细胞治疗揽要 ( 一 ) 上海市血液中心 钱开诚
如果 20 世纪是药物治疗时代, 那么 21 世纪就是细胞治疗时代 ----- 美国生物学家 George Daley
细胞治疗相关的诺贝尔奖 马里奥 卡佩奇, 奥利弗 史密斯 ( 美国 ) 马丁 埃文斯 ( 英国 ) 发现在利用胚胎干细胞引入特异性基因修饰的原理 获 2007 年诺贝尔生理或医学奖 拉尔夫 斯坦曼 ( 美国 ) 发现树突细胞和其在获得性免疫中的作用 获 2011 年诺贝尔生理或医学奖 约翰 格登 ( 英国 ) 山中伸弥 ( 日本 ) 发现成熟细胞可被诱导生成多能干细胞 ( induced pluripotent stem cells ips) 获 2012 年诺贝尔生理或医学奖
细胞治疗 利用具有特定功能的细胞的特性, 达 到预期的治疗效果 特定功能的细胞 直接获取的成熟细胞 通过特殊方法诱导培养 扩增, 形成具有特定免疫功效或再生能力的细胞群落 用分子生物学方法改造天然细胞, 使之增强精确免疫攻击能力 或分化再生能力的细胞群落
细胞治疗 第一代细胞治疗 全血输注 成分输血 红细胞输注血小板输注 粒细胞输注 第二代细胞治疗 自体免疫细胞输注 造血干细胞移植 免疫激活 ( NK LAK CIK TIL DC ) 免疫抑制 (MSC Treg tdc) 恶性血液系统疾病实体瘤遗传性疾病 实体瘤 移植耐受 自身免疫性疾病 第三代细胞治疗 同种异基因免疫细胞输注 免疫抑制 (MSC Treg tdc) 移植耐受 自身免疫性疾病 干细胞治疗 (MSC ES ips) 组织修复 器官再造
细胞治疗 免疫细胞治疗 干细胞治疗
免疫细胞治疗治疗 免疫细胞攻击治疗 淋巴因子激活的杀伤细胞 (LAK) 肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 细胞因子诱导的杀伤细胞 (CIK) 树突状细胞 (DC) 树突状细胞调节的细胞因子诱导的杀伤细胞 (DC-CIK) 自然杀伤细胞 (NK) 嵌合抗原受体 T 细胞 (CAR-T) 免疫调节细胞治疗 调节性 T 细胞 ( Regulatory T Cells,Tregs ) 耐受型树突状细胞 ( Tolerogenic dendritic cell,tdc ) 间充质干细胞 ( MSC )
免疫细胞攻击治疗
免疫细胞治疗的基础 Chester Southam: 在五十年代首次给志愿者注射活的癌细胞 结果 : 注射的癌细胞在健康人体内不生长. 注射的癌细胞在癌症病人体内可长成大肿瘤 结论 : 正常人体内具有抵抗癌细胞的免疫能力, 癌症病人体内失去健康人所具有的抗癌免疫活性 该项研究显然与医学伦理学的基本原则相违悖, 但对癌症及其治疗的机理研究提供了实证提示, 1968 年被推选成全美抗癌学会主席 首次证明人体内天然抗癌活性的存在 Science,1957 年一月 125: 158-160
淋巴因子激活的杀伤细胞 lymphokine-activated killer cell LAK 1982 年 Grimm 等首先报道 PBMC 中加入 IL-2 体外培养 4-6 天, 能诱导出一种非特异性的杀伤细胞, 可以杀伤多种肿瘤细胞 目前尚未发现 LAK 细胞特有的表面标志, 有研究表明, LAK 细胞的前体细胞是 NK 细胞和 T 细胞 1984 年 11 月 Rosenberg 等经 FDA 批准, 应用 IL-2 与 LAK 协同治疗肿瘤患者 报道 222 例, 其中 16 例患者肿瘤转移灶完全消退,26 例患者肿瘤消退 50% 以上, 证明该疗法对转移性肾细胞癌 黑素瘤 结肠癌和非何杰金氏淋巴瘤患者的疗效较显著 同时发现, 该方法治疗过程中可出现较严重的毒副反应, 最常见是出现毛细血管渗漏综合征 CLS, 表现为全身性水肿和多器官功能失调, 可引起胸腹腔积液 肺间质水肿和充血性心力衰竭
