 71 (CD71) (transferrin receptor 1) with some degree of heterogeneity for dim expression. (Right) In myelodysplastic syndrome (MDS), negative CD71 expression may be present in the majority of erythrocytes. CD235a indicates glycophorin A; PE, phycoerythrin; FITC, fluorescein isothiocyanate.

11 骨髓增生异常综合征 MNDA 表达降低

12 骨髓增生异常综合征 MNDA 表达降低

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14 欧洲推荐 4 色方案 Haematologica August; 94(8):

15 主要内容 骨髓增生异常综合征 急性白血病微小残留检测 混合表型白血病的诊断 TCR Vβ 在 T 细胞肿瘤诊断中的应用 流式细胞免疫分型的局限性 PNH

16 疗效判 MRD 流式细胞检测的检测基础 断 复发监测 肿瘤细胞与正常起源细胞免疫表型不同 跨系表达 抗原表达不同步 抗原表达丢失 抗原表达减弱 抗原表达增强 其它抗原表达 初始免疫分型结果 白血病相关表型特点 抗体组合越多覆盖率越高 敏感性越高 假阳性 假阴性均存在 随访 动态观察更有意义

17 急性髓系白血病

18 MRD 与急性髓系白血病预后

19 多参数 定量分析

20 多参数 定量分析

21 多参数 定量分析 The upper panel (left to right) shows the initial gates based on scatter characteristics and CD19 positive events. The middle panel (left to right) shows normal pattern of CD45 and CD34 and a representative example of BCP-ALL at diagnosis. The lower panel (left to right) shows detectable residual disease at mid (D+21) and end induction time points (D+33)

22 Cytometry Part A Volume 81A, Issue 1, pages 17-24, 3 NOV 2011 DOI: /cyto.a B-ALL

23 B-ALL- 白血病相关表型的发病率多参数 定量分析

24 流式细胞检测 MRD 程序

25 MRD 检测方法选择 有分子标志的首选分子标记物 ( 融合基因等 ) 有白血病相关表型的选 FCM 无初诊资料的可选用 FCM(20 个抗体以上 )

26 骨髓增生异常综合征 急性白血病微小残留检测 混合表型白血病的诊断 TCR Vβ 在 T 细胞肿瘤诊断中的应用 流式细胞免疫分型的局限性 PNH

27 混合表型白血病诊断条件 髓系 : 过氧化物酶阳性 ( 流式细胞 免疫组织化学 细胞化学 ) 或单核细胞分化 (NSE,CD11c,CD68,CD14,CD64,lysozyme 中至少 2 个阳性 ) T 系 : 胞浆 CD3( 流式细胞 CD3 epsilon 链, 免疫组化 CD3 Zeta 链不特异 ) 或表面 CD3( 混合表型白血病表面 CD3 阳性率低 ) B 系 : CD19 强阳性, 且 CD79a 胞浆 CD22 CD10 中至少 1 个强阳性或 CD19 弱阳性, 且 CD79, 胞浆 CD22,CD10 中至少 2 个强阳性

28 骨髓增生异常综合征 急性白血病微小残留检测 混合表型白血病的诊断 TCR Vβ 在 T 细胞肿瘤诊断中的应用 流式细胞免疫分型的局限性 PNH

29 异常 T 细胞的确定 一种或多种全 T 细胞抗原丢失或表达减弱 ; CD4/CD8 表达异常 ( 胸腺除外 ): 限制性表达 CD4 或 CD8;CD4/CD8 双阳性,CD4/CD8 双阴性 ; CD45 表达减弱或缺失 ; 散射光的改变 : FSC 和 / 或 SSC 增大 ; T 细胞受体表达异常 : 表达非 T 细胞相关抗原 :B 细胞相关抗原 (CD20,CD19,CD22 等 ); 髓系相关抗原 (CD13,CD33), 其它如 CD30 CD103 CD117 CD10 等 具前驱 T 细胞表型 (CD1a, CD34 TdT) 上述改变均不具有 100% 的特异性 CD45 表达显著减弱或完全缺失, 完全丢失一种或一种以上的全 T 细胞抗原,CD4 CD8 双阳性或双阴性 ( 胸腺瘤除外 ), 再结合散射光的改变可高度提示 T 细胞恶性肿瘤

30 中华临床医师杂志 2012 年 3 月第 6 期 表 1. 成熟 T 细胞肿瘤与对照组全 T 抗原丢失比较 组别 例数 丢失 1 项 丢失 2 项 丢失 3 项 合计 百分率 肿瘤组对照组 * 8.3 表 2. 成熟 T 细胞肿瘤与对照组全 T 抗原表达强度改变的比较 组别例数 1 项 2 项 3 项 4 项合计百分率 肿瘤组 对照组

