* 0 X :48 Y 8 中华放射医学与防护杂志 :48 年 4 月第 8 卷第 4 期3L 持续 低 剂 量 率 照 射 X X N,.* 下西 妥 昔 单 抗 对 结 直 肠 癌 细 胞,46 放射敏感性的影响及可能的机制* ( ( ) 将 细 胞 重 悬 于 :: 染 液 中

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1 ( =( * 0 X :48 Y 8 中华放射医学与防护杂志 :48 年 4 月第 8 卷第 4 期3L (放射生物学( 西妥昔单抗增加结直肠癌细胞对 持续低剂量率照射的敏感性 粒子 刘敬佳3王皓3曲昂3李金娜3赵勇3王俊杰 % 摘要& 3目的3 探 讨 在 放 射 性 粒 子 持 续 低 剂 量 率 照 射 下 西 妥 昔 单 抗 对 结 直 肠 癌 细 胞,46 放射敏感性的影响及可能的机 制* 方 法 3 实 验 将 直 肠 癌 细 胞,46 分 为 空 白 对 照 组 单 纯 4::, 处 理 组 单 纯,.*照 射 组 和 联 合,.*组* 克 隆 形 成 实 验 检 测 是否影响人结直肠癌,46 细胞对 放射性粒 子 持 续 低 剂 量 率 照 射 的 放 射 敏 感 性* 流 式 细,.*照射诱导的细胞凋亡的影响* 细胞周期检测 对 细 胞 周 期 的 调 节* 胞仪检测 对 检测细胞内 Z Z 的水平* 结果34::, 瑞 氏姬姆萨染色检测有丝分裂指数*,.*照 射 诱 导 的 细 胞 凋 亡 +b=s= *c:s: 增 加 的放射增敏比为 4S8并 能 够 增 加 Z Z 比值* 与空白对照组相比单独 处理可使,46 细胞 /4 期阻滞 +b :*c:s: 单纯,.*照射组细胞也存在 /4 期阻滞 +b6s*c:s:4 两者联合时的 /4 期阻滞效应与,.*单独处理时相比差异无统计学意义 +b:s6*q:s: * 有 丝 分 裂 指 数 检 测 结 果 显 示各 实,.*照 射 验组与对照组相比差异无统计学意义* 结论3 可增 加 结 直 肠 癌 细 胞,46 对 Z 比值增加,.*诱导的 细 胞 凋 亡与 细 的放射敏感性机制可能是 增加细胞内 Z 胞周期阻滞和细胞周期检查点功能无关* % 关键词& 3-3持续低剂量率照射-3放射敏感性-3结直肠癌细胞-3细胞凋亡 )E :F N =: :8 8 :F : : 8 N:8 : 8 8L =- ) ( & /0&. ) & ) ( N & + * ) + E ( ) & & ) & %0 2 + &, ) XSSXX 0 & 2 ) &-+ 0 & ) ( &, ZS 0-N. /=8 / 3,=[ 3 2 L X L,46 X L E:8 3 X N 2L E E X N N 2L N X L 2 / L 2LE Z Z N L L N EE 4S8 X /4 X L X E E +b=s=*c:s: X Z Z +b5s8 *c:s: X X /4 L N XE %: 8 :8 3,46 NL L L N L X E E. : 8 / 3-3 X X N -3* -3-3 E E 33临床 上 结 直 肠 癌 术 后 复 发 以 及 转 移 患 者 主 要 下 0 8 * 此 外表 皮 生 长 因 子 * 2引导 受体 %/-* 抑制剂西妥昔单抗 与伊 立 替康 放射 性 粒 子 近 距 离 放 疗 能 够 提 高 肿 瘤 局 部 具有协 同 抗 肿 瘤 效 应 被 美 国 食 品 和 药 物 管 理 局 采用姑息手术结合放化疗的治疗方法 0 4 控制率延长 患 者 生 存 期 -.+ 批 准 用 于 治 疗 伊 立 替 康 抗 拒 的 转 移 性 结 直.