東海大學食品科學研究所 Graduate Institute of Food Science TUNGHAI UNIVERSITY 食品科技組 Food Technology Section 碩士論文 Master Thesis 指導教授 : 阮進惠博士 Advisor:Jin-Hwei Rwan, Ph. D. 槲皮素奈米顆粒之製備及特性之研究 Preparation and Characterization of Quercetin Nanoparticles 研究生 : 林希奇撰 Graduate Student:Hsi-Chi Lin 中華民國一 一年一月 January, 2012
謝誌 研修碩士學位期間, 承蒙恩師阮進惠博士於研究上給予悉心指導並全力支持, 使實驗與論文得以順利進行與完成 在論文撰寫期間, 感謝恩師不厭其煩詳閱批改及給予建議, 使我得以順利通過學位口試, 師恩浩蕩, 對恩師致上最深的謝意 論文口試期間, 承蒙國立屏東科技大學食品科學系吳明昌博士 及本研究所盧錫祺博士, 撥空審閱及詳加修正, 並提供寶貴意見, 使本論文內容更為周詳, 在此深表由衷感謝 在研究所期間, 感謝系所所有教授和助教在專業領域上的知識傳 授及協助, 也感謝本校化材系張有義及李國禎老師慷慨借儀器及協 助, 使實驗得以順利進行 在此, 感謝盧老師和師母, 對我的包容和疼愛, 把我當自己研究室的學生關心 ; 感謝王姐為我們不計回報無私的付出 ; 感謝慧文及百秀學姐在實驗上的關懷與指導, 甚至畢業後依舊關心 ; 感謝佳華 (Pi), 因為有妳, 我才可以有足夠的勇氣面對所有的喜 怒 哀 樂 ; 感謝芃萱 ( 江 Q) 在忙碌的實驗生活, 總在 KTV 不計形象給予大家最大的快樂 ; 感謝鈺馨 (cola) 雖然不常見面, 但見到妳總有安心的感覺 ; 感謝瑄閔 ( 閔豬 ) 在實驗瓶頸時總是不忘替我加油打氣 ; 感謝建廷 ( 阿歹 ) 和俊麟 ( 郭妹妹 ), 雖然你們總以整我和嚇我為最大樂趣, 但重要時刻你們總是最講義氣的一對寶 ; 感謝本屆全體朋友們, 在兩年多裡共同創造了許多屬於我們的回憶 ; 感謝書平學妹, 謝謝妳的尊重與陪伴, 使我能專注於我的研究上 ; 感謝學弟妹偉珊 ( 小偉 ) 凱琳 鈺萍 欣
怡 ( 夜夜 ) 彥蘋 ( 大寶 ) 巧玲 豐毓( 碰碰 ) 及哲瑜 ( 尼可楊 ) 對我的包容 關心和照顧, 讓我備感溫暖 ; 感謝化工系 118 研究室高維澤 王肇擎和全體研究室的情義相挺 ; 感謝馨儀和昀真, 總是在我脆弱的時候給我最大的安慰, 即使妳們不在身邊但謝謝妳們總是關心我的近況 ; 感謝學弟妹宥勝 ( 加菲 ) 彥碩和柏雅, 有你們的關心真的很溫暖 研究所期間得到太多人的幫助, 無法一一詳列, 在此一併致謝, 謝謝你們的扶持 打氣和一路相挺, 因為有你們更加充實快樂 最後, 感謝我最愛的爸爸 媽媽及弟弟, 給我最大的包容 支持 和鼓勵, 也感謝維妮的忠實陪伴, 讓我無後顧之憂下完成學業 將此 論文獻給我最親愛的家人, 一起分享我的成長與喜悅 林希奇謹致於 東海大學食品科學研究所 中華民國一 一年一月
目錄 頁數 中文摘要......Ⅰ 英文摘要.....Ⅲ 壹 前言...1 貳 文獻整理......2 一 幾丁質與幾丁聚醣...2 ( 一 ) 幾丁質與幾丁聚醣簡介...2 ( 二 ) 幾丁質與幾丁聚醣結構...3 ( 三 ) 幾丁聚醣溶液之特性...5 ( 四 ) 低分子量幾丁聚醣之製備...5 二 臭氧...6 ( 一 ) 臭氧的基本性質...6 ( 二 ) 臭氧與有機物之反應機制.( 在水中的反應型態 )...6 ( 三 ) 臭氧氧化多醣類之可能機制...8 ( 四 ) 影響臭氧反應之因素...12 三 幾丁聚醣在藥物傳遞系統之應用...16 ( 一 ) 幾丁聚醣於生醫材料之應用...16 ( 二 ) 幾丁聚醣於藥物控制釋放之應用...16 ( 三 ) 幾丁聚醣具有促進物質吸收之原因...20 四 奈米科技...22 ( 一 ) 奈米科技簡介...22 ( 二 ) 奈米在食品之應用... 22 ( 三 ) 奈米顆粒 (nanoparticles)...23 ( 四 ) 奈米安全性...24 五 幾丁聚醣奈米顆粒...27 ( 一 ) 常見幾丁聚醣奈米顆粒的製備方法...27 ( 二 ) 以離子交聯法製備幾丁聚醣奈米顆粒之機制與應用...33 六 類黃酮物質 - 槲皮素...38 ( 一 ) 類黃酮之簡介...38 ( 二 ) 類黃酮之食物來源與其結構...38 ( 三 ) 類黃酮物質之生理機能...41 ( 四 ) 類黃酮之安全使用量...42 ( 五 ) 槲皮素之吸收障礙...42 參 材料與方法...43 一 實驗原料與藥品...43 二 實驗儀器...43
三 樣品準備...44 ( 一 ) 幾丁聚醣...44 ( 二 ) 不同分子量幾丁聚醣之製備...44 ( 三 ) 槲皮素 (Quercetin,QT) 溶解性測試...45 四 實驗方法...45 ( 一 ) 幾丁聚醣 (CS) 溶液及三聚磷酸鈉 (TPP) 溶液先後加入順序對 CS-TPP 奈米顆粒形成影響之試驗...45 ( 二 ) 幾丁聚醣 - 槲皮素 - 三聚磷酸鈉 (CS-QT-TPP) 奈米顆粒之製備...45 ( 三 ) CS-QT-TPP 奈米顆粒在模擬胃 腸液中之安定性試驗...47 五 分析方法...48 ( 一 ) 幾丁聚醣去乙醯度之測定...48 ( 二 ) 幾丁聚醣水解物之分子量測定...49 ( 三 ) 包覆率之測定...50 ( 四 ) 奈米顆粒粒徑和表面電荷之測定...50 ( 五 ) QT 之定量方法...50 ( 六 ) 掃描式電子顯微鏡 (SEM) 觀察...51 ( 七 ) 統計分析...51 肆 結果與討論...52 一 樣品製備...52 ( 一 ) 幾丁聚醣之製備...52 ( 二 ) 不同分子量幾丁聚醣之製備...52 ( 三 ) 槲皮素 (Quercetin,QT) 之溶解性...54 二 幾丁聚醣 - 三聚磷酸鈉奈米顆粒懸浮液之巨觀觀察...56 三 槲皮素 (QT) 濃度 幾丁聚醣 (CS) 分子量及幾丁聚醣 - 三聚磷酸鈉 (TPP) 重量比對幾丁聚醣 - 槲皮素 - 三聚磷酸鈉 (CS-QT-TPP) 奈米顆粒特性影響...59 ( 一 ) 槲皮素 (QT) 濃度之影響...59 ( 二 ) 幾丁聚醣分子量之影響....64 ( 三 )CS/TPP 重量比之影響...70 四 幾丁聚醣 - 槲皮素 - 三聚磷酸鈉 (CS-QT-TPP) 奈米顆粒安定性之試驗...75 ( 一 ) 模擬胃液中 (ph 1.2) 之安定性...75 ( 二 ) 模擬腸液中 (ph 7.4) 之安定性...77 五 掃描式電子顯微鏡 (SEM) 觀察 CS-QT-TPP 奈米顆粒外觀型態..78 伍 結論...80 一 不同分子量幾丁聚醣之製備...80 二 槲皮素 (Quercetin,QT) 之溶解性...80 三 幾丁聚醣 (CS)- 三聚磷酸鈉 (TPP) 奈米顆粒懸浮液之巨觀...80 四 CS-QT-TPP 奈米顆之製備及特性之影響因子...80 ( 一 )QT 濃度之影響...81 ( 二 ) CS 分子量之影響...81 ( 三 ) CS/TPP 重量比之影響...81 五 CS-QT-TPP 奈米顆粒於胃 腸液中之安定性......82
六 掃描式電子顯微鏡 (SEM) 觀察 CS-TPP 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒外觀型態........82 七 總結...83 陸 參考文獻...84
圖目錄 頁數圖一 幾丁質 幾丁聚醣及纖維素之基本結構...4 圖二 臭氧分子的共振結構...7 圖三 臭氧在水中之反應型態...9 圖四 臭氧自分解反應機制...9 圖五 臭氧氧化降解多醣類之可能機制 ( 一 )...10 圖六 臭氧氧化降解多醣類之可能機制 ( 二 )...11 圖七 營養物質經由腸上皮細胞之三種穿透模式...21 圖八 奈米顆粒於腸道吸收之優勢...26 圖九 以乳化交聯法製備幾丁聚醣顆粒流程圖...29 圖十 以離子交聯法製備幾丁聚醣顆粒之流程圖...32 圖十一 以逆微胞法製備幾丁聚醣顆粒之流程圖...32 圖十二 幾丁聚醣與 TPP 之離子交聯反應...34 圖十三 臭氧濃度及處理時間對幾丁聚醣降解程度之影響...53 圖十四 槲皮素濃度對包覆率及裝載率之影響...60 圖十五 槲皮素濃度對 CS-QT-TPP 奈米顆粒粒徑大小之影響...62 圖十六 幾丁聚醣分子量對 QT 包覆率之影響...66 圖十七 幾丁聚醣分子量對 CS-TPP 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒粒徑大小之影響..67 圖十八 CS/TPP 重量比對 QT 包覆率之影響...71 圖十九 CS/TPP 重量比對 CS-TPP 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒粒徑大小之影響...73 圖二十 CS-QT-TPP 奈米顆粒在 (a) 模擬胃液 (ph 1.2 buffer) (b) 模擬腸液中 (ph 7.4 buffer) 安定性影響...76 圖二十一 CS-TPP 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒之掃描式電子顯微鏡 (SEM) 觀察.79
表目錄 頁數表一 氧化物之氧化電位...7 表二 臭氧在水中的溶解度...14 表三 臭氧分解的自由基形式連鎖反應中典型的起始劑 促進劑及抑制劑..15 表四 幾丁聚醣在生醫材料主要特性及其應用...18 表五 幾丁聚醣在藥物學上的應用及其藥物傳遞形式...19 表六 常見幾丁聚醣奈米顆粒之製備方法及其在藥物 蛋白質或基因上的應用..28 表七 類黃酮化合物之結構...39 表八 大部分的類黃酮在植物界的分佈...40 表九 槲皮素對若干溶劑之溶解性...55 表十 CS 溶液滴入 TPP 溶液時 CS-TPP 奈米顆粒之巨觀型態...57 表十一 TPP 溶液滴入 CS 溶液時 CS-TPP 奈米顆粒之巨觀型態...58 表十二 槲皮素濃度對 CS-QT-TPP 奈米顆粒表面電位之影響...63 表十三 幾丁聚醣分子量對 CS-TPP 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒表面電位之影響...69 表十四 CS/TPP 重量比對 CS-TPP 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒表面電位之影響...74
中文摘要 本研究以帶正電之幾丁聚醣 (chitosan,cs, 去乙醯度 85%) 及帶負電之三聚磷酸鈉 (sodium tripolyphosphate,tpp), 利用離子交聯作用之方式包覆槲皮素 (quercetin,qt) 製成奈米顆粒, 以包覆與保護 QT 之生理活性為目的 首先以臭氧對 CS Original Mw (380 kda) 氧化降解至 200-250 kda (High Mw) 100-150 kda (Medium Mw) 以及 50 kda 以下 (Low Mw) 之不同分子量之 CS, 並分別溶於 1% 醋酸溶液使濃度為 2 mg/ml 及將 ph 值調至 4.7, 接著, 將不同濃度 (0.15 0.3 0.45 0.6 0.75 0.9 1.05 mg/ml) 之 QT 溶液, 與上述 CS 溶液各別均勻混合後, 滴入 TPP (ph 9.0) 溶液使 CS/TPP 重量比為 3/1 4/1 5/1 及 6/1, 製備幾丁聚醣 - 槲皮素 - 三聚磷酸鈉 (CS-QT-TPP) 奈米顆粒, 並探討 :QT 濃度 CS 分子量 及 CS/TPP 重量比對 CS-QT-TPP 奈米顆粒之包覆率 粒徑大小 表面電位及其奈米顆粒於模擬胃 腸液中之安定性 另外, 以掃描式電子顯微鏡 (SEM) 照相觀察其奈米顆粒 結果顯示, 在包覆率方面,QT 濃度大於 0.45 mg/ml, 可得較佳之包覆率約 44%;CS 分子量及 CS/TPP 重量比對包覆率無顯著影響 粒徑方面,QT 濃度由 0.15 上升至 0.45 mg/ml, 粒徑增大, 若 QT 濃度再上升至 0.75 mg/ml 時, 粒徑則稍減小 ; 而 CS 分子量愈高, 粒徑愈小 ;CS/TPP 重量比對於粒徑無顯著影響,CS-QT-TPP 奈米顆粒大小之範圍 711~759 nm 表面電位方面, 顆粒表面皆帶正電, 有包覆者之表面電位均較未包覆者低 ( 有包覆者範圍 :25.7~39.8 mv vs 未包覆者範圍 :38~42.9 mv); 低分子量 CS, 表面電位較小 ;QT 濃度及 CS/TPP 重量比對其則無明顯影響 以高分子量之 CS,CS/TPP 重量比 3/1 及 QT 濃度 0.75 mg/ml 條件下製備之 CS-QT-TPP 奈米顆粒,