肿瘤浸润淋巴细胞 (Tumor Infiltrating Lymphocytes,TIL) 1986 年 Rosenberg 研究组首先报道了肿瘤浸润淋巴细胞 TIL,TIL 是通过采集患者肿瘤组织或腹水中的淋巴细胞, 经过体外 IL-2 等等激活和扩增培养, 得到的一种在生理条件下能够杀伤肿瘤细胞的细胞群, 一般以 CD3+CD8+T 细胞为主 疗效优于 LAK, 毒副作用则明显低于 LAK 作用机制 通过释放细胞毒素直接杀伤肿瘤细胞 调节机体免疫功能, 提高机体对肿瘤细胞的杀伤能力 其后的研究提示,TIL 可提高 NK CIK 等细胞作用 临床应用已在临床应用多年, 证明对皮肤 肾 肺 肝 卵巢部位的原发或继发肿瘤
TIL 细胞治疗流程
细胞因子诱导的杀伤细胞 (Cytokine-Induced Killer,CIK) 1991 年斯坦福大学 Wolf 等首先报道单个核细胞在多种细胞因子如 IL-2 IFN-γ 及某些单克隆抗体 (anti-cd3mcab) 刺激下于体外培养扩增出的以 D3+CD56+ CD3+CD8+ 为主的一个细胞群, 称之为 CIK CIK 的扩增效率是 LAK 的 50 倍以上, 具有广泛的非 MHC 限制的极强的溶瘤活性 识别能力强, 能点射肿瘤细胞 作用机制 : 通过释放穿孔素及颗粒酶而直接杀伤 通过分泌多种细胞因子而间接杀伤 通过激活凋亡基因诱导肿瘤细胞凋亡 促进 T 细胞增殖分化 临床应用 : 清除残余癌细胞, 预防复发和转移 降低放化疗的毒副作用, 提高放化疗的疗效 用于放 化疗无效及耐药性的患者的治疗 用于失去手术指征或已复发转移的晚期患者, 缓解症状 延长生存期
树突状细胞 (Dendriticcell DC) 细胞特点 : 抗原呈递活性最强的细胞 能有效激活初始 T 细胞 作用机制 : 重建免疫监视功能 诱导产生大量效应 T 细胞 趋化效应 T 细胞迁移至肿瘤部位 可致敏辅助 T 细胞分泌多种细胞因子 临床应用 : 对血液 消化 呼吸 泌尿及生殖系统等多个系统肿瘤细胞均有杀伤作用 14
树突状细胞调节的细胞因子诱导的杀伤细胞 (DC-CIK 细胞 ) 通过负载肿瘤抗原的 DC 与 CIK 的有机结合 ( 即 DC-CIK 细胞 ) 能产生特异性和非特异性的双重抗肿瘤效应, 二者具有一定的互补作用 DC- CIK 细胞不仅能激发 增强肿瘤患者特异性抗肿瘤免疫应答, 有效清除体内残留病灶, 且在患者体内诱发免疫记忆, 从而获得长期的抗瘤效应
自然杀伤细胞 (Natural killer cell,nk) NK 细胞来源于骨髓, 主要存在于外周血 数量约占 PMBC5~10% 在 IL-2 IL-12 IFN-α TNF-α 等因子的刺激下,PBMC 可被诱导生成 扩增 NK 细胞 作用机理 NK 细胞对靶细胞杀伤时既不需特异性抗体参加, 也不需抗原预先致敏 NK 细胞可在接触病原体或肿瘤细胞后, 立即释放穿孔素 细胞因子等杀伤靶细胞的作用, 尤其是对多种肿瘤细胞有迅速杀伤和溶解作用, 抑制肿瘤的生长及扩散, 被认为是人体内的第一道抗癌防线 NK 细胞会抑制肿瘤附近新血管的增生, 限制肿瘤获取养份, 从而限制肿瘤生长 ; NK 细胞可直接改善并调节患者的免疫力及神经系统, 间接提高患者之生活品质 ; 应用前景 : 非特异性抗肿瘤和抗病毒感染 非特异性清除体内坏死细胞及脂肪等垃圾
嵌合抗原受体 T 细胞 Chimeric Antigen Receptor- Tcell CAR-T CAR-T: 利用基因工程修饰外周血 T 细胞, 使其表达嵌合抗原受体 ( Chimeric Antigen Receptor) 来特异性的识别肿瘤相关性抗原的方法 上世纪 90 年代,Rosenberg( 美国 ) 和 Eshhar( 以色列 ) 在 NIH 合作研究靶向人体黑素瘤的嵌合抗原受体, 设计初步并构建了 CAR-T 细胞, 包括一种细胞外的特异性靶向癌细胞的抗体 历经不断完善优化, 于近年成为体外过继免疫治疗的热点
