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1 微生物检验与自动化仪器的应用 广州军区总医院检验科 徐德兴

2 自从 17 世纪荷兰的吕文虎克自制镜片, 装配成简单的原始显微镜以来, 微生物学的实验研究已进行了 300 多年 但多少年来, 人们在分离微生物方面, 一直沿用由革兰 (Gran) 和郭霍 (Koch) 所创造的传统的手工方法 直到 60 年代, 源于太空计划的 VITEK 全自动化细菌鉴定仪出现 ;70; 年代, 国外才生产出半自动化的血培养仪 ; 当 80 年中期, 国内许多医院血细胞计数仪和全自动生化分析仪已经普遍使用和更新时, 而微生物学检验的自动化还是一片空白

3 进入 80 年代后期, 有的医院才陆续从国外引进一批微生物学检验的自动化仪器 自动化仪器的出现和使用, 使我国临床微生物学的检测工作前进了一大步, 也为提高这一领域的技术水平起到了促进作用 微生物学检验的自动化仪器根据微生物学的特点分为两种 : 一种是全自动血培养仪, 另一种是全自动微生物鉴定仪

4 一 全自动血培养仪 ( 一 ) 工作原理 1.Bactec460 血培养仪美国 BD 公司生产的 (1970 年 ) 世界上第一台较为先进的血培养仪 其原理主要是在培养瓶内加入含有放射性 14 C 棕榈酸底物, 当微生物生长时, 在代谢过程中利用培养基成分, 检测仪自动测定 14 CO 2 含量, 以生长指数 (growth index,gi) 表示 当 GI 值达到一定程度 ( 阈值为 30) 时, 仪器会自动发出报警信号, 表示有微生物生长

5 2 Bact/Alert 120 血培养仪 80 年代末期, 荷兰阿克苏公司研究出 Bact/Alert 系列的自动化血培养仪 利用微生物生长过程中释放出 CO 2 CO 2 又渗透到装在培养瓶底部的感应器上, 与水分子反应后, 产生 H +, 使感应器 ph 改变, 颜色由兰色变成桔黄色 ( 肉眼即可识别 ), 其反应式如下 : CO 2 + H 2 O H + + HCO 3

6 Bact/Alert 3D 培养仪上有最小有效量 (LED) 探测器, 每隔 10min 探测一次感应器的颜色变化, 并自动将结果输入计算机 ; 计算机再将连续探测的结果经计算处理, 绘制成微生物的生长曲线 ; 通过仪器对曲线变化分析, 选择运算法则 ( 加速度 速率 阈值法 ), 对标本及时快速自动报警, 报告阳性结果

7 3 Bactec 9120 血培养仪 90 年代初, 美国 BD 公司又推出新一代的 Bactec 9000 系列全自动血培仪 利用荧光增强, 连续检测技术, 微生物在代谢过程中利用培养基内养分, 释放 CO2 进入培养基, 此培养基与含有荧光物质的感应器作用, 促使感应器内荧光物质吸收后发出光源, 当仪器内部检测器测到一定荧光发生时, 立即以阳性培养信号显示 因采用敏感性较强的荧光信号, 又只需单一反应, 所以速度快, 准确性高, 干扰小

8 ( 二 ) 仪器的应用特点

9 1.Bactec460 培养仪的特点 只要培养瓶中有少量微生物生长, 含放射性的 14 CO 2 超过阈值 (30) 时, 仪器就会报警, 而此时培养瓶中液体是清晰的, 肉眼看不到混浊 Bactec460 根本问题是培养瓶含有放射性的 14 C 棕榈酸, 对人体有一定的危害, 而且同位素衰减期长, 难于处理.

