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舞梁
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1 248 中国人兽共患病学报 ChJZ 2018,34 3) DOI: /j 论著 RTGLAMP 与 LAMP 法检测结核分枝杆菌的效果比较吴丹丹 1, 李保胜 2, 亢继文 2, 孙殿兴 2 摘要 : 目的比较 RTGLAMP LAMP LGJ 法检测 MTB 的效果, 为结核病的快速诊断提供依据. 方法用常见的非结核分枝杆菌与其他常见的呼吸道感染病菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌肺炎克雷伯杆菌 ) 检测特异性, 并用酶切实验对结核分枝杆菌特异性产物进行酶切鉴定 ; 用 RTGLAMP LAMP LGJ 法检测 100 名结核病患者和 22 名来自无结核病患者痰标本中的结核分枝杆菌测试灵敏性 ; 对浓度为 1g/ μ L H37Rv 标准株进行对倍比稀释用于 RTGLAMP 极限检测实验. 结果 RTGLAMP LAMP LGJ 方法的阳性率分别为 100%,92% 和 88%;RTGLAMP 和 LGJ,RTGLAMP 和 LAMP 差异均有统计学意义 ;RTGLAMP 的灵敏度比 LAMP 高 10 倍 ;RTGLAMP 不仅可以识别活菌, 并且能够重复检测 MTB 的单一拷贝. 结论 RTG LAMP 检测效果优于 LAMP 及 LGJ, 适于基层医院结核病诊断的推广和应用. 关键词 : 结核分枝杆菌 ; 逆转录 - 环介导等温扩增 RTGLAMP); 环介导等温技术 LAMP);16SRNA 中图分类号 :R 文献标识码 :A 文章编号 : ) CmphRTGLAMPdLAMPmhdd Mybmb WU DGd 1,LIBGhg 2,KANGJGw 2,SUN DGxg 2 1.ChgdMdUvy,Chgd067000,Ch; 2.LvdIDDpm,BhIPHpPLA, Shjzhg050082,Ch) Ab:WmpdhRTGLAMP,LAMPdLGJdg MTBpvdhpddgmhdG b.ihy,ntmdhmmpybwddpy,mybmbg ppdwddbyzymdg.tdvy,wdrtglamp,lampdlg Jd100pmpmmpwhbd22pmpm,h10m d1g/ μ L H37RvddwddRTGLAMPm.Thhwdhhpv RTGLAMP,LAMPdLGJw100%,92%,88%.RTGLAMPdLGJ,RTGLAMPdLAMP wygg,rtglamphd10mhghvyhlamp,rtglampydyvbbpbdg ggpymtb.srtglampplampdlgjdppmymdg pphby. Kywd:Mybmb;vppGmddhmmp RTGLAMP);p mddhmmp LAMP);16SRNA SppdbyhSRhdMdSdPbHhPLA N.CBJ14C010) Cpdgh:SDGxg,Em:dxg@hm.m 全军医药卫生科研基金项目 N.CBJ14C010) 通讯作者 : 孙殿兴,Em:dxg@hm.m 作者单位 :1. 承德医学院, 承德 ; 2. 中国人民解放军白求恩国际和平医院肝病传染科, 石家庄结核病是由结核分枝杆菌 MybmG b,mt 引起的严重影响人类健康的慢性传染病, 是至今仍然困扰人类的古老疾病之一, 在古埃及木乃伊就曾发现结核分枝杆菌的存在. 据全球 [1] 结核报告 :2016 年新发结核病 1040 万, 随着耐药

