第 3 期颜冬梅, 等.Fis 介导伤寒沙门菌滞留菌形成材料与方法 1.1 主要材料伤寒沙门菌野生株 S.TyphiGIFU10007 由日本岐阜大学医学院微生物学教研室馈赠 ; 伤寒沙门菌 fis 缺陷株 ( fis) 由本实验室制备保存 [7] 胰蛋白胨酵母提取物氨苄西林环

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率钧乌
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1 第 27 卷第 3 期 2017 年 5 月江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.27 No.3 May2017 Fis 介导伤寒沙门菌滞留菌形成颜冬梅, 陆仁飞, 赵昕, 张盈, 黄新祥 ( 江苏大学医学院, 江苏镇江 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨伤寒沙门菌滞留现象的存在, 研究 Fis 在伤寒沙门菌滞留菌形成中发挥的作用方法 : 用药敏纸片和最小抑菌浓度检测进行药敏实验, 挑选伤寒沙门菌敏感的抗生素利用菌落计数法, 绘制细菌存活曲线 qrt PCR 检测伤寒沙门菌 fis 的表达采用细菌滞留实验分析细菌滞留能力结果 : 伤寒沙门菌在对数生长的早期和中晚期都存在滞留现象与野生株相比,fis 基因缺失株的滞留能力下降结论 :Fis 可参与伤寒沙门菌滞留菌的形成 [ 关键词 ] 伤寒沙门菌 ; 滞留菌 ;Fis; 抗生素 [ 中图分类号 ] R516.3 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2017) DOI: /j.isn y [ 引用格式 ] 颜冬梅, 陆仁飞, 赵昕, 等.Fis 介导伤寒沙门菌滞留菌形成 [J]. 江苏大学学报 ( 医学版 ),2017,27(3): ,256. EfectofFisonthepersistenceofSalmonelaentericaserovarTyphi YANDong mei,luren fei,zhaoxin,zhangying,huangxin xiang (SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013,China) [Abstract] Objective:ToinvestigatewhetherSalmonelaentericaserovarTyphiexsitspersistenceand theroleoffisinpersistenceofs.typhi.methods:drugsensitivepaperandminimuminhibitorycon centration(mic)testwereutilizedtoselecttheappropriateantibioticsfordetectingthepersistersofs. Typhi.Colony FormingUnits(CFU)whichcountedatvarioustimepointswereusedtodrawthebacteri alsurvivalcurve.theexpresionoffisins.typhiwastestedbyqrt PCR.Persistencetestwasusedto analyzethebacterialabilityofpersitenceformation.results:thepersistenceofs.typhicouldbedetec tedintheearlyandmid latelogphase.comparedwiththewildtypestrain,thefisdeletedmutanthada decreaseinpersistence.conclusion:fisisinvolvedinformingpersistersofs.typhi. [Keywords] SalmonelaentericaserovarTyphi;persister;Fis;antibiotics 伤寒沙门菌 (SalmonelaentericaserovarTyphi, S.Typhi) 是一种革兰阴性肠道杆菌, 可导致伤寒热等系统性感染疾病 [1-2] 滞留菌 (persister) 的概念最早由 JosephBigger 提出, 即金黄色葡萄球菌经高浓度青霉素处理后, 有一小部分细菌能够存活 ; 当青霉素作用去除后, 这部分细菌重新增殖, 并且对青霉素仍然敏感, 即命名为滞留菌 [3] 近年来, 通过对大肠埃希菌结核分枝杆菌金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等相关滞留菌的研究, 滞留菌形成与存活相关的基因及其作用机制逐渐明了目前滞留菌的形成机制主要包括毒素抗毒素元件 (TA Module) 氧化应激反应与细胞代谢及能量产生等 [4] 滞留菌是慢性感染细菌耐药以及生物膜形成等医学治疗难题的关键问题 [5-6] Fis 是由 98 个氨基酸组成的细菌全局调控因子, 通过与核酸结合从而调节细菌基因转录, 涉及毒力代谢等重要的生命活动 [7] 利用基因芯片对 fis 缺陷株转录组分析发现,fis 对编码 Ⅲ 型分泌器能量代谢体的基因有一定的调节 [8] ; 同时滞留菌的形成与细菌的能量代谢有关因此本研究以 Fis 为切入点初步探索其在伤寒沙门菌滞留菌的形成中所发挥的作用 [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 ( ) [ 作者简介 ] 颜冬梅 (1991 ), 女, 硕士研究生 ; 黄新祥 ( 通讯作者 ), 博士生导师,E mail:huxinx@ujs.edu.cn

