711 文章编号 :1673 8640(2013)08 0711 05 中图分类号 :Q554 文献标志码 :A DOI:10.3969/j.isn.1673 8640.2013.08.015 双试剂速率法测定二胺氧化酶活性的研究 胡进访 1, 吴雁 1, 王白石 1 2, 王旭 (1. 天津市泰达医院检验科, 天津 300457;2. 天津医科大学医学检验学院, 天津 300203) 摘要 : 目的建立检测二胺氧化酶 (DAO) 活性的双试剂连续监测法, 并进行方法学评价 方法通过试验来确定反应特异吸收峰 最佳检测时间 合理试剂配比 最佳底物浓度和反应缓冲体系的最佳 ph 值及浓度等最适反应条件 利用线性范围 精密度 回收试验 干扰试验和试剂及样本稳定性来评价该方法的敏感性 准确度和抗干扰能力 检测 150 名健康人和 30 例严重烧伤合并胃肠道黏膜屏障功能障碍或衰竭患者血清 DAO 活性, 确定参考区间和诊断准确度 结果通过试验确定以 100mmol/L 三羟甲基氨基甲烷 盐酸 (Tris HCl,pH 值 8.0) 为反应缓冲体系, 以 3.2mmol/L1,4 丁二胺为最佳底物浓度, 试剂 Ⅰ 和试剂 Ⅱ 按 4 1 与样本反应, 在 340nm 波长下 200~300s 期间连续监测还原型辅酶 Ⅰ(NADH) 吸光度的下降速度计算求得 DAO 活性 本法线性范围为 0~100U/L, 不精密度均 <5%,2 个水平的回收率分别为 95.8% 98.0%, 胆红素 <150μmol/L 血红蛋白 <4g/L 脂肪乳 <4g/L NH + 4 <60μmol/L 单胺氧化酶 (MAO)<120U/L 时对本法无明显干扰, 试剂置仪器中可稳定 2 周, 正常人血清 DAO 活性为 (3.90±2.96)U/L, 按 95% 可信区间其诊断参考区间为 0~9.7U/L, 受试者工作特征 (ROC) 曲线下面积为 0.960, 诊断准确度良好 结论建立的 DAO 活性浓度双试剂连续监测方法敏感性高 重复性好 抗干扰力强 诊断准确度良好, 试剂稳定性满足日常工作需要, 适用于全自动生化分析仪检测, 可做为临床常规检测方法用于肠黏膜损伤的诊断 关键词 : 二胺氧化酶 ; 酶活性 ; 连续监测法 Thestudyofratemethodtodetecttheactivityofdiamineoxidasewithdouble reagent HUJinfang 1,WU Yan 1,WANGBaishi 1,WANGXu 2. (1.DepartmentofClinicalLaboratory,TianjinTEDAHospital,Tianjin300457, China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300203,China) Abstract:Objective Toestablishacontinuousmonitoringmethodtodetecttheactivityofdiamineoxidase(DAO) withdouble reagent,andtoevaluatemethodologicaly.methods Themethodwasusedtoidentifytheoptimumreaction conditionsaboutthespecificabsorptionpeak,theoptimum detectiontime,areasonableratioofreagents,theoptimum substrateconcentration,thebestphvalueofreactionbufersystemandtheconcentrationofthebufer.thesensitivity, accuracyandanti interferencecapabilitywereevaluatedbylinearrange,precision,recovery,interferencetestand stabilityofreagentsandsamples.thereferenceintervalanddiagnosticaccuracywereidentifiedbydetectingtheactivity ofdaoin150healthysubjectsand30patientswhowereseverelyburntandcombinedwithgastrointestinalmucosa barierdysfunctionorfailure.results Thefinalreactionbufersystem wasbasedonthe100mmol/ltris(hydroxy methyl) aminomethanehydrochloride(tris HCl)bufer(pH 