( 4:S=: :8 :56S:48S:4S:: 基金项目 国家自然科学基金64:468 作者单位 4::454 北京大 学 第 三 医 院 肿 瘤 治 疗 中 心 刘 敬 佳 王皓 曲昂 李金娜 王俊杰 -中国科学院动物研究所 生物膜与 膜 生 物工程国家重点实验室 赵勇 X N5:F LX 通信作者 王俊杰% 肠癌作为单药使用 相 比 于 最 佳 支 持 疗 法 也 能 取 得 一定疗效 04 * 大量的 基 础 研 究 显 示西 妥 昔 单 抗 不 仅具有细胞抑制和 一 定 的 细 胞 毒 性 作 用还 能 够 增 加肿瘤细胞的放射敏感性 0 = * 本研究将探讨在

2 * 0 X :48 Y 8 中华放射医学与防护杂志 :48 年 4 月第 8 卷第 4 期3L 持续 低 剂 量 率 照 射 X X N,.* 下西 妥 昔 单 抗 对 结 直 肠 癌 细 胞,46 放射敏感性的影响及可能的机制* ( ( ) 将 细 胞 重 悬 于 :: 染 液 中 Z ZX 北京庄盟国际生物 基 因 或 8i 科技 有 限 公 司 避 光 室 温 孵 育 : ZX 洗 两 遍 8:: : * 而 后 4 Z 材料与方法 Z ZX 重 悬 细 胞 流 式 细 胞 仪 -+& 美 4细胞培养,46 细胞购自北京市肿瘤防治研 究所* 基础 培 养 基 *04=8: 添 加 4:^ 胎 牛 血 清 美国 / Z(公司 i ^( 培养箱中培养* 粒子照射与 给 药 方 案 初 始 剂 量 率 S 4 美国 & 国 Z.公司 检测前加 4: ) - 2阳性细胞为凋亡细胞* 公司 * + =细胞周期检测照射剂量达 8 /后 86 L分 别消化 8 组细胞制成单细胞 悬 液调 整 浓 度 至 d 4 bs d4: 4: Zf 活 度 的 粒 子 48 颗 中 国 同 辐 4: * 取 4 细胞悬液Z& 洗两遍 g:i预冷 股份有限公司 模 仿 平 面 插 植 排 布在 细 胞 受 照 层 的 ^酒精 在 8i 冰 箱 中 固 定 过 夜* 而 后 用 面 形 成 均 匀 的 剂 量 分 布* 初 始 剂 量 率 为 预冷的 Z& 洗 两 遍 去 除 残 余 乙 醇 :: 染 色 液 S / L照射 4 8 /分 别 需 要 =: S 6: Z& 4: * + 4: 重 悬 细 胞 48S= L 0 6 * 西妥昔单抗 德国 0 [ & 公司 i水浴锅中避光孵育 : 每间 隔 4: 混匀 本 实 验 室 前 期 研 究 表 明 初 始 浓 度 4 次* 结 束 后 4 Z& 洗 4 a 次8:: Z& 重 4::, 预处理结直肠癌,46 细胞 8 L X 美 国 Z.公 司 检 测 悬流式细胞仪 -+& 可增加细胞对单次 外 照 射 的 敏 感 性放 射 增 敏 比 为 -,2S: 进行分析* 结果用软件 0 4S6 0 5 * 由于 察 与,.*为持续低剂量率照射为观,.*是否存在 联合效 应4::, 在细胞培养液中是持续存在的* 实验分组取对数生长 期,46 细 胞胰 酶 Z(公 司 消 化 制 成 单 细 胞 悬 液每 %.2+ 美 国 / 有 丝 分 裂 指 数 检 测 照 射 剂 量 达 8 /后 86 L分 别 消 化 8 组 细 胞制 成 单 细 胞 悬 液调 整 浓 * 取 d4: 个 细 胞 置 :S=^ k 度至 d4: 离 心 去 上 清:: 卡 诺 氏 固 定 低渗溶液中 4 重 悬固 定 细 胞 室 温 4 液 甲醇t冰醋酸 bt 培养皿种 d4: 个细胞4 L 贴壁后 弃 培养 结束后取 4 滴细胞悬液置于 8 孔板中5^无 水乙 液添加新 的 完 全 培 养 液* 分 别 为 空 白 对 照 组 单 醇洗两遍蒸 馏 水 冲 两 遍 稀 释 好 的 瑞 氏 姬 姆 萨 染, 处 理 组,.