2 第 3 期颜冬梅, 等.Fis 介导伤寒沙门菌滞留菌形成材料与方法 1.1 主要材料伤寒沙门菌野生株 S.TyphiGIFU10007 由日本岐阜大学医学院微生物学教研室馈赠 ; 伤寒沙门菌 fis 缺陷株 ( fis) 由本实验室制备保存 [7] 胰蛋白胨酵母提取物氨苄西林环丙沙星卡那霉素药敏纸片 (OXOID 公司 ); 氨苄西林和环丙沙星 (Sigma 公司 );50mL 离心管 96 孔细胞培养板 (Corning 公司 );NaCl NaOH HCl 无水乙醇异丙醇 ( 上海国药 );Trizol 试剂 (Invitrogen 公司 );SYBR 荧光定量试剂盒反转录试剂盒 DNA 酶 Ⅰ 快速 DNA 消化试剂盒 (TaKaRa 公司 ); 引物合成 ( 苏州泓讯 ) PCR 仪 (ABI); 核酸紫外检测仪 (NanoDrop1000); 荧光实时定量 PCR 仪 (Bio Rad); 进口恒温摇床 (Thermo 公司 ); 恒温细菌培养箱 ( 上海跃进医疗器械一厂 ) 1.2 药敏试验 ( 纸片法 ) 为挑选筛选 S.Typhi 滞留菌时合适的抗生素, 根据文献 [10], 先采用氨苄西林环丙沙星卡那霉素观察本实验中菌株的药物敏感性将过夜培养的野生株和 fis 按转接至 20mLLB 培养基中, 培养至对数生长期, 调整麦氏浓度为 0.5, 用无菌棉拭子蘸取菌液均匀涂布于 M H 琼脂平板上, 置室温 3~5min 用无菌镊子取氨苄西林环丙沙星卡那霉素药敏纸片贴于平板表面将贴好纸片的平板置 35 孵箱孵育 24h 后, 量取抑菌圈直径 1.3 最小抑菌浓度 (MIC) 检测将 100μL 新鲜的 M H 培养基加至 96 孔板孔中, 于每排第 1 孔中分别加入 100μL 氨苄西林母液 (5120mg/L) 或环丙沙星母液 (40mg/L), 并将不含抗生素的实验孔作为空白对照在其余孔中将两种抗生素进行倍比稀释, 于每孔中加入 100μL 麦氏浓度为 0.5 的菌液,37 孵育培养,18~24h 读取结果, 能够抑制细菌生长的最低药物浓度即为 MIC 1.4 细菌存活曲线将过夜培养的细菌以转接至 20mL 新鲜 LB 培养基中,37 250r/min 摇床培养 2.5h 至对数期取 1mL 菌液至无菌 EP 管中, 分别加入 10 μl 氨苄西林 (10mg/mL) 或环丙沙星 (100mg/L), r/min 培养, 每隔 1h 取 100μL 菌液, 4000r/min 离心 10min, 用 PBS 稀释菌体至合适比例涂板,37 培养过夜, 进行菌落计数 1.5 细菌滞留能力检测将过夜培养的细菌以转接至 20mL 新鲜 LB 培养基中,37 250r/min 培养至对数期不同阶段取 1mL 菌液到无菌 EP 管中, 加入 10μL 氨苄西林 (10mg/mL) 使其终浓度为 100mg/L,37 250r/min 作用 5h 取 100μL 菌液,4000r/ min 离心 10min, 用 PBS 稀释菌体至合适比例涂板, 37 培养过夜, 进行菌落计数滞留率为 5h 菌落数与未加入药物之前菌落数之比, 重复 5 次 1.6 qrt PCR 检测 fis 的表达设计 fis 和 5sqRT PCR 扩增引物 ( 表 1),fis 5s 扩增产物长度分别为 178bp 155bp 将过夜培养的野生株以转接至 20mL 新鲜 LB 培养基中,37 250r/min 培养细菌至 D(600nm) 约为 , 离心收集菌体 Trizol 法提取 RNA, 用 DNA 酶 Ⅰ 快速 DNA 消化试剂盒消化细菌基因组 DNA, 琼脂糖凝胶电泳, 确保无残余 DNA 取 4μgRNA 行反转录, 以获得的 cdna 为模板进行 qrt PCR 检测, 根据定量试剂盒要求操作, 至少 3 个不同样本, 每个样本 3 个复孔, 结果做统计学分析表 1 qrt PCR 引物引物名称引物序列 (5 3 ) 扩增长度 5s FA TTGTCTGGCGGCAGTAGC 155bp 5s FB TTTGATGCCTGGCAGTTC fis FA GACGTACTGACCGTTTCT 178bp fis FB TGGTTACCACGGGTGTAT 1.7 统计分析采用 GraphPadPrism5 统计软件对数据进行分析, 两组数据比较采用 t 检验,P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 伤寒沙门菌野生株 fis 缺陷株对氨苄西林环丙沙星敏感且敏感度一致药敏试验结果显示, 氨苄西林环丙沙星卡那霉素对野生株的抑菌圈分别为 mm, 对 fis 的抑菌圈分别为 mm 参照 CLSI 中药敏纸片判断标准, 野生株和 fis 对上述 3 种药物敏感 (CLSI 规定 : 抑菌圈氨苄西林 >17mm, 环丙沙星 >21mm, 卡那霉素 >18mm 为敏感 ), 重复 3 次, 差异有统计学意义 (P<0.01) MIC 检测结果显示, 野生株和 fis 株在氨苄西林浓度为 2.5mg/L 时出现浑浊 ; 在环丙沙星浓度为