31 T 细胞克隆分析 TCR Vβ 受体库检测 背景 : TCR 为所有 T 细胞表面的特征性标志, 外周血中, 约 95% 的 T 细胞 TCR 由 α β 两条肽链组成, 每条肽链又可分为可变区 (V 区 ), 恒定区 (C 区 ), 跨膜区和胞质区等几部分 TCR 分子属于免疫球蛋白超家族, 其抗原特异性存在于 V 区 (Vα Vβ), 决定了 TCR 的抗原结合特异性 TCR Vβ 受体库筛查, 有助于准确识别异常的克隆增殖, 在 T 细胞淋巴瘤诊断和反应性增生鉴别诊断具有重要参考价值 原理 : 正常 T 细胞 TCR Vβ 抗原为多克隆分布 肿瘤细胞表现为单个克隆的优势生长 优点 : 有较高的灵敏度和特异性

32 正常 T 细胞 TCR Vβ 系列抗原表达呈多克隆分布

33 FL2-Height E FL2-Height F FL2-Height G FL2-Height H FL2-Height A FL2-Height B FL2-Height C FL2-Height D FSC-Height CD7 APC 1024 s s Vbeta % % s % 10 4 Vb 5.3 Vb 7.1 SSC-Height 3.17% s % 10 4 Vb 9 Vb Vb 3 Vb % % FL1-Height A6.63% FL1-Height B1.32% s s % 3.37% 10 4 Vb 0.27% 5.2 Vb Vb 23 Vb s CD5 PERCP CY % 3.85% s % % Vb 18 Vb Vb 13.1 Vb % Vb 20 Vb FL1-Height 91.82% C 91.43% FL1-Height D 3.38% 0.26% s % s Vb 11 Vb Vb 0.45% 13.2 Vb 0.04% % 89.05% Vb FL1-Height E Vb % FL1-Height F 3.28% Vb % FL1-Height G 4.48% Vb % 1.21% FL1-Height H TOTAL 62.29

34 T 细胞克隆性增生的判断 CD3+CD5brightCD4+:Total TCRVβ 70.9% --- 呈多克隆分布 CD3+CD5dimCD8+: Total TCRVβ 9.4% --- 间接提示存在其它的 TCR 克隆?? CD3+CD5brightCD8+ :TCRvβ13.1 约占 83.4%, 呈克隆性增殖

35 骨髓增生异常综合征 急性白血病微小残留检测 混合表型白血病的诊断 TCR Vβ 在 T 细胞肿瘤诊断中的应用 流式细胞免疫分型的局限性 PNH

36 M0 M1 M2 CD34,CD33,CD13 MPO,CD34,CD33,CD13, HLA-DR MPO,CD34,CD15,CD13, HLA-DR M3 MPO, CD33,CD13 CD9(HLA-DR CD11b 常阴性 ) M4 M5 M6 M7 急性髓系白血病免疫表型与 FAB 分型相关性 MPO,CD33,CD15,CD14,CD13 CD68,CD33,CD14,CD13,HLA-DR,CD36,CD64 CD33,CD235a,CD71 CD33,CD41,CD42b,CD61 形态与免疫表型的符合性不足 80%, 不能脱离形态学单纯依赖免疫表型进行白血病的诊断与分型 FAB 基于形态, 两者不符以形态为主

37 流式细胞免疫分型的局限性 幼稚细胞数量与涂片不符 ( 幼稚细胞计数以骨髓涂片为准 ) 多发性骨髓瘤浆细胞数量与涂片不符 免疫表型与 FAB 分型不能一一对应 增生性贫血与 M6 的鉴别 骨髓增生异常综合征 (MDS) 多数无特征性改变 骨髓增生性肿瘤 (MPN) 多数无特征性改变 反应性改变

38 幼稚细胞的判断 形态学差异及原因分析 流式细胞幼稚细胞计数与

39 主要内容 骨髓增生异常综合征 急性白血病微小残留检测 混合表型白血病的诊断 TCR Vβ 在 T 细胞肿瘤诊断中的应用 流式细胞免疫分型的局限性 高灵敏检测 PNH 克隆

40

41 PNH 筛查

42 欢迎大家 来实验室参观指导!

12 CD3/CD19 检测试剂盒检测人体生物标本中 CD3,CD19 的表达, 用于白血病和淋巴瘤分析, 淋巴亚群分析 13 CD3/CD56 检测试剂盒检测人体生物标本中 CD3,CD56 的表达, 用于白血病和淋巴瘤分析, 淋巴亚群分析 14 CD3/HLA-DR 检测试剂盒检测人体生物标本中

12 CD3/CD19 检测试剂盒检测人体生物标本中 CD3,CD19 的表达, 用于白血病和淋巴瘤分析, 淋巴亚群分析 13 CD3/CD56 检测试剂盒检测人体生物标本中 CD3,CD56 的表达, 用于白血病和淋巴瘤分析, 淋巴亚群分析 14 CD3/HLA-DR 检测试剂盒检测人体生物标本中 附件 1 流式细胞仪配套用体外诊断试剂分类调整产品清单 序号产品名称预期用途管理类别 1 CD19 检测试剂检测人体骨髓细胞中 CD19 的表达, 用于白血病和淋巴瘤分析 2 CD20 检测试剂检测人体生物标本中 CD20 的表达, 用于白血病和淋巴瘤分析 3 CD22 检测试剂检测人体生物标本中 CD22 的表达, 用于白血病和淋巴瘤分析 4 CD34 检测试剂用于造血干细胞检测和白血病分型 5

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