中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2011,31(3):71?75 固定化酵母乙醇发酵及固化小球微生态的研究 1 巫小丹 1 徐尔尼 2 徐颖宣 1 罗玉芬 1,3 刘玉环 (1 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室南昌 330047 2 南昌大学高等研究院南昌 330031) (3 南昌大学生物质转化教育部工程技术研究中心南昌 330047) 摘要比较了 SA PVA 固定化酿酒酵母和游离酿酒酵母的乙醇发酵能力, 采用批次发酵试验研究固定化酿酒酵母的发酵稳定性 结果表明,SA PVA 固定化酿酒酵母的发酵速度比游离酿酒酵母快, 发酵周期短 ; 发酵稳定性很好,30, 橡胶塞 90r/min 摇床培养 24h 时, 乙醇体积分数均在 3% ~3.5% 之间, 连续发酵 14 批次后, 固化小球的形态依然完好, 不发粘 通过扫描电镜对酿酒酵母包埋微生态环境进行了分析, 图像表明固定化小球的内部环境非常有利于酵母细胞的厌氧发酵产乙醇, 充分证明了 SA PVA 固定化酿酒酵母乙醇发酵的优越性 关键词酿酒酵母固定化乙醇扫描电镜中图分类号 TS26 20 世纪 60 年代发展起来的固定化细胞技术具有可连续与重复使用 可实现细胞高密度培养 能形成适于酵母酒精发酵的微环境 产物分离简单等特点 [1 5] 包埋法是应用很广的一种固定化方法, 其中海藻酸钙是迄今应用最为广泛的一种固定化载体, 它经由海藻酸钠 (sodium alginate,sa) 滴入到氯化钙溶液中而得到, 其网格孔隙大 传质阻力小 制备方法简单 价格低廉, 但强度较差, 使用寿命短, 原因在于培养基中的磷酸盐会逐渐使海藻酸钙凝胶破裂和解体 近年来, 聚乙烯醇 (polyvingakohol,pva) 因其独特的强力黏结性 皮膜柔韧性 平滑性 耐磨性等而广泛地被用作固定化包埋剂 [6 8], 但 PVA 凝胶具有非常强的附聚倾向, 这使得颗粒之间相互黏结而不易分开 此外, 作为一种无机物可与有机的 SA 和 PVA 以化学键结合, [9] 林松柏等的研究表明 SA 化学键构建了有序的固定化酶包埋环境 ; 不仅如此, 作为原子型晶体, 强度较高, 添加至凝胶颗粒中可增加强度, 海藻酸钠溶液中添加 后耐磷酸缓冲液的效果较好 [10 12] 分析对比了海藻酸钙固化小球和 SA PVA 固化小球的性能 ; 比较了 SA PVA 固定化酿酒酵母和游离酿 收稿日期 :2010 09 21 修回日期 :2010 11 16 江西省教育厅重点科技资助项目 (GJ09016) 通讯作者, 电子信箱 :xuerni@126.com 酒酵母的乙醇发酵能力, 采用批次发酵试验研究固定化酿酒酵母的发酵稳定性, 并通过扫描电镜观察包埋后微生态环境下的酵母细胞形态, 研究分析了 SA PVA 固定化酿酒酵母的优越性 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株酿酒酵母 (Sacharomycescerevisiae) 1.1.2 试剂海藻酸钠, 广东汕头市西陇化工厂 ; 聚乙烯醇, 中国医药 ( 集团 ) 上海化学试剂公司 ;H 3, 广东汕头市西陇化工厂 ;CaCl 2, 上海奉贤奉城试剂厂 ;, 上海爱建试剂厂有限公司 均为分析纯 1.1.3 培养基增殖培养基 :PDA 液体培养基 糖发酵培养基 :10% 葡萄糖,1%(NH 4 ) 2 SO 4,0.28% CaCl 2, 0.12% KCl,0.065% MgSO 4 7H 2 O,0.15% KH 2 PO 4 1.1.4 设备上海跃进医疗器械公司摇床 (SPX-150 -Z 型 ) 上海医用分析仪器厂离心机 (LXT 2 型 ) 美国扫描电子显微镜 (FEIQUANTA200F 型 ) 1.2 方法 1.2.1 SA 浓度的确定分别配制不同浓度 (0.5%, 1%,1.5%,2%,2.5%,3%) 的 SA 溶液 20ml, 转移至 20ml 医用注射器中, 滴入 100ml3%CaCl 2 溶液中, 观察成球情况 从成球情况和制备的难易程度来确定 SA