250 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷 0.01875mg/L 时出现浑浊参照 CLSI 中 MIC 判断标准 ( 氨苄西林 MIC<8mg/L, 环丙沙星 MIC< 0.

Typhi 的杀伤作用呈二相曲线变化, 前 5h 大部分菌体被杀灭, 但 5h 后仍有一部分细菌存活随着抗生素作用时间延长, 此部分菌体数目保持稳定将此部分存活的细菌转接培养, 做同种抗生素药敏试验和药物生存试验, 其结果与野生株一致, 提示与耐药菌不同, 存活的细菌并不具有遗传性, 符合滞留菌特征,

Typhi 滞留菌的形成但 fis 在菌体内表达水平不稳定, 如图 4 所示,fis 在对数早期 [D(600nm) 0.4] 表达最高 ; 其他时期与对数早期相比表达量明显下降针对本研究旨在观察 fis 与 S.

3 250 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷 mg/L 时出现浑浊参照 CLSI 中 MIC 判断标准 ( 氨苄西林 MIC<8mg/L, 环丙沙星 MIC< 0.06mg/L 为敏感 ), 野生株和 fis 对氨苄西林环丙沙星敏感且药物敏感度一致图 1 伤寒沙门菌野生株及 fis 基因缺失株药敏试验 2.2 S.Typhi 存在滞留现象且与生长时期有关如图 2 显示, 氨苄西林和环丙沙星对于 S. Typhi 的杀伤作用呈二相曲线变化, 前 5h 大部分菌体被杀灭, 但 5h 后仍有一部分细菌存活随着抗生素作用时间延长, 此部分菌体数目保持稳定将此部分存活的细菌转接培养, 做同种抗生素药敏试验和药物生存试验, 其结果与野生株一致, 提示与耐药菌不同, 存活的细菌并不具有遗传性, 符合滞留菌特征, 证实 S.Typhi 确实存在滞留现象图 3 伤寒沙门菌不同生长时期滞留率 2.3 Fis 影响 S.Typhi 滞留菌形成基于 Fis 参与 S.Typhi 的毒力和能量代谢的调节, 而这些环节也与细菌滞留相关, 猜测 Fis 可能参与 S.Typhi 滞留菌的形成但 fis 在菌体内表达水平不稳定, 如图 4 所示,fis 在对数早期 [D(600nm) 0.4] 表达最高 ; 其他时期与对数早期相比表达量明显下降针对本研究旨在观察 fis 与 S.Typhi 滞留的关系, 因此挑取对数早期研究伤寒沙门菌野生株与 fis 的滞留差异图 2 两类抗生素作用于伤寒沙门菌的细菌存活曲线为探明滞留菌的产生是否与细菌的生长时期相关, 分别在对数早期 [D(600nm) 0.4] 与对数晚期 [(D(600nm) 0.8] 测定细菌滞留率结果如图 3 所示, 在对数早期滞留率约为 1/10 5.5, 而对数晚期滞留率约为 1/10 4.5, 升高约 10 倍, 初步说明 S. Typhi 的滞留与细菌的生长时期有关图 4 qrt PCR 检测伤寒沙门菌 fis 表达如图 5 所示, 相比野生株, fis 滞留率下降, 滞留菌数量约为野生株 1/10 这表明,Fis 有助于 S. Typhi 滞留菌的生成