CAR 的优化 CAR 的基本结构中包括一个肿瘤相关抗原 ( TAA) 结合区 (scfv 段 ), 一个胞外铰链区, 一个跨膜区和一个胞内信号区 第一代 CAR 介导的 T 细胞激活是通过 CD3ζ 链上的酪氨酸激活基序完成的, 即只有 信号 1 只有 信号 1 的 T 细胞细胞因子分泌少, 抗肿瘤活性及增殖能力有限, 且易凋亡 早期利用第一代 CAR-T 开展的临床试验没有表现出显着的有效性
CAR 的优化 研究者致力于加强 CAR 激活信号, 突破第一代 CAR 的限制, 设计并构建结合共刺激结构的第二代 CAR 第二代的 CAR 设计中同时包括了 CD3ζ 链的 信号 1 和 CD28 或 CD137(4-1BB) 的 信号 2 研究表明, 搭载了 信号 2 的第二代 CAR 与第一代 CAR 相比, 抗原特异性不变,T 细胞增殖 细胞因子分泌增加, 抗细胞凋亡蛋白分泌增加, 细胞死亡延迟
CAR 的优化 进一步的优化研究着眼于发展第三代 CAR, 不仅包括 信号 1 信号 2, 还包括了额外的共刺激信号, 但迄今尚无证据表明 G3 优于 G2
CAR-T 细胞治疗示意图 Annu.Rev.Med,2014
CAR-T 细胞治疗的优势 靶点更广 CAR-T 细胞既可以靶向蛋白质抗原, 又可以靶向糖脂类抗原, 扩大了肿瘤抗原的靶点范围 ; 治疗更精准 CAR-T 细胞疗法利用抗原抗体结合机制, 能有效克服肿瘤细胞 MHC 分子表达下调以及抗原递呈降低等问题造成的免疫逃逸 ; 杀瘤谱更宽由于多种肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原, 针对某一种肿瘤抗原的 CAR 基因一旦构建完成, 便可被广泛利用 ; 效果更持久新一代 CAR 结构中增加了促进 T 细胞增殖与活化的基因序列, 保证了 T 细胞进入人体后还能增殖, 同时 CAR-T 细胞具有免疫记忆功能, 可以长时间在体内存活
CAT-T 细胞治疗的毒性 是靶标 / 非癌细胞正常细胞被 连坐 杀伤, 导致多器官损伤, 甚至死亡 细胞因子风暴 TNF-α IL-1 IL-6 IL-12 IFN-α IFN-β IFN-γ 和 IL-8 等细胞因子短时间内大量释放, 引起急性呼吸窘迫综合症, 肝肾功能衰竭等
免疫调节细胞治疗 调节性 T 细胞 ( Regulatory T Cells,Tregs ) 耐受型树突状细胞 ( Tolerogenic dendritic cell,tdc ) 间充质干细胞 ( MSC )
国外已开展的 Treg 细胞临床治疗结果 研究小组 病人数 治疗类型 Tregs 种类 输注剂量 Tregs 扩增方 法 Blazar (Minnesota) Martelli (Perugia) 23 无关供者双份脐带血移植 28 HLA 半相合造血干细胞移植 第三方脐带血 Tregs 供者 Tregs 1 10 4 至 3 10 6 per kg 2 10 6 per kg 体外扩增 200 倍 新鲜分离 临床结果 II-IV 级急性 GVHD 反应减少 急性和慢性 GVHD 非常低 Edinger (Regensburg ) 9 白血病复发率高的病人造血干细胞移植 Tregs(>50%) 和效应 T 细胞共同输注 5 10 6 per kg 新鲜分离 能安全有效地抑制 GVHD Trzonkowski (Gdarisk, Poland) 10 儿童 I 型糖尿病 自身 Tregs 10 10 6 per kg,20 10 6 体外扩增 安全, 其中有两个病人不需要打胰岛素 Colombel (Paris) 20 Crohn 氏病 自身抗原特异 性 Tregs 10 10 6-10 10 9 体外抗原特异性扩增 有一些副作用, 但都能恢复, 疾病临床指数下降
Immunity. 2009; 30: 656-665