72 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.31No.32011 的最佳浓度 1.2.2 海藻酸钙小球和 SA PVA 小球性能的比较海藻酸钙小球的制备 : 配制 2%SA 溶液 20ml, 转移至 20ml 医用注射器中, 滴入 100ml3%CaCl 2 溶液中, 得到海藻酸钙小球 SA PVA 固定化小球的制备 : 配制 2%SA 6% PVA 1% 溶液 20ml, 转移至 20ml 医用注射器中, 滴入 100ml3%CaCl 2 5%H 3 溶液中, 得到 SA PVA 固定化小球 海藻酸钙小球和 SA PVA 固定化小球耐磷酸能力比较 : 配制 0.2mol/LpH 为 6.0 的磷酸缓冲液, 分别取 100 颗左右的海藻酸钙小球和 SA PVA 固定化小球, 投入该磷酸缓冲液中,30,120r/min 摇床处理, 观察这两种小球对磷酸缓冲液的耐受情况 1.2.3 固定化酿酒酵母的制备菌体细胞的制备 : 挑取一环酵母菌接入 100mlPDA 液体培养基中,30, 120r/min 摇床培养 48h 菌悬液配制与计数 : 取上述培养物 4000r/min 离心 25min, 收集沉淀, 用无菌生理盐水配成浓度为 0.1g/ml 的菌悬液, 血球计数法算出该菌悬液的细胞浓度为 4.84 10 8 个 /ml 酵母菌的包埋和活化 : 取 1ml 菌悬液与 20ml 的包埋剂 (2%SA,6%PVA,1% ) 混合均匀后, 转入 20ml 注射器中, 滴入 100ml5%H 3 3%CaCl 2 溶液中, 得到直径为 3~5mm 的固定化小球 4 冰箱过夜后, 用无菌生理盐水洗涤 2~3 次, 接入 50mlPDA 液体培养基, 进行活化培养 30,120r/min 活化 24h 后, 换新鲜 PDA 液体培养基, 继续活化 24h, 置 4 冰箱备用 1.2.4 固定化酵母和游离酿酒发酵能力的比较固定化酵母发酵 : 取初始包埋量达 4.84 10 8 个酵母菌的固定化小球 20ml 接入 30ml 糖发酵培养基中,30,90 r/min 摇床培养 24h 后, 转为 60r/min 继续培养 12h 取样时间 : 从第 24h 开始取样, 之后每隔 3h 取样一 次, 共取样 5 次至发酵结束, 再用重铬酸钾法测酒精含量 [13] 游离酵母发酵 : 取 1ml0.1g/ml 的菌悬液接入 30ml 的糖发酵培养基中,30,90r/min 摇床培养 24h 后, 转为 60r/min 继续培养 12h 取样时间: 从第 24h 开始取样, 之后每隔 3h 取样一次, 共取样 5 次至发酵结束, 用重铬酸钾法测酒精含量 1.2.5 固定化酵母的批次发酵试验为了研究固定化酵母的稳定性, 将固定化小球 20ml 接入 30ml 糖发酵培养基中进行批式发酵 发酵条件为 30, 橡胶塞 90 r/min 摇床培养 在前一个批发酵结束后, 用无菌生理盐水洗涤小球 2~3 遍, 添加新鲜发酵培养基, 进行下一个批次的发酵, 试验共进行 14 个批次, 每个批次为 24h 用重铬酸钾法测酒精含量,DNS 法测残糖量 [14] 1.2.6 固定化酵母小球的电镜扫描样品制备与分析观察电镜扫描样品制备 : 对于静置过夜处理后的固化小球, 可直接进行切割后用滤纸吸干水份, 备用 对于活化后固化小球和发酵后固化小球, 重新悬浮于 3% CaCl 2 5%H 3 溶液中,4 冰箱过夜处理, 然后再对小球进行切割, 并用滤纸吸干水份, 备用 固化小球的观察分析 : 用美国 FEIQUANTA200F 型扫描电子显微镜观察固化小球的内部结构和酿酒酵母的细胞形态 2 结果 2.1 最佳海藻酸钠浓度的确定从表 1 可以看出,SA 浓度直接影响固定化小球的成型情况 SA 浓度太低, 会使凝胶的包埋性能差, 被固定化细胞易泄漏引起固定化功能失效 ; 随着 SA 浓度的增加, 小球状颗粒制作成型好, 载体凝胶对细胞的包埋程度增强, 同时制作难度加大, 而且可能影响物质在凝胶颗粒内部的扩散, 进而影响酵母菌的生长和发酵性能 因此,2% 为最佳 SA 浓度 表 1 不同浓度的 SA 对小球制备难易度及成型状况的影响 Table1 EfectofconcentrationofSAonimmobilizingdificultyandformingcondition SA 浓度 溶液粘度 制备难易度 成型情况 0.5% 粘度小 容易 难以成型 ( 不规则 ) 1% 粘度一般 容易 能成球型, 但形状 大小不均匀, 直径 3~4mm 1.5% 粘度一般 容易 成球较好, 但形状 大小不均匀, 有些呈椭球型, 直径 3~4mm 2% 粘度较合适 较容易 2.5% 粘度较大 较难 成球好, 形状 大小较均匀, 直径 4~5mm 3% 粘度很大 困难
