中国农业科学 2010,43(5):986-992 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.05.013 一株异养氨氧化青霉 (Penicillium sp.) 特性研究 喻其林, 陈旭, 黄明媛, 路子佳, 潘虹, 王立群 ( 东北农业大学生命科学学院, 哈尔滨 150030) 摘要 : 目的 对分离自鸡粪好氧堆肥的一株氨氧化青霉(Penicillium sp.)m25-22 进行异养氨氧化特性的研究, 为该菌在鸡粪等固体废弃物好氧堆肥过程中的应用提供依据 方法 在以铵盐为唯一氮源的培养基中, 研究该菌生成亚硝酸盐氮与硝酸盐氮的能力 ; 调整培养基的碳源种类 氮源种类 蔗糖浓度 铵态氮浓度 ph 和培养温度等, 研究环境条件对该菌氨氧化能力的影响 结果 该菌在以铵盐为唯一氮源的培养基中, 菌体生长量及铵态氮利用率在 1 5 d 迅速增加 ; 硝酸盐氮浓度 3 5 d 上升迅速, 以后维持在 1.1 1.2 μg ml -1 ; 同时有少量亚硝酸盐氮生成 该菌在以葡萄糖 蔗糖 淀粉或纤维素为唯一碳源的培养基中均进行异养氨氧化, 能氧化硫酸铵 蛋白胨 乙酰胺 尿素或 L- 天冬氨酸中的负三价氮, 其中可溶性淀粉 纤维素 蛋白胨等缓效碳 氮源更有利 该菌在以蔗糖为唯一碳源 铵盐为唯一氮源的培养基中, 异养氨氧化的最适条件为, 蔗糖浓度 12 g L -1 铵态氮浓度 2.438 mg ml -1 ph 7.5 和培养温度 30 结论 M25-22 存在细菌的无机氮氧化途径, 且能将生成的亚硝酸盐氮迅速氧化为硝酸盐氮, 其氨氧化作用属于次级代谢 该菌能以多种有机物为碳源进行异养氨氧化, 能氧化多种氮源中的负三价氮素, 且在高有机物 高铵态氮浓度下表现出较强的异养氨氧化能力, 因而在鸡粪等固体废弃物的好氧堆肥实践中具有应用价值 关键词 : 好氧堆肥 ; 异养氨氧化 ; 青霉 ; 次级代谢 Study on the Characteristics of a Strain of Penicillium sp. With the Capacity of Heterotrophic Ammonium Oxidation YU Qi-lin, CHEN Xu, HUANG Ming-yuan, LU Zi-jia, PAN Hong, WANG Li-qun (College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030) Abstract: Objective The objective of this study was to reveal the characteristics of a strain (M25-22) of Penicillium sp. with the capacity of heterotrophic ammonium oxidation isolated from chicken feces compost, and to provide scientific references for its application in aerobic composting. Method Media with ammonium salt as the sole nitrogen source was used to determine the heterotrophic ammonium oxidation activity of the strain. Some environmental factors, such as compositions of carbon and nitrogen sources, concentrations of sucrose and ammonium nitrogen, initial ph and culture temperature, were adjusted to gain better insight into the effects of them on ammonium oxidation by the strain. Result In media containing (NH 4 ) 2 SO 4 at a concentration of 0.5 g/100 ml, mycelium weight and utilization ratio of ammonium nitrogen increased markedly during the first 5 days; nitrate concentration increased markedly from the 3rd to 5th day, and remained constant thereafter; nitrite