PBMC 来源 人源性 CD4 + Treg - 细胞来源 :PBMC 分选 CD4 + CD25 + T 细胞 - 扩增方法 1: 雷帕霉素 TGF-β anti-cd3/28 IL-2 共扩增 12 天 - 扩增效率 :30-35 倍 - 扩增方法 2: 雷帕霉素 人 B 细胞 anti-cd3/28 IL-2 扩增 - 扩增效率 : 约 80 倍 12 天, anti-cd3/28 IL-2 再扩增 6 天
人源性 CD4 + Treg 1 10 8 PBMC 经分选后可获得 0.8-1.5 10 6 CD4 + CD25 + T 细胞, 经 12 天扩增后扩增方法 1 可获得 3.0-3.5 10 7 CD4 + Treg; 扩增方法 2 可获得 6.4-12 10 7 CD4 + Treg 实验证明 :CD4 + Treg 经过冻存和复苏后仍然能发挥其有效的抑制功能
治疗效果 - GVHD 1 10 6 CB Treg 细胞能有效的抑制 20±2g 小鼠的 GVHD 发病
人源性 CD4 + Treg 脐血来源 - 细胞来源 : 脐血单个核细胞分选 CD4 + CD25 + T 细胞 - 扩增方法 :anti-cd3/28 IL-2 扩增两轮 - 扩增效率 :1200-2100 倍 1unit CB 经分选后可获得 3-7.5 10 6 CD4 + CD25 + T 细胞, 经两轮扩增后可获得 1.2-2.2 10 9 CB Treg
治疗效果 - GVHD 1 10 6 CB Treg 细胞能有效的抑制 25±2g 小鼠的 GVHD 发病
治疗效果 - CIA 1 10 6 Treg 细胞能有效的抑制 25±2g 小鼠的 CIA 发病
PBMC 来源 人源性 CD8 + Treg - 细胞来源 :PBMC 分选 CD8 + T 细胞 - 扩增方法 : 雷帕霉素 TGF-β anti-cd3/28 IL-2 扩增 4 轮, 一共 27 天 - 扩增效率 : 约 10000 倍, 每轮约 10 倍 1 10 8 PBMC 经分选后可获得 2 10 7 CD8 + T 细胞, 经 27 天扩增后可获得 2 10 11 CD8 + Treg
治疗效果 4 10 6 CD8Treg 细胞能有效的抑制 20±2g 小鼠的 EAE 发病 4 10 6 CD8Treg 细胞能有效的抑制 20±2g 小鼠的 CIA 发病
治疗效果 自身免疫性结肠炎 1 10 6 CD8Treg 能有效的减轻 25±2g 小鼠的自身免疫性结肠炎的发病
耐受型树突状细胞 ( Tolerogenic dendritic cell,tdc )
研究背景 耐受型树突状细胞 (Tolerogenic dendritic cell, tdc) - 低表达 MHC 和共刺激分子 - 大量分泌 IL-10 和 TGF-β 等 - 不能有效的刺激效应性 T 细胞 - 能在体内外产生或扩增 ntreg 或 itreg Nat Rev Immunol. 2007 Aug;7(8):610-21
人源性 tdc tdc - 细胞来源 :PBMC 中的单核细胞 - 诱导方法 :GM-CSF IL-4 IL-10 TGF-β 诱导 - 诱导效率 :0.8-1.1 倍 免疫抑制联合诱导的 tdc - 细胞来源 :PBMC 中的单核细胞 - 诱导方法 :GM-CSF IL-10 TGF-β 联合他克莫司诱导 - 诱导效率 :0.6-0.9 倍
治疗效果 自身免疫性结肠炎 1 10 6 tdc 细胞能有效的减轻 25±2g 小鼠的自身免疫性结肠炎的发病
免疫细胞治疗展望 被寄予厚望 路曼曼其修远 还须上下而求索
谢谢!
实验流程 白膜层 PBMC CD14 + 单核细胞 tdc 剩余细胞 CD19 + B 细胞 Breg 剩余细胞 CD8 + T 细胞 CD8 + Treg 剩余细胞 CD4 + CD25 + T 细胞 CD4 + ntreg CD4 + CD25 - T 细胞 CD4 + itreg