2011,31(3) 巫小丹等 : 固定化酵母乙醇发酵及固化小球微生态的研究 73 2.2 海藻酸钙小球和 SA PVA 小球性能的比较 由表 2 可知, 在对磷酸缓冲液的耐受能力上,SA PVA 固定化小球对于海藻酸钙小球有着绝对的优 势, 不仅强度高, 耐受能力强, 而且经 3% CaCl 2 5% H 3 溶液短暂浸泡后, 能够很好地回复形状和强度 表 2 海藻酸钙小球和 SA PVA 小球耐受磷酸缓冲液能力的比较 Table2 Compareofthebearingabilityofcalcium alginateandsa PVA balsonphosplatebufer 样品材料 磷酸缓冲液处理后, 溶液出现混浊的时间 40min 后小球状态 重新悬浮于 3%CaCl 2 5%H 3 溶液后小球状态 海藻酸钙小球 10min 小球一捏即碎 形状能够回复, 但是小球表面形成裂纹 SA PVA 小球 30min 小球变软, 但富有弹性 形状能够很好地回复 2.3 固定化酵母和游离酵母发酵能力的比较由图 1 可见, 固定化酵母在 24h 时, 残糖仅为 0.8 mg/ml, 对糖的利用率达到 99.2%, 糖发酵已基本结束, 此时乙醇含量为 2.24%, 随后乙醇含量因挥发而略有下降 而游离酵母在 24h 时, 残糖高达 69.47mg/ ml, 乙醇体积分数为 0.69%, 随着发酵的继续, 乙醇含量逐步提高,36h 后残糖仍高达 39.57mg/ml, 乙醇体积分数仅为 1.22% 由此可见固定化酵母不但能提高乙醇产量, 而且大大缩短了发酵周期 图 2 小球的形态变化 Fig.2 Themorphologicalchangeofbals atdiferentstage (a)beforeproliferation(b)afterproliferation (c)aftertheseventhbatch 图 1 游离酿酒酵母与固定化酿酒酵母发酵周期的比较 Fig.1 Thebatchfermentationofglucosebyimmobilized S.cerevisiaeandfreeS.cerevisiae 2.4 固定化酵母的稳定性分析从图 2 可看出, 活化后小球和发酵 14 批次后小球形态基本一致, 小球不发粘, 尤其是发酵 14 批次后小球强度仍然很好, 这可能是因为发酵培养基中的 CaCl 2 有助于维持小球的强度和形态 从图 3 可以看出, 小球发酵性能较稳定 在 30, 橡胶塞 90r/min 条件下连续发酵 14 批次, 每批次发酵时间为 24h, 每批次所得发酵醪液乙醇体积分数均在 3% ~3.5% 之间, 残糖不足 1mg/ml 2.5 固定化小球微生态环境分析从图 4a 可看出, 固定化小球内部呈网状结构, 存在大量孔洞, 为固定在其上的酵母细胞提供了良好的附着微环境及良好的传质传热条件 ; 为包埋酵母提供了局部的厌氧环境, 这十分有利于酵母的乙醇发酵作用 ; 可使包埋酵母免受发酵过程中的机械剪切力的损伤, 图 3 固定化酵母的批次发酵 Fig.3 Resultsofrepeatedbatchesofethanol fermentationbyimmobilizeds.cerevisiae 这在很大程度上延长了酵母的使用寿命 同时从图 4b 可以看到, 刚进行固定化时, 酵母细胞密度较低, 且出芽较少 图 5a 显示, 活化之后小球的网状结构开始被酵母填充, 依然为多孔状结构 从图 5b 可看出, 固定化酵母在经活化之后, 形态完好, 出芽旺盛 在经过了 7 个批次的发酵之后, 由图 6 可以看到, 固定化小球的内部构造强度仍然很好, 固定化小球内部聚集了大量的酵母细胞, 维持着高密度细胞发酵, 有利于乙醇产量的提高 3 讨论 以复合材料 SA PVA 制备的固定化小球耐磷
74 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.31No.32011 图 4 活化前 SA PVA 固定化小球横切面扫描电镜图片 Fig.4 SEM photographsofthetransversesection ofimmobilizedbalsbeforeproliferation SA PVA 固定化酿酒酵母的乙醇发酵速度比游离酿酒酵母快, 发酵周期可大大缩短 固定化酿酒酵母的发酵稳定性很好, 连续发酵 14 批次后, 小球的形态依然完好, 不发粘 30, 橡胶塞 90r/min 摇床培养 24h 时, 乙醇体积分数均在 3% ~ 3.5% 之间, 残糖不足 1mg/ml 电镜扫描结果表明固定化小球的内部结构有利于酵母细胞的增殖, 