8.0).Theoptimum substratewas3.2mmol/l1,4 tetranethylenediamine,andtheratioofreagentⅠ andreagentⅡ was4 1.TheactivityofDAOwascalculatedbythe continuousmonitoringoftheloweringspeedofnicotinamideadeninedinucleotide(nadh) absorbanceunderthe wavelengthof340nmduring200 300s.Thelinearrangewas0 100U/L,theimprecisionwas<5%,therecoveryrate was95.8% and98.0%,themethodwasnotinterferedwhenbilirubin<150μmol/l,hemoglobin<4g/l,lipid< 4g/L,NH + 4 <60μmol/Landmonoamineoxidase(MAO)<120U/L.Thereagentswerestablein2weeks.The normalactivityofserum DAO was(3.90 ± 2.96)U/L,andaccordingto95% confidenceinterval,thediagnostic referencerangewasis0 9.7U/L.Theareaunderreceiveroperatingcharacteristic(ROC)curvewas0.960,andthe diagnosticaccuracywasgood.conclusions ThecontinuousmonitoringmethodtodetecttheactivityofDAO with double reagentissensitiveandreproducible,andhasstrongabilityofanti interferenceandgooddiagnosticaccuracy.the stabilityofreagentcanmeetthedailyneedsofautomaticbiochemicalanalyzerfordetection.itmaybecomearoutine clinicaldetectionmethodforthediagnosisofintestinalmucosainjury. Keywords:Diamineoxidase;Enzymeactivity;Continuousmonitoringmethod 基金项目 : 天津市卫生局科研课题 (03KZ10) 作者简介 : 胡进访, 男,1968 年生, 学士, 副主任技师, 主要从事临床生物化学检验工作
712 检验医学 2013 年 8 月第 28 卷第 8 期 二胺氧化酶 (diamineoxidase,dao,e.c.1.4. 3.6) 是人和哺乳动物小肠黏膜绒毛和胎盘绒毛中具有高度活性的细胞内酶, 在二胺 ( 组胺 腐胺和尸胺 ) 代谢中起催化作用, 其与肠黏膜细胞核酸和蛋白质合成密切相关 [1], 在分裂细胞中高度表达 血 DAO 活性的变化是反映小肠黏膜结构和功能状况的较理想指标 [2] 我们根据 Kirsten 等 [3] Lorenz [4] [5] 等和 Hosoda 等介绍的方法, 建立了双试剂连续监测法测定血中 DAO 活性 材料和方法 一 仪器与试剂岛津 UV VIS2450 型紫外 可见吸收光谱仪, HITACHI7600 020 全自动生化分析仪,BECK MANCX7 全自动生化分析仪 1,4 丁二胺 ( 腐胺 ) DAO 还原型辅酶 Ⅰ(nicotinamideadeninedi nucleotide, NADH) 二磷酸腺苷 (adenosine diphosphate,adp) 乳酸脱氢酶 (lacticdehydro genase,ldh) 谷氨酸脱氢酶 (glutamicacidde hydrogenase,gldh) α 酮戊二酸 血红蛋白 胆红素均购自美国 Sigma 公司 ; 乙二胺四乙酸二钠购自 Genview 公司 ; 医用脂肪乳及其他试剂均为国产试剂 二 试剂配制 1.100mmol/L 三羟甲基氨基甲烷 盐酸 (Tris HCl) 缓冲液精确称取 12.153gTris, 加入 1.0mL 5mmol/L 乙二胺四乙酸二钠, 用 1.0mol/LHCl 调 ph 值至 8.0, 定容至 1000mL 2. 试剂 Ⅰ 按各自相对分子质量和酶活性取量, 用 Tris HCl 缓冲液配制 0.3mmol/LADP 1000U/LLDH 3000U/LGLDH 5mmol/L 乙二胺四乙酸 10mmol/Lα 酮戊二酸溶液 3. 