concentration remained at a low level. The strain showed an ability to oxidize ammonium nitrogen growing in media containing glucose, sucrose, starch or cellulose as the sole carbon source, and to oxidize the negative trivalent nitrogen of ammonium sulfate, peptone, acetamide, urea or L-aspartate. Slowly available carbon or nitrogen sources, such as starch, cellulose and peptone, were beneficial to ammonium oxidation by the strain. In media containing sucrose as the sole carbon source and ammonium sulfate as the sole nitrogen source, nitrate formation was the most pronounced with sucrose present at a concentration of 12 g L -1 and ammonium nitrogen present at a concentration of 2.438 mg ml -1, at the initial ph level of 7.5 and at 30. Conclusion There is an inorganic nitrogen nitrification pathway of bacteria in 收稿日期 :2009-07-03; 接受日期 :2009-08-28 基金项目 : 国家自然科学基金 (30371054) 作者简介 : 喻其林, 硕士研究生 Tel:13895725653;E-mail:yuqilin7007@163.com 通信作者王立群, 教授 Tel:0451-55190519;E-mail: wangliqun2@163.com
5 期喻其林等 : 一株异养氨氧化青霉 (Penicillium sp.) 特性研究 987 the strain. Ammonium oxidation by the strain is involved in secondary metabolism. The strain is capable of oxidizing a variety of reduced nitrogen with different carbon sources, and has an enormous capacity for ammonium oxidation at high concentrations of organic substance and ammonium nitrogen. It is indicated that the strain has an expansive application prospect in aerobic composting of solid waste. Key words: aerobic composting; heterotrophic ammonium oxidation; Penicillium sp.; secondary metabolism 0 引言 研究意义 随着畜禽养殖业的发展, 其粪便污染问题日益严峻 [1-3] 好氧堆肥是使之无害化的主要方法 [4] [5], 但该过程的氨挥发会导致严重的氮素损失 [6], 其量可达 62% [7], 因而影响堆肥的质量 异养氨氧化微生物能在高有机物 高铵态氮或高有机氮的环境中, 将铵态氮或负三价有机氮氧化为羟胺 亚硝酸盐氮或硝酸盐氮 [8], 从而减少了氨的挥发, 保证肥效 [9-10] 因此, 利用这类微生物 明确其氨氧化特性, 具有重要意义 前人研究进展 异养氨氧化微生物的种类多于自养氨氧化微生物, 其底物范围也比自养氨氧化微生物的广泛, 铵态氮 酰胺 肟 芳香硝基化合物等均可利用 [11] 因此作用更复杂, 其特性及机理迄今未完全明了 目前有关细菌的研究报道较多, 如氨单加氧酶 羟胺氧化酶等异养氨氧化酶类的分离 [12-13] ; 某些种属 (Pseudonocardia [14] Alcaligenes [15] Acinetobacter [16] ) 已用于实践, 但研究发现具有该作用的真菌比细菌数量更多 效率更高 [17] 而有关此类真菌的氨氧化特性的相关报道甚少 