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1 论著 秀丽隐杆线虫作为 Ras / MAPK 信号通路的抗肿瘤 药物筛选模型研究 刘东玲1ꎬ2ꎬ3 ꎬ支德娟1 ꎬ白彦丽2 ꎬ周 (1.大学药学院ꎬ甘肃 婷2 ꎬ李红玉1 730000ꎻ2.甘肃中医药大学药学院ꎬ甘肃 3.甘肃省中药药理与毒理重点实验室ꎬ甘肃 摘要:目的 730000) 730000ꎻ 采用秀丽隐杆线虫 Ras / 有丝分裂原蛋白活化酶( MAPK) 信号通路上的过度激活系列突变 体研究该模式生物作为 Ras / MAPK 信号通路的抗肿瘤药物筛选模型的可行性及其分子机制ꎮ 方法 采用 96 孔板将索拉菲尼和依托泊苷作用于 L1 期秀丽隐杆线虫( 每孔 80 ~ 100 条) ꎬ并设空白对照ꎬ每个处理设 3 个重复ꎮ 培养秀丽隐杆线虫 4 ~ 5 d 后ꎬ于倒置生物显微镜下观察秀丽隐杆线虫野生型和突变体数目ꎮ 与空 白对照比较ꎬ野生型比例越高ꎬ说明药物效果越好ꎮ 结果 索拉菲尼能够剂量依赖性地逆转 let 60 / ras( gf) 和 mek / erk( gf) 双突变体多阴门表型ꎬ对其下游转录因子 lin 1( lf) 和 lin 31( gf) 多阴门突变体几乎没有影响ꎻ 依托泊苷对信号通路上游因子 let 60 / ras( gf) 及下游转录因子突变体 lin 31( gf) 均有明显的抑制作用ꎬ不依 赖细胞信号通路ꎮ 结论 瘤细胞毒药物ꎮ 秀丽隐杆线虫模型不但能够筛选靶向 Ras / MAPK 信号通路的抑制剂ꎬ还能评价肿 关键词:秀丽隐杆线虫ꎻRas / 有丝分裂原蛋白活化酶( MAPK) 信号通路ꎻ抗肿瘤ꎻ药物筛选模型 中图分类号:R965.1 文献标志码:B 文章编号:1003 8450(2018)02 0001 05 DOI:10.16841 / j.issn1003 8450.2018.02.01 生长因子受体介导的 Ras / 有丝分裂原蛋白活 化酶( MAPK) 信号通路是与细胞增殖 分化 凋亡等 密切相关的重要信号通路ꎬ该信号通路发生异常与 肿瘤的发生 发展密切相关ꎮ 在人类肿瘤细胞中 ras 基因突变占 15 ~ 30 ꎬ其中 90 的胰腺癌 50 的 结肠癌及 20 ~ 30 的急性白血病中有 ras 基因突 变 ꎮ Ras / MAPK 信号通路上 A raf 和 C raf 基 因 突变较少ꎬB raf 基因突变约占 7 [2] ꎮ 30 的卵巢 癌 35 ~ 50 的甲状腺癌和 50 ~ 70 的恶性黑色 素瘤中有 B raf 基因突变 [3] ꎮ 因此ꎬ该信号通路中 很多因子都可能成为肿瘤防治的潜在靶点 [4] ꎮ 秀丽隐杆线 虫 ( Caenorhabditis elegansꎬ 简 称 C. [1] elegans) 因其结构简单 生长周期短 基因与人类基 因具有高度同源性 易培养 适于高通量筛选等特 点ꎬ被广泛应用于药物初步毒性评价以及活性筛选 等领域 [5] ꎮ 秀丽隐杆线虫中的 Ras / MAPK 信号通 路是高度保守的ꎬ过度激活的 let 60 / ras 持续激活下 游的级联反应ꎬ导致多阴门表型ꎮ 可通过抑制多阴 门表型来筛选下调 ras 过度激活的药物候选物ꎬ近 年来已经被应用于化合物及中药抗肿瘤药物的筛 选 [6 7] ꎮ 目前ꎬ 关 于 秀 丽 隐 杆 线 虫 作 为 筛 选 靶 向 Ras / MAPK 信号通路的药物候选物 的 模 型 研 究 较 少ꎮ 因此ꎬ本研究采用秀丽隐杆线虫 Ras / MAPK 信 号通路上的过度激活系列突变体研究该模式生物作 为 Ras / MAPK 信号通路的抗肿瘤药物筛选模型的 可行性及其分子机制ꎬ为建立 Ras / MAPK 信号通路 的药物候选物的平台提供一定的理论依据ꎮ 1 材料 1.1 秀丽隐杆线虫株及大肠杆菌 秀丽隐杆线虫株:MT2124ꎬlet 60 ( n1046sdꎬgf) IV 