中国中西医结合杂志年月第卷第期! 4.56 $ :5 4.5$6 3. : 9 * :/ :0 :* 5 : /0. / :/3 3 7 & 3/ ./ 3:.. : 9 :/ :3. 5 : -,./ /3 / :/ 3 9/ 3 # :5 #0 :/ 3 :/ : 7 :

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猎扶
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1 中国中西医结合杂志年月第卷第期! 基础研究蛇床子素对 & 小鼠肾上腺皮质瘤细胞皮质功能的影响潘志强梁龙龙方肇勤刘小美卢文丽张园园摘要目的研究蛇床子素,./0,./ 对肾上腺皮质功能的影响方法以 & 小鼠肾上腺皮质瘤细胞为实验对象以含 1 1 和 1 血清培养液培养细胞分别采用 -,./ 处理 & 细胞 ## 0 以 1 二甲基亚砜 +, 为阴性对照组腺苷酸环化酶激活剂 * 为阳性对照组倒置显微镜下观察细胞形态变化采用法检测细胞分泌液皮质酮含量 2 ( 2 法检测类固醇急性调节蛋白 / 3 胆固醇侧链裂解酶羟化酶羟基类固醇脱氢酶 4.56 羟化酶羟化酶 $ 羟化酶 -$ 碳链裂解酶 $ 及 $ 羟基类固醇脱氢酶 4.5$6 基因表达水平结果 -,./ 组可明显抑制 & 细胞增殖且对含 1 血清培养液中细胞抑制作用更明显与阴性对照组比较阳性对照组 & 细胞 / $ 及 4.5$6 基因表达水平明显增强 7 干预 ## 0 -,./ 组 & 细胞皮质酮水平明显升高 7 与 # 0 比较干预 # 0 后 -,./ 组皮质酮含量明显升高 7 干预 # 0 后 -,./ 组 / 基因表达明显增强 7 干预 # 0 后 / 3 基因表达水平进一步增强 7 但基因表达无明显差异 8 干预 ## 0 后 -,./ 组皮质酮合成酶和性激素合成酶 $ 基因表达明显增强 7,./ 对醛固酮合成酶和性激素合成酶 4.5$6 基因表达水平未见明显作用结论蛇床子素通过增强类固醇激素合成相关酶基因表达参与调节肾上腺皮质功能并以促进皮质酮的合成与分泌作用为主关键词蛇床子素肾上腺皮质 & 小鼠肾上腺皮质瘤细胞羟化酶碳链裂解酶羟基类固醇脱氢酶类固醇急性调节蛋白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基金项目国家自然科学基金资助项目! #$ 上海市进一步加快中医药事业发展三年行动计划 # 年! %& ' 作者单位上海中医药大学基础医学院上海通讯作者潘志强 ($) * +, $- $#

2 中国中西医结合杂志年月第卷第期! 4.56 $ :5 4.5$6 3. : 9 * :/ :0 :* 5 : /0. / *:/3 3 7 & * *3/ *./ 3:.. : 9 * :/ :*3. 5 : -,./ /3 / :/ 3 9/ 3 # :5 #0 :/ 3 :/ : 7 :/ :/. 9 *3/ *./ 3: :* : :5 -,./ /3 / :/ 3. 9/ 3 #0 :/ 3 :/ :. *3 5 /0 #0 :/ 3 : / : 7 9/ 3 #0 :/ 3 :/ : = 3.. :. 9 / 3 : :. 3. : 9 * :/ 3 / 5 : :5 -,./ 3. 7 / 3 : = 3.. :. 9 3/0 3 : 0 :* 5 9/ 3 #0 :/ 3 :/ : 7 4 3,./.0 5 : 99 */ : 8 55 / : : = 3.. :. 