康 磊 等 9& 靶向的放射性标记探针对乳腺癌小鼠模型的活体显像 5 > $ ' %# B # $ > > * -' 9 ' $ 7$ % $ # > # % $ # & %# 9 9 是一类小分子非编码 9 一般为 个核苷酸 经与靶基因的 E 端非编码区域互补配对 通过抑制或降解作用在转录

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1 ?7 927 *C"9 9":*" =<*2 <"*9*:$ 9 论著 # 靶向的放射性标记探针对乳腺癌小鼠模型的活体显像 康 磊 霍 焱 王荣福 张春丽 闫 平 徐小洁 北京大学第一医院核医学科 北京 军事医学科学院生物工程研究所 北京 摘 要 目的 9& & 显著高表达于乳腺癌 肺癌 肝癌等多种恶性肿瘤 本研究旨在构建靶向 & 的放射性示踪探针对乳腺肿瘤的活体显像 方法 体外化学合成靶向 & 的反义互补寡核苷酸探针 7& 并对其进行 E 端乙酰基修饰及 E& 甲氧基修饰 进而与双功能螯合剂 9<& 偶联后 在氯化亚锡的还原作用下对其标记 评价血清稳定性 并对乳腺癌荷瘤裸鼠进行活体显像 对比反义 无义及阻断组的显像差异 并通过实时定量 % B $& & 鉴定肿瘤的 & 水平 结果 & 7& 的制备标记率达 5 放射化学纯度大于 放射比活度约为 通过对比无义对照组及阻断组 & 7& 能够在活体水平特异性地显示 & 高表达的恶性肿瘤 此外 针对 & 不同表达水平的肿瘤 & 7& 亦可在活体水平反映其表达差异 结论 经化学修饰的 标记的 7& 探针具有良好的血清稳定性及活体肿瘤靶向识别作用 为肿瘤显像提供了潜在的新型探针 关键词 微 9 锝 乳腺肿瘤 寡核苷酸探针 放射性核素显像 小鼠 裸 中图分类号 5 文献标志码 文章编号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基金项目 国家自然科学基金 5 高等学校博士学科点新教师专项科研基金 首都临床特色应用研究 5 资助 % # > ' 9 $9 % $ % # ' 5 ' < ' *#% $ ' ' % # 9 ' # ' $% # $ $' # $ ' 5 # % ' & $ %I D $ D ' % ' >% # %$ ' A 网络出版时间 5&&5 网络出版地址 ' A A # $ 55' $

