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1 第 25 卷第 5 期 2016 年 10 月 激光生物学报 ACTA LASER BIOLOGY SINICA Vol.25No.5 Oct.2016 doi: /j.isn 经典饲养层细胞 Wnt 表达的差异及其对人胚胎干细胞 Wnt/β Catenin 信号通路的影响 邓磊玉 1, 林戈 1,2, 卢光 2 (1. 中南大学基础医学院, 湖南长沙 ;2. 国家干细胞工程中心湖南长沙 ) 摘要 : 目的 : 研究比较三种经典饲养层体系使用的成纤维细胞中 Wnt 基因的表达, 及其对共培养的人胚胎干细胞的影响 方法 :PCR 验证 19 种 Wnt 基因在三种不同来源饲养层细胞中的表达情况,qPCR 验证各组共培养人胚胎干细胞的 Wnt/β Catenin 信号通路相关基因表达水平, 流式检测其在不同密度饲养层条件下的增殖分化情况 结果 : 在全部 19 种 Wnt 基因 (Wnt1,Wnt2,Wnt2b,Wnt3,Wnt3a,Wnt4,Wnt5a,Wnt5b,Wnt6,Wnt7a, Wnt7b,Wnt8a,Wnt8b,Wnt9a,Wnt9b,Wnt10a,Wnt10b,Wnt11,Wnt16) 的表达检测中, 昆明白小鼠来源饲养层细胞表达其中的 16 种,ICR 小鼠来源饲养层细胞表达其中的 10 种, 人成纤维细胞来源饲养层细胞表达其中的 10 种 ; 增加饲养层细胞密度能够不同程度活化 Wnt/β Catenin 信号通路下游基因的表达, 并激活人胚胎干细胞中的负反馈机制 ; 高密度小鼠饲养层条件促进人胚胎干细胞的分化, 高密度人饲养层条件促进人胚胎干细胞的增殖和分化 结论 : 不同经典饲养层体系提供的 Wnt 环境不同, 其培养的人胚胎干细胞状态也有差异 关键词 : 人胚胎干细胞 ; 饲养层细胞 ;Wnt/β Catenin;Ki67;SSEA4 中图分类号 :Q813.1 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) DiferentWntExpresionofClasicFeedersEfects HumanEmbryonicStem CelsviaWnt/β CateninSignaling DENGLeiyu 1,LINGe 1,2,LUGuangxiu 2 (1.SchoolofBasicMedicalScienceCentralSouthUniversity,Changsha410013,Hunan,China; 2.NationalEngineeringResearchCenterofHumanStemCels,Changsha410205,Hunan,China.) Abstract:Objective:ComparingexpresionofWntgenesinthreediferentclasicfeederculturesystemsandtheir efectsonhumanembryonicstemcels.methods:wntmrnalevelinthreediferentfeedertypeswastestedbypcr. Wnt/β Cateninsignalinginhumanembryonicstem cels(hescs)culturedonhigh/lowdensityfeedersweretestedby qpcr.proliferationanddiferentiatedrariosofhescsculturedonhigh/lowdensityfeedersweretestedbyflowcytometric analysis.results:inthetestofal19wntgenes(wnt1,wnt2,wnt2b,wnt3,wnt3a,wnt4,wnt5a,wnt5b,wnt6, Wnt7a,Wnt7b,Wnt8a,Wnt8b,Wnt9a,Wnt9b,Wnt10a,Wnt10b,Wnt11,Wnt16),feederfrom KUNMINGBAI 收稿日期 : ; 修回日期 : 作者简介 : 邓磊玉,(1982-), 女, 湖南长沙人, 博士, 主要从事人胚胎干细胞研究 ( 手机 ) ;( 电子邮箱 )f5_105@ 163.com 通讯作者 : 林戈 (1974-), 男, 广东潮州人, 教授, 博士生导师, 主要从事生殖医学和人胚胎干细胞研究 ( 电话 ) ;( 电子邮箱 )linggf@hotmail.com; 卢光 (1939-), 女, 湖南长沙人, 中南大学教授, 博士生导师, 主要从事生殖医学和人胚胎干细胞研究 ( 电话 ) ;( 电子邮箱 )lugxdirec tor@aliyun.com