9 :5 $ 3. : 9 * :/ :0 :* 5 6 :5 -,./ 9/ 3 /3 / :/ 93 # :5 # 0 7,./.0 5 : */ : :5 4.5$6 = 3.. :. :*. :,./ * 5 3 / 53 : *3/ = 9 :*/ : :5 3 / *3/ *./ 3 :. :/0.. :5. *3 / : /03 0./3 : /0 : : : = 3.. :. 9./ 3 5 : * :. > &,2+./0 53 : *3/ = &. 53 :*3/ * / 3 * $ 4.56 / 3 肾上腺皮质负责合成与分泌类固醇激素其分泌的醛固酮参与机体电解质调节和维持水盐平衡分泌的糖皮质激素参与糖脂肪和蛋白质的生物合成和代谢还具有抑制免疫应答抗炎抗毒抗休克等作用此外也合成少量性激素研究表明肾上腺皮质功能是中医肾虚证的重要功能定位因此以肾上腺皮质细胞为实验对象探索补肾中药对皮质功能的影响有助于阐明补肾治法的部分作用机制近年研究发现部分温肾助阳中药具有类似激素样作用 # 蛇床子具有温肾壮阳祛风燥湿杀虫止痒作用其有效成分为蛇床子素./0,./ 又名甲氧基欧芹酚化学名为 $ 甲氧基异戊烯基香豆素现代药理研究表明,./ 对机体内分泌生殖系统免疫系统心脑血管系统均有不同作用包括抗心律失常抗氧化抗炎镇痛抗过敏抗骨质疏松抗肿瘤雄激素样和促性腺激素样作用等中医学理论认为温肾助阳中药有助于改善肾虚证提示此类中药的药理作用可能涉及对肾上腺皮质功能的调节本研究观察,./ 对 & 细胞小鼠肾上腺皮质瘤细胞相关激素合成酶基因表达的作用及其皮质功能的影响材料与方法细胞株 & 细胞购自中国科学院细胞库药物试剂及仪器,./ 白色粉末纯度 8?1 购自上海市食品药品检验所批号腺苷酸环化酶激活剂 * 二甲基亚砜 +, 均购自 53 *0 公司,./ 采用 +, 溶解胎牛血清青链霉素混合液 +; 培养液均购自 4 *: 公司 3 购自 : /3 : 公司 3 *3 / 2 3 :/ > / & 2 3= = ( 2!. 4. 购自 > 2 公司采用 33 # 在线软件设计引物并委托 9 *0:. 公司合成皮质酮试剂盒购自 : 公司 >'# 型倒置显微镜,. 公司 = 型酶标仪 / < 公司 $ ;./ 2 2./ 实时荧光定量 2 仪公司细胞培养 & 细胞采用含 1 胎牛血清青链霉素混合液的 +; 培养液置于 1, $ 湿饱和的条件下常规培养细胞生长至 1 融合时用含 + 1 胰酶消化后铺板后培养取其对数生长期细胞进行实验 # 细胞分组及干预本研究以 1 +, 为阴性对照组 - * 作为阳性对照组在含 1 的血清培养液条件下采用 -,./ 干预 & 细胞 ## 0 在相应时点收集细胞上清培养液用于检测皮质酮含量收集细胞进行 2! 表达检测观察指标及检测方法不同血清浓度培养条件下各组 & 细胞形态观察由于血清所含物质复杂血清中的激素对细胞生长有重要作用本研究应用常规含 1 血清培养液和 1 低血清培养液两种培养条件分别采用 1 +, -,./ 干预 & 细胞 # 0 在倒置显微镜下观察细胞形态并在倍下拍摄细胞照片皮质酮含量测定采用酶联免疫吸附实验法进行检测按照小鼠皮质酮试剂

3 中国中西医结合杂志年月第卷第期! 盒说明书进行操作流程包括配制皮质酮标准品及稀释不同梯度倍稀释细胞上清培养液样品加入标准品和样品酶标试剂孵育洗涤加入显色底物酶标仪检测 # 读数值进行数据分析实时荧光定量 2 2 ( 2 检测相关基因 2! 表达检测类固醇急性调节蛋白 / 3 胆固醇侧链裂解酶羟化酶羟基类固醇脱氢酶 4.56 羟化酶羟化酶 $ 羟化酶 -$ 碳链裂解酶 $ 及 $ 羟基类固醇脱氢酶 4.5$6 基因表达上下游引物序列采用 33 # 在线软件合成表委托 9 *0:. 公司上海合成部完成按照 3 试剂盒说明书抽提 & 细胞总 2! 