多阴门 表 型ꎬ 由 Howard Hughes Medical Institute 惠赠ꎻCB1275ꎬlin 1( e1275) IV 多阴门表型ꎬ温度敏 感性(15 ~ 17 ꎬ突变体表型在 80 左右ꎻ20 左 右ꎬ突变体表型几乎达 100 ) ꎬ来源于 Caenorhabdi tis Genetics Center ( CGC) ꎻ PJ1115ꎬ gais37 IVꎬ ccis55 V 双突变多阴门表型ꎬ大约 25 培养突变体比例较 高ꎬ来源于 CGCꎻ MT301ꎬ lin 31 ( n301) II 多 阴 门 表 型ꎬ来源于 CGCꎮ 大肠杆菌:E. coli OP50ꎬ尿嘧啶渗 收稿日期:2016 10 18 基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(81603407) ꎻ国家自然科学基金地区基金项目( 81760789) ꎻ甘肃省中药药理与毒理重点实验室开 放基金项目[ ZDSYS ZZKJ 2013( C) 001] ꎮ 作者简介:刘东玲(1983 ) ꎬ女ꎬ副教授ꎬ理学博士ꎮ 研究方向:中药药理与毒理研究ꎮ 通信作者:李红玉(1964 ) ꎬ男ꎬ教授ꎬ理学博士ꎮ 研究方向:药物及保健品的开发与应用研究ꎮ E mail:lihy lzu.edu.cn 1

2 漏突变株ꎬ作为秀丽隐杆线虫的食物ꎬ购于 CGCꎮ 1.2 药品及主要试剂 依托泊 苷 注 射 液 ( 江 苏 恒 瑞 医 药 有 限 股 份 公 司ꎬ规格 0.1 g / 5 ml) ꎬ购于大学第一医院ꎬ批号 vp101202ꎻraf 抑制剂索拉菲尼( 纯度 98 ) ꎬ购自 24 h 后ꎬ 于 浮 游 生 物 计 数 板 上 计 数ꎬ 定 量 至 4 ~ 5 条 / μlꎬ备用ꎮ 2.2 药物对秀丽隐杆线虫 Ras / MAPK 信号通路上 多阴门突变体活性的影响 药效实验在 96 孔细胞培养板中进行ꎬ每孔中的 大连美仑生物技术有限公司ꎻ胆固醇( 分析纯) ꎬ上 终体积为 200 μlꎮ 先用 S 液线虫培养基将索拉菲 1.3 每孔加入 20 μl 的待测样品ꎬ使索拉菲尼终浓度分 海化学试剂研究所ꎮ 培养基 LB( luria broth) 液体培养基:氯化钠 10 g / Lꎬ蛋 尼 依托泊苷母液系列稀释成 10 倍待测样品浓度ꎬ 别为 1ꎬ2ꎬ4ꎬ6ꎬ8 μmol / Lꎬ 依托泊苷 终 浓 度 分 别 为 白胨 10 g / Lꎬ酵母粉 5 g / Lꎬ利用蒸馏水配制ꎬ并用 400ꎬ600ꎬ800ꎬ1 000 μmol / Lꎮ 然后加入 20 μl 已制 菌20 minꎮ M9 Buffer ( 1L ) : 2. 2 mmol / L KH 2 PO 4 ꎬ 20 μl 已 制 备 好 的 10 mg / ml 的 OP50 菌 液 以 及 MgSO 4 ꎬ121 温度下灭菌 20 minꎮ NGM( nematode 20 生化培养箱中培养 4 ~ 5 dꎬ在倒置生物显微镜 1 mol / L的 NaOH 溶液调 ph 至 7.0ꎬ121 温度下灭 4.2 mmol / L Na 2 HPO 4 ꎬ48. 55 mmol / L NaClꎬ1 mol / L growth medium) 培养基(1L) :NaCl 3 gꎬ蛋白胨2.5 gꎬ 琼脂 17 gꎬ1 mol / L K 2 HPO 4 KH 2 PO 4 缓 冲 液 ( ph 6.0)25 mlꎬ蒸馏水 975 mlꎬ灭菌后加入分别过滤除 菌的 5 mg / ml 胆 固 醇 溶 液 1 mol / L MgSO 4 溶 液 1 mol / L CaCl 2 溶液各 1 mlꎮ 1.4 仪器 连续变倍体视显微镜( SMZ 180ꎬ上海凤凰光学 股份有限公司) ꎬ倒置生物显微镜( XDS 1Bꎬ重庆光 电仪器总公司) ꎬ台式高速冷冻离心机( TGL 20Mꎬ 上海卢湘仪离心机仪器有限公司) ꎬ不锈钢手提式 