试剂 Ⅱ 准确称取 0.2668g1,4 丁二胺溶于 1 000 ml Tris HCI 缓冲液中, 浓度为 3.2mmol/L;0.25mmol/LNADH 三 研究对象选择 2006 年 1 月至 2009 年 12 月在天津市第四医院烧伤病房住院的严重烧伤患者 30 例 所有患者烧伤早期均接受正规休克复苏治疗, 休克期度过平稳, 手术及创面换药按常规进行, 于伤后第 2 天抽取静脉血, 分离血清于 -80 冷冻保存备用 从健康体检人群中选取临床诊断基本正常, 肝功能 肾功能 血脂均正常, 无肠道疾病的健康 体检者 150 名, 年龄 18~55 岁, 男 女各 75 名, 女性均为非妊娠期 采集静脉血, 分离血清, -80 冷冻保存备用 四 方法 1.DAO 的测定原理利用 DAO 催化 1,4 丁二胺产生 H 2 O 2 和 NH 3,NADH NH 3 和 α 酮戊二酸在 GLDH 作用下, 生成 NAD + 和谷氨酸,NADH 在 340nm 处有特异吸收峰, 其被氧化的速率与血清 DAO 活性呈正比, 测定 NADH 下降速率, 即可测出 DAO 活性 反应方程式 :1,4 丁二胺 +O 2 +H 2 O DAO R CHO+NH 3 + H 2 O 2 ;NH 3 +α 酮戊二酸 + NADH+H + GLDH 谷氨酸 +NAD + +H 2 O 被检样本与试剂 Ⅰ 作用一定时间后, 可将内源性 1,4 丁二胺和 NH 3 消耗掉, 再加入试剂 Ⅱ 测定 此设计方法排除了内源性干扰, 保证了 DAO 测定的准确性 2. 吸收光谱范围测定试剂 Ⅰ 和试剂 Ⅱ 按 4 1 混合后, 加入 30U/LDAO 标准液于 37 反应 3~5min, 用岛津 UV VIS2450 紫外 可见吸收光谱仪进行波长扫描, 测定吸收光谱 3. 最佳检测时间的确定试剂 Ⅰ 和试剂 Ⅱ 按 4 1 混合后, 加入 30U/LDAO 标准液于 37 反应, 用岛津 UV VIS2450 紫外 可见吸收光谱仪检测 0~600s 的吸光度 (A) 值变化率, 找出 A 值稳定变化时间范围, 即为最佳检测时间 4. 最适 Tris HCl 缓冲液浓度与 ph 值选择 对不同浓度的 Tris HCl 缓冲液 ( 分别为 50 100 200 500mmol/L) 和 ph 值 ( 分别为 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5) 与高浓度 DAO 临床样本进行测定, 观察 DAO 在不同浓度的缓冲液和 ph 条件下的活性变化, 找出最佳缓冲液浓度和 ph 值 5. 最佳底物浓度选择用 100mmol/LTris HCl 缓冲液 (ph 值 8.0) 制成不同浓度 1,4 丁二胺溶液 (0~8.0mmol/L), 对临床高值血清中 DAO 进行测定 按双倒数做图法求得 DAO 的 Km 值, 最佳底物浓度为 Km 值的 10~20 倍 五 方法学评价 1. 线性范围取 DAO 分别配制成 2.5 5.0 10 20 40 80 100 160 240U/L, 在全自动生化分析仪上进行测定, 绘制标准曲线, 得出线性范围 2. 精密度试验选用 10 30 50U/LDAO 标准液,1d 内连续测定 20 次, 计算批内精密度 ; 每天不同浓度各测 2 次, 连续测定 20d, 取其均值计算批间精密度
713 3. 回收试验取 DAO 活性为 10 和 30U/L 的临床血样本 0.9mL, 各加入 0.1mL 蒸馏水作为基础样本 Ⅰ 和 Ⅱ; 加入 0.1mL100U/LDAO 标准品混合作为回收样本 Ⅰ 和 Ⅱ, 测定其实测值与理论值的差异, 计算回收率 4. 干扰试验按干扰物体积与血清样本体积比为 1 9 向临床高值混合血清 (24U/L) 中加入不同浓度的干扰物, 使其样本中干扰物终浓度分别为胆红素 :50 100 150 200μmol/L; 血红蛋白 : 0.5 1 2 3 4 5g/L; 脂肪乳 :2 3 4 5 6g/L; NH + 4 :40 60 80 100 150μmol/L; 单胺氧化酶 (monoamineoxidase,mao):40 60 80 100 120 140U/L 每份样本重复测定 2 次, 取其均值与理论值做比较, 其干扰变异系数 (CV)<5% 为无干扰 5. 试剂稳定性试验将试剂 Ⅰ 和 Ⅱ 分别置于 HITACHI7600 020 全自动生化分析仪和 BECK MANCX7 全自动生化分析仪试剂仓中, 连续观察 4 周 10 和 30U/L 两水平 DAO 标准液测量值的变化 同时在 BECKMANCX7 全自动生化分析仪上进行试剂空白监测, 以试剂空白 <0.5 为试剂失效 6. 样本稳定性将 3 例血液样本分别放置于室温 4 和 -80 保存, 观察不同储藏温度对样本中 DAO 稳定性的影响 同时还观察了反复冻融对 3 个不同浓度 DAO 的影响 7. 