2 康 磊 等 9& 靶向的放射性标记探针对乳腺癌小鼠模型的活体显像 5 > $ ' %# B # $ > > * -' 9 ' $ 7$ % $ # > # % $ # & %# 9 9 是一类小分子非编码 9 一般为 个核苷酸 经与靶基因的 E 端非编码区域互补配对 通过抑制或降解作用在转录后水平进行调控 广泛存在于真核生物体内并发挥多种重要的调控功能 当某些 9 由于基因扩增 缺失 变异等原因发生表达失调 增多或减少 时 可以导致恶性肿瘤的发生 9 可作为一类肿瘤标志物 协助恶性肿瘤的早期诊断 疗效评估及预后判断 甚至部分 9 本身可作为治疗药 物 9& & 是早期发现具有癌基因功能的 9 定位于染色体 细胞整合簇的非编码区 参与分化 造血 炎症 凋亡和免疫过程 研究证实 & 显著高表达于乳腺癌 肺癌 结肠癌 胰腺导管癌 甲状腺癌 淋巴瘤等多种恶性肿瘤 在肿瘤发生 发展 侵袭及转移中发挥重要的作用 评价恶性肿瘤中高表达的 & 对恶性肿瘤的早期诊断 疗效评价 治疗指导等方面具有潜在的应用价值 反义寡核苷酸能够与序列互补的 9 发生特异性的结合 利用这一特点 设计和合成与特定 9 互补结合的反义寡核苷酸 & 9$ & % $ # 7 标记放射性核素达到放射性示踪作用 可在体内与互补的 9 进行特异性结合 显示肿瘤部位高表达的 9 分布 通过放射性显像设备在活体水平对肿瘤进行显像 5 本研究通过双功能螯合剂 9<& 介导放射性核素锝 & 标记 & 靶向的 7 在活体水平评价其在乳腺癌荷瘤裸鼠模型的显像情况 拟为肿瘤阳性显像提供一种新型的无创性显像探针 材料与方法 主要材料与仪器 & 乙酰基 &9<& 由 = 教授 B '% # $ '$ 提供 7 选择与 & 完全互补的序列 在 E 端连接 碳己基和氨基提供偶联结构 7& 序列为 E&9< & & & & E 在 7 两端 个碱基进行硫代修饰 '& ' ' 两端各 个碱基 E& 甲氧基修饰 E&7& ' $E&7 以提高核酸稳定性 对照组探针 >$ $ 序列为 E&9< & & & E 修饰方式同上 以上探针由生工生物工程 上海 股份有限公司进行化学合成和修饰 '# 购于美国 * ' 公司 高锝酸钠溶液购于中国北京原子高科技术股份有限公司 放射性活度仪购自中国计量科学研究院 * 为美国 * 公司产品 9&& 羟乙基哌嗪 &9&& 乙磺酸 <* * 氯化亚锡 $ < 7 二甲基甲酰胺购于 &$# ' 公司 酒石酸钠 乙酸铵 氢氧化铵等常规分析纯化学试剂购于北京化学试剂公司 & 7& 标记探针的制备 & 7& 标记探针的制备分为 7& 与 9<& 的偶联反应及 标记反应两步 基本与之前研究相同 取适量 7 探针溶于 $ 2<* * 缓冲液 < 中 与适量 9<& 相混 使 M 7 的最终摩尔比为 M 室温下静置反应 ' 后得到偶联产物 纯化后在碳酸氢钠 $ 2 乙酸铵 $ 2 和氢氧化铵 5 $ 2 的酒石酸钠缓冲液 < 中 加入适量新鲜的 7 淋洗液 5 $ < 7 2 加热 L 反应 ' 得到标记产物 进行高效液相色谱法 ' ' $ % # ' ' < 2 纯化和鉴定 血清稳定性将 标记的 7& $ 按照体积比 M 溶于新鲜人血清中 室温静置 ' 分别使用 质量分数 琼脂糖凝胶电泳评价该探针在 ' ' ' ' ' ' ' 的血清稳定性 细胞培养及荷瘤裸鼠模型的建立 &5 &@& 乳腺癌细胞系购买于美国典型培养物保藏中心 %$ % $& $ 将细胞在 体积分数 7 5 L 条件下常规培养于含 体积分数 胎牛血清及双抗的高糖 * 培养基 " B 公司 中 雌性 % % 裸鼠 周龄 购买并饲养于北京大学第一医院实验动物中心 将处于对数生长期的 4 5 的 &5 和 &@& 细胞分别接种于小鼠右腋下 待肿瘤直径长至 即可用于活体动物显像 动物显像取 & 高表达的 &5 及 & 低表达

3 ?7 927 *C"9 9":*" =<*2 <"*9*:$ 9 &@& 荷瘤裸鼠各 只 分别经尾静脉注射 & 7& 及 & $ 探针 A 约 5 此外 取 只 &5 荷瘤裸鼠预先尾静脉注射无标记的 7& A 进行阻断 ' 后再注射 & 7& 进行显像 将裸鼠俯卧位使用低能 高分辨平行孔准直器采集静态图像 ' 采集计数为 像素为 4 放大倍数为 5 倍 2 实时定量 % B $& & 显像后 脱颈处死荷瘤裸鼠取肿瘤组织 通过 & 测定其 & 水平 先使用 -$ 试剂 " B 公司 从肿瘤组织中提取总 9 再使用 9 公司 合成 9 然后使用 9 公司 对其扩增 使用 9 作为内参 对 & 的含量进行定量 以循环阈值 ' '$# $ 表示 & 的相对表达量 统计学分析应用 5 统计学软件进行统计学分析 定量资料用均数 3 标准差来表示 两组间的比较采用 %# 检验进行分析 值小于 为差异有统计学意义 结果 标记结果 7& 偶联 9<& 后 在氯化亚锡的还原作用下可以被 标记 图 向反应体系中加入新鲜 2 7 淋洗液 2 $ < 7 2 加热 L 反应 所得产物标记率可达 5 放射化学纯度大于 放射比活度约为 图 & 7& 的制备示意图 ' # & 7& # ' ' $ % # ' ' 血清稳定性评价将 & 7& 置于人新鲜血清中不同时间 经凝胶电泳鉴定其条带稳定性 结果显示 在 ' 内 标记探针均显示为唯一的条带 随着时间延长 条带亮度未见明显降低 未见拖尾及扩散现象 图 说明经过 E&7 及 化学修饰的 & 7& 探针在新鲜人血清中具有良好的稳定性 &5 荷瘤裸鼠显像选择 & 高表达的 &5 荷瘤裸鼠作为动物显像模型 通过尾静脉分别注射 标记的 7& 探针和无义靶向的对照探针 结果显示 注射后 ' 内 裸鼠腹部的放射性浓聚最多 主要位