高压灭 菌 器 ( SYQ DSX 280ꎬ 上 海 申 安 医 疗 器 械 备好的 L1 期秀丽隐杆线虫液(4 ~ 5 条 / μl) ꎬ再加入 140 μl的 S 液培养基ꎮ 每个处理设 3 个重复ꎬ放在 下观察秀丽隐杆线虫野生型和突变体数目ꎮ 野生型 比例 / 野生型线虫数 / 线虫总数( 野生型数目 突 变体数目) 100 ꎮ 与空白对照比较ꎬ野生型比例 越高ꎬ说明药物效果越好ꎮ 线虫的野生型和突变体判定:在线虫中ꎬlet 60 / ras(gf)突变体的过度激活能够持续地激活下游的因 子[Raf Mek Erk(MAPK)] 发生级联反应ꎬ导致线 虫产生多阴门表型[8] ꎮ 成虫期野生型和突变体线虫 的假阴门表型很容易在普通生物学显微镜下观察和 区别(线虫野生型见图 1 Aꎬ突变体见图 1B ~ D)ꎮ 厂) ꎬ恒温振荡器( HZQ F160Aꎬ上海一恒科学仪器 有限公司) ꎮ 2 2.1 方法 秀丽隐杆线虫培养及同步化 E. coli OP50 的培养:将从 CGC 购买的在固体 板上培养的 OP50 用接种环接种到 LB 液体培养基 里ꎬ放 在 摇 床 ( 37 ꎬ130 r / min) 上 培 养 20 h 后ꎬ 6 000 r / min离心 10 minꎬ收集菌体ꎬ并称重ꎬ用 S 液 重悬ꎬ制成质量浓度为 10 mg / ml 的 OP50 菌液ꎮ 秀 丽隐杆线虫培养:将冻存在 80 冰箱中的秀丽隐 杆线虫 Ras / MAPK 信 号 通 路 突 变 体 取 出ꎬ 迅 速 解 冻ꎬ铺于线虫 NGM 培养基上ꎬ在 20 生化培养箱中 培养至成虫ꎮ 秀丽隐杆线虫同步化:将几乎所有的 Aꎬ野生型 ( 有 1 个真阴门) ꎻBꎬCꎬD 为突变体ꎬ多阴门 表型( 均有 1 个真阴门ꎬ此外 B 有 1 个假阴门ꎬ 秀丽隐杆线虫培养至成虫后ꎬ将成虫收集到 10 ml 离心管中ꎬ4 000 r / min 离心 4 minꎬ弃上清后ꎬ剩下 液体少许ꎬ加入裂解液 5 mlꎬ涡旋振荡约 6 minꎻ然 后4 000 r / min离心 1 minꎬ小心弃去上清ꎬ加入 9 ml M9 Buffer 液ꎬ4 000 r / min 离心 1 minꎬ弃上清ꎬ剩余 2 ml液体ꎬ放在 20 生化培养箱中进行孵化ꎬ放置 2 图1 2.3 C 有 2 个假阴门ꎬD 有 3 个假阴门) 线虫野生型和突变体比较示意图( 200) 统计方法 实验数据采用 SPSS 17.0 统计软件进行统计分 表示ꎬ采用单因 析ꎬ计量资料服从正态分布时以 x±s

3 素方差分析ꎬP<0.05 表示差异有统计学意义ꎮ 采用 逆转 let 60 / ras( gf) 和 mek / erk( gf) 双突变体多阴门 3 且具有 剂 量 依 赖 关 系ꎻ 对 其 下 游 转 录 因 子 lin 31 Origin8.0 软件绘制图形ꎮ 3.1 结果 索拉菲尼对秀丽隐杆线虫 Ras / MAPK 信号通 路上多阴门突变体的影响 结果表明:与空白对照比较ꎬ索拉菲尼能够明显 表型ꎬ差异均有统计学意义( 见图 2 AꎬBꎬP<0.01) ꎬ ( gf) 和 lin 1( lf) 多阴门突变体几乎没有影响( 图 2 CꎬDꎬP>0.05) ꎮ 这与索拉菲尼靶向 Raf / Mek / Erk 结 果相一致ꎮ Aꎬlet 60 / ras( gf) ꎻBꎬmek / erk( gf) ꎻCꎬlin 31( gf) ꎻDꎬlin 1( lf) ꎮ 与空白对照比较 P<0.01ꎮ 图2 3.2 索拉菲尼对秀丽隐杆线虫 Ras / MAPK 信号通路上多阴门突变体的影响 依托泊苷对秀丽隐杆线虫 Ras / MAPK 信号通 逆转信号通路上游因子 let 60 / ras( gf) 及下游转录因 结果表明:与空白对照比较ꎬ依托泊苷能够明显 意义(图 3 AꎬBꎬP<0.01)ꎬ且具有剂量依赖关系ꎮ 路上多阴门突变体的影响 图3 子突变体 lin 31(gf)的多阴门表型ꎬ差异均有统计学 Aꎬlet 60 / ras( gf) ꎻBꎬlin 31( gf) ꎮ 与空白对照比较 P<0.01ꎮ 依托泊苷对秀丽隐杆线虫 Ras / MAPK 信号通路上多阴门突变体的影响 3