2 3 期吴丹丹等 :RTGLAMP 与 LAMP 法检测结核分枝杆菌的效果比较 249 与多重耐药菌株的出现, 结核病的控制难度不断增 [2G4] 加, 而建立快速灵敏度高特异性强的诊断方法 [5] 对结核病的防治工作具有重要意义, 也是进行早 [6G7] 期隔离诊治的前提. 目前结核病的诊断方法主要是痰涂片抗酸染色法罗氏固体培养法 LGJmG dm,lgj) 液体快速培养法核酸扩增等方法, 染色涂片虽然简单易行, 但敏感性差, 检出率 [8] 低, 并且不能鉴别死菌活菌, 亦不能分辨 MTB 与非结核分枝杆菌 NGb myb, NTM); 罗氏固体培养法培养周期长, 需要 4~8 [9] 周, 改进后液体快速培养系统将时间缩短到 10d [9G10] 左右, 但花费昂贵且容易受到污染, 只能检出活 [11] 力旺盛的菌, 并且培养法不能鉴别结核分枝杆菌 [12G13] 与非结核分枝杆菌 ; 以扩增核酸为基础的实验技术, 具有快速灵敏特异强等特点, 比如 PCR 环介导等温扩增技术 pgmddhmmg [14] p,lamp) 等, 但因 PCR 技术对操作人员技能有较高要求, 需要的热循环设备价格昂贵而很难得到推广.LAMP 克服了上述缺点, 具有反应快速操作简单的优势, 一台水浴锅等恒温设备在 50m 左右即可完成操作, 扩增结果可用肉眼判定, 简单培训即可完成操作, 适合在基层医疗机构的 [15G16] 应用.2016 年 8 月 WHO 推荐发展中国家的基础医疗单位使用新的检测方法 TBGLAMP, 这种 [17] 方法可以替代痰涂片方法. 但 PCR LAMP 等分子生物学检测法是针对结核杆菌 DNA 基因为靶序列设计的引物并进行扩增的, 对死菌或活菌都呈现阳性结果, 无法在临床上评估抗结核治疗效果, 也无法进行药敏实验, 且 DNA 双链结构, 稳定, 不易降解, 易污染. 结核杆菌 16SRNA 为单链结构, 脆弱易降解, 半衰期短, 不易污染, 仅存在于代谢增殖的活菌中, 占总 RNA 的 80%, 与 16SDNA 的单一拷贝相比较, 而 16SRNA 在一个结核分枝杆菌里可达数万个, 故选择合并反转录功能的逆转录 G 环介导等温扩增技术 vpglamp,rtg LAMP) 不仅有助于判定活菌, 而且可以进一步提高 [18G20] 灵敏性.RTGLAMP 和 LAMP 技术相似, 只是扩增体系中模板为 RNA 且多加入了逆转录酶和 RNA 酶抑制剂. 本研究以结核分枝杆菌 16S RNA 基因设计特异性引物, 用同一引物对结核杆菌的 16SRNA 使用 RNAGLAMP 法检测与传统的 DNAGLAMP 法进行检测, 以 LGJ 法做对比, 比较其灵敏度与特异性. 1 材料与方法 1.1 样本来源收集中国人民解放军白求恩国际和平医院感染科 2015 年 11 月年 12 月确诊肺结核的就诊者痰液 100 例, 其中男性 62 例, 女性 38 例, 年龄在 15~80 岁, 从我院呼吸科收集排除结核菌感染的其他细菌感染的对照组痰液样本 22 例, 其中有 3 份经痰培养确定为金黄色葡萄菌肺炎铜绿假单胞菌肺炎肺炎克雷伯肺炎患者痰标本, 所有患者签署知情同意书. 1.2 菌株与试剂结核杆菌标准株 H37Rv, 非结核分枝杆菌 : 胞内分枝杆菌海分枝杆菌堪萨斯分枝杆菌鸟结核分歧杆菌浅黄分枝杆菌耻垢分枝杆菌偶发分枝杆菌龟分枝杆菌由本实验室保存. 