4 J#& 康磊"等2 "LL 靶向的放射性标记探针对乳腺癌小鼠模型的活体显像 于肝脏位置& 随着显像时间延长"全身的放射性本 底逐渐降低"注射 > "LL 的荷瘤裸鼠可以 清晰显 示 出 肿 瘤 影 像" 而 注 射 对 照 探 针 及 非 标 记 2d #J" 肿瘤 $lj$ S&"%[%$ %""图 Hd$ "表明 > "LL 在 肿 瘤 部 位 的 摄 取 水 平 可 以 反 映 '3 "LL 的局部表达水平& "LL 阻断后的裸鼠则无法显示出肿瘤图 J$"提 "LL 探针在荷瘤裸鼠体内能够浓聚于 '3 示 "LL 高表达的肿瘤部位"具有肿瘤靶向显像能力& 图 HG> "LL 于人新鲜血清中的凝胶电泳结果 J$ 3'HG< ;9 7 > "LL * 9 97' * 7' 图 G> "LL 在不同 '3 "LL 表达水平的乳腺癌荷瘤 及 I3>?C3检测的 3 "LL 表达水平 d$ 肿瘤 'J$ 3'GU *' ' ' * 5 *b * ' 5 Z 9 5 * A ; * f '3 "LL 9 5'* * " *5 9 f '3 "LL > * 7' 75 * 5 b:i3>?c3 d$ 图 IG> "LL无义对照及阻断组在 2CG S 荷瘤裸鼠模型的活体显像结果 J$ 3'IGU *' ' ' * 2CG S 7' b *' * > "LL" 'b * *5 b e 5 7; H$ 不同 '3 "LL 表达水平的荷瘤裸鼠显像结果 IG讨论 '3W@是一类小分子非编码 3W@"能够在转录 后水平参与细胞增殖分化和凋亡等多种细胞信号 为评价 >标记的 "LL 探针在肿瘤部位 的摄 取 情 况 能 否 反 映 '3 "LL 的 表 达 水 平" 选 择 通路& 研究表明"'3 "LL 可以编码转录调控蛋白 2CG S 和 2=@ 2d #J" 这两种荷瘤裸鼠模型分别 Bd?" B#G# C: *=?4 gj3" DUDC g 及 高 表 达 和 低 表 达 '3 "LL" 结 果 显 示" 2CG S 和 ><G*L & '3 "LL 在乳腺癌肺癌结肠癌胰腺导管 2=@ 2d #J" 这两种荷瘤裸鼠均可以显示出肿瘤放 癌甲状腺癌淋巴瘤等多种恶性肿瘤具有高表达特 射性浓聚"但 2CG S 荷瘤裸鼠的肿瘤部位放射性浓 征"特别是在乳腺肿瘤中"相比癌旁组织显著高表达" 聚在各个时间点均显著高于 2=@ 2d #J" 荷瘤裸 在肿瘤发生发展侵袭及转移中发挥重要的作用*& & 鼠 图 H@$ & 取两种模型的肿瘤进行 I3>?C3实验 因此"通过对肿瘤组织中高表达的 '3 "LL 进行活体 检测该肿瘤组织的 '3 "LL 表达水平"结果显示" 显示"有望在活体水平对恶性肿瘤组织进行显像& 2CG S 荷 瘤 裸 鼠 肿 瘤 的 '3 "LL 表 达 显 著 高 于 蛋白 受 体 激 酶 细 胞 核 和 =W@结 合 蛋 白" 如 CN 本研究选择 '3 "LL 作为靶点"将放射性核素