4 第 35 卷第 2 期 2018 年 4 月 J GANSU UNIVERSITY OF CHINESE MEDICINE Vol 35 No 2 Apr 讨论 秀丽隐杆线虫是一种常见的小型土壤线虫 ꎬ 属 于线形动物门 线虫纲动物 ꎬ 以大肠杆菌 E. coli OP50 为食 ꎬ 在土壤中自由生长 ꎮ 秀丽隐杆线虫全身 透明 ꎬ 在发育过程中很容易在显微镜下对其细胞和 组织进行跟踪观察 ꎬ 并具有雄性和雌雄同体 2 种性 别 ꎬ 自然繁殖的线虫绝大多数为雌雄同体 [9] ꎮ 秀丽 隐杆线虫成虫长约 1 mmꎬ 体径约 50 μmꎬ 在实验室 易于观察与操作 ꎬ 在 20 生化培养箱中培养 ꎮ 线虫 从受精卵发育为成虫仅需 3. 5 dꎬ 野生型线虫在 20 可存活约 20.0 d [10] ꎮ 秀丽隐杆线虫是一种经 典的模式生物 ꎬ 因其在发育遗传方面的相关研究获 得了 2 次诺贝尔生理医学奖 (2002 年和 2006 年 )ꎮ 秀丽隐杆线虫遗传背景清楚 个体结构简单 生活史 短 ꎬ 它的基因组测序和细胞图谱已绘制完成 ꎬ 线虫的 蛋白质组序列中至少有 40% 的人类同源基因 [11-12] ꎬ 这为研究人员通过秀丽隐杆线虫探讨药物作用及其 作用机制奠定了基础 ꎮ 因此 ꎬ 秀丽隐杆线虫被广泛 应用于药物筛选及其毒理学等研究领域 [13-14] ꎮ Ras 是一种小分子蛋白鸟苷三磷酸酶 ( GTP ase)ꎬ 是肉瘤病毒基因的同源物 ꎮ Ras / MAPK 信号 通路是一条被广泛激活的 MAPK 通路 ꎬRas 被激活 能引起下游的蛋白激酶级联反应 ꎬ 将细胞外信号传 递进入细胞内 ꎬ 引起一系列细胞反应 ꎬ 从而调控细胞 增殖 凋亡 分化 转移等 [15] ꎮ 该信号通路的失调与 肿瘤的发生 发展有着密切的关系 ꎮ 在秀丽隐杆线 虫中 ꎬ let 60 编码的 Ras 蛋白与人类的 K Ras 和 N Ras 蛋白在前面的 164 个氨基酸 ( 总共 184 个氨基 酸 ) 中有 83% 是完全相同的 ꎬ 该基因是调节线虫阴 门发育的一个因子 [8] ꎮ 线虫中的 let 60 / ras 突变和 人类癌症中检测到的 ras 是相似的 ꎬ 而且 let 60 / ras 转导阴门发育信号通路是从 let 23 细胞膜受体开始 经 Sem 5 因子到下游的激酶因子这样的顺序激活 Lin 45 / Mek 2/ Mpk 1 MAPK 通路 [16] ꎮ 因此 ꎬ 线虫的 阴门发育过程由 Rtk / Ras / Raf / Map 激酶级联反应决 定 ꎬ 和哺乳动物中 Ras 调控的细胞增殖信号通路高 度保守 ꎮ [17] Hara 等首次利用秀丽隐杆线虫作为体内 模式生物来评价法尼基转移酶抑制剂 ( FTIs) 的活 性 ꎬ 以秀丽隐杆线虫 Ras / MAPK 信号通路上系列 多阴门表型突变体株作为观察指标 ꎮ 结果发现 ꎬ 该药能够明显将 ras 基因的活力过度激活型突变 体逆转为野生型 ꎬ 且对多产卵器表型的逆转作用 呈剂量依赖性 ꎮ 后来发现体外细胞实验中具有很 4 好效果的 FTIs 在临床应用时却和体外实验效果不 一致 ꎬ 这个结果吸引了 Lackner 等的注意 ꎬ 于是他 们利用线虫突变体 ꎬ 确定了 FTIs 的另一个直接作 用靶点 Rab 香叶烯基转移酶 ꎮ 这与他们推测 FTIs 的治疗效应可能是由其他的分子机制引起的结果 是一致的 ꎮ 这个结果不仅加强了对 FTIs 作用机制 的理解 ꎬ 也让人们对秀丽隐杆线虫在研究靶向肿 瘤药物筛选中的应用有了一个全新的认识 ꎮ 王 [6] 昉利用秀丽隐杆线虫突变体研究中药提取物的 抗 ras 活性 ꎬ 结果表明大黄 