改良罗氏培养基由本实验室自己配制, 细菌 DNA 提取试剂盒购自上海生工,RNA 提取试剂盒 RNy MK) 购自 QIAGEN 痰标本处理取痰标本, 加入痰液 2 倍体积的 RNA 保护剂, 用 2 倍体积 2% NG 乙酰 GLG 半胱氨 [21] 酸 NALC)GNOH 溶液进行消化, 旋紧盖子, 在涡旋振荡器上涡旋震荡 2 m, 直至痰标本充分液化, 取 0.1 ml 痰标本接种于改良酸性罗氏培养基中, 余痰用于提取 RNA 与 DNA 储存于 -80 冰箱, 同一患者的标本取相同体积的痰液, 分别按照 DNA 与 RNA 提取试剂盒提取,RNA 提取时根据试剂盒提示加入 DNI 进行处理 RTGLAMP 引物设计从 NCBI 数据库下载非结核杆菌 16SRNA 全序列, 用 COmg 工具将结核杆菌标准株 GBk 号 :NR_ ) 与各种非结核杆菌进行序列对比, 非结核杆菌包括 : 胞内分枝杆菌 M. NR_ ) 海分支杆菌 M.mm NR_ ) 堪萨斯分枝杆菌 M.k NR_ ) 鸟结核分枝杆菌 M.vm NR_ ) 浅黄分枝杆菌 M.v NR_ ) 耻垢分枝杆菌 M. gm NR_ ) 偶发分枝杆菌 M.G m X ) 龟分枝杆菌 M.h A ). 发现两个高变区 bp 处和 bp 处, 从而确定特异引物的设计区段. 然后用引物设计软件 PmExpV5, 针对该区段设计多套特异引物, 比较每套引物的 3 端位点的特异性并使用 BLAST 工具进一步验证其特异性, 最后选出最佳引物. 本实验选用 1-210bp 区段设计特异引物如图 1, 引物序列如表 1, 所有引物由上海生工公司合成. 表 1 中 3 和 B3 为 RTGLAMP 外引物,IP 和 BIP 为 RTGLAMP 内引物, 其中内

250 中国人兽共患病学报 2018,343) 引物由两段相邻的正反序列组成.IP 由 11 的互补区段 ) 和 2 组成,BIP 由 B1B1 的互补区段 ) 和 B2 组成. 图 1 RTGLAMP 引物的相对位置和特异识别位点 g.1 RvpdpgRTGLAMP 表 1 以 16SRNA 为靶序列的 RTGLAMP 引物 Tb.

3 250 中国人兽共患病学报 2018,343) 引物由两段相邻的正反序列组成.IP 由 11 的互补区段 ) 和 2 组成,BIP 由 B1B1 的互补区段 ) 和 B2 组成. 图 1 RTGLAMP 引物的相对位置和特异识别位点 g.1 RvpdpgRTGLAMP 表 1 以 16SRNA 为靶序列的 RTGLAMP 引物 Tb.1 RTGLAMPpmgg16SRNA Nm Sq5 G3 ) Lgh/bp 3 TCCTGGCTCAGGACGAAC 18 B3 CGCTTTCCACCACAAGACAT 20 IP1+ 2) BIPB1+ B2) TCGCCACTCGAGTATCTCG CGAAGGCGGCGTGCTTAACAG CAT AGTAACACGTGGGTGATCTG GCCGATCCCGTGGTCCTATCG CG RTGLAMP 反应体系 25μL 体系包括 :1.6 μm/l 内引物 IP 和 BIP),0.2μm/L 外引物 3 和 B3),0.8 m/l 甜菜碱 Sgm,USA),8 mm/l MgSO4,1.4 mm/l dntp,8 U B DNA 聚合酶 Nw Egd BLb,Ipwh, MA,USA) 20U 重组核糖核酸酶抑制剂 IvG g) 100U MGMLV 反转录酶 Vzym) 2.5μL 10 b,1 μl 模板 RNA 或 DNA, 最后加入 1μL 钙黄绿素和 MC2 混合液浓度分别 0.05 mm/l 和 0.6mm/L), 用去离子水补足 25μL. 同时用未加入模板的体系作为阴性对照. 将反应管置于 60 恒温水浴箱内反应 50 m, 然后常温下或冰盒中终止反应. 