2 424 激光生物学报第 25 卷 mousefibroblastsexpresed17/19,feederfromicrmousefibroblastsexpresed10/19,feederfrom humanfibroblasts expresed10/19.increasingfeederceldensitycouldactivatewnt/β CateninsignalinganditsfeedbackinhESCs.High densitymousefeederinduceddiferentiationofhescs,highdensityhumanfeederinduceddiferentiationaswelashigh erproliferationratioofhescs.conclusions:hescswerevariedindiferentwntconditionsthatprovidedbyclasic feedercels. Keywords:humanembryonicstemcels;feedercels;Wnt/β Catenin;Ki67;SSEA4 0 引言 [1] 作为胚胎分化的关键一环,Wnt/β Catenin 信号通路为人熟知 [2], 而在多能干细胞的研究中,Wnt/ β Catenin 信号通路显示对多能性维持 分化 增殖等均具有影响, 其复杂多变的功能吸引了众多科学家的目光, 然而从胚胎干细胞成功培养至今, 其确切作用方式和对其他信号通路的交叉影响仍然成谜 想要准确了解 Wnt/β Catenin 信号通路在多能干细胞中的作用, 得到可控状态的细胞材料就显得尤为重要 了解不同的多能干细胞培养方式下 Wnt/β Catenin 信号通路的活化情况, 是得到可控状态的细胞材料的先决条件 本文对比研究了三种经典饲养层体系下 WNT 蛋白的表达情况, 以及人胚胎干细胞中 Wnt/β Catenin 信号通路的活化情况, 为得到稳定状态的人胚胎干细胞和优化无饲养层体系提供必要依据 1 材料与方法 1.1 饲养层细胞来源及培养 本实验 ICR 及昆明白小鼠成纤维细胞取自 12.5 d 的小鼠胚胎肌肉皮肤, 培养至第三代使用 人成纤维细胞系来自流产胚胎肌肉和皮肤组织, 培养至第七代使用 成纤维细胞的培养基为高糖 DMEM(Hy clone) 加 10% 胎牛血清 (Invitrogen), 使用代数培养 至汇合度 90%, 经丝裂霉素 C 处理 2.5h 后按照相应密度计数种植于 0.1% 明胶 (Sigma) 孵育的细胞培养皿 1.2 人胚胎干细胞来源及培养本文使用的人胚胎干细胞系 chhesc 8 为本实验室自主建系, 来源于试管婴儿废弃胚胎 该细胞系干细胞特征性鉴定符合 NIH 对胚胎干细胞的鉴定标准, 已于本室之前发表论文中刊登相关鉴定结果 [3] 人胚胎干细胞培养基成分购自 Invitrogen 公司, 包含 :75% DMEM/F12 15% Knockout 血清替代物 1mmol/L 非必需氨基酸 0.1mmol/Lβ 巯基乙醇 2mmol/L 左旋谷氨酰胺和 4ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子 (bfgf), 每天换液,3mL/ 孔, 培养六天后机械切割传代 1.3 饲养层细胞中 Wnt 基因的表达检测三种不同来源的成纤维细胞制备成饲养层以后,Trizol 抽提总 RNA, 将 1μgRNA 逆转录为 cd NA, 再以 cdna 为模板进行 PCR,20μL 体系,95 1min;94 30s, s,72 30s,25 个循环 ;72 延伸 5min 取 PCR 产物 5μL 和 Load