逆转录反应体系反应条件为 $ :.# 2 扩增反应体系为反应程序为? :?..# 循环基因相对表达量分析方法采用 / 法分析以 1 +, 为对照组以 */ : 基因 / 均值作为内参 / A / 目的基因 / 内参基因其中 / 值为扩增 : 个循环基因的荧光数值 / A / 实验组 / 对照组目的基因相对表达量 A / 本实验采用孔板各组均复孔并独立重复次统计学方法采用专业软件进行统计分析计量资料以 =. 表示多组间比较采用方差分析 7 为差异有统计学意义结果不同血清浓度培养条件下各组 & 细胞形态比较图对照组 & 细胞呈现扁平贴壁样生长在 1 血清培养液条件下 -,./ 组 & 细胞形态无明显变化 -,./ 组细胞形态呈现轻度皱缩现象在 1 血清培养液条件下 -,./ 组 & 细胞形态亦无明显变化 -,./ 组细胞显著皱缩并出现死亡 -,./ 组细胞大量脱落与死亡提示大于 - 浓度的,./ 在低血清培养液条件下对小鼠肾上腺皮质瘤细胞有明显的抑制生长作用故后续实验,./ 浓度选用 - 各组干预 ## 0 & 细胞皮质酮分泌水平比较表与阴性对照组比较阳性对照组皮质酮水平明显升高 7 且干预 # 0 后皮质酮含量升高较 # 0 时更明显 7 -,./ 组干预 # 0 & 细胞皮质酮水平明显升高 7 -,./ 组干预 # 0 & 细胞皮质酮水平明显升高 7 与干预 # 0 比较 -,./ 组干预 # 0 后皮质酮水平明显升高 7 各组干预 ## 0 & 细胞类固醇激素合成起始环节相关酶基因表达水平比较表与阴性对照组比较阳性对照组 / 3 基因表达水平明显升高 7 且干预 # 0 后 / 3 基因表达明显高于 # 0 7 干预 # 0 后 -,./ 组 / 3 基因表达水平明显升高 7 干预 # 0 后表目的基因引物序列基因 2! 序列号引物序列值产物 6 */ :! B$? 上游下游??! B?$$? 上游下游 #! B? 上游下游 #! B??? 上游下游 $! B$? 上游下游! B??? 上游下游?? 4.56! B? 上游下游?????? 4.5$6! B? 上游下游??? / 3! B# 上游下游????$

4 中国中西医结合杂志年月第卷第期! 图不同血清浓度培养条件下各组 & 细胞干预 # 0 后细胞形态变化和 -,./ 组 / 3 基因表达明显升高 7 7 与阴性对照组比较基因表达阳性对照组明显增强 7 -,./ 组差异无统计学意义 8 与阴性对照组比较干预 # 0 阳性对照组 4.56 基因表达明显升高 7 -,./ 组 4.56 基因表达明显升高 7 7 干预 # 0 后各组上调 4.56 基因表达的幅度下降且阳性对照组与 -,./ 组较 # 0 时表达明显下降 7 表各组干预 ## 0 & 细胞皮质酮分泌水平比较 - =. 组别 : 阴性对照 # $# 阳性对照 # $? $ -,./ # #$? $# # -,./ # #? $? -,./ # $# # # ## 注与阴性对照组比较 7 7 与本组干预 # 0 比较 7 表同 # 各组 & 细胞干预 ## 0 皮质酮合成酶基因表达水平比较表 # 与阴性对照组比较阳性对照组皮质酮合成关键酶基因表达明显升高 7 用药 # # 0 后 -,./ 组基因表达亦明显升高 7,./ 干预 ## 0 后基因呈现不同特征与阴性对照组比较阳性对照组基因表达明显升高 7 -,./ 组干预 # 0 后可上调基因表达 7 并呈现量效关系与用药 # 0 比较干预 # 0 后各组基因表达均受抑制 7 7 各组 & 细胞干预 ## 0 醛固酮合成酶基因表达水平比较表 * 和,./ 对醛固酮合成关键酶基因表达均无明显作用且发现基因在 & 细胞中表达量极低各组 & 细胞干预 ## 0 性激素合成酶基因表达水平比较表与阴性对照组比较给药干预 ## 0 后 * 均促进 $ 基因组别 : 表各组干预 ## 0 & 细胞类固醇激素合成起始环节相关酶基因表达水平比较 =. / 阴性对照 # #? 