扩增完成后, 体系变绿色是为阳性, 保持淡橙色是为阴性, 同时对比了 RTGLAMP 和 LAMP 反应体系的温度与时间, 并进行了优化, 将扩增产物 5μL 在凝胶中电泳约 25 m 以验证结果 RTGLAMP 的灵敏度将结核分枝杆菌菌液 10 倍梯度稀释, 取各稀释度菌液 2 ml 分别提取 RNA 与 DNA, 然后进行 RTGLAMP 与 LAMP 检测, 测试两种方法灵敏度, 重复 3 次以上实验, 以凝胶电泳和钙黄绿素染色进行结果判定 RTGLAMP 的特异性以结核杆菌标准株 H37Rv 作为阳性对照, 其他肺部细菌感染者及常见的非结核杆菌及作为阴性对照, 用 RTGLAMP 方法, 电泳观察扩增结果并进行特异性比较 RTGLAMP 的检测极限使用核酸蛋白分析仪 Eppd,Gmy) 对纯化的结核杆菌标准株 RNA 进行多次测量, 取平均值作为真实 RNA 含量值, 并用去离子水调至 1g/ μ L 作为 RTGLAMP 实验的模板. 用去离子水对模板进行倍比稀释, 根据公式 : Yp/ μ L)= X g/ μ L)RNA 目的基因长度碱基数 ) 340 其中 340 为一个 RNA 分子量, 目的基因为长度为 16SRNA 全长 1537kb,16SRNA 占总 RNA 的 80%, 经计算得 1g 约等于 10 18, 即 1g 约相当于 10 9 pyrna,1g 约相当于 1pyRNA. 用 RTG LAMP 法进行扩增, 根据结果评价 RTGLAMP 的检测极限 RTGLAMP 和 LAMP 产物酶切鉴定反应结束后, 采用限制性内切酶 XhI 进行酶切鉴定,

L６:Ng v 测结果比较用卡方检验, P ００５认为两者有统计２结果１ RTLAMP 与 LAMP 反应条件的优化 RT LAMP 由于新加入反转录酶,反应时间约５０ m, 对比不同反应温度５６５８６０６３６５ )对酶的影响,如图２ A)所示,当温度为６０时, RTLAMP 特异性条带非常清晰,温度过

4 ３期吴丹丹等: RTLAMP 与 LAMP 法检测结核分枝杆菌的效果比较２５１３０μL 酶切体系如下: RTLAMP 产物或 LAMP 产物３μL Q CUT １０ b ３μL XhI１μL 去离子水补足２３ μl,３７ C 作用１ h. 酶切产物用２０琼脂糖凝胶进行电泳. ８统计分析用本研究的 RTLAMP 法和 LAMP 法对采集的临床样本进行扩增,统计分析软２５０bpDNA mk ; １５: ５ m １５ m ３０ m ４０ m 件为 SPSS２０. 统计结果用灵敏度特异度. 检５０m ; ６学差异. L６:Ng v 测结果比较用卡方检验, P ００５认为两者有统计２结果１ RTLAMP 与 LAMP 反应条件的优化 RT LAMP 由于新加入反转录酶,反应时间约５０ m, 对比不同反应温度５６５８６０６３６５ )对酶的影响,如图２ A)所示,当温度为６０时, RTLAMP 特异性条带非常清晰,温度过高可使反转录酶活性降低,反应结果不理想, LAMP 反应 B [ ] DNA 聚合酶的最适温度一般６３ ~６５２２２３,如图２６０ ~６５均有反应,当温度为６０, B ２５０bpDNA m k L １５:５,１５,３０,４０d５０m 图３不同时间的 RT LAMP A)与 LAMP 电泳图３ Amp g m A)RT LAMPd LAMP ０１０７菌/mL,再进行１０倍梯度稀释后分别提取 RNA 与 DNA,进行 RTLAMP 与 LAMP 检测,显示 RTLAMP 检测该菌的灵敏度为０１００菌/ ml图４A),而 LAMP 方法检测该菌的灵敏度为１０１０１菌/mL 图４,反应 RTLAMP 比 LAMP 法的灵敏性高约１０倍. DNA 聚合酶和反转录酶都具有较高的活性,故本 RTLAMP 实验选取６０为最适温度.