本研究切入点 笔者在鸡粪好氧堆肥的研究中证明了氨氧化霉菌的存在, 并筛选到一株高效异养氨氧化青霉 (Penicillium sp.)m25-22 [18] 本文将对其的氨氧化能力以及环境条件的影响予以报道 拟解决的关键问题 测定 M25-22 不同生长时期的氨氧化能力, 并探索各环境条件对该菌氨氧化能力的影响, 为该菌应用于鸡粪等固体废弃物好氧堆肥过程 遏制氮素的损失提供参考 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株异养氨氧化青霉菌 (Penicillium sp.) M25-22 保存于东北农业大学生命科学学院微生物学教研室, 分离自鸡粪好氧堆肥 25 温段 1.1.2 异养氨氧化霉菌培养基蔗糖 1.0 g,(nh 4 ) 2 SO 4 0.5 g,k 2 HPO 4 0.1 g,kcl 0.05 g,mgso 4 7H 2 O 0.05 g, NaCl 0.1 g,feso 4 7H 2 O 0.001 g,mnso 4 H 2 O 0.0001 g, ZnSO 4 7H 2 O 0.0001 g,cuso 4 5H 2 O 0.0001 g,h 2 O 100 ml,ph 6.8 1.2 方法 1.2.1 M25-22 不同生长时期氨氧化能力及生长量的测定 M25-22 接种盛 100 ml 异养氨氧化霉菌培养基的 250 ml 三角瓶中,25 130 r/min 摇床培养 后每天定时取样, 测定培养基中菌体生长量及铵态氮 亚硝酸盐氮 硝酸盐氮浓度, 并由铵态氮浓度换算出铵态氮利用率, 即培养基中铵态氮利用浓度与初始铵态氮浓度之比 其中, 培养基中铵态氮利用浓度, 即培养基中初始铵态氮浓度与培养后铵态氮浓度之差 1.2.2 环境条件对 M25-22 氨氧化能力的影响调整异养氨氧化霉菌培养基中的碳源种类 氮源种类 蔗糖浓度 铵态氮浓度 初始 ph 以及培养温度等, 分别做单因素试验, 研究各环境条件对 M25-22 氨氧化能力的影响 碳源种类影响试验中, 分别采用葡萄糖 蔗糖 可溶性淀粉 纤维素为唯一碳源, 核算并保证培养基中碳素含量为 4.0 mg ml -1 除碳源外, 培养基其它成分及其用量同 1.1.2 氮源种类影响试验中, 分别采用硫酸铵 蛋白胨 乙酰胺 尿素 L- 天冬氨酸作为唯一氮源, 核算并保证培养基中氮素含量为 1.06 mg ml -1 除氮源外, 培养基其它成分及其用量同 1.1.2 蔗糖浓度影响试验中, 设置每 100 ml 培养基中分别含蔗糖 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 和 2.0 g, 共 11 个浓度梯度 培养基其它成分的用量同 1.1.2 铵态氮浓度影响试验中, 设置每 100 ml 培养基中分别含 (NH 4 ) 2 SO 4 0.15 0.35 0.55 0.75 0.95 1.15 和 1.35 g, 共 7 个浓度梯度 核算后各梯度分别相当于含铵态氮 0.318 0.742 1.166 1.590 2.014 2.438 和 2.862 mg ml -1 培养基其它成分的用量同 1.1.2 初始 ph 影响试验中, 设置培养基初始 ph 分别为 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 和 8.5, 共 11 个梯度 培养基成分及其用量同 1.1.2 培养温度影响试验中, 采用异养氨氧化霉菌培养基, 设置培养温度分别为 20 25 30 35 40 45
988 中国农业科学 43 卷 和 50, 共 7 个梯度 上述各试验中培养基分别接种 M25-22, 除培养温度影响试验外 ( 培养温度试验中采用设置温度 ), 培养条件同 1.2.1, 但培养时间均为 5 d, 并设空白对照 3 次重复 碳源 氮源种类试验测定菌体生长量及硝酸盐氮 亚硝酸盐氮浓度 ; 其它试验测定铵态氮 硝酸盐氮浓度, 并计算铵态氮利用率 ( 铵态氮浓度影响试验计算铵态氮利用量 ) 1.2.3 检测方法菌体生长量采用干重法 [19] ; 铵态氮采用纳氏试剂法 [20] ; 亚硝酸盐氮采用 N-(1- 萘基 ) - 乙二胺光度法 [20] ; 硝酸盐氮采用镉柱还原法 [21] 1.2.4 数据分析用 SAS9.0 统计分析软件对数据进行分析 ( 多重比较采用 Duncan s 新复极差法 ) 2 结果 2.1 M25-22 不同生长时期氨氧化能力及生长量的测定由图 1 可知,M25-22 在培养 1 d 后, 菌体生长量及铵态氮利用率均明显增加,5 d 后增幅渐缓 硝酸盐氮浓度 2 d 后开始增加,3 5 d 上升迅速, 以后渐缓, 并维持在 1.1 1.2 µg ml -1 亚硝酸盐氮浓度也在培养 2 d 后开始增加,4 d 最高, 