ingbufer0.5μl 混合, 在 1.5% 琼脂糖凝胶进行电泳, 溴乙锭染色, 紫外投射仪上观察电泳结果并照像 引物序列见表 1 表 1 小鼠来源相关引物 Tab.1 Primers(Musmusculus) 基因 Forward5 3 Reverse5 3 Wnt1 TACTACGTTGCTACTGGCACTGA CGATTTCTCGAAGTAGACGAGGT Wnt2 AGCCAAGGAGAATTAAAGTCCTGA CTTAAGAAAGAGCCCCTGAAAC Wnt2b TATGCTATCTCGTCAGCAGCAGGAGT ATGAGGTTTCTGTGTGTTCAGGT Wnt3 TGGCTGTCCACCATAGATGA TCGTGTGCGAATACACTCTTG Wnt3a TCCTACTTGGAGGGGTCTCTTAC GGGGTTTGTTAGGTCTTGGTATC Wnt4 AGACGTGCGAGAAACTCAAAG CAGGTGTGCCAGGTCCTCATCTG Wnt5a AGAAGCCCATTGGAATATTAAGC CCAGACACTCCATGACACTTACA Wnt5b TTATGCAGATAGGTAGCCGAGAG ACAGACATACTGGTCCACAACCT Wnt6 GAGAGCTCCTACAGTGTGGTTGT ATATTCCTGTATTGGCCCAGAGT Wnt7a CTGGCGAGTGTCAGTTTCGTT TGTTACACTTGACGTAGCAGCAC

3 第 5 期 邓磊玉等 : 经典饲养层细胞 Wnt 表达的差异及其对人胚胎干细胞 Wnt/β Catenin 信号通路的影响 425 基因 Forward5 3 Reverse5 3 Wnt7b ACATCATCTGCAACAAGATTCCT GACTTCTCGATGTACACCAGGTC Wnt8a GACGAGTCACAAAATGGAAAAAC CAGAAGTTCAGGCTCTATCTCCA Wnt8b GCCTGGTGAGTAACAATTTTCTG TCTTGTTCTCCAGGCAGTAGTCT Wnt9a TTCAAGGAGACTGCTTTCCTCTA GGTGTACAATTCTTCTGGTGCTG Wnt9b TACTACGTTGCTACTGGCACTGA CGATTTCTCGAAGTAGACGAGGT Wnt10a ACGCTTCTCTAAGGACTTTCTGG AACAGAAAGAGGGGAACCTACAG Wnt10b AGAAGTTCTCTCGGGATTTCTTG CTCGTTACAGATTTCACCTGACC Wnt11 ACTGAATCAGACGCAACACTGTA ACAAGTTCTGAGTCCTTCACAGG Wnt16 ATCAGCAGAAGTTTCTCACCTTG GTAATGAATGGGACAGACTGTGA 1.4 人胚胎干细胞中 Wnt/β Catenin 信号通路相关基因的表达检测三种经典饲养层分别在高密度和低密度条件下共培养人胚胎干细胞, 培养六天后机械切割收集人 胚胎干细胞克隆,Trizol 抽提总 RNA, 将 1μgRNA 逆转录为 cdna, 再以 cdna 为模板进行 realtime PCR, 以 β ACTIN 为参照,2 ΔΔCt 得到表达倍数, 高密度 / 低密度得到表达差异倍数 引物序列见表 2 表 2 人来源相关引物 Tab.2 Primers(Homosapiens) 基因 Forwardprimer5 3 Reverseprimer5 3 WNT1 TACTACGTTGCTACTGGCACTGA CCTCTGTTGCCGTAAAGGAC WNT2 GGCTAACGAGAGGTTTAAGAAGC TTGAGAAAGCTCCTTTGAGACAC WNT2B TGTATATGCCATCTCATCAGCAG TCCACAGTATTTCTGCATTCCTT WNT3 CCAATCTCAAGTGGACTTTGTTC GTGCATGTGGTCCAGGATAGT WNT3A CCCACTCGGATACTTCTTACTCC TCGTACTTGTCCTTGAGGAAGTC WNT4 CACTGAAGGAGAAGTTTGATGGT