同样的,在我们对比不同反应时间５ m １５ m ３０ m ４０ m ５０ m )对 RTLAMP 及 LAMP 反应的影响, RTLAMP 与 LAMP 选取反应温度６０与６５, 从图３ A)中可以看出 RTLAMP 反应１５m 就可以观察到扩增条带,反应３０ m 和５０ m 时都可以得到很清晰明亮的特异性条带,图３ LAMP 反应３０ m 才可以看到扩增条带, ５０ m 可看到明亮的条带,本实验反应时间确定为５０ m 使扩增反应更加彻底. A) RTLAMP 凝胶电泳及钙黄绿素染色图; LAMP 凝胶电泳及钙黄绿素染色图. ２５０bpDNA mk ; １９: ０１０７０１０６０１０５０１０４０１０３０１０２０１０１０１０００１０１菌/mL; １０ A)E ph dc gp RTLAMP E ph dc gp LAMP; ２５０bpDNA mk ; １９: ０１０７, ０１０６, ０１０５, ０１０４, ０１０３, ０１０２, ０１０１, ０１００, ０１０１ b m/m, １０ g v. 图４ RT LAMP 和 LAMP 的灵敏度实验４ S v RT LAMPdLAMP y y ２５０bpDNA mk ; １４: ５６５８６０６３６３ ; ６２５０bpDNA m k L １５:５６,５８,６０, ６３ d６５ L６:g v 图２不同温度的 RT LAMP A)与 LAMP 电泳图２ Th ph d mp m ) ) A R T L AM P d B L AM P p ２ RTLAMP 与 LAMP 的敏感度经载玻片直接显微镜计数法,选取原始结核分枝杆菌菌液浓度３ RTLAMP 特异性如图５所示, RTLAMP 能特异性地扩增出结核分枝杆菌,而其他其细菌及非结核分支杆菌均未扩增出特异性条带,说明 RT LAMP 引物特异性强. ４ RTLAMP 的检测极限通过对倍比稀释１ g/μl H３７Rv 标准株进行 RTLAMP,重复３次后,结果 RTLAMP 检测极限均可达到１g 约１ py,说明了 RTLAMP 灵敏度极高,只要有结核菌的存在就可以被检出图６).

２５２２０１８, ３４３) 中国人兽共患病学报 AB: RTLAMP 凝胶电泳及钙黄绿素染色图２５０bp DNA mk ; A: １４:肺结核金黄色葡萄菌肺炎铜绿假单胞菌肺炎 A) RTLAMP 酶切实验,２５０bpDNA m k LAMP 酶分枝杆菌海分枝杆菌堪萨斯分枝杆菌鸟结核分枝杆菌浅黄

AB: E ph dc gp RTLAMP; ２５０bpDNA mk ;A: １４: p m mp b 切实验,１００bpDNA m k ; １２酶切前后 bpdna m k L１,b hd L２,RLP g p 图７酶切产物分析 S phy pm, P dm g ７ R z ymd g y b H３７Rv,M,M m m,m k, 痰标本检测结果如图８所示, RTLAMP

说明 RTLAMP 较 LAMP 敏感性强, 比较敏感性如图８),以罗氏培养法为金标准,用, K b pm pm B:１９: M pm M v m,m v,m gm,m m,m h 图５ RT LAMP 的特异性实验５ Sp RT LAMP y y 果中对培养法与 LAMP 法检测不到的结核菌仍能 RTLAMP 与 LAMP 对

RTLAMP 与 LAMP 差异在统计学上有统计学意义意义 P ００５,表２), RTLAMP 阳性率高于 LAMP.