其在模擬胃液 (ph 1.2) 於 2 小時內 QT 之釋放率約 5~6%, 及在模擬腸 液 (ph 7.4) 於 6 小時內 QT 之釋放率約 12% SEM 觀察下,CS-TPP 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒均為立體之球狀 關鍵字 : 幾丁聚醣 槲皮素 三聚磷酸鈉 奈米顆粒 安定性
英文摘要 ABSTRACT Chitosan ( 85% deacetylation, 380 kda) was hydrolyzed by ozone oxidation into 200~250 kda (High Mw), 100~150 kda (Medium Mw) and 50 kda (or lower) (Low Mw) molecular weights. These chitosans (CS) that were dissolved in 1% acetic acid solution were adjusted to ph 4.7 and mixed individually with quercetin (QT) solution of different concentrations (0.15 ~ 0.75 mg/ml). The mixed solutions were added dropise the sodium tripolyphosphate (TPP) solution (ph 9.0) by different CS/TPP mass ratio of 3:1, 4:1, 5:1 and 6:1 to prepared CS-QT-TPP nanoparticles. Such effective factors as quercetin concentration, chitosan molecular weight and CS/TPP mass ratio on the encapsulation efficiency, particle size, zeta potential and of the nanoparticles were investigates. SEM and stability (in the buffer of ph 1.2 and ph 7.4) of the nanoparticles were also determined. As a result, a higher QT encapsulation efficiency was obtained in a QT concentration higher than 0.45 mg/ml (a highest value about 44%), it was insignificantly affected by chitosan Mw and CS/TPP mass ratio. CS-QT-TPP nanoparticles size decreased as CS Mw increased and QT concentration from 0.45 to 0.75 mg/ml, it was insignificantly affected by CS/TPP mass ratio, it changed in a range of 711~759 nm. Zeta potential of CS-QT-TPP nanoparticles decreased as CS Mw decreased and was insignificantly affected by QT concentration, also as CS/TPP mass ratio changed. All CS-QT-TPP nanoparticles showed positive charge
(+25.7~+39.8 mv), these values were lower than that of CS-TPP nanoparticles (i.e, not encapsulated QT) (+38~+42.9 mv). Nanoparticles that were prepared with original CS (380 kda), QT concentration of 0.75 mg/ ml and CS/TPP mass ratio of 3/1 showed a cumulative release of 5~6% and 12% in the ph 1.2 buffer for 2 hr and ph 7.4 buffer for 6 hr, respectively. SEM also showed that both CS-TPP and CS-QT-TPP nanoparticles were spherical shape. Key words: Chitosan, Quercetin, Sodium tripolyphosphate, Nanoparticles, Stability.
壹 前言 槲皮素屬於類黃酮類物質, 而類黃酮 (flavonoids) 廣泛地存在食物當中, 因此在日常飲食當中攝取到類黃酮的機會相當大 目前已有一些研究顯示, 類黃酮具有許多生理活性, 如 : 抗高血壓 抗心律不整 抗發炎 抗過敏 降血液膽固醇 穩定血小板及肥大細胞 抗肝毒性及抗腫瘤等 (Formica and Regelson, 1995) 但是 Walgren 等學者 ( 1998 ) 研究指出槲皮素由腸腔側 ( apical ) 滲透至腸內壁側 ( basolateral ) ( 即表示吸收之意 ) 之 P app (apparent permeability coeffi-cients, 表觀滲透系數 ) 值為 5.8±1.1 10-6 cm. sec -1, 而由腸內壁側滲透至腸腔側 ( 即表示釋出之意 ) 之 P app 值為 11.1±1.2 10-6 cm. sec -1, 可見槲皮素於腸內釋出速率比吸收速率快一倍 其他學者研究大鼠口服槲皮素, 指出其生物利用率低於 17% (Khaled et al., 2003), 在人體內甚至小於 1%(Gugler et al., 1975), 顯然其生體利用率非常地低 文獻指出, 以幾丁聚醣包覆藥物或活性物質 (bioactive agents) 時可降低其在胃 腸內之強酸或有關酵素破壞, 幾丁聚醣可隔離其與胃 腸內之其他物質產生結合而保護其活性 利用幾丁聚醣之黏性黏附在腸膜壁上, 可延長其在腸黏膜上接觸之時間, 有助於其吸收性 (Tengamnuay and Mitra, 1997) 幾丁聚醣可暫時性地打開腸膜細胞之緊密連接 (tight junctions,tj) 通道, 讓其易於進入細胞內 (Artursson et al., 1994) 另外, 將其製成奈米顆粒可促進其進入腸細胞內 上述這些特性具有提高藥物或生物活性物質之運輸及吸收 因此, 本研究嘗試利用幾丁聚醣作為基材, 與三聚磷酸鈉交聯作用, 將槲皮素包覆在其中並製備為奈米顆粒, 希望透過此方式能增加在腸道之安定性, 且增加其在腸道中滯留時間, 進而提高槲皮素之吸收及利用
貳 文獻整理 一 幾丁質與幾丁聚醣 ( 一 ) 幾丁質與幾丁聚醣簡介 幾丁質 (chitin) 是一種具有高度彈性及延展性之淡黃色至褐色的棉絮狀或絲狀固體 在自然界中的含量僅次於纖維素, 是第二豐富的天然聚合物 (Knorr, 1984) 它是地球上蘊藏量最豐富的胺基醣(amino sugar) 形式之多醣, 同時也是地球上除蛋白質外數量最大的含氮天然纖維素, 一樣具有保護及支持生物體的作用, 常與蛋白質結合成黏多醣體 (mucopolysaccharide) 並以此形式存在於自然界 ( 陳,1999) 最早由 Hachett 於 1799 年以酸處理甲殼動物後發現之物質, 法國植物學家 Braconnot 於 1811 年以稀釋氫氧化鈉溶液並加熱處理菇類時發現一種不溶於水的物質, 將之命名為 fungine 接著,1821 年學者 Odier 在昆蟲表面堅硬表皮的部分發現一些特殊物質, 將其命名為幾丁質 (chitin)(louis, 1821), 原意是希臘語包覆的物質之意 (Ruiz-Herrera, 1978) 1859 年 Rouget 將幾丁質與濃氫氧化鈉溶液進行加熱處理後, 發現可溶於有機酸中,1894 年 Hoppe-Seyler 將此物質正式命名為幾丁聚醣 (chitosan)(muzzarelli, 1977) 幾丁質廣泛存在於如甲殼類的外殼 軟體動物的內骨骼 昆蟲外殼及真菌 酵母菌之細胞壁中, 其中以蝦 蟹等甲殼類及真菌類 (fungi) 之幾丁質含量較高, 因此, 此類生物廢棄物 ( 如蝦 蟹之外殼 ), 於容易取得與價格低廉之優勢下, 是目前幾丁質的主要獲取來源
( 二 ) 幾丁質與幾丁聚醣結構 幾丁質 (chitin) 在不同的生物體中依分子鏈的排列形成不同的構形,X 線繞射結果顯示可分成三種不同結晶構形 :α-chitin β-chitin 與 γ-chitin 其中 α-chitin 為斜方晶系 (rhombic), 結構緻密, 質地較硬, 是自然界的幾丁質中最普遍且最穩定的構形 (Muzzarelli, 1977) 幾丁質是一種構造類似纖維素 (cellulose ) 之聚合物, 約由 1000~3000 個 N- 乙醯葡萄糖胺 (N-acetyl-2-amino-2-deoxy-D-glucose 或稱為 N-acetyl-D-glucosamine) 的單元體以 β-1,4 所鍵結而成之高分子直鏈狀多醣聚合物, 而 D-glucosamine 之含量取決於幾丁聚醣之去乙醯程度 其結構與纖維素類似, 差異在於幾丁質或幾丁聚醣在 C-2 位置上所接的是胺基或乙醯基, 而纖維素在 C-2 位置上所接的是 OH 基 ( 如圖一 ) 幾丁聚醣乃基本構成單位為葡萄醣胺 (glucosamine) 的高分子聚合物 將幾丁質經高溫及濃鹼處理進行去乙醯化作用 (deacetylation), 除去部分乙醯基, 露出游離胺基, 進而獲得產物幾丁聚醣 目前, 幾丁質與幾丁聚醣之去乙醯程度差異並沒有明確的界定, 只有學者 Muzzarelli 及 Rocchett 於 1985 年提出總氮量佔聚合物的百分之七 (w/w) 以上者即可稱為幾丁聚醣 ; 而另外一種說法是以去乙醯度大於 60 % 且微溶於酸性溶液者稱為幾丁聚醣 (Aiba, 1992)
圖一 幾丁質 幾丁聚醣及纖維素之基本結構 Fig. 1. Structure of chitin, chitosan and cellulose. (Krajewska, 2004)
( 三 ) 幾丁聚醣溶液之特性 幾丁質是白色結晶狀物質, 對溶劑的抗性很大, 不溶於水及一般之無機或有機溶劑, 且也不溶於鹼液中, 只溶於強無機酸, 屬難溶性物質 幾丁聚醣因具有較多的胺基, 其溶解性比幾丁質佳, 稀酸即可溶解, 例如醋酸 (acetic acid) 甲酸(formic acid) 乳酸(lactic acid) 檸檬酸 (citric acid) 丙酮酸(pyruvic acid) 鹽酸及磷酸中 其中以甲酸當溶劑為最佳, 其溶解性隨著去乙醯程度增加而增加, 從 0.2 %~100% 的甲酸水溶液系統均可以溶解幾丁聚醣, 不溶於硫酸及中性或鹼性溶劑, 但可溶於酸化多醇 (acidified polyols)( Knorr, 1984) 由於幾丁聚醣上的胺基 (-NH 2 ) 在酸性溶液下會形成 -NH + 3, 使幾丁聚醣成為帶正電的聚合物 (Illum, 1998) ( 四 ) 低分子量幾丁聚醣之製備 低分子量幾丁聚醣具有許多生理活性, 如 : 抗發炎 抗腫瘤 抗真菌 抗微生物等作用 (Kim & Rajapakse, 2005; Maeda & Kimura, 2004; Shahidi et al., 1999) 幾丁聚醣應用範圍十分廣泛, 但因分子量高 黏度高 溶解度差, 使其應用受到限制, 因此製備出低分子量及具高溶解度之幾丁聚醣, 是研究幾丁聚醣的重要目標 同時, 降解幾丁聚醣之另一目的為期望利用經臭氧降解後低分子量幾丁聚醣形成更小之奈米顆粒, 提高在腸道之吸收並提升生物利用率 常見製備低分子量之幾丁聚醣有以下幾種方法 : 一, 化學酸水解法 : 常使用亞硝酸鹽類降解幾丁聚醣, 優點亦是斷醣苷鍵的鍵結位置能力專一, 雖作用時間短但為了去除亞硝酸鹽使用透析的方式極為耗時, 並且此法可能有亞硝酸鹽之殘留, 對食品之應用亦為顧慮 ; 二,