以后逐渐降低,11 d 消失 亚硝酸盐氮始终比硝酸盐氮浓度低, 说明 M25-22 氧化铵态氮生成的亚硝酸盐氮能迅速被氧化为硝酸盐氮, 即氧化的主产物为硝酸盐氮 图 1 还可见, 亚硝 酸盐氮 硝酸盐氮的生成是在菌体生长量和铵态氮利用率趋于最大值之后, 故推断 M25-22 的氨氧化作用属于次级代谢 [22] 2.2 碳源种类对 M25-22 氨氧化能力的影响由图 2 可知,M25-22 在所试 4 种碳源培养基中的生长量不同, 但均有异养氨氧化作用, 生成的亚硝酸盐氮量较低 硝酸盐氮量大 不同处理下微生物的生长量顺序为 : 蔗糖 > 葡萄糖 > 可溶性淀粉 > 纤维素 ; 亚硝酸盐氮和硝酸盐氮生成量的顺序相同, 排列为 : 可溶性淀粉 > 纤维素 > 蔗糖 > 葡萄糖 可溶性淀粉和纤维素碳源处理的亚硝酸盐氮和硝酸盐氮生成量高于蔗糖和葡萄糖的处理, 认为是微生物生理学的速效碳源的初级代谢产物量大并对次级代谢具有抑制作用 [22] 所致, 该结果也提示 : 对于属于次级代谢的异养氨氧化作用, 利用淀粉 纤维素等缓效碳源要优于蔗糖 葡萄糖等速效碳源 按单位菌体生长量生成的硝酸盐氮量计, 所试碳源中纤维素最高, 由此推断,M25-22 在鸡粪好氧堆肥的异养氨氧化时以纤维素为碳源更有利 另外, 从菌体生长量 亚硝酸盐氮和硝酸盐氮生成量的顺序还可见,M25-22 生长的最适碳源与异养氨氧化作用的并不一致 2.3 氮源种类对 M25-22 氨氧化能力的影响 图 1 M25-22 不同生长时期菌体干重 铵态氮利用率及生成亚硝酸盐氮 硝酸盐氮浓度 Fig. 1 Dry mycelium weight, utilization ratio of ammonia-n, and concentrations of nitrite-n and nitrate-n produced by M25-22 during different periods 柱体上间具有不同字母的表示处理差异显著 (P<0.05), 下同 Bars with different letters are different significantly at 0.05 level. The same as below 图 2 不同碳源条件下的菌体干重 亚硝酸盐氮浓度与硝酸盐氮浓度 Fig. 2 Effect of various carbon sources on dry mycelium weight and concentrations of nitrite-n and nitrate-n
5 期喻其林等 : 一株异养氨氧化青霉 (Penicillium sp.) 特性研究 989 由图 3 可知,5 种氮源中的负三价氮素均能被 M25-22 转化成亚硝酸盐氮和硝酸盐氮, 后者浓度亦明显高于前者 在氮素含量相同时, 菌体生长量差别不大, 但亚硝酸盐氮量和硝酸盐氮量差别较大 不同氮源处理的亚硝酸盐氮量排序为 : 蛋白胨 > 乙酰胺 > 尿素 > 硫酸铵 >L- 天冬氨酸 ; 硝酸盐氮量为 : 蛋白胨 > L- 天冬氨酸 > 乙酰胺 > 尿素 > 硫酸铵 这说明, 该菌氧化负三价有机氮的能力强于对铵态氮的氧化能力, 蛋白胨居首 原因是速效氮源对次级代谢具有抑制作用 [22], 而蛋白胨与其它 4 种氮源相比, 属缓效氮源 图 4 蔗糖浓度对培养基中硝酸盐浓度 铵态氮利用率的影响 Fig. 4 Effect of concentration of sucrose on concentration of nitrate-n and utilization ratio of ammonia-n 图 3 不同氮源条件下的菌体干重 亚硝酸盐氮浓度与硝酸盐氮浓度 Fig. 3 Effect of various nitrogen sources on dry mycelium weight and concentrations of nitrite-n and nitrate-n 2.4 蔗糖浓度对 M25-22 氨氧化能力的影响由图 4 可知, 在蔗糖浓度 12 g L -1 时, 硝酸盐氮浓度最大 ; 小于该浓度, 硝酸盐氮浓度 铵态氮利用率均随之增加而升高 ; 大于该浓度, 铵态氮利用率继续升高, 而硝酸盐氮浓度下降 这是因为培养基中蔗糖浓度的增加, 使 C/N 渐趋合理, 故氨氧化作用加强 ; 当蔗糖浓度超过 12 g L -1 时,C/N 不适, 氨氧化作用减 [23] 弱 这与 Schmidt 等研究的异养氨氧化菌株 (Aspergillus flavus) 在 C/N 高于 5.9 时, 不再生成硝酸盐氮的结果相符 2.5 铵态氮浓度对 M25-22 氨氧化能力的影响由图 5 可知, 在以硫酸铵为唯一氮源的培养基中, 铵态氮浓度在 2.438 mg ml -1 之前时, 硝酸盐氮浓度和铵态氮利用浓度均随之增加而增加 