5 ２５２２０１８, ３４３) 中国人兽共患病学报 AB: RTLAMP 凝胶电泳及钙黄绿素染色图２５０bp DNA mk ; A: １４:肺结核金黄色葡萄菌肺炎铜绿假单胞菌肺炎 A) RTLAMP 酶切实验,２５０bpDNA m k LAMP 酶分枝杆菌海分枝杆菌堪萨斯分枝杆菌鸟结核分枝杆菌浅黄 A)RTLAMP ２５０bpDNA m k LAMP １００肺炎克雷伯肺炎患者痰标本;B:１９:结核杆菌 H３７Rv 胞内分枝杆菌耻垢分枝杆菌偶发分枝杆菌龟分枝杆菌. AB: E ph dc gp RTLAMP; ２５０bpDNA mk ;A: １４: p m mp b 切实验,１００bpDNA m k ; １２酶切前后 bpdna m k L１,b hd L２,RLP g p 图７酶切产物分析 S phy pm, P dm g ７ R z ymd g y b H３７Rv,M,M m m,m k, 痰标本检测结果如图８所示, RTLAMP 的扩增结检测阳性. 说明 RTLAMP 较 LAMP 敏感性强, 比较敏感性如图８),以罗氏培养法为金标准,用, K b pm pm B:１９: M pm M v m,m v,m gm,m m,m h 图５ RT LAMP 的特异性实验５ Sp RT LAMP y y 果中对培养法与 LAMP 法检测不到的结核菌仍能 RTLAMP 与 LAMP 对１２２例痰标本进行检测, ３种方法阳性率 RTLAMP 法１００ LAMP 法９２ L J法８８, RTLAMP 与 L J 差异有统计学意义 P ００１,表２), LAMP 和 L J但差异无统计学意义 P ００５,表２).RTLAMP 与 LAMP 差异在统计学上有统计学意义意义 P ００５,表２), RTLAMP 阳性率高于 LAMP. RTLAMP 凝胶电泳及钙黄绿素染色图; ２５０bpDNA mk ; １１０:０１g １０pg １pg １００１０１１００g １０g g g g １g ０１g/μL; １１:阴性对照 E ph d C gp RTLAMP ２５０bpDNA mk, １１０:０１g, １０pg, １pg, １００１０ g, g, １１００g, １０g, １g, ０１g/μL, １１:g v g, 图６ RT LAMP 检测极限实验６ RT LAMPd m y ５ RTLAMP 与 LAMP 产物酶切鉴定为验证 RTLAMP 与 LAMP 扩增产物为结核分枝杆菌特异性产物,用同一引物扩增 RTLAMP 与 LAMP 目的基因扩增产物均为１９２kb 片段,经 XhI酶切 A)RTLAMP 凝胶电泳及钙黄绿素染色图; LAMP 凝胶电泳及钙黄绿素染色图. ２５０bpDNA m k ; １４:肺结核患者痰标本; ５ A)E ph dc gp RTLAMP E ph dc gp LAMP; ２５０bpDNA mk ; １４ : Sp m mp m p w h 成大小约８０kb 片段,如图７所示出现与预期大小 b ; ５ g v LAMP 产物量巨大,在相同反应的时间内,部分片段未能完全酶切有关. ８ T mp RT LAMP y 相符的条带.RTLAMP 出现２条条带可能与 RT ６临床样本检测 RTLAMP 与 LAMP 对同一图８ RT LAMP 和 LAMP 的临床样本的检测 dlamp

6 3 期吴丹丹等 :RTGLAMP 与 LAMP 法检测结核分枝杆菌的效果比较 253 表 2 临床样本的检测结果 Tb.2 Tmp D MTB NGMb P LGJ RTGLAMP <0.01 b LAMP > <0.05 d MTB 患者,=100;NGMb 患者,=22; b RTGLAMP 与 LGJ 相比的灵敏度 ; LAMP 与 LGJ 相比的灵敏度 ; d RTGLAMP 与 LAMP 相比的灵敏度 MTBp,=100;NGMbp,=22; b ThvG yrtglampmpdlgj; ThvyLAMPmG pdlgj; d ThvyRTGLAMPmpdLAMP. 3 讨论目前, 结核病发病人数仍然居高不下,WHO 制定结核防治目标是到 2025 年, 要使全球结核病的发病率呈每年 10% 的速率下降, 到 2035 年, 全球要终止结核病的流行, 要达到这一目标, 优化现有的结核 [1] 病诊断技术至关重要, 而目前作为金标准的培养法尽管能鉴别结核分枝杆菌活菌与死菌, 但是培养周期长, 且不能分辨 MTB 与 NTM, 近年来, NTM 的感染率逐渐上升, 它与结核杆菌感染的临床表现影像学特征及其相似, 形态学上难以鉴别, [24G25] 但治疗差异大, 许多结核分枝杆菌对抗结核药物天然耐药, 常规化疗效果不佳, 尤其对于 HIV 合 [25G27] 并肺部感染 NTM 患者, 常被误认为结核, 从而延误治疗, 此实验建立的 RTGLAMP 技术特异性强, 能够鉴别结核与非结核分枝杆菌, 利于指导用药. 