*组 h 独 4:: Z& 冲 洗 两 遍* 液覆盖细 胞 室 温 染 色 4: a: 普通光学 显 微 镜 下 计 数 双 核 的 有 丝 分 裂 细 胞* 有,.*组每组 个平行样* 8克隆形成实 验在 放 射 性 粒 子 照 射 模 型 丝分裂指数 ^ b双核细胞数 总细胞数 d4::^* 中照射 剂 量 达 到 4 8 /后即 刻 消 化 细 胞 制 成 6 检 测 照 射 完 成 后 在 不 同 时 间 单细胞悬液 锥 虫 蓝 计 数 后 取 一 定 数 量 的 活 细 胞 Z 的 含 量*标 记 点提取蛋白分别检测 Z 种至 = 孔 板 中 每 个 剂 量 点 设 个 重 复 样* 培 养 山羊抗 兔 二 抗 4 t :::北 京 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 48 a4 后 甲 醇 固 定 瑞 氏 姬 姆 萨 染 色 限公司 * 蒸馏 水 冲 洗 4 a 遍* 常 规 显 微 镜 下 计 数 q 5统计 学 处 理 每 个 实 验 重 复 次* 数 据 用 : 个细胞为 4 个克隆计算克隆形 成 率 * *b ELE E S: 软 件 采 用 非 配 m 表示采 用 / 克隆 数 细 胞 接 种 数 d4::^ 进 而 计 算 存 活 率 对 +检 验 或 双 因 素 方 差 分 析 比 较 组 间 差 异* *c 6 6b 处理组 * 对照组 * d4::^* 根据 :S: 为差异具有统计学意义* g4a 4: 多靶单击模型 6b4 g4 g 采用 / ELE 结33果 E S: 拟合剂量存活曲 线并 求 出 4: 4f 6 和 &%** &%*b单纯照射达到特定 生物效 应 所 需 照 4克隆形成实验检测 对,46 细胞放射 射剂量 照射联合放 射 增 敏 剂 后 达 到 同 样 生 物 学 效 敏感性的影 响 根 据 克 隆 形 成 实 验 得 到 的 结 果 拟 应所需照射剂量* 合生存曲线见图 4所 得 放 射 生 物 学 参 数 见 表 4由 细胞凋亡检测照射剂量达 8 /后 86 L分 表 4 求得 西 妥 昔 单 抗 的 放 射 增 敏 因 子 &%* 约 为 别消化 8 组细胞制成单细胞 悬 液调 整 浓 度 至 d 4S8* 并且经西妥昔单抗处理后,46 细胞 的 准阈 4: * 取 4 细胞 悬 液Z& 洗 两 遍控 干 水 分 剂量 4f 降低*

3 * 0 X :48 Y 8 中华放射医学与防护杂志 :48 年 4 月第 8 卷第 4 期3L ( 6( 表 L,46 细胞经 处理后的放射生物学参数 m 33组别,.*组 h,.*组 4: / 4f / 6 4S: m:s4 :S= m:s: 4S= m:s4 :S: m:s:8 :S6= m:s: :S8 m:s:= 4S66 m:s4: :S46 m:s:4 0 期 细胞比 并无相加或协同作用* 两者联 合组 / 例比空白对照组 减 少 +bs6*c:s: 单 独 处 理 组与对照组相比差异均无统计学意义 表 * 表 L各组细胞处理后 86 L 凋亡和凋亡 相关蛋白的变化 m 33组别 凋亡率 ^ 空白对照组 S44 m4s: :33 处理组 8S:8 m:s6 :S44 m:s:4 S4 ms= 4S5= m:s: 4=S m:s55 S8 m:s:5,.*组,.*组 h 图 L 对,46 细胞剂量生存曲线的影响 Z Z 33注 与空白 对 照 组 比 较 +b8s5 *c:s: - 与,.*组 比 33 增 加,.*诱 导 的 细 胞 凋 亡与 空 8 *c:s: 较+b=S= 5 白对照组 比 较 单 独 处 理 能 够 增 加 细 胞 凋 亡 338 对 / 0 检 测 点 功 能 的 影 响处 理 结 束 +b8s5*c:s: 与,.