TTGTTACTCCACCTTAGGTCTGC WNT5A AGTGCAATGTCTTCCAAGTTCT CATCATGTCTTCAGGCTACAT WNT5B CACTCTGCCTCACAAAGGTGTAT ATTCAGTTTAGGGCTTTCCTGAC WNT6 AGAAGCTGCCTCCATTTCG GTAGCCAGAGGCCTTTAGACTGG WNT7A ACTCTCATGAACTTGCACACAACAA AGTTGAGGGCTCTGAGAGATTTT WNT7B AGAGCAAAGTGATGAGGAGACTG ACGCCCAGCTAATTTTTGTATT WNT8A AGAACTGTAGCATGGGTGACTT GCAGTAATACTTGCTCACCACA WNT8B CAATTCCTCTGTGCTCTCCTAGA AGAGGAACAAAGATCCTTTGGAG WNT9A TCAAGGAGACTGCCTTCCTCTAT ACTCCACATAGCAGCACCAAC WNT9B CCTCAAGTACAGCACCAAGTTTC GCATGCATGTGATGACAGTCT WNT10A CGAGTCGGAGCTGTGTGTC GTAAGCGGTGCAGCTTCCTA WNT10B CAAGAGTTTCCCCCACTCTCT CTTACACACATTCACCCACTCTG WNT11 CTATTTGCTTGACCTGGAGAGAG CGGTCTGTGTAGGGGTTGTAG WNT16 GCACCAAAGAGACAGCATTTATT TAGCAGCACCAGATGAACTTACA SFRP1 AACGTGGGCTACAAGAAGATG CAGCGACACGGGTAGATGG SFRP2 ATGACCTAGACGAGACCATCC GTCGCACTCAAGCATGTCG FZD2 TTTCTGGGCGAGCGTGAT AAACGCGTCTCCTCCTGTGA Fzd8 GCTCGGTCATCAAGCAACAG ACGGTGTAGAGCACGGTGAAC FRZB TCCTGGAGACCAAGAGCAA GAGCCACAGCACCGATTT GSK 3β CTGTTCCGAAGTTTAGCC AAGAGGTTCTGCGGTTTA β Catenin CTGCCAAGTGGGTGGTATA GGGATGGTGGGTGTAAGAG CCND1 TCTACACCGACAACTCCATCCG TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGTG V JUN ACTCGGACCTCCTCACCTCG ATGTGCCCGTTGCTGGAC E CADHERIN TGCTCACATTTCCCAACTCC CTTGCCTTCTTTGTCTTTGTT β ACTIN CGCACCACTGGCATTGTCAT TTCTCCTTGATGTCACGCAC

4 426 激 光 生 物 学 报 第 25卷 1 5 不同培养条件下人胚胎 干 细 胞 的 增 殖 分 化 达进行了研究 昆明白小鼠来源的成纤维细胞表达 检测 其 中 17 种 见 图 1B Wn 1 Wn 2 Wn 2b Wn 3 流式细胞仪检测不同组别人胚胎干细胞的 K 67 Wn 3 Wn 4 Wn 5 Wn 5b Wn 7 Wn 7b Wn 8 及 SSEA4阳性细胞来鉴定其增殖分化能力 K 67试 Wn 9 Wn 9b Wn 10 Wn 10b Wn 11 Wn 16 剂盒 SSEA4直标抗体及同型对照均购自 BD公司 I CR小鼠来源 的 成 纤 维 细 胞 表 达 其 中 10种 Wn 2 2 实验结果 Wn 2b Wn 3 Wn 4 Wn 5 Wn 7b Wn 1 0 Wn 1 0b Wn 11 Wn 16 人胚胎来源的成纤维细胞表达其中 2 1 三种不同来源的 经 典 饲 养 层 细 胞 中 Wn的 10种 Wn 1 Wn 2 Wn 2b Wn 4 Wn 5 Wn 6 表达 Wn 9 Wn 10b Wn 11 Wn 16 2 2 三种不同来源的经典饲养层细胞在高密度 低密度条件下对人胚胎干细胞 Wn C n n信号 通路的影响 A 从左到右分别为昆明白小鼠来源胚胎成纤维细 胞 I