10 2. Bact/Alert 3D 血培养仪的特点 优点 : 培养瓶就在仪器内孵育, 而且瓶子在不停的上下震荡, 能促使微生物快速生长 可动态观察微生物的生长情况, 计算机内设定了多种判读方式 ( 加速度 速率法 起始阈值法 ), 支持延迟放瓶, 弥补荧光法的不足 当培养瓶内 CO 2 不断增多, 感应器颜色连续变化时, 计算机荧屏上就会显示其号码的标本瓶为阳性, 同时声音报警, 全屏变黄 仪器本身可扩展和兼容同一仪器监测结核和一般细菌

11 3.Bactec 9000 系列培养仪的 特点 采用荧光染料吸收 CO 2 而发出荧光, 这个技术的特点是敏感性强, 报告阳性的时间更快,12 24 小时就能培养出 90% 的阳性结果 (20 个菌 /ml 血液 ), 而对产碱杆菌等不利用葡萄糖的菌株不需延长培养的时间 Bactec 9000 系列目前只支持做普通血培养, 及含血液分枝杆菌培养, 而不能做非无菌标本的 TB 培养和药敏试验 ; 但 BD 公司推出专业 TB 菌培养的全自动仪器 MGIT 960 和小的手工分枝杆菌

12 二 微生物鉴定系统 ( 一 ) 仪器的基本组成 1. 测试部分 2. 打印机 3. 试验板 ( 条 )

13 ( 二 ) 细菌鉴定工作原理细菌编码制定的原理 要有大量的细菌生化反应的资料菌名生化反应 GLU LYS ORN H2S IND LAT DUL MAL URE CIT 大肠埃希菌 志贺菌 爱德华菌 沙门氏菌 肺炎克雷伯菌

14 记录未知菌的生化反应结果, 用 + - 来表示 并输入计算机 电脑系统自动将输入结果与细菌生化资料计算如 : 未制菌的生化为 与大肠埃希菌鉴定百分率 : = 志贺菌 : 100 ( ) ( ) ( ) =0.0 肺炎克雷伯菌 : (0.8) ( ) ( ) ( )= 上面三种菌中鉴定值最大为大肠埃希菌

15 ( 三 ) 手工鉴定系统 手工鉴定系统均采用数值鉴定法, 将测试菌加入试验条, 在普通温箱内孵育 小时, 再加入附加试剂, 根据各种颜色变化, 人工判读阳性或阴性结果 ; 再将阴 阳性转换成数码

16 API 系统的特点 各种自动化仪器的补充和金标准 ⑴API 最大优点是选用的试验条种类较多 ⑵API 的生长反应, 采用新型呈色底物, 人工易识别 ⑶API 系半自动化, 大部分靠手工操作

17 RaPID 快速细菌鉴定系统的特点 ⑴RaPID 系统是由美国 Remel 公司开发生产的一种新型细菌 ( 真菌 ) 检测系统 ⑵RaPID 系统最主要的特点是 : 一是快速, 二是操作比 API 简便 ⑶ 适合于没有自动化鉴定仪器的医院使用

18 MicroScan 快速细菌鉴定及药敏系统的特点 ⑴ MicroScan 系统是由美国德灵诊断 (Dade Behring) 开发生产的细菌鉴定及药敏的手工系统与其自动系统 AutoScan 4 和全自动系统 WalkAway 采用相兼容的鉴定及药敏检测板块 ⑵ 拥有大量和准确的鑑定细菌的数据库 ⑶ 适合于没有自动化鉴定药敏仪器并希望将来在微生物实验室逐步升级为自动化或全自动化的医院使用

19 ( 四 ) 半自动鉴定药敏系统 目前, 市场上主要的自动鉴定药敏系统有美国德灵诊断 (Dade Behring) AutoScan 4 自动鉴定药敏系统和法国 biomerieux 的 ATB 自动鉴定药敏系统等 对于中小型的实验室可以选择

20 AutoScan 4 自动鉴定药敏系统 1 与其半自动系统 Autoscan 4 采用相兼容的鉴定及药敏检测板块 2 试剂及接种孵育等在机外进行, 机器自动读板并自动传送判读数据至计算机系 统进行数据统计及打印结果

21 ATB 自动鉴定药敏系统 (1)ATB 是由 API 的标准改良而成, 鉴定菌种达 600 种 (2) 试剂及接种孵育等在机外进行, 机器自动读板并自动传送判读数据至计算机系统进行数据统计及打印结果

22 ( 五 ) 全自动化仪器鉴定系统 MicroScan SI 鉴定药敏系统 是美国 70 年代中期生产的一种生自动化鉴定仪 鉴定 : 采用数值法, 但它是将试验板放在仪器内孵育, 由读数仪来判别阴 阳性, 计算机将阴 阳性结果转换成出现频率, 与计算机储存的某类菌群中所有菌总出现率之和进行比较, 求得鉴定 %