诊断准确度选取 30 份烧伤后出现胃肠道黏膜屏障功能障碍或衰竭的烧伤患者样本和 30 份正常对照者样本, 用本法测定血清 DAO 活性, 采用受试者工作特征 (receiveroperatingchara teristic,roc) 曲线评价诊断准确度 8. 参考区间测定 150 名健康体检者 DAO 活性浓度, 按 95% 可信区间确立参考区间 六 统计学方法采用 SPSS16.0 统计软件进行分析 结果用 x±s 珋表示,P<0.05 为差异有统计学意义 结果一 方法建立 1. 光谱扫描结果 DAO 试验反应的特异吸收峰值与反应原理中 NADH 的特异吸收峰值一致, 均为 340nm 因此本法检测波长为 340nm, 副波长选择 405~410nm 以排除试验干扰 见图 1 2. 最佳检测时间的确定图 2 显示 200~ 300s 曲线近似水平, A 变化率稳定, 故选为最 佳检测时间 图 1 DAO 试验反应波长扫描 图 2 DAO 试验反应 A 变化率 经时曲线 3. 最佳缓冲液浓度与 ph 值选择 高浓度 DAO 测定值在缓冲液浓度为 100mmol/L ph 值 8.0 时最大 因此以 100mmol/L ph 值 8.0 为最 佳缓冲液浓度及 ph 值 结果见表 1 表 1 不同缓冲液浓度与 ph 值条件下测定结果 Tris HCl 缓冲液 (mmol/l) ph 值 50 100 200 500 7.0 17.13 22.89 16.34 9.36 7.5 24.65 33.84 21.86 15.92 8.0 35.53 43.54 31.01 19.34 8.5 27.85 36.82 24.94 17.12 9.0 22.23 28.36 19.46 13.21 9.5 17.58 23.88 15.78 10.29 4. 最佳底物浓度选择 根据实测结果做图可 看出当底物浓度 >3.2mmol/L 时 A 值变化不大, 反应几乎为最大速度, 说明反应已达零级反应 临床样本实测底物最佳浓度为 3.2mmol/L 根 据 Mjehaelis Menten 方程做双倒数曲线, 计算求得 Km=0.15 最佳底物浓度应为 Km 的 10~20 倍, 与临床样本实测底物最佳浓度相近似 见图 3
714 检验医学 2013 年 8 月第 28 卷第 8 期 及低值 (10U/L)3 个水平的批内和批间精密度均 <5%, 本法重复性良好 见表 2 3. 回收试验 2 个水平的回收率分别为 98.0% 95.8%, 说明本法准确度较高 见表 3 表 2 精密度试验结果 图 3 底物浓度与酶促反应二 方法学评价 1. 线性范围本法线性范围为 0~100U/L 见图 4 标准品浓度批内精密度批间精密度 x±s 珋 x±s 珋 50( 高值 ) 49.64±0.87 1.75 49.50±1.02 2.06 30( 中值 ) 29.80±0.61 2.05 29.60±0.98 3.31 10( 低值 ) 9.08±0.34 3.47 9.70±0.42 4.33 表 3 回收试验结果 样品 测定浓度 加入浓度 回收浓度 回收率 (%) 基础样品 Ⅰ 8.9 基础样品 Ⅱ 26.7 回收样品 Ⅰ 18.7 10 9.8 98.0 回收样品 Ⅱ 36.3 10 9.6 95.8 图 4 DAO 测定的线性范围 2. 精密度试验高值 (50U/L) 中值 (30U/L) 4. 干扰试验胆红素 <150μmol/L 血红蛋白 <4g/L 脂肪乳 <4g/L NH + 4 <60μmol/L MAO<120U/L 时对本法无明显干扰 见表 4 胆红素 (μmol/l) 血红蛋白 (g/l) 表 4 干扰试验结果 脂肪乳 (g/l) NH + 4 (μmol/l) MAO 50 2.6 0.5 1.3 2-0.8 40 3.7 40 0.4 100 3.5 1 1.9 3-3.0 60 4.8 60 0.6 150 4.8 2 2.6 4-4.9 80 5.4 80 1.0 200 5.7 3 3.9 5-5.5 100 6.5 100 1.2 4 4.7 6-8.2 150 6.9 120 1.6 5 5.6 140 2.0 5. 试剂稳定性检测结果以 CV<10% 为限, 试剂在 BECKMANCX7 全自动生化分析仪上可稳定保存 3 周, 在日立 HITACHI7600 020 全自动生化分析仪上可稳定保存 2 周 ; 以试剂空白 A 值 >0.5A 为限, 试剂可在 BECKMANCX7 全自动生化分析仪上可保存 3 周 6. 样本稳定性样本置 4 可保存 1 周, -80 可保存 6 个月, 反复冻融对反应结果有影响 7. 诊断准确度 ROC 曲线下面积为 0.960 ( 在非参数假设下标准误 =0.022; 在零假设下渐进 Sig=0.000; 渐近 95% 可信区间 :0.913~ 1.000) 表明本法的诊断准确度良好 见图 5 图 5 ROC 曲线分析