*联 合 具 有 协 同 效 后 86 L 经 姬 姆 萨 染 色 后 计 数 双 核 的 有 丝 分 裂 细 应比单独,.*诱导更多的细胞凋亡 +b=s= 胞得到有丝分裂指数* 空 白 对照组 组 5 8*c:S: 两者联 合 时 早 期 凋 亡 的 细 胞 明 显 增,.*组细胞有丝分裂指数分,.*组 h Z 比值也增加 图 表 * 加并且 Z 别 为 4S4: m S= ^ 4S: m S5 ^ 44S5: ms5 ^和44S=: ms= ^各 组 之 间 差 异无统计学意义* 讨33论 %/-*在多种上皮细 胞 癌 如 乳 腺 癌 结 直 肠 癌 卵巢癌中过表达 注4空白对照组- 6 分别为 处 理 结 束 后 : 8 86 L = 5 分别为,.*照 射 结 束 后 : 8 86 L-8 4: 分 别,.*处理结束后 : 8 86 L 为 h 0 4: * 很多研究表明肿瘤细胞 表 面 %/-*的表达具 有 放 射 防 护 作 用 此 作 用 可 人 为 地 划分 为 个 阶 段 早 期 时 %/-* 可 促 进 肿 瘤 细 胞.+损 伤 修 复 继 而 抑 制.+损 伤 诱 导 的 细 胞 凋 Z 蛋白在处理 图 L各实验组 Z 亡最后促进残余肿瘤细胞 的 加速 再 增 殖 结束后不同时间点的表达量 0 44 * 鉴于 此人们逐渐 研 发 了 一 系 列 抑 制 %/-*活 性 的 分 子 对细胞周期的影响经 处理后/4 u 厄 洛 替 尼 靶向 药 物 如 吉 非 替 尼 期,46 细胞 比 例 增 加 +b:*c:s: & 期 细 和 西 妥 昔 单 抗 X * 美 国 胞比例 不 变*,.* 后 /4 期 细 胞 比 例 增 加 -.+批 准 吉 非 替 尼 和 厄 洛 替 尼 可 作 为 单 药 用 于 治 +b6s*c:s:4 & 期细胞比例减少 +b=s*c 疗晚期非小 细 胞 肺 癌 :S:4 两者 联合后在 /4 期阻滞 和 & 期减少 效应 中 抗与伊立替康联合治疗 %/-*过表达的转移性 结直 0 4: 于 ::8 年 批 准 西 妥 昔 单 表 L,46 细胞处理后 86 L 细胞周期分布 ^ m 333组别 /: /4 & / 0 空白对照组 5S ms5 4S6 m8s55 S5= m4s:= 组 6S8 m:s= 44S:: m:s:5 S m:s4= 5S44 m:s S56 m:s4= 8S54 m:s: 5S8: m:s8 S54 m:s5 S=6 m:s4,.*组 h,.*组 33注 与同一周期空白对照组比较+b : 6S =S S6 *c:s:4

4 * 0 X :48 Y 8 中华放射医学与防护杂志 :48 年 4 月第 8 卷第 4 期3L ( 5( 肠癌患者* 在转移 性 结 直 肠 癌 的 三 线 化 疗 中单 独 短此段时间内肿 瘤 细 胞 再 群 体 化 效 应 较 弱因 此 相比于最佳支持治疗能够提高 患者的 生 活质 再群体化不是肿瘤细胞 对 量延长 无 进 展 生 存 期 和 总 体 生 存 期 0 4 * 与 影响因素 直肠癌能够延长患者的无进展生存期 * -.+于,.*放 射 敏 感 性 的 * 电离辐 射 诱 导 多 种 细 胞 反 应 包 括 蛋 白 合 成 伊立替康 联 合 用 于 治 疗 伊 立 替 康 抗 拒 的 转 移 性 结 蛋白激活以及活化 细 胞 周 期 检 查 点 功 能进 而 延 迟 :4 年批准将西妥昔单抗加入到化疗处方 -(,- * 0 检测点功能对电离辐射诱导 细胞增殖其中/ 中仅作为 k*+& 野 生 型 的 转 移 性 结 直 肠 癌 患 者 的 0 期 阻 滞 具 有 重 要 作 用 当 / 0 检测点功 的 / 一线治疗手段* 由于一 部 分 结 直 肠 癌 患 者 的 k*+& 0 阻 滞 效 应 消 失并 伴 有 有 丝 分 裂 指 能减弱时 / 基因存在突 变西 妥 昔 单 抗 并 不 能 完 全 抑 制 %/-* 数指数的升高 下游信 号 因 此 理 论 上 西 妥 昔 单 抗 只 用 于 治 疗 0 期阻滞 h,.