CR小鼠来源胚胎成纤维细胞 人来源胚胎成纤 维细胞 B 19种 WNT及看家基因在三种不同来源 成纤维细胞制备的饲养层中的表达情况 A F m h mb n b b mkun MI NGBAIm u I CR m u hum n B 19WNT A 昆明白来源饲养层组 B I CR来源饲养层组 C nd ACTI N x p n n h d n d 人来源饲养层组 图 1 Wn在三种来源饲养层中的表达 A KUNMI NGBAIm u d B I CR m u d F 1 Wn x p n n d m h d C hum n d n p 图 2 不同饲养层 来 源 高 低 密 度 培 养 下 人 胚 胎 干 细 胞 中 Wn C n n信 号 相 关 基 因 的 表 达 差 本实验使用的两种小鼠成纤维细胞及人成纤维 细胞形态见图 1A 两种小鼠成纤维细胞形态差异不 001 n 3 异 P 0 F 2 F d h n Wn C n n d n n 大 而人成纤 维 细 胞 形 态 更 为 修 长 和 均 一 本 实 验 hum n mb n m h u u d nh w 针对全部 19种 Wn基 因 在 三 种 成 纤 维 细 胞 中 的 表 d P 0 001 n 3

5 第 5期 邓磊玉等 经典饲养层细胞 Wn表达的差异及其对人胚胎干细胞 Wn C n n信号通路的影响 三种不同来源的经典饲养层细胞在高密度条件 下均能活化 人 胚 胎 干 细 胞 Wn C n n信 号 通 路 2 3 三种不同来源的经典饲养层细胞在高密度 低密度条件下对人胚胎干细胞克隆形态的影响 hhesc 8克隆在三种不同来源的低密度饲养层 但是各组活化情况不尽相同 昆明白小鼠来源的高 密度饲养层条件下 相关基因的 qpcr结果见图 2A 表达有统计学差 异 的 基 因 P 0001 包 括 Wn 427 C 而在三种 体系下均维持未分化克隆形态 图 3A 不同来源的高密度饲养层体系下出现不同程度的分 信号通路受体 FZD2 z z d p 2 FZD2 化 小鼠来源 的 两 组 主 要 表 现 为 克 隆 边 缘 细 胞 分 化 表达上调 分泌型 Wn信号通路拮抗剂 SFRP2 中央细胞增厚图 3D E 人来源组主要表现为克隆中 d z z d dp n2 SFRP2 表达上调 Wn 央增厚分化 图 3F 信号通路下游基因 E CADHERI N表达上调 I CR小 2 4 三种不同来源的经典饲养层细胞在高密度 鼠来源的高密度饲养层条件下 相关基因的 qpcr结 低密度条件下对人胚胎干细胞增殖的影响 果见图 2B 表达有统计学差异的基因 P 0001 包 hhesc 8细胞在三种不同来源的低密度饲养层 括 分泌型 Wn信号通路 拮 抗 剂 SFRP1表 达 上 调 67流 式 检 测 阳 性 率 体系下的 增 殖 细 胞 表 面 标 记 K 分泌型 Wn信号通路拮抗剂 SFRP2表 达 上 调 Wn CR组 381 人 来 源 组 分别为 昆明白组 388 I 信号通路下游基因 V J UN表达上调 人来源的高密 38 3 图 4A右上排 在三种不同来源的高密度饲 度饲养层条件下 相关基因的 qpcr结果见图 2B 表 养层体系下的干细胞未分化标记 SSEA4流式检测阳 达有统计学差异的基因 P 0001 包括 Wn信 性率分别为 昆明白组 409 I CR组 394 人 来 号通路受体 FZD2表达上调 分泌型 Wn信号通路 源组 437 图 4A右 下 排 K 67标 记 同 型 对 照 见 拮抗剂 SFRP1表达上调 Wn信号通路下游基因 图 4A左 高密度 饲 养 层 体 系 下 的 干 细 胞 未 分 化 率 细胞周期调控蛋白基因 CCND1表达上调 均高于低密度饲养层组 A 低密度昆明白饲养层 B 低密度 I CR饲养层 C 低密度人饲养层 D 高密度昆明白饲养层 E 高密度 I CR饲养层 F 高密度人饲养层 A L wd n KUNMI NGBAIm u d B L wd n I CRm u d C L wd n hum n d D H hd n KUNMI NGBAIm u d E H hd n I CRm u d F H hd n hum n d 图 3 不同饲养层条件下的人胚胎干细胞克隆形态 F 3 M ph hesc n nd n d