4 第 3 期颜冬梅, 等.Fis 介导伤寒沙门菌滞留菌形成讨论图 5 伤寒沙门菌滞留率目前已发现大肠埃希菌结核分枝杆菌金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等致病菌均存在滞留现象 [9] 研究表明, 滞留菌形成与毒素抗毒素元件 [10] [11] [12] 氧化应激诱导或细胞代谢和能量产生等机制有关, 然而滞留菌的形成与存活的确切机制仍然不是很清楚, 尤其是尚未找到参与核心调控的关键分子本研究通过抗生素筛选试验发现伤寒沙门菌同样也存在滞留现象研究发现细菌处于生长时期后期时, 产生的滞留菌数目增加, 提示细菌的滞留与自身营养状态密切相关以往认为滞留菌是细菌的一种类似休眠的低代谢生活方式, 蛋白质合成受阻 [5], 细菌的多项生命活动受到抑制, 药物作用靶点消失, 从而导致抗生素耐受但最新研究表明, 滞留菌是细菌应对环境变化时一种活跃的自我保护机制, 与传统的理解恰好相反, 滞留菌可以利用有限的物质如氧气, 产生出比正常细菌多数倍的 ATP, 维持细菌的新陈代谢, 实现了消耗少, 产能多的新型生存方式, 以便适应不同的环境 [13] 滞留菌为细菌群体中一种正常的存在, 是进化程度更高一级的群体, 对环境的变化敏感, 以便更好地存活 Fis 是一个核酸结合蛋白, 在细菌各种生命活动中都发挥着全局调控的作用目前关于 fis 的研究报道甚多, 鼠伤寒沙门氏菌 fis 基因芯片结果发现 fis 对多种氨基酸转运体有调节作用, 参与菌体的能量代谢过程 [8] [14] Germain 等在大肠埃希菌中发现,hipA 高表达后滞留率会升高 100~1000 倍, 后续发现 HipA 是通过磷酸化谷氨酰 trna 合成酶而使其失活, 导致大量空载的 trna 聚集, 从而抑制多种蛋白质的生成, 促使滞留菌生成基因芯片技术发现 fis 缺失后编码谷氨酸和谷氨酰胺转运体的基因表达上调 [8], 因此我们猜想 fis 缺失后, 谷氨酸和谷氨酰胺转运体活性增强, 使得胞外转运至胞内的谷氨酸和谷氨酰胺增多, 滞留率相比野生株有所下降此猜想可以用酶促反应的模型进行解释, 当反应中酶的浓度一定时, 底物浓度在一定范围内越高, 酶促反应的效率越高, 当转运至胞内的谷氨酸浓度增加时, 相当于底物浓度增加, 促使酶促反应的进行, 部分抵消 HipA 的促滞留菌形成的毒性作用毒素抗毒素元件是导致滞留菌形成的一个关键因素, 多种因素都可促使编码毒素基因的表达伤寒沙门菌中,Fis 对多种毒素基因都有一定的调节, 如 SPI 1 SPI 2 等, 可以部分解释当 fis 缺失后, 细菌的滞留能力下降接下来的研究可以通过基因转录组学分析 fis 对编码毒素分子基因的调控作用以及通过富集 fis 缺陷后形成的滞留菌, 对其毒素分子的表达量进行分析 [ 参考文献 ] [1] ParyCM,HienTT,DouganG,etal.Typhoidfever [J].NEnglJMed,2002,347(22): [2] EverestP,WainJ,RobertsM,etal.Themolecular mechanismsofseveretyphoidfever[j].trendsmicrobi ol,2001,9(7): [3] BiggerJW.TreatmentofStaphylococalinfectionswith penicilin by intermitentsterilisation[j]. Lancet, 1944,244(6320): [4] ZhangY.Persisters,persistentinfectionsandtheYin Yangmodel[J]. Emerg MicrobesInfect, 2014, 3 (1):e3. [5] LewisK.Persisterscels,dormancyandinfectiousdis ease[j].natrevmicrobiol,2007,5(1): [6] FauvartM,DeGrooteVN,MichielsJ.Roleofpersister celsinchronicinfections:clinicalrelevanceandper spectivesonanti persistertherapies[j].jmedmicrobi ol,2011,60(pt6): [7] ZhangH,NiB,ZhaoX,etal.Fisisesentialforthe stabilityoflinearplasmidpbssb1andafectsthemotili tyofsalmonelaentericserovartyphi[j].plosone, 2012,7(7):e [8] KelyA,GoldbergMD,CarolRK,etal.Aglobalrole forfisinthetranscriptionalcontrolofmetabolism and typeⅢ secretioninsalmonelaentericserovartyphi murium[j].microbiology,2004,150(pt7): [9] CohenNR,LobritzMA,Colins J,etal.Microbial persistenceandtheroadtodrugresistance[j].cel HostMicrobe,2013,13(6), [10] FauvartM,DeGrooteVN,MichielsJ.Roleofpersister ( 下转第 256 页 )