酵素降解法 : 常用酵素例如 cellulase chitosanase 等, 優點為專一性極高, 但由於酵素價錢昂貴不符合大量降解之經濟效益, 作用時間長, 且無法確定是否可完全將酵素去除, 造成影響日後製備樣品之疑慮 三, 臭氧氧化還原降解法 : 基本原理為利用臭氧之強氧化力打斷鍵結, 是一種有效率且成本低廉的降解方式 ( 陳,2002) 二 臭氧 ( 一 ) 臭氧的基本性質 自然界中, 產生臭氧 (ozone) 的途徑有兩種 : 一種是由閃電激發氧氣而生成 ; 另一則是陽光中之紫外線照射氧氣而產生, 存在於大氣層中 臭氧為一種極度不安定物質, 在一般室溫下, 臭氧呈無色氣體狀態, 顏色會隨濃度增加而呈現淺藍色, 在濃度約為 0.05 ppm 時人鼻即可嗅出其帶有刺激性臭味, 若高於 1000ppm 時, 則會有致死的危險 其為氧分子之同素異形體 (allotrope), 由三個氧原子構成, 具有兩種共振結構 ( 如圖二 ), 鍵長 1.278Å, 鍵角 116 45, 在水中的溶解度為氧氣的三倍, 具有極性 (dipole) 和僅次於羥自由基 (hydroxyl radical) 的強氧化力 ( 表一 ), 易與其他物質產生化學反應 (Langlais et al., 1991) 人為方式多是利用高壓電板放電激發乾燥氧氣產生, 以此原理設計臭氧製造機, 可應用於工業或實驗室 (Langlais et al.,1991) ( 二 ) 臭氧與有機物之反應機制 ( 在水中的反應型態 ) 臭氧是一種強氧化劑, 在水中的分解機制複雜,1976 年已有學者 Hoigne 與 Bader 提出臭氧可能進行的兩種反應途徑 ( 圖三 ):(1) 以
圖二 臭氧分子的共振結構 Fig. 2. Resonance structures in ozone molecules. (Langlais et al., 1991) 表一 氧化物之氧化電位 Table. 1 Oxidation potentials of various oxidants (Sheldon, 1977)
臭氧進行直接反應 (2) 以臭氧分解時所產生之自由基進行自由基反 應 (Hoigne et al., 1983; Staehelin et al., 1985; Langlais et al., 1991) 1. 以臭氧進行直接反應 (Direct ozonization) 直接反應分為三種機制 : 電偶極環加成機制 (Cycle addition) 親電性反應機制 ( Electrophilic reaction ) 與親核性反應機制 (Nucleophilic reaction) 即表示臭氧會直接與其他的化學物質進行氧化反應, 具選擇性 (selectivity), 反應速率因環境條件而異 於水溶液中, 臭氧會分解產生氫氧自由基, 若能減少或避免氫氧自由基的生成, 則有助於直接氧化反應之進行 2. 自由基反應 (Free-radical reaction) 臭氧在水中易與 OH - 反應生成較高氧化力之 OH. 自由基 ( 如圖 四 ), 產生之自由基與其他化學物質反應, 以此方式進行之反應, 因 此臭氧之自分解反應與其反應機制對於氧化反應極為重要, 此反應方 式速率快但不具選擇性 臭氧於降解幾丁聚醣時, 可能會以自由基的 型態進行 ( 三 ) 臭氧氧化多醣類之可能機制 在 2001 年已有學者 Kabal nova 等人提出臭氧降解幾丁聚醣的反應機制可能分為兩種, 臭氧可能在不開環的情況下裂解幾丁聚醣 ( 圖五 ), 這是實驗中所期望的反應機制, 但由於臭氧並無專一性, 所以也可能在不期望的位置氧化裂解幾丁聚醣 ( 圖六 )
圖三 臭氧在水中之反應型態 Fig. 3. Reaction types of ozone in aqueous solution. ( 刁,1993) O 3 + H 2 O HO + 3 + OH - HO + 3 + OH -. 2HO 2. O 3 + HO 2 OH. + 2O 2 OH.. + HO 2 H 2 O + O 2 圖四 臭氧自分解反應機制 Fig. 4. The reaction mechanism of ozone degeneration. (Weiss, 1935)
圖五 臭氧氧化降解多醣類之可能機制 ( 一 ) Fig. 5. The mechanism for ozonolytic depolymerization of polysaccharides. (Kabal nova et al., 2001)
圖六 臭氧氧化降解多醣類之可能機制 ( 二 ) Fig. 6. The mechanism for ozonolytic depolymerization of polysaccharides. (Kabal nova et al., 2001)
( 四 ) 影響臭氧反應之因素 ( 陳,2002) 1. ph 值 臭氧在水中之分解反應速率式為 : O 3 : 水中溶解性臭氧 圖四中顯示反應過程中的中間產物有 OH 及 HO 2 等自由基其皆含有未配對電子, 氧化力較強, 會催化臭氧本身進行分解反應, 自由基之間也會進行反應, 而使自由基於溶液中的含量降低, 造成臭氧的氧化力之衰退,pH 值愈高, 即 OH - 濃度愈高之環境中, 氫氧根離子會加速臭氧的分解作用, 產生自由基, 改變臭氧的反應途徑, 臭氧分子的分解速率愈高, 在水中愈不安定 不同的 ph 值將使臭氧有不同的自解反應, 然而水中若存有抑制劑 ( 如 :CH3COO - ), 便能夠減緩臭氧自解 因此, 需調節水中 ph 值, 減少臭氧分解 2. 溫度 隨著溫度的上升會使水中氣體溶解量下降, 臭氧也有相同的情形 表二為不同溫度下臭氧在水中的溶解度, 可明顯發現, 於 60 時臭氧在水中的溶解度幾乎為零 對任何反應而言, 通常是溫度愈高反應越快, 幾丁聚醣的氧化降解也不例外 提高溫度, 水中臭氧的溶解度會減少, 其本身的分解速度會增加, 使水中臭氧的有效濃度降低,
幾丁聚醣的降解速率因而減緩, 但因溫度的升高同時溶液中化學反應速率也會增加, 使臭氧與幾丁聚醣之間的氧化反應速率增快 此兩種效應合在一起時的結果, 使得臭氧反應速率隨著溫度而變化的效應並不明顯 3. 起始劑 催化劑及抑制劑 水中會存在許多有機質做為臭氧反應中起始劑 (initiator) 抑制劑 (inhibitor) 促進劑(promotor) 之角色 ( 表三 ) 反應中起始劑可開始臭氧之自分解, 促進劑則可加快臭氧分解反應速率, 抑制劑則可抑制臭氧自分解反應
表二 臭氧在水中的溶解度 Table 2. The solubility of ozone in water 溫度 ( ) O 3 (g/1000 g) 0 0.0394 5 0.0343 10 0.0299 15 0.0259 25 0.0139 30 0.0077 40 0.0042 50 0.0006 60 0.0000 ( 謝,1993)
表三 臭氧分解的自由基型式連鎖反應中典型的起始劑 促進劑及 抑制劑 Table 3. Typical initiators, promoters and inhibitors for decomposition of ozone by radical-type chain reaction (Staehelin and Hoigné, 1985)
三 幾丁聚醣在藥物傳遞系統之應用 ( 一 ) 幾丁聚醣於生醫材料之應用 幾丁聚醣是由天然生物中所製備出的生物高分子 (biopolymer), 與生物體有一些良好的特性 : 生物相容性, 人體內不會對幾丁聚醣產生排斥 生物分解性, 其可被人體中溶菌酶所分解 ; 無毒性, 幾丁聚醣對人體不會產生毒害 在生物醫學材料方面的應用也很廣泛 ( 表四 ), 較為常見的用途於手術縫合線 傷口癒合 改善消化吸收機能 降低膽固醇與高血壓和藥物釋放控制等 (Chuang et al., 2000), 因此可確定其為良好之生醫基材 ( 二 ) 幾丁聚醣於藥物控制釋放之應用 為了有效達到藥物的臨床療效, 通常需要有適當的藥物載體, 將足夠劑量的藥物傳送至病發部位 因幾丁聚醣同時具有正電荷以及形成膠體和薄膜的特性, 這種系統一方面能夠控制藥物的釋放和持續有效治療的時間, 另一方面, 更可把藥物輸送到特定的位置, 故可以用於控制藥物釋放技術上 ( 表五 ) 已建立的系統為:(1) 微顆粒系統 (microgranulation) (2) 持續釋放基質體 (sustained release matrices) (3) 可浸蝕的基質體 (erodible matrices) 和 (4) 可控制釋放的膠體系統 (controlled release gel system), 而所製成的藥品形式有錠劑 (tablets) 微顆粒(microparticles) 小顆粒體(granules) 及微脂粒 (liposomes) 等 ( 陳,2000) 這些載體除了具有增加藥物傳遞效率 提高藥物標的性 改善藥物釋放模式等優點之外, 甚至可達到控制藥物釋放 攜帶藥物至特定器官或組織 提高藥物身體可用率 增加藥物耐受性 降低藥物副作用等目的, 因此他們被認為是相當有潛力的藥物傳遞系統, 對於治療藥物的施用具有極大的用途
(Soppimath et al., 2001;Hu et al., 2002;Hans and Lowman, 2002;Pan et al., 2002) Schipper 等人 (1999) 指出幾丁聚醣可提升藥物之吸收 一些不 易被消化吸收的藥物如 atenolol 與幾丁聚醣混合後, 經實驗證實幾丁 聚醣可提升 atenolol 被腸道細胞 Caco-2 的吸收度率達 10~15 倍 Juma and Muller 等人 (1999) 研究結果, 因幾丁聚醣具正電荷可與藥物中帶負電荷游離脂肪交互作用形成乳劑狀, 此時幾丁聚醣與脂肪形成聚合物可以有效保護脂肪功能, 以避免藥物中脂肪因高溫滅菌而被破壞, 顯示其具有穩定藥物成分之功能 Miwa 等人 (1999) 探討紫杉醇是否能因幾丁聚醣之包覆可以更有效地被送達至腫瘤部位 由於幾丁聚醣同時具有疏水基和親水基, 可與紫杉醇 (toxol) 形成小於 100nm 小顆粒膠粒 (micelle), 且紫杉醇與幾丁聚醣之混合物對腫瘤細胞的抑制能力比游離的紫杉醇佳, 因此證實幾丁聚醣具有可以幫助藥物送達目的器官之功用 許多文獻皆證實, 部分藥物屬水溶性或有可能遇到酸性環境即溶解, 使這些藥物無法順利到達腸道被吸收因而喪失其功效, 但幾丁聚醣可作為口服藥物傳遞載體, 具有延緩或控制藥物溶解速度 (Brine, 1989;Felt et al., 1999;Ganza-Gonzalez et al., 1999)
表四 幾丁聚醣在生醫材料主要特性及其應用 Table 4. Principal properties of chitosan in relation to its use in biomedical applications 生醫材料方面的應用 主要特性 外科縫合 生物相容性 牙齒移植 生物可分解性 人工皮膚 修復功能 骨骼重建 成膜性 隱形眼鏡 保水性 藥物控制釋放 無毒性, 生物耐受性 膠囊材料 可被溶菌酶分解 具有治療特性 具抗細菌 病毒 真菌效果 (Rinaudo, 2006)
表五 幾丁聚醣在藥物學上的應用及其藥物傳遞形式 Table 5. Pharmaceutical applications and delivery system of chitosan Route of administration Oral Delivery system Microparticulate Liposomes Buccal disk Solution Vesicle Film coating Tablets Spray dried particles capsules Parenteral Microspheres Solution Nasal Ocular Solution Suspension Gene therapy Other Gel systems (Dodane and Vilivalam, 1998)