原因是铵态氮浓 图 5 铵态氮浓度对培养基中硝酸盐浓度 铵态氮利用量的影响 Fig. 5 Effect of concentration of ammonia-n on concentration of nitrate-n and utilization content of ammonia-n 度的提高, 增加了菌体氧化和同化铵态氮的底物之故 ; 此后, 铵态氮浓度的再度提高, 则使 C/N 不适宜, 故两者均降低 2.6 ph 对 M25-22 氨氧化能力的影响由图 6 可知,M25-22 所在培养基的硝酸盐氮浓度在 ph7.5 时最高, 铵态氮利用率在 ph7.0 时最高, 随后二者均下降 说明该菌氨氧化的最适 ph 比同化铵态氮的高 2.7 培养温度对 M25-22 氨氧化能力的影响由图 7 可知, 随着培养温度的升高,M25-22 所在培养基中硝酸盐氮浓度和铵态氮利用率均表现为先增
990 中国农业科学 43 卷 图 6 ph 对培养基中硝酸盐浓度 铵态氮利用率的影响 Fig. 6 Effect of ph on concentration of nitrate-n and utilization ratio of ammonia-n 后降 前者 30 时最高 ; 后者 25 时最高 可见, 该菌氧化铵态氮的最适温度亦较同化铵态氮的高 实践意义 本文中氨氧化青霉 M25-22 在高有机物 高铵态氮浓度下表现出较强的异养氨氧化能力, 且具有分解纤维素以及同化 氧化铵态氮及多种有机氮的能力 因此, 将其用于鸡粪等固体废弃物的好氧堆肥实践中, 可发挥其遏制氨挥发 保持肥效 减少环境污染的作用 近年研究认为, 具有异养氨氧化作用的主要是细菌和真菌 探索它们的作用方式和调控机理, 将有助于实际应用 [24] Kuenen 等的研究认为, 异养氨氧化细菌对负三价氮素的氧化代谢途径有两条, 即无机氮氧化途径和有机氮氧化途径 差别系前者生成亚硝酸盐氮, 而后者不能 本文的 M25-22 能积累亚硝酸盐氮, 证明该菌具有无机氮氧化途径 至于是否尚存有机氮氧化途径, 有待进一步验证 本研究表明, 亚硝酸盐氮 硝酸盐氮是在 M25-22 生长进入稳定期后才大量生成, 故推断 M25-22 的氨 [25] 氧化作用属于次级代谢, 这一点与 Robertson 等关于异养氨氧化细菌的报道相符 另外本研究进一步证明, 有利于次级代谢的缓效营养物质有利于该菌异养氨氧化作用, 这一发现为调控异养氨氧化霉菌, 乃至所有异养氨氧化微生物的氨氧化作用提供了新的思路 氨氧化青霉 M25-22 异养氨氧化作用的最适 ph 为 7.5, 最适温度为 30, 且缓效碳源如纤维素等更有利于该作用的发挥 由此推断, 该菌在实际应用中, 保持堆肥体系的偏碱 中温环境, 以及增加其中秸秆等高纤维素原料的含量, 将对该菌的氨氧化具有促进作用, 即可更有效的降低堆肥氮素损失 保持肥效 4 结论 图 7 培养温度对培养基中硝酸盐浓度 铵态氮利用率的影响 Fig. 7 Effect of culture temperature on concentration of nitrate-n and utilization ratio of ammonia-n 3 讨论 鉴于异养氨氧化微生物具有在高有机物 高氮素条件将负三价氮转化为亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的作用, 因此, 对这类微生物资源的开发研究具有重要的 4.1 M25-22 在以铵盐为唯一氮源的培养基中, 菌体生长量及铵态氮利用率均在 1 5 d 时迅速增加 ; 硝酸盐氮生成量在 3 5 d 上升迅速, 以后维持在 1.1 1.2 µg ml -1 ; 亚硝酸盐氮的生成时段与前者类似, 但量较低 说明 M25-22 存在细菌的无机氮氧化途径, 并能将生成的亚硝酸盐氮迅速氧化为硝酸盐氮, 其氨氧化作用属于次级代谢 4.2 M25-22 在以葡萄糖 蔗糖 淀粉或纤维素为唯一碳源的培养基中均有异养氨氧化作用, 能氧化硫酸铵 蛋白胨 乙酰胺 尿素或 L- 天冬氨酸中的负三价氮素 其中的可溶性淀粉 纤维素 蛋白胨等缓效碳源或氮源更有利于该菌的氨氧化作用