5 256 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷 [6] IzumiD,IshimotoT,SugiharaH,etal.CXCL12/CX CR4activationbycancer asociatedfibroblastspromotes integrinβ1 clusteringand invasiveabilityin gastric cancer[j].intjcancer,2016,138(5): [7] 簎淑莉, 冯起校, 刘振海.CXCL12 CXCR4 在胃癌中的表达及其与腹腔转移的意义 [J]. 实用癌症杂志, 2014,29(1): [8] 孙梯业, 颜伟, 赵永亮, 等. 趋化因子受体 CXCR4 在胃癌组织中的表达及意义 [J]. 中华普外科手术学杂志 ( 电子版 ),2011,5(2): [9] 陈友权, 于燕妮. 基质细胞衍生因子 1 及其受体 CXCR4 在进展期胃癌中的表达及意义 [J]. 中华临床医师杂志 ( 电子版 ),2012,6(12): [10] YasumotoK,KoizumiK,KawashimaA,etal.Roleof thecxcl12/cxcr4axisinperitonealcarcinomatosisof gastriccancer[j].cancerres,2006,66(4): [11] ZhaoBC,WangZJ,MaoWZ,etal.CXCR4/SDF 1 axisisinvolvedinlymphnodemetastasisofgastriccar cinoma[j].worldjgastroenterol,2011,17(19): [12] LukerKE,LukerGD.FunctionsofCXCL12andCX CR4inbreastcancer[J].CancerLet,2006,238(1): [13] SunZ,ZhangN.ClinicalevaluationofCEA,CA19 9, CA72 4andCA125ingastriccancerpatientswithneo adjuvantchemotherapy[j].worldjsurgoncol,2014, 12:397. [14] HeB,ZhangHQ,XiongSP,etal.Changingpaterns ofserumceaandca199forevaluatingtheresponseto first linechemotherapyinpatientswithadvancedgastric adenocarcinoma[j].asianpacjcancerprev,2015, 16(8): [15] ShimadaH,NoieT,OhashiM,etal.Clinicalsignifi canceofserumtumormarkersforgastriccancer:asys tematicreviewofliteraturebythetaskforceofthejap anesegastriccancerasociation[j].gastriccancer, 2014,17(1): [16] WatanabeM,TakemasaI,KanekoN,etal.Clinical significanceofcirculatinggalectinsascolorectalcancer markers[j].oncolrep,2011,25(5): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 陈海林 ( 上接第 251 页 ) celsinchronicinfections:clinicalrelevanceandper spectivesonanti persistertherapies[j].jmedmicrobi ol,2011,60(pt6): [11] GrantSS,HungDT.Persistentbacterialinfections,an tibiotictolerance,andtheoxidativestresresponse[j]. Virulence,2013,4(4): [12] TraxlerMF,SummersSM,NguyenHT,etal.Theglob alppgpp mediatedstringentresponsetoaminoacidstar vationinescherichiacoli[j].molmicrobiol,2008,68 (5): [13] RadzikowskiJL,VedelaarS,SiegelD,etal.Bacterial persistenceisanactiveδ S stresresponsetometabolic fluxlimitation[j].molsystbiol,2016,12(9):882. [14] GermainE,Castro RoaD,ZenkinN,etal.Molecular mechanism ofbacterialpersistencebyhipa[j].mol Cel,2013,52(2): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 刘星星

7 北京大学学报医学版 # +94* 4 ' % 论著!! "# $ #% %"&!%'!! $ "( )& * $ +,-.)/ ) 01 " * ). " 2")3 )01 ( /" 433% /1 " 0 "51 " -.)/$ 6',)") 4.))%) 0

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