( 三 ) 幾丁聚醣具有促進物質吸收之原因 1. 生物黏著性 幾丁聚醣具有生物黏著性, 由於腸膜帶負電 幾丁聚醣之胺基帶 正電, 因此可吸附於腸膜以利增加顆粒於腸道之停留時間, 因而增加 其所載之藥物或營養物質之吸收 2. 具可逆性調控腸道上皮細胞之緊密連結 (tight junction) 開合之能 力 營養物質或藥物經由口服之方式進入人體, 主要是經由小腸之吸收進而利用 腸膜之通透機制如圖七所示, 分子通過腸道上皮細胞進入血液會透過三種主要的路徑 :(1) 被動擴散通過細胞膜 (transcellular pathway),(2) 被動擴散通過相鄰細胞間隙 (paracellular pathway), 以及 (3) 載體調控運輸 (carrier-mediated transcellular pathway) 因細胞之細胞膜主要是由脂質雙層膜所構成, 故親脂性分子可較容易透過細胞間轉運擴散 (transcellular diffusion) 的方式通透入細胞膜 ; 親水性分子若無法被細胞膜上載體辨認, 則無法通過疏水性的細胞膜 因此另一種特殊通過上皮細胞的方式則須透過相鄰細胞間隙 (paracellular pathway) 此運輸方式, 將物質運送到細胞膜內 然而透過相鄰細胞間隙運輸之親水性分子會受到上皮細胞之緊密連結 (tight junction) 嚴格限制 (Ward et al., 2000) Dodane 等學者 (1999) 指出幾丁聚醣可暫時打開 tight junction 使藥物或營養物質進入細胞內 調控腸道上皮細胞緊密連結開合是因為幾丁聚醣帶有正電荷, 能夠黏附在腸道上皮細胞上, 與調控緊密連接開合的蛋白產生作用
圖七 營養物質經由腸上皮細胞之三種穿透模式 : 被動擴散通過細胞 膜 被動擴散通過相鄰細胞間隙及載體調控運輸 Fig. 7. Transport across intestinal epithelium. Molecules cross the intestinal epithelium into the blood primarily by three pathways : passive diffusion across the cell membranes (transcellular pathway); passive diffusion between adjacent cells (paracellular pathway); and carrier-mediated transport (carrier-mediated pathway). (Ward et al., 2000)
五 奈米科技 ( 一 ) 奈米科技簡介 近年來, 材料奈米化是快速發展之技術, 其涵蓋面包括製造 加工 應用等方向, 主要藉由一些物理或化學方法, 使大小維持在奈米等級之技術 奈米粒子之定義為 : 存在之粒子其三維空間大小均在 100 奈米 (nm) 或以下, 此單位即是毫米 (millimeter) 的百萬分之一 當材料縮小至奈米尺寸時, 雖然化學組成並未改變, 但會因其表面積增大, 表面原子數增多, 表面電位能提高, 具有特殊的表面 體積及量子效應 ( 陳,2008), 使奈米物質展現出許多異於宏觀的物質現象, 諸如在熔點 導電性 導熱性 磁性 電容性 發光性 水溶性等方面皆呈現與傳統截然不同的特性, 而從這些特性衍生出的各種奈米塑材 奈米塗料 奈米觸媒 藥物纖維 奈米光學等令人目不暇給的工業及商業應用 ( 劉及郝,2003) ( 二 ) 奈米在食品之應用 食品奈米技術已經成功應用於營養物質的遞送, 可以控制營養活性成分的釋放與保留有效營養素的濃度 食品原料經奈米化製成, 會造成營養活性成分在生物體內有不同於常態的分佈與轉運方式 ( 謝, 2008), 如下 : 1. 提高吸收率 降低粒徑有助於提高營養物質在腸道之吸收率, 也可增加在身體 組織中之滲透 傳輸及吸收 (Chen et al., 2006)
2. 提高生體利用率 包覆極性或非極性分子, 如大分子的蛋白質 不易被吸收之維生素或營養素, 大小夠小, 因而可提高其穿透細胞膜之能力, 協助傳遞至標的細胞 (Desai et al., 1996; Desai et al., 1997; Lamprecht et al., 2004 and Schafer et al., 1992) 3. 增進保健功效 利用奈米包覆技術, 可包覆營養物質, 以保護營養物質不受腸道溫度 ph 值變化 酵素作用等影響和破壞, 以增加營養物質可利用率, 在奈米載體的保護下, 營養物質能更快進入腸道並且被腸道吸收, 同時經奈米化可延長營養物質在腸道保留濃度及滯留時間, 有效發揮其生理功效 (Kawashima, 2001; Peppas, 1995 and Arbo s et al., 2002) ( 三 ) 奈米顆粒 (nanoparticles) 奈米顆粒可利用化學或機械方法製造, 而利用機械方式所製備出 之奈米顆粒大小通常介於 100~1000 nm 之間 ; 若以化學法則可製備出 更小的顆粒, 大小約為 10~100 nm(acosta, 2009) 一般奈米科技粒子大小須小於 1000 nm 被認可為微米顆粒 ; 粒子大小小於 100 nm 才可稱為奈米顆粒 然而在藥學領域, 則認為粒子大小小於 1 μm( 即 1000 nm) 即可定義為 奈米顆粒 (Kipp, 2004), 因此本文認定奈米顆粒泛指尺寸大小介於數奈米至數百奈米之顆粒 當顆粒粒徑大於 1μm 是無法通過生物屏障, 而當顆粒大小介於
100~1000 nm 時, 可改善營養物質之生體利用率 (Acosta, 2009), 因此, 奈米顆粒相較於微米顆粒 (>1μm) 較易通過腸道上皮細胞 (Desai et al.,1996), 且顆粒愈小, 其生體利用率愈高 食品經過奈米化後, 會延長其在腸胃道中時間, 可提高其與腸道上皮細胞的接觸機會且可直接被細胞吸收 ( 圖八 ), 進而提高營養物質之生物利用率 (Kawashima, 2001; Peppas, 1995 and Arbo s et al., 2002) ( 四 ) 奈米安全性 奈米化材料之安全性需朝三方面進行 : 一 物理化學特性 ; 二 體外細胞試驗 ; 三 動物研究 綜合而言, 食用性奈米食品的安全問題, 不僅要探討體內外之生物性研究, 同時也應加上奈米食材本身之特性了解, 如下 : 1. 奈米食材材料之選擇 除了要研究本身之主要成分外, 另一重點則是要考慮選擇包覆物質的安全性 目前開發上, 為免除奈米包覆材料安全之困擾, 大多使用食用及天然之高分子材料, 例如 : albumin collagen chitosan, 這些材料確定均可在人體內正常代謝, 不會造成對身體之毒害問題 2. 奈米食材之體外細胞實驗 奈米粒子可能與各種礦物類食材有不同之交互作用產生協同效應, 因而產生毒害 故可在體外細胞實驗粗篩, 先了解奈米食材在細胞中如何運作, 是否會引起發炎或死亡現象, 進而預測下一步的生物實驗
3. 奈米食材之生物研究 在不同生物系統中, 奈米粒子大小 分佈方式 表面電位及逐漸聚集之現象, 均會隨不同之材質與熱能效應而有不同的結果 因此與傳統食品之檢測方式不同, 確認劑量多寡是很重要的議題, 由實驗結果得知劑量效應與生物體反應機制間的相關性, 以獲得明確安全極限值
圖八 奈米顆粒於腸道吸收之優勢 Fig. 8. Schematic representation of different absorption mechanisms of bioactive molecules. (Chen et al., 2006)
五 幾丁聚醣奈米顆粒 ( 一 ) 常見幾丁聚醣奈米級顆粒的製備方法 以幾丁聚醣作為基材製備微米及奈米顆粒已被廣泛應用在藥物傳遞上 幾丁聚醣可透過物理法及化學法將藥物吸附於表面或包覆在微粒中 物理法有研磨法 噴霧乾燥法 過篩法等, 但其製備出之顆粒粒徑不易達奈米級, 且粒徑分佈廣, 再加上只能透過顆粒表面吸附方式攜帶藥物, 故較不適用於藥物傳遞方面 化學方法的方面,Gan 和 Wang(2007) 統整出幾項近年常被用來製備幾丁聚醣奈米顆粒其應用在藥物 蛋白質或基因上 ( 見表六 ), 方法如下 : 1. 乳化液滴接合法 (emulsion-droplet coalescence) 此方法是利用幾丁聚醣的胺基與交聯劑之醛基進行反應而結合 Tokumitsu 等人 (1999) 提出, 結合微乳化交聯法及沉澱法兩種方法, 利用交聯劑來穩定顆粒結構, 與幾丁聚醣溶液與氫氧化鈉溶液作用產生沉澱兩種特性之結合, 另外 Agnihotri 等人 (2004) 提出以乳化交聯法製備幾丁聚醣奈米顆粒, 其方法如圖九 製備過程為先個別配製幾丁聚醣 - 藥物乳化液 (W/O) 和幾丁聚醣 NaOH 乳化液 (W/O), 之後以高速攪拌將兩者均勻, 即可產生幾丁聚醣奈米顆粒 此方法被應用於以 EDC ( 1-ethyl-3-dimethylamino propyl-carbodimide hydrochloride) 作為交聯劑, 以 methlene chloride 為油相, 製備幾丁聚醣 -linoleic acid 奈米顆粒上, 可獲得粒徑範圍 200-600 nm 之奈米顆粒 (Chen et al., 2003)
表六 常見幾丁聚醣奈米顆粒之製備方法及其在藥物 蛋白質或基因 上的應用 Table 6. Summary of preparation method for chitosan nanoparticles Method of preparation Drugs/proteins/genes Chitosan nanoparticle systems Ionic gelation Coacervation precipitation Emulsion-droplet coalescence Reverse micellar or Insulin, BSA, cyclosporin A DNA gadopentetic acid Doxorubicin Self-assembly chemical Deoxycholic acid modification (Gan and Wang, 2007)
圖九 以乳化交聯法製備幾丁聚醣顆粒流程圖 Fig. 9. Schematic representation of preparation of chitosan particulate systems by emulsion cross-linking method. (Agnihotri et al., 2004)
2. 凝聚及沉澱法 (Coacervation or precipitation) 共凝結及沉澱法主要原理是透過幾丁聚醣在鹼性條件下無法溶解的特性製備顆粒, 幾丁聚醣形成顆粒的作用力主要為分子內氫鍵 其製備方法是利用附有噴嘴之空氣壓縮機將幾丁聚醣溶液噴入鹼性溶液 ( 如 NaOH NaOH-mathanol 或 ethanediamine) 中, 此時因幾丁聚醣不溶於鹼性溶液的特性, 當幾丁聚醣溶液接觸到鹼性溶液後, 會產生有凝結及沉澱的反應 將沉澱物, 再經過濾及多次離心水洗作用, 去除殘留的鹼性溶液, 即可得幾丁聚醣微米 / 奈米顆粒 (Nishimura et al., 1986) 已有學者將幾丁聚醣與 DNA 利用共凝結法製備奈米顆粒, 形成不成規則球型顆粒, 但顆粒粒徑範圍在 100 ~ 250nm, 且在 ph 值小於 6 時, 顆粒表面電位帶正電, 而最重要的是以此方法製備的幾丁聚醣 -DNA 複合奈米顆粒具有保護 DNA 不受核酸分解酵素影響之優勢 (Mao et al., 2001) 3. 離子交聯法 (Ionic crosslinking) 離子交聯法是常見用來製備幾丁聚醣奈米顆粒的方法 ( 圖十 ) 製備原理為利用幾丁聚醣的胺基於酸性環境下帶正電荷, 此特性易與帶負電之分子進行離子交聯而產生奈米顆粒, 常使用的帶負電分子為 tripolyphosphate(tpp),tpp 為帶五個負電之分子, 可與幾丁聚醣產生足夠強度之作用力而形成奈米顆粒, 這些作用力包括離子鍵 氫鍵及親疏水之作用力等 (Kawashima et al., 1985a/1985b) 此方法優點有 : 一 反應條件溫和 簡單, 且不使用具有毒性的化學交聯劑 ; 二 可藉由製作條件的調整, 製備出期盼的粒徑大小並使顆粒的表面電位維持正電 ; 三 對蛋白質 疫苗 DNA 等物質有極佳包覆效果 ;