6 激 428 光 生 物 学 报 第 25卷 A 流式细胞仪检测各组培养条件下人胚胎干细胞表面增殖标记 K 67的阳性率 B 流式细胞仪检 测各组培养条件下干细胞未分化表面标记 SSEA4的阳性率 A F w m hescbm mb n p m k K 67 B F w m hescbm mb nund n dm k SSEA4 图 4 流式细胞仪检测各组培养条件下人胚胎干细胞的增殖和未分化情况 饲养层密度和来源见 图示 各组数值标于峰图内 同型对照提供在每组结果左侧 F 4 F w m hesc p ndund n d u F d d n nd u w p v d d np u p v w m k d n h wp kd m I SOd m w h wn 2 5 三种不同来源的经典饲养层细胞在高密度 4 图 4B右下排 SSEA4标记同型对照见图 组 64 低密度条件下对人胚胎干细胞分化的影响 4B左 高密 度 饲 养 层 体 系 下 的 干 细 胞 未 分 化 率 均 hhesc 8细胞在三种不同来源的低密度饲养层 体系下的干细胞未分化标记 SSEA4流式检测阳性率 分别为 昆明白组 901 I CR组 895 人 来 源 组 低于低密度饲养层组 3 讨论 94 图 4B右上排 在三种不同来源的高密度饲养 过去近 20年的时间里 Wn信号通路在多能干 层体系下的干细胞未分化标记 SSEA4流式检测阳性 细胞中的功 能 研 究 从 未 停 止 它 促 进 多 能 干 细 胞 向 率分别为 昆明白组 589 I CR组 546 人 来 源 多种神经细 胞 的 分 化 4 参 与 阻 止 胚 胎 干 细 胞 向 上

7 第 5 期 邓磊玉等 : 经典饲养层细胞 Wnt 表达的差异及其对人胚胎干细胞 Wnt/β Catenin 信号通路的影响 429 胚层干细胞的分化 [5], 既能参与干细胞多能性的丢失 [6], 又被报道参与维持干细胞的自我更新和多能性 [7], 包括维持干细胞端粒酶的活性 [8] 通过分割 Wnt 信号通路不同环节的机制研究表明, 不同的 WNT 蛋白对胚胎干细胞的作用不一样 [9], 培养环境中的 WNT3A 蛋白能够直接活化干细胞转录核心因子 OCT4 和 NANOG 从而促进多能性的维持 [10],Wnt 信号通路核心蛋白 β Catenin 的胞内蛋白浓度而不是转录活性对干细胞多能性维持起关键作用 [11],β Catenin 与 TCF3 转录因子的结合能够降低干细胞多能性, 活化的 β Catenin 与 TCF1 2 4 转录因子的结合能够促进干细胞的分化 ; 与此竞争的是 β Catenin 与 OCT3/4 NANOG SOX2 等干细胞转录因子的结合能够增强干细胞多能性 [12 14] 在不同针对 Wnt 信号通路的研究中, 可以看到各种多能干细胞培养体系的应用, 但是不同体系下多能干细胞的 Wnt 信号通路活化状态并未引起重视, 也就是说迄今为止的各种多能干细胞是在不同的 Wnt 起始状态下进行的相关研究, 得出各种不同的结论或者不稳定的实验结果很可能就与细胞的起始状态有关 为了验证不同培养体系下的人胚胎干细胞的 Wnt 活化情况, 我们针对三种经典有饲养层培养体系进行了分析 首先探索的是三种饲养层细胞在优化条件下的 WNT 蛋白表达, 结果显示不同的饲养层细胞, 提供的 WNT 蛋白种类显然差异巨大 七种 Wnt 基因在三种饲养层细胞中均有表达, 十一种 Wnt 基因在三种饲养层细胞中表达存在有或无的差异 而同一株胚胎干细胞在不同饲养层条件下, Wnt 信号通路相关基因的表达水平也差异很大, 由于人鼠来源的饲养层细胞最优密度不尽相同, 我们在实验中采用比较增加同一饲养层细胞密度前后对人胚胎干细胞的影响的方法, 结果显示, 昆明白和人来源饲养层条件下 WNT 蛋白受体 FRZD2 表达上升 ; 与 WNT 蛋白竞争性结合的分泌型拮抗因子 SFRP 家族成员 SFRP1/2 在三组条件下上调程度不同, 但是每组至少有一种出现明显上调, 说明高密度饲养层细胞均能引起人胚胎干细胞中 Wnt 信号通路的负反馈, 差别在于昆明白组上调的是 SFRP1,ICR 组 SFRP1/2 均有上调, 而人来源组上调的是 