这种缺氧条件下更利于酵母菌将糖转化生成乙醇 采用此种小球发酵稻草秸秆糖化液产乙醇, 并进一步优化固定化小球发酵稻草糖化液的条件, 可实现稻草糖化液快速高效的乙醇转化 参考文献 图 5 活化后 SA PVA 固定化小球横切面扫描电镜图片 Fig.5 SEM photographsofthetransversesection ofimmobilizedbalsafterproliferation 图 6 发酵 7 批后 SA PVA 固定化小球横切面扫描电镜图片 Fig.6 SEM photographsofthetransversesection ofimmobilizedbalsaftertheseventhbatch 酸缓冲液能力明显优于海藻酸钙小球 SA PVA 固定化小球的制作方法为 :2%SA,6%PVA,1% 混合均匀后, 转入 20ml 注射器中, 滴入 100ml3%CaCl 2 5%H 3 溶液中, 可得直径 3~5mm 的固定化小球 [1]MitsuruW,JyojiK,IchiroC.Continuousproductionofethanol usingimmobilizedgrowingyeastcels.appliedmicrobiologyand Biotechnology,1980,10(4):275 287. [2]TyagiRD,GhoseTK.StudiesonimmobilizedSacharomyces cerevisiae.i.analysisofcontinuousrapidethanolfermentationin immobilized celreactor. Biotechnology and Bioengineering, 1982,24(4):781 795. [3]AbbiM,KuhadRC,SinghA.Bioconversionofpentosesugarsto ethanolbyfreeandimmobilizedcelsofcandidashehatae(ncl 3501):Fermentationbehaviour.ProcesBiochemistry,1996,31 (6):555 560. [4]NajafpourG,YounesiH,IsmailKSK.Ethanolfermentationin an immobilized celreactor using Sacharomyces cerevisiae. BioresourceTechnology,2004,92(3):251 260. [5]FuN,PeirisP,Markham J,etal.Anovelco cultureproces withzymomonasmobilisandpichiastipitisforeficientethanol productiononglucose/xylosemixtures.enzymeandmicrobial Technology,2009,45(3):210 217. [6] 李峰, 吕锡武, 严伟. 聚乙烯醇作为固定化细胞包埋剂的研究. 中国给水排水,2000,16(12):14 17. LiF,LuXW,YanW.ChinaWater& Wastewater,2000,16 (12):14 17. [7] Ting Y P, Sun G. Use ofpolyvinylalcoholas a cel immobilization matrix forcopperbiosorption by yeastcels. JournalofChemicalTechnology&Biotechnology,2000,75(7): 541 546. [8] 李慧蓉, 尹艳, 高云霞. 聚乙烯醇包埋固定黄孢原毛平革菌方法的探讨. 江苏工业学院学报,2003,15(2):5 8. LiH R, Yin Y, GaoY X.JournalofJiangsu Polytechnic University,2003,15(2):5 8. [9] 林松柏, 陈伟兵, 蒋妮娜, 等. / 海藻酸钠复合水凝胶作