四 顆粒組成會影響包覆物質的釋放速率 ; 五 經冷凍乾燥後, 依舊可維持包覆物質的活性及顆粒的完整性 (Janes et al., 2001) Fernández-Urrusuno 等人 (1999) 包覆胰島素, 結果顯是當 CS/TPP 重量比 6/1 製備之奈米顆粒時, 可得表面電位為 +54~+25 mv 粒徑範圍約 300~400 nm 之奈米顆粒 Xu 及 Du(2003) 相同方法包覆 BSA, 再以 TEM 觀察顆粒, 可觀察到顆粒粒徑約在 20~200 nm 之間, 並且形狀呈球型之奈米顆粒 4. 逆微胞法 (Reverse micellar) 逆微細胞是藉由水 油 表面活性劑組成穩定混合物, 以巨觀觀察此混合物是均勻, 製作流程為將介面活性劑與有機溶劑混合, 再加入幾丁聚醣及交聯劑後, 接著去除有機溶劑和介面活性劑 ( 圖十一 ), 即可得幾丁聚醣微米 / 奈米顆粒 (Leong and Candau, 1982) Mitra 等人 (2001) 已經利用此方法來包覆抗癌藥物 Doxorubicin, 粒徑大小約 100±10 nm, 已知此大小之藥物顆粒對於腫瘤細胞具有良好滲透性和較長之滯留效果 5. 噴霧乾燥法 (spray-drying) 噴霧乾燥法被工業界較廣泛使用在乾燥粉末之製備, 利用液滴通過熱空氣移除水分而產生顆粒 製備過程須將幾丁聚醣溶於醋酸溶液中, 將欲包覆物質同時分散於幾丁聚醣溶液中, 並加入適當交聯劑 接著將此溶液通過噴霧乾燥之設備, 在熱空氣中噴成霧狀, 經去除水分後即可得漂浮之幾丁聚醣顆粒 (He et al., 1998)
圖十 以離子交聯法製備幾丁聚醣顆粒之流程圖 Fig. 10. Schematic representation of preparation of chitosan particulate systems by ionic gelation method. (Agnihotri et al., 2004) 圖十一 以逆微胞法製備幾丁聚醣顆粒之流程圖 Fig. 11. Schematic representation of preparation of chitosan particulate systems by reverse micellar method. (Agnihotri et al., 2004)
( 二 ) 以離子交聯法製備幾丁聚醣奈米顆粒之機制與應用 幾丁聚醣在酸性溶液中或小於其 pka(ph~6.3) 時, 其所帶的胺 基 (NH 2 ) 會轉變為帶有正電荷 (NH 3 + ) 的胺基 ( 圖十二 a); 三聚磷 酸鈉 (sodium tripolyphosphate,tpp) 是一種由三個磷酸組合而成的 多元體, 帶有多種負離子 :P 3 O 10 5- 離子 OH - 及 HP 3 O 10 4- 當三聚磷 酸鈉溶於水中磷酸鹽會分解出鈉離子, 而使五個磷酸根分別帶負電荷 ( 圖十二 b) 三聚磷酸鈉之負電荷 -P 3 O10 5- -HP 3 O10 4- 及 -OH - group 會與幾丁聚醣之 -NH 3 + 互相競爭產生離子交聯作用 (ionic-crosslinking) 而構成網狀結構進而形成顆粒 ( 圖十二 c) Shu and Zhu (2000) 研究幾丁聚醣與三聚磷酸鹽形成交聯複合顆粒, 利用 FITC-dextran 及 brilliant blue 作為藥物模擬物, 探討三聚磷酸鹽溶液之 ph 值 交聯時間對釋放速率之影響 此研究同時探討以幾丁聚醣與不同陰離子化合物 : 三聚磷酸鹽 硫酸鹽 檸檬酸鹽形成顆粒, 發現以三聚磷酸鹽製出之膠粒的機械強度效果最好, 而幾丁聚醣加入三聚磷酸鹽及硫酸鹽之複合物膠粒有較好藥物釋放特性 Pan 等人 (2002) 進一步以幾丁聚醣微膠粒包埋胰島素探討動物實驗, 觀察其血糖變化, 結果發現幾丁聚醣微膠粒有增強胰島素在腸道的吸收力, 可使患有糖尿病的大白鼠之血糖量減少並維持此作用約 10 小時 Ma 等人 (2002) 指出因為包覆的大分子之蛋白質 ( 如胰島素 ) 藥物和幾丁聚醣分別有 pi 以及 pka 的限制, 在幾丁聚醣和被包覆的藥物混合後之 ph 值會影響奈米微粒的形成, 進而使得藥物釋放效果較不穩定, 因此可證實離子強度對於幾丁聚醣奈米微粒負載藥物及釋放的能力有影響
(a) 幾丁聚醣溶於酸性溶液中 (b) 三聚磷酸鈉 (TPP) (c) Chitosan-TPP 交聯反應 圖十二 幾丁聚醣與 TPP 之離子交聯反應 Fig. 12. Molecular structure of chitosan in acid solution(a)and tripolyphosphate(tpp)(b) Ionic crosslinking between chitosan and TPP(c). (Hsieh et al., 2008)
Xu 與 Du (2003) 等學者對牛血清包覆及釋放有較為完整之研究, 而研究中提及幾丁聚醣分子量 牛血清蛋白濃度 幾丁聚醣溶液濃度與去乙醯程度等操作變因對包覆率的影響 結果顯示, 包覆率隨著分子量增加而變大, 因為分子量大之幾丁聚醣有較長鏈可包覆牛血清蛋白 牛血清濃度變大, 包覆率變小但裝載率卻變大 ; 幾丁聚醣溶液濃度變大黏度也隨之增加, 阻礙了交聯作用, 因此包覆率隨著溶液黏度增加而變小 去乙醯程度增加包覆率也隨之變大, 因為胺基增加擁有更多正電可以反應 而釋放速率研究結果顯示, 分子量小 去乙醯程度大 幾丁聚醣溶液濃度大較佳之釋放效果 Gan 等人 (2007) 探討幾丁聚醣與三聚磷酸鈉之比值 牛血清蛋白濃度及幾丁聚醣濃度與包覆率及釋放速率關係 隨幾丁聚醣與三聚磷酸鈉比值之上升包覆率隨之下降 而牛血清蛋白濃度增加包覆率也隨之增加並且在文中提及牛血清蛋白添加與包覆率關係仍未有明確的定論, 而幾丁聚醣濃度變大則使得包覆率下降 釋放速率實驗中低分子量幾丁聚醣 低濃度幾丁聚醣溶液 較高之幾丁聚醣與三聚磷酸鈉比值 低牛血清蛋白濃度皆有較好之釋放效果 楊 (2008) 研究中已探討三種不同 ph 之幾丁聚醣溶液 (ph 3.4 4.7 6.0) 與三種不同 ph 之 TPP 溶液 (ph 3.0 6.0 9.0) 製備的兒茶素奈米顆粒, 結果顯示以 ph 4.7 之幾丁聚醣溶液與 ph 9.0 之 TPP 溶液製備的奈米顆粒懸浮液較佳且顆粒為奈米級 吳 (2008) 研究以不同分子量幾丁聚醣包覆牛血清蛋白及舞菇多醣類製備奈米顆粒, 結果指出大分子量幾丁聚醣對於牛血清蛋白與舞菇多醣的包覆率皆較佳 包覆牛血清蛋白之顆粒外觀不成圓形, 且表面電位下降
Wan 等人 (2009) 以幾丁聚醣 -TPP 包覆 Aspirin (ASA) 與 Probucol (PRO) 兩種模擬藥物製備成奈米顆粒 結果顯示, 不同 TPP 溶液之 ph 值與 TPP 濃度會影響其奈米顆粒之大小 TPP 溶液在 ph3 及 ph8.6 時,ASA 及 PRO 兩者包覆率皆大於 50%;TEM 圖示結果顆粒大小皆小於 300nm 可證實幾丁聚醣奈米顆粒可應用在同步包覆多種藥物, 以有效地治療複雜的心血管疾病 張 (2010) 研究以高壓均質製備幾丁聚醣奈米乳滴乳化液, 指出幾丁聚醣乳化液的乳化型態為 O/W 型, 乳化循環次數多有助於乳化液之安定性, 經加熱及凍結 - 解凍的過程觀察, 發現 30 及 50mL oil/100ml chitosan solution 以高壓 (1500bar) 乳化 6-7 passes 之組別依然有良好安定性 孫 (2010) 指出以高分子量幾丁聚醣,CS/TPP 重量比 3/1, 製 備幾丁聚醣 - 分離大豆水解蛋白質水解物 - 三聚磷酸鈉奈米顆粒, 其在 模擬胃腸液中有良好之安定性 Dudhani 及 Kosaraju(2010) 利用幾丁聚醣 -TPP 包覆 catechin 製備奈米顆粒並探討其特性 在 ph 5.5 下,chitosan/TPP 比例為 2/1 時, 幾丁聚醣奈米顆粒對 catechin 時包覆率可達 90%; 在模擬體外腸道環境累積釋放試驗, 利用螢光標記觀察奈米顆粒之生物黏著性, 結果得知包覆及未包覆有 catechin 之奈米顆粒分別具有 40% 及 32% 黏膜黏著力, 因此證實幾丁聚醣具有良好之生物黏著性及控制 catechin 在腸胃道中之釋放能力 Al-Qadi 等人 (2011) 研究微膠囊化幾丁聚醣奈米顆粒肺蛋白 之傳遞情形, 將胰島素幾丁聚醣奈米顆粒 不含胰島素之幾丁聚醣奈
米顆粒 經甘露醇微膠囊化之胰島素 幾丁聚醣奈米顆粒三者分別吹入老鼠氣管中, 結果顯示胰島素與幾丁聚醣藉由離子交聯的方式製備成奈米顆粒後, 能延長降低葡萄糖濃度之時間, 而又使用甘露醇微膠囊化胰島素幾丁聚醣奈米顆粒共同進行噴霧乾燥後, 在一定時間內, 具有增加降低葡萄糖濃度在氣管分佈面積之能力
五 類黃酮物質 - 槲皮素 ( 一 ) 類黃酮之簡介 類黃酮其名稱源自於拉丁語之 flavus 乃為黃色之意, 為存在植物表皮中的一種色素, 具有遮斷紫外線功能 類黃酮廣泛存在自然界的植物中, 屬於植物多酚類 (plant phenolics), 而類黃酮為植物的二級代謝物 (secondary metabolites), 其在植物生理代謝過程中扮演許多重要的角色, 例如 : 控制茁壯素 (auxins) 分泌量, 調節植物之生長與分化 (growth and differentiation) 抗菌(antifugi and bactericidal activity) 等, 而在食用植物中, 類黃酮亦可提供其顏色 質地及風味 ( Formica and Regelson, 1995) 目前為止至少已有 4000 多種的類黃酮被發現, 大部份是與醣類結合的形式存在, 一般在植物的葉 花 果實中會以醣苷 (glycosides) 的狀態存在, 若經酵素或酸處理則會降解為非醣苷 (aglycone) 及糖 (sugar), 而木質性組織例如 : 樹皮, 則以非醣苷鍵結物質存在, 種子則可能包括上述兩者 (Huang et al., 1992) ( 二 ) 類黃酮之食物來源與其結構 類黃酮之主要結構為 2-phenyl-benzo-α-pyrones, 基礎結構是以 benzo-α-pyrone 的 A,C 二個環, 再接上一個酚基的 B 環 (phenyl ring), 如表七所示 因主要結構上可接不同官能基, 因此種類相當繁多, 包含 : 黃酮 (flavones) 異黃酮(isoflavones) 黃酮醇(flavonols) 黃烷酮 (flavanones) 黃烷醇(flavanols) 前花青素(procyanidins) 及花青素 (anthocyanins) 等 食物本身即含有許多類黃酮物質, 隨著植物 蔬菜 水果等種類而不同 ( 表八 )
表七 類黃酮化合物之結構 Table 7. Structure of flavonoids (Smith and Yang, 1994)
表八 大部份的類黃酮在植物界的分佈 Table 8. The distribution of flavonoids in the the plant kingdom (Nijveldt et al., 2001)
( 三 ) 類黃酮物質之生理機能 類黃酮 (flavonoids) 廣泛地存在食物當中, 因此在日常飲食當中攝取到類黃酮的機會相當大 目前已有大量研究顯示類黃酮具有許多不同的生理活性, 陸續研究指出類黃酮具有許多臨床相關之功能 : 抗高血壓 (anti-hypertensive) 抗心律不整 (anti-arrhythmic) 抗發炎 ( anti-inflammatory ) 抗過敏 ( anti-allergic ) 降血液膽固醇 (hypocholesterolaemic) 穩定血小板及肥大細胞(platelet and mast cell stabilizaing) 抗肝毒性(anti-hepatotoxic) 避孕(anti-fertility) 以及抗腫瘤 (anti-tumor) 等 (Formica and Regelson, 1995), 對於人體健康之維持相當重要 Verma ( 1992 ) 在實驗鼠身上塗上 DMBA ( 7,12 dimethylbenzo[a]anthracene) 腫瘤起始劑之後, 每週 2 次以 10 nmol 之 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate 去促進腫瘤形成, 在預定時間內用槲皮素去治療, 觀察結果發現槲皮素可以抑制在實驗鼠身上所引起的皮膚腫瘤起始反應 Pace-Asciak 等人 (1995) 研究顯示, 槲皮酮能抑制脂質過氧化 物所導致血小板的凝集, 而避免粥狀動脈硬化的發生 Kanzawa 等人 (1995) 實驗以 0.81 μg 槲皮酮能夠抑制 20 ng 的 Trp-P-2 對老鼠傷寒沙門桿菌 TA98 之 50% 突變性 (IC50) 因此證實槲皮素在 Trp-P-2 破壞 DNA 之前可先中和 Trp-P-2, 是一種具專一性之去突變因子 (antimutagen)