*组 / 0 组未出现 / k*+& 基因野 生 型 的 肿 瘤 患 者* 但 仍 有 研 究 表 明 0 检测点功能可能出 期细胞比例 下 降预 示 着 / 在 k*+& 野生型的 转 移 性 结 直 肠 癌 患 者 中西 妥 昔 现问题* 但是经有 丝 分 裂 指 数 指 数 检 测 发 现实 验 单抗联合 标 准 化 疗 方 案 并 不 能 显 著 延 长 此 类 患 者 组与 对 照 组 细 胞 相 比 不 存 在 差 异 因 此 推 测 的无进展 生 存 期 和 总 生 存 期 * 0 等 0 4= 认 为结直肠癌 患 者 k*+& 基 因 微 小 突 变 的 不 可 检 测 者对西妥昔单抗治疗无反应的主 要原 因 * 目前 * 本 研 究 中,.*单 独 处 理,.*后未出现 / 0期细胞阻滞是由于细胞周期 的再分布* 本研究表明 增加结直肠癌细胞,46 对 和诊断明确后 发 生 的 突 变是 k*+& 基 因 野 生 型 患 0 4 0,.*的放射敏感性机 制 可 能 是 增 加 细 k*+& 基因突变型的结直肠 癌 患 者 尚 无 理 想 的 治 疗 Z 比值增加,.*诱 导 的 细 胞 凋 胞内 Z 手段因此本研究 旨 在 探 讨 是 否 增 加 结 直 肠 亡与细胞 周 期 阻 滞 和 细 胞 周 期 检 查 点 功 能 无 关* 癌细胞,46 k*+& 基 因 突 变 型 对,.*的 基因突变型结直肠癌患者的一个手段* 放射敏感性及其潜在的机制* 本研究显示 与,.*可 能 成 为 治 疗 k*+& 鉴于此 联 合,.*同 时 处 理 结 直 参 考 文 献 肠癌细 胞,46 具 有 协 同 抗 肿 瘤 效 应 即 能,.*的 放 射 敏 感 性 放 射 增 够增加,46 对 敏比 &%*4: 为 4S8* 在 体外细胞 实验 中%/-*抑制 剂放射增敏机制有减弱电离辐射诱导的.+损伤 修复能力-增 加 辐 射 诱 导 的 细 胞 凋 亡- 抑 制 细 胞 再 群体化-扰 乱 细 胞 周 期 检 查 点 功 能 并 使 细 胞 周 期 再分布 0 46 * 本 课 题 组 前 期 研 究 表 明 与,.*联合时可 减 低,46 细 胞 的.+损 伤 修 复 能力 0 45 * X 0 2L : ( 0 3X L. + [,, :4: 545 4:: 4:8 0 3 nx &, 2 X E X X E L E 0 ( :4: _,X, X, EE 2 X E X 电离辐射主要 通 过 内 源 途 径 诱 导 细 胞 凋 亡依 家 族 蛋 白 及 线 粒 体 的 参 与 最 终 激 活 效 应 赖 Z 性天冬 氨 酸 蛋 白 水 解 酶 执 行 凋 亡 反 应 0 : * Z Z [ 也 有 抗 凋 亡 蛋 白 家族蛋 白 有 促 凋 亡 蛋 白 Z Z Z 等抗凋亡蛋白与促凋亡 蛋白 之 间 的 比 例在 一 定 程 度 上 影 响 细 胞 的 命 运 0 4 * 本实验中 h,.*处 理 组 细 胞 Z Z 比例明显 高于 单 独 和 单 独,.* 处 理 组 说 明 h,.*处理后细胞易于发生凋亡* 放疗间歇肿瘤 细 胞 的 再 群 体 化由 一 些 具 有 快 速增殖潜力的细胞 引 起是 肿 瘤 放 射 抗 拒 的 原 因 之 一* 临床 上 0 4 3L X Z 2 X + 2 2L E X,.* 达 到 肿 瘤 治 疗 剂 量 时 间 较 * ( :44 = X &0 0 0 X E E N L E [ fx X L E [ X * ::: ==4== 48 0 = 3 X T - _ 0 X +E E X E N L E LX X : 0 3, + 2L E + 4 X X N 0 Z L * EL :: :5 84= 下转第 页