传统的结核核酸扩增检测技术都是针对结核菌 [28G30] DNA 进行的, 无法检测出有活力的菌, 并不能评估临床化疗效果.16SRNA 半衰期短, 仅存在于有代谢活性的活菌中, 本实验用 RNA 保护试剂对活体菌预前处理, 用 RTGLAMP 技术检测结核菌 RNA, 避免了结核菌残留 DNA 引起的假阳性结果, 在指导临床治疗上有一定意义. LAMP 技术自问世以来以其操作简单经济快速灵敏度高特异性强显示了诸多优势. 通过对临床样本检测, 结果表明 RTGLAMP 法阳性检测率高于 LAMP 法与培养法, 差异有统计学意义. 本实验培养阴性并不代表痰标本中没有结核分枝杆菌, 有可能是由于细菌的数量低于检测限造成的. 由于 16SRNA 拷贝是 DNA 的 [19] 倍, 故 RTG LAMP 灵敏度极高, 反应迅速, 可重复检测单一拷贝,15 m 即可看到扩增结果, 与预期的 RTG LAMP 灵敏度是 LAMP 相比, 灵敏度实验证明 RTGLAMP 比 LAMP 灵敏度高约 10 倍, 可能由于以下原因引起的 :1)RNA 易降解衰减, 提供有效的模板减少 ;2)RNA 半衰期短, 逆转录效率低 ; 3)RNA 单链启动效率低于双链启动效率 ;4)LAMP [31] 反应启动后的高效率及高灵敏性等, 尽管如此, RTGLAMP 仍在灵敏度及活菌检测方面有不可超越的优势. 尽管 L 等已经报道过 RTGLAMP 检测结核杆菌, 但 L 等使用酶联免疫法 ELISA) 对扩增产物进行检测, 这种方法相对昂贵 10 美元 ) 且耗 [32] 时 5h), 不利于基层医疗机构的使用. 总之, 本研究中的 RTGLAMP 技术操作简单检测快速特异性高灵敏度强可检测活菌, 显示了适用于基层医疗机构的多处优势, 近年来有学者研究从样本处理到结果判读一体化的便携式微型生化反应系统, 如微流控芯片毛细管实验室. 如果能有更便捷经济的定量检测, 将更加有利于结核杆菌的临床诊断及治疗,2035 年终止结核病的目标将会更近一步. 参考文献 : [1]WHO.Gbbp2017[EB/OL].2017G12G01) [2018G02G08].hp:// p// [2]SgKJ,KhvjS,RhML.MdgGbG dxvydggb[j].cdspg HbPpMd,2015,59): DOI: /hpG p [3]COvLN,MzGSbhJdS,VGMgLA,. D mdgg Mybm b dbzg mmkgy kgdpbg[j].bzjid,2016,202):166g172. DOI: /j.bjd [4]MGL MI,OGGgJE,T MT,.Myb dvyg mgdxvydggbg Djb,HA[J].IJTbLg D, 2016,202):150G153.DOI: /jd [5]HvRT.Gmmydhdg b[j].c VImm,2015,228):845G849. DOI: /CVI.00199G15 [6]ZbUN,JvdH,ZA,.Cmp mpydzhgnhqdgbg pdp[j].jpk Md A,2015,658): 879G881. [7]OxdO,SgmJ,AvzGG,.XpR)MTB/RI hdgbmg:mg pdmm[j].ps,2016, 113): DOI: /j.p

7 254 中国人兽共患病学报 2018,343) [8]BR,ShmPK,JySC,.Cmpvy dpyznd mpywhg gddd[j].jtbr,2017,52):118g128. DOI: /j [9]yzgB,Dg M,SOO,.CmphpG mtkym whljdmgit mhdhdgg b[j].ijcexp Md,2014,74):1084G [10]YL,LJC,WgMS,.Evmddd gppmhdgpbymybg mbm MGITmp[J].JMbImmG I,2016,491):60G65.DOI: /j.jm [11]Bm Y,OkzP,RjGPG,.Um mhddmybm b mpxmpmmpgmdg g[j].jc Mb,2013,517):2273G2279.DOI: /JCM.00749G13 [12]GhbA,MdGKzmbd A,Mhk M,.CmG pdpcr mhddgmybg mbdcspm[j].jdg hpjmb,2014,72):8939.doi: /jm.8939 [13]MhK,Rvb T,VyyhK,.M