( 四 ) 類黃酮之安全使用量 根據藥理學研究, 一般類黃酮的安全建議量是 17 ~ 23 mg/day, 而根據毒性研究顯示, 每天 1 到 1.5 克的類黃酮藥物, 如西阿尼醇 (cianidanol) 會導致急性腎臟炎 溶血性貧血 血小板減少症 肝炎 發燒或皮膚過敏 但是, 在膳食中含有很多不同種類的類黃酮, 而且日常的飲食不至於會達到具毒性的劑量 ( 五 ) 槲皮素之吸收障礙 張等人 (2004) 解釋, 普通的培養條件培養成熟的 Caco-2 細胞即可形成與小腸上皮細胞相同的细胞極性和致密的單細胞層组織, 其形態和功能上與人體的小腸上皮細胞相似, 腸腔分化出絨毛面 AP 側 (apical, 腸腔側, 又稱黏膜劑 ) 和基底面 BL 側 (basolateral, 腸內壁側, 又稱漿膜劑 ) 在人體口服後經細胞和細胞旁路被動擴散的藥物透過 Caco-2 細胞單層的轉運速率, 將其表示為表觀滲透系數 (apparent permeability coefficients,p app ) Walgren 等人 (1998) 研究指出槲皮素由 apical 滲透至 basolateral ( 即表示吸收之意 ) 之 P app 為 5.8 ±1.1 10-6 cm. sec -1, 而由 basolateral 滲透至 apical( 即表示釋出之意 ) 之 P app 為 11.1±1.2 10-6 cm. sec -1 槲皮素於腸內釋出速率比吸收速率快一倍, 因此難被身體所利用 其他學者指出口服槲皮素於大鼠體內生物利用率低於 17%(Khaled et al., 2003), 在人體內甚至小於 1%(Gugler et al., 1975)
参 材料與方法 一 實驗原料與藥品 1. Chitin( 幾丁質 ): 高雄應化公司, 高雄台灣 2. Quercetin(QT, 槲皮素 ):Alfa Aesar, 美國 3. Potassium polyvinyl sulfate solution(p.v.s.k): 和光純藥, 日本 4. Toluidine blue:sigma, 美國 5. Sodium acetate:ferak, 德國 6. GPC standards (Pullulan):Shodex, 日本 7. Hydrochoric acid: 聯工化學廠股份有限公司, 台灣 8. Sodium Chloride:Panreac Quimca Sa, 西班牙 9. Sodium tripolyphosphate: 和光純藥, 日本 10. Acetic acid: 聯工化學廠股份有限公司, 台灣 11. Sodium hydroxide: 聯工化學廠股份有限公司, 台灣 12. Ethanol absolute:ferak Berlin GmbH, 德國 二 實驗儀器 1. 磨粉機 :1hp 型, 群策電機工業股份有限公司, 台灣 2. 分析篩網 :Tyler 標準規格篩網,Endecotts, 英國 3. 電磁式過篩機 :OCTAGONDIGITAL 2000 型,Endecotts, 英國 4. ph meter:sp701 型,Suntex, 台灣 5. 真空冷凍乾燥機 :EYELAFD-5N 型,Tokyo, 日本 6. 高效率套組式臭氧機 :OW-K1/O 型, 易暘儀器, 台灣 7. 高速低溫離心機 :CR22GII 型,Hitachi, 日本 8. 微量超高速離心機 :CS 120GX 型,Hitachi, 日本 9. 高效率液相層析儀 :
A. L-6000 pump,hitachi, 日本 B. RI-Deterctor 8110,Bischoff, 德國 C. D-2500 chromatointegrator 積分儀,Hitachi, 日本 D. HSP gel AQ4.0 管柱,Waters, 日本 10. Microplate reader:mrⅡ 型 (DYNEX, 美國 ) 11. 細胞粉碎機 :XL-2020 型,Misonix, 美國 12. 往復式恆溫震盪器 :BT-350 型,Yih Der, 台灣 13. 雷射奈米粒徑及界面電位分析儀 :Zetasizer Nano 3000HS 型, Malvern Instrument, 英國 14. 掃描式電子顯微鏡 :JSM 7000F 型,Jeol, 日本 三 樣品準備 ( 一 ) 幾丁聚醣 將片狀幾丁質磨成粉末後, 經 40 與 60 mesh 篩網過篩, 取得 40-60 mesh 幾丁質粉末 參考沈 (2004) 方法, 粉末狀幾丁質經 57%(w/v) NaOH 於 102±2 熱攪拌處理 130 min, 取出幾丁聚醣以蒸餾水沖洗至中性 ph 值並置入烘箱進行乾燥 (80,8 小時 ) 以 Toei 及 Kohara (1976) 其方法測定幾丁聚醣之去乙醯度, 選擇大於 85% 去乙醯度者於後續實驗 ( 二 ) 不同分子量幾丁聚醣之製備 參考 Yue 等人 (2008) 利用臭氧降解幾丁聚醣之方法 取幾丁聚醣溶解於之 1% 醋酸溶液中至濃度 1 %(w/v), 攪拌 24 小時後以 PET 材質之過濾器過濾去除溶液中較大的雜質及鹽類 將 100 ml 幾丁聚醣溶液置於 50 ~ 55 水浴中通入 0.55 及 6.3g/m 3 不同濃度之臭氧, 進
行氧化降解處理不同時間, 之後以 NaOH 溶液調至 ph 7, 使 chitosan 析出, 離心 (21000 g,30 min) 三次, 過程中以去離子水反覆水洗 3-4 次去除鹽類, 並冷凍乾燥 接著利用膠體層析管柱 (Gel Permeation Chromatography,GPC) 測定其分子量, 選出未水解者 380 kda (Original Mw) 200-250 kda (High Mw) 100-150 kda (Medium Mw) 以及 50 kda 以下者 (Low Mw) 進行後續試驗 ( 三 ) 槲皮素 (Quercetin,QT) 溶解性測試 取 5 mg QT 粉末, 分別加入 5 ml 不同溶劑 ( 水 醋酸 酒精及 DMSO) 以及不同比例測試之 選擇適當溶劑後, 測試不同溶劑與水之比例並觀察其溶解性, 以利尋找奈米顆粒之製備條件 四 實驗方法 ( 一 ) 幾丁聚醣 (CS) 溶液及三聚磷酸鈉 (TPP) 溶液先後加入順序對 CS-TPP 奈米顆粒形成影響之試驗 參考吳 (2008) 及楊 (2008) 之方法, 將不同分子量 CS 溶液 1% (v/v) 之醋酸溶液中至 2 mg/ml 之濃度, 調 ph 至 4.7; 將不同濃度之 TPP 溶於過濾的去離子水中, 調 ph 至 9.0, 然後將上述 CS 溶液 5mL, 各別加入含 TPP 溶液之燒杯內, 使 CS/TPP 重量比為 3/1 4/1 5/1 6/1, 此為 CS 溶液滴入 TPP 溶液之組別 ; 另一組則為將 TPP 溶液滴入 CS 溶液, 其他條件相同 接著將上述組別攪拌 15 min 後, 各別加 20 μl 甘油, 攪拌 5 min, 靜置 10min 後, 觀察其巨觀型態, 即奈米顆粒成立情形 ( 二 ) 幾丁聚醣 - 槲皮素 - 三聚磷酸鈉 (CS-QT-TPP) 奈米顆粒 之製備
參考吳 (2008) 及楊 (2008) 之方法, 將不同分子量幾丁聚醣 (CS) 溶於 1 %(v/v) 之醋酸溶液中至 2 mg/ml 之濃度, 調 ph 至 4.7; 不同濃度之三聚磷酸鈉 (TPP) 溶於去離子水中, 調 ph 至 9.0; 將槲皮素 (QT) 溶於絕對酒精中 樣品添加次序為先將 CS 溶液加入 QT 溶液中攪拌, 再將 TPP 溶液緩緩滴入混合液中攪拌 ( 註 : 在製備過程皆避光, 目的是防止槲皮素因光照而影響其抗氧化能力 ) 此試驗目的為探討 QT 濃度 CS 之分子量及 CS/TPP 重量比對 CS-QT-TPP 奈米顆粒之包覆率 粒徑及表面電位之影響 其細節如下 : 1. QT 濃度之影響 將 7 ml 不同濃度 (0.15 0.3 0.45 0.6 0.75 mg/ml) 之 QT 溶於絕對酒精中與 5 ml CS 溶液 (Original Mw,2 mg/ml,ph 4.7) 攪拌 10 min, 充分混合形成混合液 ( 目的 : 有機相與水相比例調整至 1:1), 再將 2 ml TPP 溶液 (1.667 mg/ml,ph 9.0) 緩慢滴入混合液中, 攪拌 15min, 使得反應液中 CS/TPP 重量比為 3/1, 而後添加 20μL glycerol 攪拌 5min( 目的 : 避免奈米顆粒相互黏附 ), 離心 (32,000 g,30 min,20 ), 將上層液測定 QT 含量並計算其包覆率與裝載率, 另外將沉澱物即 CS-QT-TPP 奈米顆粒測定其粒徑大小及表面電位 2. CS 分子量之影響 將 7 ml QT 溶液 (con. 0.75 mg/ml) 與 5 ml 不同分子量之 CS 溶液 (Original Mw High Mw Medium Mw Low Mw,con. 2 mg/ml, ph 4.7) 攪拌 10min 充分混合形成混合液 ( 目的 : 有機相與水相比例調整至 1:1), 再將 2 ml TPP 溶液 (1.667 mg/ml,ph 9.0) 緩慢滴入混合液中, 攪拌 15 min, 使得反應液中 CS/TPP 重量比為 3/1, 而
後添加 20μL glycerol 攪拌 5 min, 離心 (32,000 g,30 min,20 ), 並以相同上述方法測定其包覆率, 奈米顆粒之粒徑大小及表面電位 3. CS/TPP 重量比之影響 將 7 ml QT 溶液 (con. 0.75 mg/ml) 與 5 ml CS 溶液 (Original Mw,2 mg/ml,ph 4.7) 攪拌 10 min 充分混合形成混合液 ( 目的 : 有機相與水相比例調整至 1:1), 再將 2 ml 不同濃度之 TPP 溶液 (0.84 1.00 1.25 1.667 mg/ml,ph 9.0) 緩慢滴入混合液中, 攪拌 15 min, 使得反應液中 CS/TPP 重量比分別為 6/1 5/1 4/1 及 3/1, 而後添加 20μL glycerol 攪拌 5 min, 離心 (32,000 g,30 min,20 ), 可得沉澱物即 CS-QT-TPP 奈米顆粒 並以相同上述方法測定其包覆率, 奈米顆粒之粒徑大小及表面電位 ( 三 )CS-QT-TPP 奈米顆粒在模擬胃 腸液中之安定性試驗 將 7mL QT 溶液 (con. 0.75 mg/ml) 與 5 ml CS 溶液 (Original Mw,2 mg/ml,ph 4.7) 攪拌 10 min 充分混合形成混合液, 再將 2 ml TPP 溶液 (1.667 mg/ml,ph 9.0) 緩慢滴入 ( 目的 : 有機相與水相比例調整至 1:1), 攪拌 15min, 使 CS-QT-TPP 反應液中 CS/TPP 重量比為 3/1, 而後添加 20μL glycerol 攪拌 5 min, 離心 (32,000 g,30 min,20 ), 可得沉澱物即 CS-QT-TPP 奈米顆粒, 並進行在模擬胃 腸液中之安定性試驗, 其細節如下 : 1. 模擬胃液中 (ph 1.2) 之安定性 參考范 (2003) 方法, 將 CS-QT-TPP 奈米顆粒置於 6 ml 鹽酸緩 衝溶液 (ph 1.2, 含 50% 酒精 ) 之 50 ml 三角錐形瓶, 於恆溫水浴槽
中震盪 (37,100 rpm),0.5 1 1.5 及 2 小時取出 0.5 ml 溶液樣品, 利用 QT 之定量方式分析 QT 含量, 再以下列公式計算其時間累積 QT 之釋放率, 同時再加回 0.5 ml 鹽酸緩衝溶液, 使瓶內維持一定體積 計算方式如下 : Wn = Cn V + Vs Σ[C(a-1 )] Wn / W 100 = 時間累積 QT 釋放率 (%) Wn: 時間累積 QT 總含量 W:CS-QT-TPP 奈米顆粒中 QT 總含量 n,a: 取樣次數 C: 測定 QT 之濃度 V: 總溶液體積 Vs: 採取樣品體積 2. 模擬腸液中 (ph 7.4) 之安定性 參考范 (2003) 方法, 將 CS-QT-TPP 奈米顆粒置於 6 ml 磷酸緩衝溶液 (ph 7.4, 含 50% 酒精 ) 於 50 ml 三角錐形瓶於恆溫水浴槽中震盪 (37,75 rpm), 於 1 2 3 4 5 及 6 小時取出 0.5 ml 溶液樣品, 利用 QT 之定量方式回推 QT 含量, 並以上述公式計算其時間累積 QT 之釋放率, 同時再加回 0.5 ml 磷酸緩衝溶液, 使瓶內維持一定體積, 計算方式同上 五 分析方法 ( 一 ) 幾丁聚醣去乙醯度之測定