5 期喻其林等 : 一株异养氨氧化青霉 (Penicillium sp.) 特性研究 991 4.3 以蔗糖为唯一碳源 铵盐为唯一氮源的培养基中,M25-22 进行异养氨氧化作用的最适条件为 : 蔗糖浓度 12 g L -1 铵态氮浓度 2.438 mg ml -1 ph 7.5 和培养温度 30 References [1] Soupir M L, Mostaghimi S, Yagow E R, Hagedorn C, Vaughan D H. Transport of fecal bacteria from poultry litter and cattle manures applied to pastureland. Water, Air, and Soil Pollution, 2006, 169: 125-136. [2] 程绍明, 马杨晖, 姜雄晖. 我国畜禽粪便处理利用现状及展望. 农机化研究, 2009, 25(2): 222-224. Cheng S M, Ma Y H, Jiang X H. Comprehensive utilization technologies of livestock manure. Journal of Agricultural Mechanization Research, 2009, 25(2): 222-224. (in Chinese) [3] 张绪美, 董元华, 王辉, 沈旦. 江苏省畜禽粪便污染现状与防治对策. 土壤, 2007, 39(5): 708-712. Zhang X M, Dong Y H, Wang H, Shen D. Pollution of livestock and poultry feces in Jiangsu and countermeasures. Soils, 2007, 39(5): 708-712. (in Chinese) [4] 黄宏坤, 林而达. 规模化畜禽养殖场废弃物无害化处理及资源化利用研究. 北京 : 中国农业科学院博士后研究工作报告, 2002. Huang H K, Lin E D. Studies on waste treatment and utilization in large scale animal farm. Beijing: Postdoctoral Researche Reports of Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2002. (in Chinese) [5] Delaune P B, Moore P A Jr, Daniel T C, Lemunyon J L. Effect of chemical and microbial amendments on ammonia volatilization from composting poultry litter. Journal of Environmental Quality, 2004, 33(2): 728-735. [6] Raviv M, Medina S, Krasnovsky A, Ziadna H. Organic matter and nitrogen conservation in manure compost for organic agriculture. Compost Science and Utilization, 2004, 12(1): 6-11. [7] Kithome M, Paul J W, Bomke A A. Reducing nitrogen losses during simulated composting of poultry manure using adsorbents or chemical amendments. Journal of Enviromental Quality, 1999, 28(1): 194-201. [8] Marshall K C, Alexander M. Nitrification by Aspergillus flavus. Journal of Bacteriology, 1962, 83: 572-578. [9] 曹喜涛. 畜禽粪便堆制过程中氮素损失及接种异养亚硝化细菌的初步研究 [D]. 南京 : 南京农业大学, 2004. Cao X T. Nitrogen losses and inoculation with heterotrophic nitrifier during the compost of livestock and poultry manure[d]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2004. (in Chinese) [10] 王立群, 曹立群, 肖维伟, 顾文杰, 孙文. 鸡粪好氧发酵氮转化 与相应细菌数量变化规律的研究. 