鸦胆子 钩藤和苦参的 中药提取物对 ras 基因突变体线虫的多阴门表型 [7] 有不同程度的抑制作用 ꎮ Reiner 等利用作为模 式生物评价 ras 靶向的抗肿瘤药物候选物 ꎬ 采用 Mek 抑制剂测试 U0126 对线虫 Ras / MAPK 信号通 路上多阴门突变体的抑制作用 ꎬ 发现 U0126 能够 剂量依赖性地抑制 Mek 上游 let 60 / ras( gf) 突变体 的多阴门表型 ꎬ 对下游转录因子 lin 1( lf) 多阴门突 变体几乎没有影响 ꎮ 这些应用将为秀丽隐杆线虫 作为靶向 Ras / MAPK 信号通路抗肿瘤药物筛选模 型提供了一定的应用前景 ꎮ 本研究选择了 Raf 靶向抑制剂索拉菲尼和细胞 毒药物依托泊苷评价秀丽隐杆线虫作为靶向 Ras / MAPK 信号通路药物筛选模型的可行性 ꎮ 索拉菲尼 是 Bayer 和 Onyx 公司共同研制的一种多靶点的生 物靶向新药 ꎬ 临床前研究和临床试验提示索拉菲尼 有广泛的抗肿瘤作用 ꎮ 研究表明 ꎬ 索拉菲尼可通过 抑制 Raf 活性从而阻断 Raf / Mek / Erk 信号传导通 路 ꎬ 抑制肿瘤细胞的增殖 ꎬ 直接抑制肿瘤生长 ꎮ 结果 发现索拉菲尼能够剂量依赖性地抑制 ras 过度激 活 ꎬ 对其下游转录因子 lin 1(lf) 和 lin 31(gf) 多阴门 突变体几乎没有影响 ꎬ 这与 Mek 抑制剂 U0126 抑制 其上游因子引起的多阴门表型 ꎬ 而对其下游因子突 变体多阴门表型却无影响的结果一致 [7] ꎮ 本研究 还进一步利用细胞毒药物依托泊苷间接验证了线虫 作为靶向 Ras / MAPK 信号通路药物筛选模型的可 行性 ꎮ 依托泊苷为细胞周期特异性抗肿瘤药物 ꎬ 其 作用机制主要为抑制 DNA 拓扑异构酶 Ⅱꎬ 从而干扰 DNA 的结构和功能 ꎮ 其并不像索拉菲尼一样是一 个信号通路靶向药物 ꎬ 而是一个细胞毒的抗癌药物 ꎮ 结果发现依托泊苷对信号通路上游因子 let 60 / ras (gf) 及下游转录因子突变体 lin 31(gf) 都有明显的 抑制作用 ꎬ 不依赖细胞信号通路 ꎮ 因此 ꎬ 结果表明秀 丽隐杆线虫模型不但能够筛选靶向 Ras / MAPK 信 号通路的抑制剂 ꎬ 还能评价肿瘤细胞毒药物 ꎮ

5 参考文献: [1] Bos J L.Ras oncogenes in human cancer:a review[ J].Can cer Resꎬ1989ꎬ49(17) :4 682 4 689. [2] Garnett M JꎬMarais R.Guilty as charged:b RAF is a human oncogene[ J].Cancer Cellꎬ2004ꎬ6(4) :313 319. [3] Beeram MꎬPatnaik AꎬRowinsky E K. Raf:a strategic target [10] Lee JꎬNam SꎬHwang S Bꎬet al.functional genomic approa ches using the nematode Caenorhabditis elegans as a model system[ J].J Biochem Mol Biolꎬ2004ꎬ37(1) :107 113. [11] CeS Consortium.Genome sequence of the nematode C. ele gans: a platform for investigating biology [ J ]. Scienceꎬ 1998ꎬ282(5 396) :2 012 2 018. for therapeutic development against cancer[ J].J Clin Oncolꎬ [12] Sternberg P W. Working in the post genomic C. elegans [4] Roberts PꎬDer C.Targeting the Raf MEK ERK mitogen acti [13] Buckingham S Dꎬ Sattelle D B. Strategies for automated 2005ꎬ23(27) :6 771 6 790. vated protein kinase cascade for the treatment of cancer[ J]. Oncogeneꎬ2007ꎬ26(22) :3 291 3 310. [5] 冀娇娇ꎬ董洁ꎬ王贝贝ꎬ等.