阳性对照 #?#? #? # $? -,./ # $ $ $ # $? # # -,./ # #? #? $ # # # -,./ #? # $ #? $ 组别 : 表 # 各组干预 ## 0 & 细胞皮质酮合成酶基因表达水平比较 =. 阴性对照 #??? # 阳性对照 #? # # # $ -,./ # #$ #$ $? # -,./ # # # #?? -,./ #??? $ $? 注与阴性对照组比较 7 7 与干预 # 0 比较 7 7

5 中国中西医结合杂志年月第卷第期! 表各组干预 ## 0 & 细胞醛固酮合成关键酶基因表达水平比较 =. 组别阴性对照阳性对照 #? ## -,./ # -,./? # $ -,./?? 表达 7 和 -,./ 组干预 ## 0 后均可上调 $ 基因表达水平 7 与阴性对照组比较阳性对照组可诱导 4.5$6 基因表达 7 不同浓度,./ 组 4.5$6 基因表达水平比较差异无统计学意义 8 讨论肾上腺皮质功能被认为与中医证候有关尤其是虚证往往表现出肾上腺皮质功能不同程度的衰退 $ 温肾助阳类中药有助于改善肾阳虚为主的证候本研究主要观察蛇床子主要组分,./ 对小鼠肾上腺皮质功能作用的影响在细胞株选择方面常用的肾上腺皮质细胞包括人肾上腺皮质癌细胞系!4?2 4 等小鼠肾上腺皮质瘤细胞 & 及大鼠牛等原代细胞由于本课题组长期以来开展了大量的小鼠证候实验研究? 因此采用 & 小鼠肾上腺皮质瘤细胞为实验对象 & 细胞的生物学特性具备分泌皮质激素的能力尤其对腺苷酸环化酶激活剂应答力强并可促进皮质激素的合成与分泌本研究采用了 * 作为 & 细胞诱导激素分泌的阳性对照剂结果显示 * 可明显促进 & 细胞皮质酮与性激素合成酶相关基因表达并诱导皮质酮分泌结果也发现醛固酮合成酶基因表达量在 & 细胞极低不能被 * 诱导表达提示 & 细胞失去合成与分泌醛固酮的生物学特性此外有报道显示 & 细胞对促肾上腺皮质激素 4 的应答力弱本课题组前期研究发现 & 细胞对 4 急性应答弱但对 4 慢性应答依然存在本研究首先观察了,./ 对 & 细胞增殖的影响 -,./ 对含 1 血清培养液的 & 细胞增殖作用不明显通过剥夺血清后浓度大于 -,./ 对 & 细胞的生长具有显著抑制甚至毒性作用提示血清所含某种物质可减弱,./ 对 & 细胞增殖的抑制效应或,./ 对极低血清培养环境下的 & 细胞敏感性增强在此基础上进一步从肾上腺皮质细胞个功能水平观察和 -,./ 对 & 细胞类固醇激素合成酶基因表达的作用并观察了两个时间窗口的药物作用效应结果发现,./ 可促进 / 3 基因表达且呈现时效与量效关系提示,./ 可促进胞浆内胆固醇向线粒体转运从而有利于提供 & 细胞类固醇激素合成的原料但,./ 对表达无明显作用由于属类固醇激素合成限速酶提示,./ 不能加速启动胆固醇侧链的裂解此外不同浓度,./ 干预 # 0 后可增强和 4.56 基因表达从而有助于类固醇激素合成但随用药时间延长至 # 0 该作用逐渐减弱进一步研究发现皮质酮合成关键酶表达可被,./ 诱导并具有量效作用进而检测细胞分泌液中皮质酮含量发现,./ 能促进皮质酮的合成与分泌并与,./ 剂量和作用时间有关然而醛固酮合成酶转录的起始模板量极低既不能通过腺苷酸环化酶激活剂诱导表达也不能被,./ 所增强表达因此未检测细胞分泌液的醛固酮水平有文献报道 & 细胞醛固酮合成与分泌较少即使血管紧张素也不能刺激 & 细胞类固醇合成另外在性激素合成方面发现,./ 干预 ## 0 后均可促进 $ 基因表达但对 4.5$6 基因表达无作用有文献报道 $4 +. 