5 * 0 X :48 Y 8 中华放射医学与防护杂志 :48 年 4 月第 8 卷第 4 期3L 044 3X k [. X k Y 0 L E L E E E N L X :: := 44 * ( Z L 04 3/ & kl Y 0 / L * fx L E X X Y * :: * / 0 * ( ( N L X & L L ([ :: = 4= X Z &X T n r 2L L E N L -(,-(T8 L L E / X X ::= 4 4= =4: = k *v & & /.* L L E X (*2 X L E L L ([ E L fx X 0 & X E X :: = + &X ( :: n k L N2 Nk E X. * X :: 8 6 4:6 4: Z. +X - N0 X X ::= 4= 4 %X &X ( 04= 3 +/ Z 0, % 0: 3王俊杰 袁 惠 书 刘 江 平 等2引 导 放 射 性 粒 子 组 织 中 华 放 射 肿 瘤 学 杂 间植入治疗复发直肠癌的疗 效 观 察 0 志::= & LX, % Z [ & * X X E X / &X :: E [ 0/ 0 * L E X E L L X 0. * ( Z L X 0 54 * X :: : : Y 0 *. * L L E N L L E L E E 收稿日期:4 : 45 上接第 5 页 X 0 6 3, rx + 2L L L E X E X X N, :44 L EL 0*(,46 0 * ( : : = 30 & n * & % k*+& 4 45= 0 5 3王皓 王俊杰 曲昂 等西 妥 昔 单 抗 联 合 照 射 对 结 直 肠 癌,46 细胞的抑制作用及机制 探 讨 0 中 华 放 射 医 学 与 防 868 护杂志 : : 30 *% 0X L+ L Y * E X L.+ E 0 * L ( ::5 5 4= 044 3L. &2L E N L E E X.+ 0 :: 4 4 = ==: * 04 3 [. (w L k E & X % 0 :: L : :8: :86 X E X % 0 :: N L fx %/-* [ X :4 86= 8:8 8: 046 3& 0 L * E N L E L 0 ( ::8 4 6: 刘敬佳 王俊杰 赵勇 等西妥昔单抗对 4 *粒子照 射 结 中华 直 肠癌细胞.+修复能力和信号传导通路的影响0 6 放射医学与防护杂志 :4 = 6 0: 3n X * & + 2L Z, E EE :: X n X * 0 L E E Z L 0. : : k0 /X 2 / XZ L X X :4 86= 8:8 = 04 3.,+ *2 X 2L X X L L * 0 Z 04 3X L. X n & & X L E X fx %/-* L E X X X X X E -,(T X-,(T 0 3. */ Z 2L L L E Z * = & *,., /4 L X / L L X L E (*. Y X0 ( :4 : 4 Z4 0. L. ::= = X L 2& + *+ & L / + 收稿日期:4 : 5

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