5 ?7 927 *C"9 9":*" =<*2 <"*9*:$ 9 示踪技术与 9 的分子生物学特征相结合 设计具备特定化学结构的核酸分子 7& 通过化学结构修饰如 E& 甲氧基修饰和硫代修饰提高其血清稳定性及生物活性 使之能够与 & 发生特异性靶向结合 并且通过与双功能螯合剂 9<& 偶联可被放射性核素 所标记 最终制得放射性核素 标记的 & 靶向探针 & 7& 为新型 无创性的肿瘤分子显像探针 并分别从放射性标记 血清稳定性 肿瘤细胞摄取 体外抑制活性以及荷瘤动物体内生物分布与活体显像等方面评价 & 7& 用于肿瘤显像的潜在应用价值 目前针对 & 在体内水平的检测方法均为肿瘤活检组织的离体测定 如 9 基因芯片技术 9 ' >$ 检测 & 分析 免疫组织化学方法等 这些检测方法存在以下问题 有创性 需要穿刺活检 操作过程较为繁琐 结果有赖于病理组织的有效选取 存在一定的假阴性率 因此 9 的组织检测不能满足早期诊断的需要 不适于广泛的筛查和预防 放射性核素示踪技术的最大优势就是避免了检查的创伤性 实现了无创 活体 实时的肿瘤分子显像 不受标本取材的限制 对生物体进行整体全面的评价 避免了假阴性结果 靶向核酸探针能否与靶基因特异性结合 是靶向显像技术成功与否的关键 反义核酸与靶点的结合根本上取决于有效反义寡核苷酸的稳定性 未修饰的核酸分子在体内或血清环境下容易发生降解进而导致活性丧失 必须要使用一定的化学修饰方法来保证寡核苷酸的生物稳定性 目前关于核酸分子的化学修饰方式主要包括 E 糖基修饰 包括 E& 7 E&7& ' ' $ E&$% 锁核酸 $ A # % $ #29 和磷酸骨架修饰 ' ' ' > A> # 合适的化学修饰不但能够提高核酸探针与靶向 9 的杂交亲和力 提高其抵抗核酸酶降解的能力 而且还可以减缓核酸探针的血浆清除速度并提高进入组织的能力 29 修饰或肽核酸修饰的核酸探针通过抑制 & 用于治疗实体和血液系统恶性肿瘤 均取得了良好效果 本研究通过构建 &5 和 &@& 动物模型并在荷瘤裸鼠体内对比 & 高表达组和对照组标记的生物分布和肿瘤显像情况 进一步证实了 9 探针能够在体内发挥特异性靶向结合的能力 但是 到目前为止 设计实现肿瘤特异性的 9 肿瘤靶向探针仍然极具挑战 因为当 标记的小分子核酸探针在体内应用时 其活体分布是决定可否发挥活体作用性的重要问题 本研究采 用 标记的 7 探针进行活体显像 虽然在活体水平可以显示 & 过表达的肿瘤影像 但是荷瘤裸鼠腹部的放射性浓聚非常明显 & 靶向的寡核苷酸 7 属于单链小分子 9 在前期研究中 本课题组分别对反义核酸 端粒酶靶向 9 探针进行了 标记 同样发现这类小分子探针在肾和肝中的浓聚过高 分析其原因 一方面 小分子核酸分子属于水溶性 通过泌尿系统排泄 另一方面 本研究所采用的探针进行了全程硫代修饰 这种修饰方法增加了探针的脂溶性 使得其在肝脏摄取增多 因此 采用合适的载体来提高小分子核酸的体内有效分布对于提高肿瘤显像的敏感性 特异性意义重大 纳米载体可以将分子核酸进行包裹后提高其体内靶向分布 这种载体是否可以提高本研究的核酸分布效果值得进一步研究 综上所述 标记的 7 探针能够在活体水平显示肿瘤部位的 & 表达水平 通过显示肿瘤高表达的 & 有望探索其在恶性肿瘤的肿瘤靶向显像中具有的潜在应用价值 $ 9 > ' # %? $ 5 > : 9 %$ ' $? $ 55 %$% % 9 $ %$ $%$ #? ' 5 < 2? 2 $ 9 % # # > $? ' B 5 <? ' % = $ $ 9& B % %$ & $? & A 5?% AB B AB C%$ 2 $ & # # A ' $ $ # $ # $ &? 9 $ 5 2 C ' $" B # & & 9$ % $ # % B $ & % $ & # #? $ ' 9% $ # 5 C 2 %? $7 - # & # $> $ # > 9? $@ ' 5 ' '? <= & $ '% > &5 $ ' %' % & #% # % $??@ # % 9 &* $ $ $ ' ' 9# %$ $ %> 9? 9 % C 2 = $9 B B B %$ - 9# $ B ' & # $> $ # $& 9 %??9% $ # 5 王荣福 康磊 徐小洁 等 端粒酶靶向的 9 标记探针在肿瘤活体显像的研究? 2=< '%CC 2 C # ' # $ $? 9 & & 收稿 本文编辑 任英慧

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附件二: 推荐国家自然科学奖项目公示 项目名称 推荐单位 基于放射性示踪小分子核酸的肿瘤靶向显像研究 教育部 推荐单位意见 : 我单位认真审阅了推荐书及附件材料, 确认全部材料真实有效, 相关栏目均符合国家科学技术奖励工作办公室的填写要求 探索和寻求具有我国自主知识产权的肿瘤早期 特异诊断方法, 不仅可对肿瘤患者的治疗决策 疗效监测和预后评价等产生重要的临床应用价值, 且在抗肿瘤新药研发领域也具有重要意义 王荣福教授项目组以肿瘤早期诊断为出发点,

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