23 鉴定 %= 测试菌的出现频率 某类菌群中所有菌的总出现频率 100% 如测试菌与计算机内储存菌中某一个菌鉴定 % 最接近, 则自动鉴定结果 最新型号有 MicroScan WalkAway SI, 系统鉴定菌种达 500 种

24 ⑵ 药敏试验 :DMS: 软件中含 86 种抗生素, 不同 类型的板上, 抗生素的种类不同 G- 板上含 种抗生素,G+ 板上含 种抗生素, 为直接药敏浓度, 符合最新的 NCCLS 药敏试验的法规 可一板二用 ( 鉴定加药敏 )

25 Vitek 鉴定药敏系统 ⑴ 鉴定基础读数 现时读数百分变化率 (%)= 基础读数 100% ⑵ 药敏试验 : 根据回归分析法的原理, 计算机将各小池每小时细菌生长的结果进行回归分析, 所得斜率值与经典方法所测 MIC 值进行比较, 最后测出测试菌对某抗生素的 MIC 值 ( 与 NCCLs 吻合, 通过 FDA) 快速药敏可在 2 小时实现 (VITEK 2)

26 PHOENIX 鉴定药敏系统 ⑴ 鉴定 :Phoenix 全自动鉴定药敏仪是 BD 公司 2000 年生产的一种全自动化鉴定仪 ⑵ 药敏试验 :90% 细菌的鉴定在 2 4 小时完成, 85% 细菌药敏在 4 6 小时内出结果

27 全自动仪器的应用特点 全自动化微生物鉴定系统均有一个计算机专家系统软件可以提供各种数据分析及流行病学的统计 下面将各仪器的特点总结归类如下 :

28 1.MicroScan SI 鉴定系统的特点 是较早应用于临床的全自动鉴定仪 该系统的检测原理同时使用了比色法, 荧光法及比浊法 仪器可鉴定的种类分别为革兰氏阴性菌 & 革兰氏阳性菌 酵母菌 厌氧菌 苛氧菌 药敏实验为直接法, 可以不依赖细菌鉴定的结果而直接得到 MIC 的结果, 这有助于当细菌暂时未鉴定出来时, 实验室仍然可以为临床提供该未知菌的药敏结果, 从而指导临床用药

29 2. VITEK 一 二代鉴定系统共 302 种 135 种 GN 菌 115 种 GP 菌和 52 种真菌, 12 种细菌鉴定板 28 种 45 孔药敏板. 药敏实验原理 : 微量肉汤稀释法测定 MIC( 按 NCCLs 参考方法, 全部通过 FDA 测试 ) 该系统的检测原理 : 采用荧光法 多通道显色法 ( 鉴定 ) 及动态比浊法 ( 药敏 ) 采用真空充填方法加样, 操作简单环保, 符合生物安全要求

30 AES 高级专家系统 高智能专家系统的理论基础 组成和临床意义 见并参考约 生物梅里埃公司将内部研究的数据, 结合微生物学家的意 100,000 篇 已发表的权威杂志的文章中有关细菌耐 药的资料, 建立起 AES 庞大的数据库 它包含了目前世界上已 知的约 200 种耐药机制,2,000 种细菌的耐药表型和 20,000 个抗生素 MIC 的分布图 这些数据包括我们熟识的 PRP, MRSA,ESBL,VRE,HLAR, VRSA 等外, 也包括了很多国内还未出现的或尚未检测到的耐药菌株数据

31 3.PHOENIX 鉴定系统 仪器可鉴定 419 种革兰氏阴性菌 & 革兰氏阳性菌等 其中有 262 种 GN 菌和 157 种 GP 菌 BDXpert 专家系统软件可以提供准确的鉴定结果 最佳的药敏结果判断标准 每种抗生素有 3-7 个药物浓度, 是真正的 MIC 值和各种耐药机制的监测, 如 ESBL,MRSA,VRE,HLAR 等 从而保证了实验结果的准确性

32 自动化仪器的几个有关问题 1. 使用自动化仪器的技术人员, 要具备一定的素质和临床微生物检验的工作经验, 同时应有一定的英语水平 2. 严格按照仪器要求的条件各程序操作 3. 自动化仪器也不是万能的 4. 自动化仪器有其设计的年代性和局限性

33 衷心感谢各位专家教授 莅临指导!

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