2011,31(3) 巫小丹等 : 固定化酵母乙醇发酵及固化小球微生态的研究 75 为固定化纤维素酶载体. 复合材料学报,2008,25(6):22 27. LinSB,ChenW B,JiangNN,etal.ActaMateriaeCompositae Sinica,2008,25(6):22 27. [10] 宋向阳, 徐勇, 杨富国, 等. 海藻酸锰固定化细胞的乙醇发酵. 南京林业大学学报 ( 自然科学版 ),2003,27(4):1 4. SongXY,XuY,YangFG,etal.JournalofNanjingForestry University(NaturalSciencesEdition),2003,27(4):1 4. [11]CoradinT,LivageJ.Mesoporousalginate/silicabiocomposites forenzymeimmobilisation.comptesrenduschimie,2003,6 (1):147 152. [12] YadavG D,JadhavaSR.Synthesisofreusablelipasesby immobilizationonhexagonalmesoporoussilicaandencapsulation incalcium alginate:transesterificationinnon aqueousmedium. MicroporousandMesoporousMaterials,2005,86(1 3):215 222. [13] 天津轻工业学院. 工业发酵分析. 北京 : 中国轻工业出版社, 2009.64 66. Tianjin University ofscience and Technology. Analysis of industrialfermentation. Beijing: China LightIndustryPres, 2009.64 66. [14] 李合生. 植物生理生化实验原理和技术. 北京 : 高等教育出版社,2004.197 199. LiHS.Principlesandtechniquesofthephysicalandchemical experimentonplants.beijing:highereducationpres,2004. 197 199. StudyofEthanolFermentationbyImmobilizedSaccharomycescerevisiae andimmobilizedmicroecology WUXiao dan 1 XUEr ni 1 XUYing xuan 2 LUOYu fen 1 LIUYu huan 1,3 (1StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,NanchangUniversity,Nanchang 330047,China) (2InstituteforAdvancedStudy,NanchangUniversity,Nanchang 330031,China) (3TheEngineeringResearchCenterforBiomasConversion,NanchangUniversity,Nanchang 330047,China) Abstract TheethanolfermentationabilityofSA PVA immobilizedsacharomycescerevisiaeandfree S.cerevisiaewascompared.Inaddition,batchfermentationwasusedtotestthestabilityofethanolfermentation ofimmobilizeds.cerevisiae.theresultsshowedthat,thefermentationspeedofsa PVA immobilizeds. cerevisiaewasfasterthanfrees.cerevisiae;thefermentationstabilityoftheimmobilizeds.cerevisiaewasgood, thevolumefractionofethanolremained3% ~3.5% whenculturedat30 for24hoursusingrubberplugand theshapeofbalswerestilintact,notstickyafte14batchescontinuousfermentation;theinternalimmobilized environmentwasveryconducivetotheanaerobicfermentationtoproduceethanolbysa PVA immobilizeds. cerevisiae. Keywords Sacharomycescerevisiae Immobilized Ethanol SEM