715 8. 参考区间 150 名健康对照者血清 DAO 活性为 (3.90±2.96)U/L, 按 95% 可信区间其诊断参考区间为 0~9.7U/L 讨论 DAO 是一种有脱胺作用的细胞内氧化酶, 主要存在于哺乳动物小肠黏膜 胎盘绒毛和肾组织中, 其中 95% 以上存在于小肠黏膜或绒毛上皮细胞, 其分解代谢组胺等多胺物质与细胞核酸和蛋白合成密切相关, 具有高度活性 [1] DAO 对 1,4 丁二胺和戊二胺具有专属特异催化作用,MAO 对其几乎无催化作用, 所以反应催化底物选用 1,4 丁二胺 NADH NH 3 和 α 酮戊二酸在 GLDH 催化下产生 NAD + 的反应, 已在其他成熟生化反应体系中应用, 如尿素检测, 所以反应监测指示物选用 NADH 本研究用双试剂连续监测法测定 DAO, 能消除内源性 NH 3 和 1,4 丁二胺的干扰, 提高了对溶血 黄疸 脂血等样本的抗干扰能力, 增强了试剂在机稳定性, 优于单试剂法 终点法和酶联免疫吸附试验 本法检测 DAO 可直接反映酶的催化活性, 而非酶的抗原表位含量, 在反映酶的催化功能方面优于放射同位素标记测定法 荧光法 酶联免疫吸附试验等免疫学检测法 方法学评价显示本方法准确度 精密度 线性良好, 抗干扰能力强, 但易受样本中甘油三酯的影响, 故样本应避免脂血 本研究通过观察试剂空白值和标准品测定值的变化联合评价试剂稳定性, 分析结果得出影响试剂有效性的主要因素为试剂中 NADH 的稳定性 为使试剂更稳定和易于保存, 配制试剂时应加入 EDTA 和酶稳定剂 另外, 某些重金属离子和硫基化合物皆能抑制 DAO [7], 故配制试剂时应注意排除该类物质 试剂在不同仪器上的稳定性有差异, 这与仪器的试剂在机贮存温度 制冷方式及试剂容器取样孔的大小相关 本法适用于全自动生化仪, 可对单个样本进行实时检测, 为急症和重症患者提供准确的临床报告 不同方法所测得酶含量和酶活性有差异, 应建立自己实验室的参考区间, 以供临床使用 目前临床用于肠道检查的内窥镜和放射显影 技术, 只能观察到肠道及其黏膜大体结构变化, 而血清 DAO 检测在细胞水平层面上, 可无创伤性地反映肠黏膜结构和功能的损伤 修复情况 血清 DAO 活性在各种原因导致的肠黏膜损伤 妊娠早期是否正常和胎儿成熟度监测均有临床意义 有研究显示组织或体液中 DAO 活性升高还见于某些恶性肿瘤 [6], 但恶性肿瘤患者血中 DAO 的检测尚缺乏报道 本法测定 DAO 适于临床推广 由于本研究病种和病例数有限, 对 DAO 与临床其他疾病的关系有待进一步观察和研究 参考文献 [1] ThompsonJS,VaughanWP,ForstCF,etal.Theefect oftherouteofnutrientdeliveryongutstructureand diamineoxidaselevels[j].jpen JParenterEnteral Nutr,1987,11(1):28 32. [2] 黎君友, 吕艺, 付小兵, 等. 二胺氧化酶在创伤后肠道损伤中变化及意义 [J]. 中华危重病急救医学, 2000,12(8):482 484. [3] KirstenE,GerezC,KirstenR.Anenzymaticmicro determination method forammonia,specificaly for extractsofanimaltisuesandfluids.determinationof NH4ionsinblood[J].Biochem Z,1963,337:312 319. [4] LorenzW,KuscheJ,WerleE.Onanewmethodfor thedetermination ofdiamineoxidaseactivity[j]. HoppeSeylersZPhysiolChem,1967,348(5):561 567. [5] HosodaN,NishiM,NakagawaM,etal.Structuraland functionalalterationsin the gutofparenteraly or enteralyfedrats[j].jsurgres,1989,47(2):129 133. [6] 杨山钟. 二胺氧化酶放射化学法测定及其临床应用 [J]. 南京铁道医学院学报,1993,34(4):246 249. [7] GeorgeG.Guilbaultmethodsofenzymaticanalysis translatedbymiaohuinan[m].shanghai:shanghai ScienceandTechnologyofShanghaiPres,1983:88 89. ( 收稿日期 :2012 10 07) ( 本文编辑 : 龚晓霖 )