秀丽隐杆线虫在中药研究领域 中的应用[ J].中国现代中药ꎬ2016ꎬ18(4) :526 530. [6] 王昉.利用线虫作为模式生物筛选能够抑制癌基因 ras 活性的药物[ PDR].上海:复旦大学ꎬ2005:21 30. [7] Reiner D JꎬGonzález Pérez VꎬDer C Jꎬ et al. Use of Cae norhabditis elegans to evaluate inhibitors of rasfunction in vi world[ J].Cellꎬ2001ꎬ105(2) :173 176. analysis of C. elegans locomotion[ J]. Invertebrate Neuros ciꎬ2008ꎬ8(3) :121 131. [14] Crane Mꎬ Chung Kꎬ Stirman Jꎬ et al. Microfluidics enabled phenotypingꎬ imagingand screening of multicellular orga nisms[ J].Lab Chipꎬ2010ꎬ10(12) :1 509 1 517. [15] E O NeillꎬW Kolch. Conferring specificity on the ubiqui tous Raf / MEK signalling pathway[ J]. Br J Cancerꎬ2004ꎬ 90(2) :283 288. vo[ J].Methods Enzymolꎬ2008ꎬ439: 425 449. [ 16] Sternberg P WꎬHan M.Genetics of RAS signaling in C. ele during C. elegans vulval inductionꎬ encodes a ras protein [17] Hara MꎬHan M.Ras farnesyltransferase inhibitors suppress [8] Han MꎬSternberg P W.let60ꎬa gene that specifies cell fates [ J].Cellꎬ1990ꎬ63(5) :921 931. [ 9] Grant B DꎬWilkinson H A.Functional genomic maps in Cae norhabditis elegans[ J]. Curr Opin Cell Biolꎬ2003ꎬ15( 2) : 206 212. gans[ J].Trends Genetꎬ1998ꎬ14(11) :466 472. the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans[ J].Proc Natl Acad Sci USAꎬ1995ꎬ 92(8) :3 333 3 337. [ 编辑:徐 燕] Using Caenorhabditis elegans is to study the antitumor drug screening model of the Ras / MAPK signaling pathway LIU Dongling 1ꎬ2ꎬ3 ꎬZHI Dejuan 1 ꎬBAI Yanli 2 ꎬZHOU Ting 2 ꎬLI Hongyu 1 (1.College of PharmacyꎬLanzhou UniversityꎬLanzhouꎬGansuꎬ730000ꎬChinaꎻ 2.College of PharmacyꎬGansu University of Chinese MedicineꎬLanzhouꎬGansuꎬ730000ꎬChinaꎻ 3.Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology of Traditional Chinese Medicine in Gansu ProvinceꎬLanzhouꎬGansuꎬ730000ꎬChina) Abstract: Objective To study the biological model and the molecular mechanism of anti tumor drug scree ning model of using caenorhabditis elegans ( C. elegansis) as Ras / MAPK signaling pathway using its over activated series of mutants. Methods Sorafenib and etoposide were used to treat L1 nematodes in 96 well plate(80 to 100 cells per well) and a blank control group was set. Every processing method was set up with 3 replicates. After 4 to 5 days of nematode cultureꎬthe numbers of wild type and mutants of nematodes were observed under an inverted mi croscope. Compared with the blank controlꎬthe higher wild type ratio means the better drug efficacy. Results So rafenib reversed the multiple vulval phenotypes of let 60 / ras ( gf) and mek / erk ( gf) double mutants in a dose dependent mannerꎬbut had no effects on lin 1( lf) and lin 31( gf) which are its downstream transcription factors. Whereas etoposide has a significant inhibitory effect on the upstream signaling factor let 60 / ras( gf) and the down stream transcription factor mutant lin 31( gf) and does not depend on cellular signaling pathways. Conclusion C. elegans can not only screen for the inhibitors of target Ras / MAPK pathwayꎬbut also evaluate the cytotoxic drugs. Key words:c. elgansꎻ Ras / MAPK signal pathwayꎻ anticancerꎻ drug screening model 5

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