ypgddmybmbg gdbrpvempcrddpx PCR[J].IJMyb,2015,41):60G66.DOI: /j. jmy [14]BkS.LAMPGAvvPOCdggpG mytbm[j].idjtb,2017,642): 72G76.DOI: /j.jb [15]ShS,DhwL,DyP,.LpGmddhmmG pyd Mybm b mpxwm[j].idjmd Mb,2016, 343):322G327.DOI: /0255G [16]MRL,MySA,CS,.Impvdpm pgmddhmmpyvwmpmg g[j].achm,2017,891):625g632.doi: /. hm.6b02578 [17]WHO.ThpGmddhmmpTBG LAMP)hdgpmyb:py gd[eb/ol].2016g08g08)[2018g02g08].hp://www. wh./b/pb/mpgdggm// [18]Smm KE,KmmdO,Sb O,.SmG qyh16srna dpbgby RpSqwdyMybm p[j].jc Mb,2010,489):3231G3235.DOI: /JCM.00362G 10 [19]ChY,HgSR,JBY,.CvdGm PCRgg16SbmRNAhdMyG bmb mpx[j].ij TbLg D, 2015,199):1102G1108.DOI: /jd [20]YG,dhD,GdJJ,.NdPCRbG pgmbmmy16srna gg qd[j].pso,2015,107): doi: /j.p [21]LD,ZhJ,NX,.PGdghkpgg Rv2461bdmpgpGmdd hmmpyhdmybg mbpmmp[j].ijcexpph, 2014,712):8706G8714. [22]NgmK,HT,NmT.AdbypG mddhmmpgppm[j].m CPb,2002,163):223G229. [23]hS,MzZA,Ghm M,.Chggp mddhmmp LAMP)hqmG dtxpmgd[j].apjtp Md,2015,85):366G372.DOI: /S1995G764514) 60345GX [24]AyG,EGKmySS,Abmk A,.PvG b mybmgbg p Ng[J].PS O,2013,85):63170.DOI: /j.p [25]JS,Sk MM,ShmN,.HghpvG bmybdmgghivdg dvdtbdmygxpm y Dh,Id[J].PhgGb Hh,2014,1082): 118G122.DOI: / Y [26]ShhkAH,HdhP,BbdSZ,."MdgG b" my bb myb [J].EJI Md,2015,264):279G284.DOI: /j. jm [27]YX,LP,L G,.ThpvGb myb mdch:symvw dmgy[j].ji,2016,736):558g567.doi: /j.j [28]ChHT,ZhgJ,YgSH,.Rpddp pvvdnabyvpgmddhmmpg [J].JVMhd,2009,1581/2):100G103.DOI: /j.jvm [29]DhmK,KhkK,ChkbyS,.LpGmddG hmmpdna LAMP):wdg ghhwddgmdhmphg: vw[j].pkjbgs,2014,172):151g166. [30]RA,SmhIE.A DNAGbdGmPCRy bgwhqhbphgpdg myg Abdph[J].P Mhd, 2016,121):48.DOI: /13007G016G0149Gz [31]NmT,Okym H,MbhH,.LpGmddG hmmpdna[j].nadr,2000, 2812):63. [32]L M,ChYH,PgC.EvvpG pgmddhmmpjwh ELISAGhybdzymdMybG mb [J].JMbMhd,2009,762):174G 180.DOI: /j.mm 收稿日期 :2017G06G21 编辑 : 王晓欢

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第期王兴涛等猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析病料毒株及细胞试剂引物设计提取及基因克隆及测序河南农业科学王兴涛罗俊滕蔓樊剑鸣鄂巍禹斌刘力张改平利用技术对河南省某规模化猪场乙脑疑似病例的种猪精液进行分析从部分样本中扩增出与流行性乙型脑炎病毒基因和基因具有高度同源性的预期产物在日龄乳鼠脑内接种种猪