參考 Toei 與 Kohara(1976) 方法, 精稱 0.02 g 幾丁聚醣樣品及標準品並記錄其重量 將樣品及標準品溶於 10 ml 之 0.1 M 醋酸溶液中, 置於室溫下攪拌一小時待其溶解, 再以蒸餾水定量至 50 ml 接著, 取 5 ml 樣品及標準品溶液於三角錐形瓶中, 加入 0.05 ml toluidine blue 指示劑後, 以 N / 400 potassium polyvinyl sulfate solution (P.V.S.K) 進行滴定, 滴定至溶液由藍色變成紅紫色, 此為其滴定終點, 利用標準品滴定量與重量和樣品之重量及滴定量做計算即可得知去乙醯度 ( 二 ) 幾丁聚醣水解物之分子量測定 參考吳 (2008) 之方法, 精稱 10 mg 幾丁聚醣水解物及 pullulan 標準品, 分別溶於 10 ml 1% 醋酸溶液及去離子水中, 於冰箱靜置隔夜後, 以 0.45 μm filter 進行過濾 利用 Gel Permeation Chromatography (GPC) 方法分析幾丁聚醣水解物之分子量 以 pullulan 標準品建立檢量線 Pullulan 標準品分子量分別為 11800 22800 47300 112000 212000 404000 及 788000 Dalton 測定樣品遲滯時間(retention time) 並與檢量線相互對照, 即可推算幾丁聚醣水解物之平均分子量 系統 :L-6000 pump D-2500 chromatointegrator 積分儀 (Hitachi 公司, 日本 ) 偵測器 :RI-Detector 8110(Bischoff, 德國 ) 管柱 :HSP gel AQ4.0(Waters ; 6.0 mm * 150 mm) 移動相 :0.2M 醋酸 /0.1 M 醋酸鈉流速 :0.5 ml/min 溫度 :45 樣品濃度 :1 mg/ml
注射量 :20 μl 偵測時間 :15 min ( 三 ) 包覆率及裝載率之測定 製備 CS-QT-TPP 奈米顆粒時, 將 CS-QT-TPP 反應液離心, 取上 清液, 利用類黃酮測定方法推測其 QT 含量, 計算其包覆率 (encapsulation efficiency %) 接著將離心後得到之沉澱物 CS-QT-TPP 奈米顆粒, 利用烘箱烘乾 並秤重, 可得 CS-QT-TPP 奈米顆粒之乾重, 並計算及裝載率 (loading capacity %) ( 四 ) 奈米顆粒粒徑和表面電荷之測定 使用雷射光散射法粒徑及界面電位分析儀 (Zetasizer 3000HS, Malvern,UK) 測定奈米顆粒大小及表面電荷 製備奈米顆粒之實驗容器務必清洗乾淨並且使用之溶液皆以 0.45 µm 過濾膜過濾再進行實驗 將 CS-TPP 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒懸浮於適量的去離子水中, 使用超音波細胞粉碎機將聚集顆粒震碎 (40% duty cycle,20 secs), 靜置 5 min 後, 取上層溶液, 以動態光散射法 (dynamic light scattering method) 測定顆粒之粒徑大小 另外, 將 CS-TPP 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒以去離子水稀釋至適當濃度, 測定其表面電荷 所有樣品皆測定
三次, 求其平均值 (mean ±SD) ( 五 )QT 之定量方法 測定原理為類黃酮化合物於鹼性條件下可與硝酸鋁形成穩定的黃色錯合物, 並於波長 415 nm 下有最大吸光 先取 250 μl 之待測物, 加入 50 μl10% 硝酸鋁和 50 μl 1M 醋酸鉀, 再加入 1.4 ml 去離子水, 混合, 於室溫下反應 40 分鐘, 測 λ 415 nm 下吸光值 標準曲線 ( 標準品 Quercetin 濃度 vs 吸光值 ) 可推算 QT 之濃度 ( 六 ) 掃描式電子顯微鏡 (SEM) 觀察 CS-QT-TPP 奈米顆粒以去離子水多次反覆離心水洗作用, 以去除樣品中的鹽類, 將顆粒懸浮於 1 ml 去離子水中, 利用超音波細胞粉碎機分散樣品後, 將樣品滴在 4mm*4mm 經裁切後之蓋玻片上, 靜置於室溫風乾 24 小時, 利用離子附膜機在樣品鍍上一層白金, 再以熱場掃描式電子顯微鏡觀察幾丁聚醣顆粒表面型態 ( 七 ) 統計分析 本實驗數據皆以平均 ± 標準誤差 (means±sem) 表示 所有組別之試驗數據皆利用 SAS 9.1 軟體進行全隨機設計 ( completely randomized desigin) 變異分析(ANOVA) 及 Duncan s new multiple Range test 分析, 當機率值小於 0.05(p < 0.05) 表示各組於統計上有顯著差異 並使用 SigmaPlot 10.0 軟體進行作圖
肆 結果與討論 一 樣品製備 ( 一 ) 幾丁聚醣之製備 Wu 及 Du(2003) 研究中指出幾丁聚醣去乙醯度愈高 (75.5 ~ 92 %), 對牛血清白蛋白 (bovine serum albumin,bsa) 包覆率愈好並且降低 BSA 的釋放速率, 較適合做為日後之藥物或營養物質之載體 且高去乙醯度之幾丁聚醣溶於酸性溶液中時, 具有高度陽離子之特性, 此特性可提高在腸道中帶負電之腸黏膜的吸附力, 同時也可暫時性的打開腸黏膜上的緊密連結 (tight junctions), 有利於藥物傳遞 營養物質滲透吸收 (Huang et al., 2004;Lin et al., 2005) 幾丁聚醣是由幾丁質經過高溫及強鹼處理, 可使結構上之乙醯基 (-NHCOCH 3,acetyl group) 被脫去, 轉變為胺基 (-NH 2,amino group), 當去乙醯度到達一定的程度之後 ( 各文獻定義不同 ) 即可稱為幾丁聚醣 因此本研究選擇以去乙醯度大於 85 % 之幾丁聚醣做後續之實驗基材 ( 二 ) 不同分子量幾丁聚醣之製備 圖十三所示幾丁聚醣 (Original Mw:380 kda) 分別以臭氧濃度 0.55 及 6.3g/m 3 氧化至不同時間, 其降解程度之情形 於臭氧濃度 0.55 g/m 3 處理 0 30 60 90 及 120 min 後, 分別得到 380 378 287 218 及 216 kda 分子量之幾丁聚醣, 而臭氧濃度 6.3g/m 3, 處理 0 5 10 15 20 30 40 50 及 60 min, 可分別降解幾丁聚醣至 380 350
圖十三 臭氧濃度及處理時間對幾丁聚醣降解程度之影響 Fig. 13. Effect of ozone concentration and treatment time on the degree of chitosan degradation. Ozone concentration:,0.55 g/m 3 ;, 6.3g/m 3.
241 143.5 96 43.1 33.2 27.8 及 23.9 kda 分子量 於臭氧濃度 0.55 g/m 3 時, 降解速率慢, 經 120 min 後分子量僅降解至 216 kda 但臭氧濃度 6.3 g/m 3 之降解曲線可明顯看出 CS 於處理 30min 即可得到 45.8 kda 並於降解 60 min 時到達 23.9 kda 低分子量之 CS, 因此可確定此方法效率佳 由於每一批次以相同條件下經臭氧處理後的 CS, 其分子量都有些許差異, 因此日後實驗不同分子量之幾丁聚醣分類如下 :Original Mw ( 未被水解之 Chitosan,380 kda ) High Mw (200-250 kda 之 Chitosan) Medium Mw (100-150 kda 之 Chitosan ) 及 Low Mw (50 kda 以下之 Chitosan) Yue 等人 (2008) 研究以臭氧降解幾丁聚醣以形成水溶性低分子量幾丁聚醣, 結果指出幾丁聚醣經臭氧氧化降解過程結構可能變形出 amide I (νc=o) 及 amide II (δ N-H) 兩種,amide II 來自於胺基 (-NH + 3 ) 之分解 由此可得知臭氧降解過程中並無專一性, 可能會將幾丁聚醣上之胺基部分切除 以臭氧之方式降解製備不同分子量幾丁聚醣, 其切斷幾丁聚醣鍵結位置之專一性雖較低, 但為較省時 省成本且高效率之方法 且食品經過奈米化後, 會延長其在腸胃道中時間, 可提高其與腸道上皮細胞的接觸機會且可直接被細胞吸收, 進而提高營養物質之生物利用率 (Chen et al., 2006) 本實驗期望低分子量製備之 CS-QT-TPP 奈米顆粒以得到粒徑更小之顆粒以提高吸收率 生物利用率以增進保健功效 ( 三 ) 槲皮素 (Quercetin,QT) 之溶解性 表九所示為 QT 對水 冰醋酸 絕對酒精及 Dimethyl sulfoxide (DMSO) 溶解情形, 以及 QT 對絕對不同濃度酒精之可溶性 由此結果得知, 槲皮素 (Quercetin,QT) 可完全溶解於 DMSO 及絕對酒精兩種溶劑, 但由於 DMSO 有毒性, 故本研究選用絕對酒精 而酒
表九 槲皮素對若干溶劑之溶解性 Table 9. Solubility of quercetin in a number of solvents 水 1% 冰醋酸 冰醋酸 99.8% 絕對酒精 DMSO 含 90% 含 80% 含 70% 含 60% 含 50% 含 40% 絕對酒精 絕對酒精 絕對酒精 絕對酒精 絕對酒精 絕對酒精 :precipitate ( 完全不溶解 ) :precipitate and creamy suspension ( 部分溶解 ) :creamy suspension, no precipitate ( 完全溶解 )
精濃度若小於 50% 則 QT 難溶解 因此, 於製備幾丁聚醣 - 槲皮素 - 三 聚磷酸鈉奈米顆粒時, 酒精濃度不宜小於 50% 二 幾丁聚醣 - 三聚磷酸鈉奈米顆粒懸浮液之巨觀觀察 本實驗探討 CS 溶液與 TPP 溶液加入順序所形成之 CS-TPP 奈米顆粒懸浮液其巨觀形態之差異 表十為不同分子量幾丁聚醣與不同 CS/TPP 重量比由 CS 溶液滴入 TPP 溶液所製備的 CS-TPP 奈米顆粒懸浮液所呈現之巨觀型態, 及表十一則由 TPP 溶液滴入 CS 溶液所得到 CS-TPP 奈米顆粒懸浮液其巨觀型態 兩者相比, 自表十一顯示 CS-TPP 奈米顆粒懸浮液其均勻懸浮狀況較佳, 較不易有沉澱之現象, 但表十沉澱情形在中低分子量 CS 較為嚴重 莊 (2004) 指出若可直接看出溶液中顆粒產生聚集沉澱現象, 顆粒大小介於奈米級和微米級間, 且顆粒大小分佈範圍較寬, 因此推測由 TPP 溶液滴入 CS 溶液所得到 CS-TPP 奈米顆粒懸浮液可達奈米級顆粒之可能性較大, 因此後續實驗加入順序選擇以 TPP 溶液滴入 CS 溶液 Calvo 等人 (1997) 將不同濃度之 CS 溶液與不同濃度 TPP 溶液混合反應, 指出若反應液在巨觀下呈現乳白色而不沉澱狀態則為奈米顆粒 ; 若有明顯沉澱物則為微米顆粒 吳 (2008) 之研究將 TPP 溶液滴入不同分子量之 CS 溶液形成不同 CS/TPP 重量比之 CS-TPP 奈米顆粒懸浮液其巨觀形態顯示於 61.6 kda 個別與 5/1 及 6/1 之 CS/TPP 重量比或 6.4 kda CS 溶液個別與 2/1 3/1 4/1 5/1 6/1 之 CS/TPP 重量比混合製備之顆粒懸浮液出現奈米級程度較高 同時作者另外也做將牛血清蛋白 (bovine serum albumin,bsa) 與 CS 溶液形成混合液後, 再將混合液滴入 TPP 溶液中, 可將 BSA 包覆於 CS-TPP 網狀結構中得較高之包覆率 但大部分文獻所使用製備幾丁聚醣奈米顆粒
表十 CS 溶液滴入 TPP 溶液時 CS-TPP 奈米顆粒之巨觀型態 Table 10. Phenmenons of CS-TPP nanoparticles under adding chitosan solution to TPP solution CS/TPP Original High Mw- Medium Mw- Low Mw- mass ratio Chitosan Chitosan Chitosan Chitosan 3:1 4:1 5:1 6:1 :precipitate( 奈米顆粒數目少 ) :precipitate and creamy suspension( 奈米顆粒數目較多 ) :creamy suspension, no precipitate( 奈米顆粒數目最多 )