中国土壤与肥料, 2008(5): 61-65. Wang L Q, Cao L Q, Xiao W W, Gu W J, Sun W. Study on regulation of N-removal and N-removal bacteria in the course of chicken manure aerobic fermentation. Soil and Fertilizer Sciences in China, 2008(5): 61-65. (in Chinese) [11] Doxtader K G, Alexander M. Nitrification by heterotrophic soil microorganisms. Soil Science Society of America Proceeding, 1966, 30: 351-355. [12] Moir J W B, Crossman L C, Spiro S, Richardson D J. The purification of ammonia monooxgenase from paracoccus denitrificans. Federation of European Biochemical Societies, 1996, 387: 71-74. [13] Otte S, Schalk J, Kuenen J G, Jetten M S M. Hydroxylamine oxidation and subsequent nitrous oxide production by the heterotrophic ammonia oxidizer Alcaligenes faecalis. Applied Microbial Biotechnology, 1999, 51: 255-261. [14] Ahmad N U D, Xu H Y, Chen L P, Liu Z P, Liu S J. Enhanced biological nutrient removal by the alliance of a heterotrophic nitrifying strain with a nitrogen removing ecosystem. Journal of Environmental Sciences-China, 2008, 20(2): 216-223. [15] Joo H S, Hirai M, Shoda M. Piggery wastewater treatment using Alcaligenes faecalis strain No. 4 with heterotrophic nitrification and aerobic denitrification. Water Research, 2006, 40(16): 3029-3036. [16] 陈赵芳, 尹立红, 浦跃朴, 李先宁, 谢祥峰. 一株异养硝化菌的筛选及其脱氮条件. 东南大学学报 : 自然科学版, 2007, 37(3): 486-490. Chen Z F, Yin L H, Pu Y P, Li X N, Xie X F. Screening of a heterotrophic nitrifying bacterium strain and its optimal conditions for nitrogen removing. Journal of Southeast University: Natural Science Edition, 2007, 37(3): 486-490. (in Chinese) [17] Stroo H F, Klein T M, Alexander M. Heterotrophic nitrification in an acid forest soil and by an acid-tolerant fungus. Applied and Environmental Microbiology, 1986, 52(5): 1107-1111. [18] 吴永英, 王广旭, 顾文杰, 曹立群, 张传富, 彭科峰, 王立群. 鸡粪好氧堆肥中霉菌的筛选及降解特性. 哈尔滨工业大学学报, 2008, 40(7): 1116-1120. Wu Y Y, Wang G X, Gu W J, Cao L Q, Zhang C F, Peng K F, Wang L Q. Characteristic of moulds decomposing from aerobic composting of chicken manure. Journal of Harbin Institute of Technology, 2008, 40(7): 1116-1120. (in Chinese) [19] 李芳, 刘波, 刘芳, 陈家骅. 摇床转速对淡紫拟青霉菌生长的影响. 微生物学杂志, 2005, 25(2): 103-106. Li F, Liu B, Liu F, Chen J H. Effects of different shaker s rotating
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