SFRP1; Wnt 信号通路讲解复合体核心因子 GSK3 β 没有明显差异 ;β Catenin 本身的表达水平也没有明显差异 ; 下游相关基因表达有明显差异的有昆明白组的细胞粘附相关蛋白 E CADHERIN,ICR 组的 V JUN, 以及 人来源组的 CNND1 针对下游基因相关的细胞生物学特征, 我们分别对人胚胎干细胞的分化 (E CAD HERIN 相关 [11] ) 和增殖 (V JUN,CNND1 相关 [15,16] ) 标记进行了流式验证, 干细胞表面标记 SSEA4 显示增加密度 ( 提高 WNT 浓度 ) 后干细胞会出现分化, 而增殖表面标记 Ki67 的流式结果显示, 人来源组饲养层密度增加能够使干细胞增殖能力上升, 这也与 CNND1 表达上调相匹配 虽然现在的多能干细胞培养方式越来越多样和成熟, 但是 Wnt 信号通路在各种培养条件的优化中往往并未引起足够重视 [17 22], 包括在限定性的无饲养层体系优化中,Wnt 信号也多被忽略 [6,23] 本文通过对比三组不同经典饲养层体系中 Wnt 信号通路的差异, 提示不同培养条件下人胚胎干细胞的 Wnt 信号起始状态存在差异, 这可能对其分化和相关信号通路的研究结果具有较大影响 提示在无饲养体系优化和 Wnt 信号通路研究中, 培养环境中的基础 Wnt 水平差异应该纳入考虑 参考文献 [1] RUDNICKIM A,WILLIAMSBO.Wntsignalinginboneand muscle[j].bone,2015,80: [2] BARLOW LA.Progresandrenewalingustation:newinsights intotastebuddevelopment[j]. Development,2015,142: [3] YANGS,LING,TANYQ,etal.Tumorprogresionofcul ture adaptedhumanembryonicstem celsduringlong term cul ture[j].geneschromosomescancer,2008,47: [4] LUJ,ZHONGX,LIUH,etal.Generationofserotoninneurons fromhumanpluripotentstem cels[j].natbiotechnol,2016, 34: [5] TENBERGED,KUREKD,BLAUWKAMPT,etal.Embry onicstemcelsrequirewntproteinstopreventdiferentiationto epiblaststemcels[j].natcelbiol,2011,13: [6] KIM JJ,LEEJS,MOONBH,etal.Wip1 expresingfeeder celsretainpluripotencyofco culturedmouseembryonicstem celsunderleukemiainhibitoryfactor deprivatedcondition[j]. ArchPharmRes,2010,33: [7] ZHANGP,CHANGW H,FONG B,etal.Regulationofin ducedpluripotentstem(ips)celinductionbywnt/beta catenin signaling[j].jbiolchem,2014,289: [8] HOFFMEYERK,RAGGIOLIA,RUDLOFFS,etal.Wnt/be ta cateninsignalingregulatestelomeraseinstemcelsandcancer cels[j].science,2012,336: [9] SINGLA D K,SCHNEIDER D J,LEWINTER M M,etal. Wnt3abutnotWnt11supportsself renewalofembryonicstem cels[j]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 345:

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