酶个亚型其中人 4.5$6 唯一表达于睾丸细胞此外文献报道 & 细胞性激素合成量极少因此本研究未深入检测细胞所分泌的性激素水平在后续研究中本组别表各组干预 ## 0 & 细胞性激素合成酶基因表达水平比较 =. $ 4.5$6 阴性对照 $??? 阳性对照 $ $ # $# -,./ # # $ # # -,./? -,./ $? #? # $? 注与阴性对照组比较 7 7

6 中国中西医结合杂志年月第卷第期! 课题组将采用小鼠睾丸间质细胞为对象探索,./ 对睾酮合成与分泌的可能作用综上,./ 作用于 & 细胞后可能通过激活 / 3 的表达增强线粒体膜对胆固醇的转运能力最后通过促进皮质酮合成酶的表达以增加皮质酮的合成量且对性激素合成酶有明显促进作用但对醛固酮合成酶无作用推测,./ 对 & 细胞皮质功能的作用类似于 * 药效可能通过增加激活环磷酸腺苷 * 途径 # 进而激活腺苷酸环化酶以提高细胞内 * 含量实现促进皮质酮的合成与分泌参考文献 / : 3. 3*0./ 3 5 :.. /0. 9 /0 53 : :5*3 : $ # 4 // : 5!,, / * / :5 *03: * 3 / : 9 5./ 3: 35 */ : :5*3 : 沈自尹肾阳虚证的定位研究中国中西医结合杂志??$$ # 闫朋宣杜宝俊罗然中药类激素样作用研究进展中华中医药杂志 #? # 汪文来于智敏鞠大宏等蛇床子化学及药理研究进展中国中医基础医学杂志 $ $# $ < > *0 // : + : / : = 3.. : 5 /. : 3 / ( :/ / / 2 :5 /0 + / + / /05 /0 5. # # # $ 沈自尹衰老生理性肾虚证的 4 轴分子网络调控研究中国中西医结合杂志 ##? # # 潘志强方肇勤肾上腺皮质细胞模型研究进展中华内分泌代谢杂志? $ $#? 方肇勤潘志强卢文丽等同病异证和异病同证的物质基础肿瘤高血压糖尿病大鼠 - 小鼠神经内分泌组织一些重要激素的转录特征上海中医药大学学报 # $ 潘志强方肇勤卢文丽等不同程度邪毒证 4 肝癌小鼠血液激素含量动态变化分析中国中西医结合杂志 2 : : 3 > * :*3/ * * :. :5*3 : # 3 * * *0./3 : :./ 3 5 :.. :5 / :5*3 2 3 :53 :. :/0.. : 53 : 3*0 2 :5*3 / ? $ # 张志文激素第二信使 * 的发现生物学通报 #$? 收稿修回中国中西医结合杂志获 # 年百种杰出学术期刊荣誉称号中国科技信息研究所简称中信所年月日公布了最新的中国科技论文统计结果中国中西医结合杂志再次获得 # 年百种杰出学术期刊荣誉称号自年中信所评选此荣誉称号以来共计十三次评选中我刊第十二次获得此荣誉称号同时我刊继续获评为中国科技核心期刊并有篇文章入选中国精品科技期刊顶尖学术论文 ;

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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中国中西医结合杂志 年 月第 卷第 期! 4.56 $ :5 4.5$6 3. : 9 * :/ :0 :* 5 : /0. / *:/3 3 7 & * *3/ *./ 3:.. : 9 * :/ :*3. 5 : -,./ /3 / :/ 3 9/ 3 # :5 #0 :/ 3 :/ : 7 :

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