表十一 TPP 溶液滴入 CS 溶液時 CS-TPP 奈米顆粒之巨觀型態 Table 11. Phenmenons of CS-TPP nanoparticles under adding TPP solution to chitosan solution CS/TPP Original High Mw- Medium Mw- Low Mw- mass ratio Chitosan Chitosan Chitosan Chitosan 3:1 4:1 5:1 6:1 :precipitate( 奈米顆粒數目少 ) :precipitate and creamy suspension( 奈米顆粒數目較多 ) :creamy suspension, no precipitate( 奈米顆粒數目最多 )
之方法, 幾乎都是將 TPP 滴入 CS 溶液 因此本實驗之研究希望了解 CS 溶液與 TPP 溶液加入順序對於形成 CS-TPP 奈米顆粒多寡之影 響 結果證明由 TPP 溶液加入 CS 溶液之順序較佳 三 槲皮素 (QT) 濃度 幾丁聚醣 (CS) 分子量及幾丁聚醣 - 三聚磷酸鈉 (TPP) 重量比對幾丁聚醣 - 槲皮素 - 三聚磷酸鈉 (CS-QT-TPP) 奈米顆粒特性之影響 ( 一 ) 槲皮素 (QT) 濃度之影響 孫 ( 2010 ) 將幾丁聚醣 - 分離大豆蛋白水解物 - 三聚磷酸鈉 (CS-ISPH-TPP) 奈米顆粒進行模擬胃腸液之安定性探討, 結果顯示以高分子量之幾丁聚醣,CS/TPP 重量比 3/1 所製備之 CS-ISPH-TPP 奈米顆粒, 具有較好之安定性 因此本實驗先使用未降解之幾丁聚醣 (Original Mw chitosan,380.6 kda), 固定 CS/TPP 重量比為 3/1, 探討不同濃度 (0~7 mg/ml) 之 quercetin 對 CS-QT-TPP 奈米顆粒特性如 QT 之包覆率 粒徑大小 表面電位之影響 1. 包覆率之影響 因 QT 不帶電故在此包覆方式中應以幾丁聚醣與 TPP 形成網狀結構之物理性包覆為主 由圖十四所示,QT 濃度於 0.45 mg/ml 時, 其包覆率達最高約 44%, 其濃度小於 0.45 mg/ml 時, 可能因其分散太細, 部分包覆不到, 使其包覆率偏低, 而其濃度大於 0.6 mg/ml 因包覆已經到達飽和狀態使得包覆率逐漸下降之趨勢 但裝載率則隨 QT 濃度增加而有明顯上升之趨勢 有關前人之研究結果可分為兩種 : 一種為不帶電之被包覆物質,
圖十四 槲皮素濃度對包覆率及裝載率之影響 Fig. 14. Effect of quercetin concentration on the encapsulation efficiency and loading capacity. (Original Mw chitosan;cs/tpp:3/1)
吳 (2008) 以舞菇多醣體 (PS) 為被包覆物質, 結果顯示隨 PS 濃度增加, 其包覆率有顯著之下降 楊 (2008) 研究包覆表沒食子兒茶素沒食子酸酯 (Epigallocatechin gallate,egcg) 之幾丁聚醣奈米顆粒, 隨 EGCG 濃度上升包覆率有顯著下降之趨勢 另一種為帶電之被包覆物質, Deng 等人 (2006) 將 55kDa 幾丁聚醣與 TPP 交聯包覆 lysozyme, 得到實驗結果為 lysozyme 濃度自 0.23 mg/ml 增加至 1.17 mg/ml, 其包覆率由 47.3% 下降至 14.4%, 作者推論由於製備奈米顆粒方法是先將 lysozyme 溶於幾丁聚醣溶液中形成混合液, 再將 TPP 溶液滴入混合液中, 包覆過程是藉由 TPP 溶液滴入幾丁聚醣溶液的瞬間藉離子交聯法形成網狀結構進而捕捉 lysozyme, 因此若提高 lysozyme 初始濃度即可增加 lysozyme 被捕捉的量, 故裝載率增加, 但是包覆率有下降之趨勢是由於奈米顆粒的形成, 其捕捉到 lysozyme 的機會降低所致 Gan 與 Wang (2007) 以幾丁聚醣交聯 TPP 奈米顆粒包覆牛血清蛋白 (bovine serum albumin,bsa),bsa 濃度自 0.25 mg/ml 上升至 1.5 mg/ml, 對 BSA 包覆率有提升之結果 (38.7% 增加至 72.5%) 作者解釋, 包覆率隨著 BSA 濃度增加而變大, 隨著濃度的增加, 包覆後微粒為多層結構, 有較多之 BSA 吸附之微粒表面, 使得包覆率上升 2. 粒徑大小之影響 在粒徑大小的部分, 結果如圖十五所示,QT 濃度自 0.15 mg/ml 上升至 0.45 mg/ml 的過程中顆粒自 714 nm 至 823 nm 逐漸增大, 與包覆率的結果相互呼應 ; 當 QT 濃度繼續增加至 0.75 mg/ml 時在 SAS 統計分析有顯著差異, 顆粒有減小之趨勢 823 nm 至 758 nm, 但就數值上觀察範圍約 758 nm ~ 823 nm, 差異不大, 應是包覆率已達飽和之故 Jang 等人 (2008) 包覆 L-Ascorbic Acid (AA) 之幾丁聚醣奈
圖十五 槲皮素濃度對 CS-QT-TPP 奈米顆粒粒徑大小之影響 Fig. 15. Effect of quercetin concentration on particle size of CS-QT-TPP nanoparticles. (Original chitosan;cs/tpp:3/1) * A-D mean bars (QT concentration) with different letters are significantly different (p<0.05)
米顆粒, 指出 AA 濃度由 0.1 mg/ml 增加至 0.3 mg/ml 時, 顆粒粒徑會隨之增加,Wu 等人 (2005) 研究顯示利用 200kDa 之幾丁聚醣包覆甘草酸銨 (ammonium glycyrrhizinate), 隨甘草酸銨濃度增加, 奈米顆粒之粒徑增加 皆與本文此部分結果相同 3. 表面電位之影響 表十二之結果顯示 CS-QT-TPP 奈米顆粒之表面電位與未包覆 QT 之 CS-TPP 奈米顆粒相比在統計分析的結果有顯著差異 是由於幾丁聚醣於酸性溶液中, 其結構上的 NH 2 被形成帶正電之 NH + 3, 此時將帶負電之 TPP 溶液滴入幾丁聚醣溶液中, 形成幾丁聚醣奈米顆粒, 此時在顆粒表面上依然存在正電荷未與 TPP 離子形成交互作用之 + NH 3 離子 而當 QT 進入被包覆時,QT 會把部分 CS 之胺基所帶的正電荷蓋住, 使表面電位下降 而隨著 QT 濃度增加,CS-QT-TPP 奈米顆粒表面電位幾乎差異不大, 因 QT 不帶電之關係, 電荷分佈於 +34.3 ~ +36.3 mv 之間 Calvo 等人 (1997) 以 chitosan/polyethylene oxide (CS/PEO-PPO) 奈米顆粒包覆牛血清蛋白, 其奈米顆粒表面電位範圍於 +20 ~ +60 mv Gan 與 Wang(2007) 以 CS 與 TPP 交聯包覆牛血清蛋白, 牛血清蛋白濃度增加其所製備的奈米顆粒其表面電位, 皆帶正電荷並且差異不大 幾丁聚醣的高度陽離子特性可提高在腸道中帶負電之腸黏膜的吸附力, 同時也可暫時性的打開腸黏膜上的緊密連結 (tight junctions), 有利於藥物傳遞 營養物質滲透吸收 (Huang et al., 2004;Lin et al., 2005) ( 二 ) 幾丁聚醣分子量之影響 由前者實驗結果可得 QT 濃度於 0.45 mg/ml 包覆率最高 44%, 雖
表十二 槲皮素濃度對 CS-QT-TPP 奈米顆粒表面電位之影響 Table 12. Effect of quercetin concentration on the zeta potential of CS-QT-TPP nanoparticles Quercetin concentration ζpotential(mv) (mg/ml) 0 +41.3±2.9 A 0.15 +36.3±2.0 B 0.3 +36.3±2.0 B 0.45 +35.4±0.9 B 0.6 +36.2±2.2 B 0.75 +36.3±1.2 B (Original chitosan ;CS/TPP mass ratio:3/1) * A-B mean in the same column (QT concentration) with different superscripts are significantly different (p<0.05)
QT 濃度於 0.75 mg/ml 時包覆率為 39.4%, 但當 QT 濃度分別於 0.45 mg/ml 及 0.75 mg/ml, 回推被包覆之 QT 實際含量為分別 0.198mg/mL (0.45 mg/ml * 44%) 及 0.2955 mg/ml(0.75 mg/ml * 39.4%), 可明顯看出 QT 濃度於 0.75 mg/ml 時, 實際 QT 包覆量較多, 即當 QT 濃度為 0.75 mg/ml 較加裝載率, 並且此濃度製出 CS-QT-TPP 顆粒比前者為小 (759 nm vs 823 nm), 表面電位帶正電荷 (+36.3 mv vs +35.4 mv) 故接下來的實驗固定 QT 溶液濃度為 0.75 mg/ml,cs/tpp 重量比為 3/1, 探討不同分子量 (Original Mw:380 kda High Mw: 200~250 kda Medium Mw:100~150 kda 及 Low Mw:<50 kda) 的幾丁聚醣對 CS-QT-TPP 奈米顆粒之包覆率 粒徑大小及表面電位之影響 1. 包覆率之影響 由圖十六所示, 隨不同分子量 Original Mw High Mw Medium Mw 及 Low Mw, 其包覆率結果分別為 39.4% 38.6% 38.5% 和 39.6%, 經由 SAS 統計分析結果顯示 CS 分子量對包覆率的影響沒有顯著差異 Xu 與 Du (2003) 等人研究結果顯示隨著分子量自 115 kda 增大至 210 kda, 包覆率也從 9.5% 增加至 19%, 作者認為因分子量大之幾丁聚醣有較長鏈, 可與 TPP 鍵結形成更多網狀結構包覆牛血清蛋白 吳 (2008) 製備包覆舞菇多醣體之幾丁聚醣奈米顆粒, 高分子量幾丁聚醣比低分子量幾丁聚醣之包覆率高約 10%, 作者認為因舞菇多醣屬物理性包覆, 高分子量幾丁聚醣分子量較長, 其溶液黏度較高有較好之包覆率, 其與 Xu 與 Du (2003) 有相同之結果 楊 (2008) 研究使用不同分子量 CS,CS/TPP 重量比為 6/1 包覆表沒食子兒茶素沒食子酸酯 (Epigallocatechin gallate,egcg) 之幾丁聚醣奈米顆粒, 其隨 CS 分子量自 481.3kDa 減小至 85.2kDa, 包覆率有自 41.3% 上升至 47.1% 之趨勢, 作者推測原因可能是 CS 對 EGCG 是物理性包覆,
圖十六 幾丁聚醣分子量對 QT 包覆率之影響 Fig. 16. Effect of chitosan molecular weight on the QT encapsulation efficiency. (Quercetin concentration.. 0.75mg/mL;CS/TPP mass ratio.. 3/1) * A mean bars (chitosan Mw) with different letters are significantly different (p<0.05)
高分子量幾丁聚醣, 溶液黏度大, 分子立體障礙大, 使得 EGCG 進入顆粒的能力受限 而本研究與以上結果有些差異, 其理由可能是 : (1) 本研究採取臭氧氧化降解 CS, 使被降解的 CS 之結構與前人研究所採用酵素水解 CS 之結構不同 ;(2)CS 溶液與 TPP 溶液在此加入順序不同 ;(3) 被包覆者亦不同 2. 粒徑大小之影響 圖十七所示,CS 之分子量對未包覆 ( 即 CS-TPP) 及有包覆 QT( 即 CS-QT-TPP) 奈米顆粒之大小的影響 在未包覆者方面, 未經降解之 CS, 其 CS-TPP 奈米顆粒之大小比降解 CS 較大, 此由於未降解 CS 具有較長的分子鏈, 可與 TPP 鍵結呈現較大的顆粒 在包覆者方面, 無論 CS 分子量大小, 其 CS-QT-TPP 奈米顆粒均較未包覆者大, 因有 QT 在內之關係 Gan 與 Wang (2007) 研究指出, 有包覆 BSA 之奈米顆粒其粒徑皆大於未包覆者, 與本研究相呼應 另外,Medium Mw 之 CS 及 Low Mw 之 CS, 其 CS-QT-TPP 奈米顆粒稍比 Original Mw 之 CS 及 High Mw 之 CS 者較大 ( 自約 758nm 增加至 864nm) 此可能由於較低分子量 CS 之立體結構障礙較小, 溶液黏度較低, 與 TPP 離子和槲皮素作用較均勻所致 楊 (2008) 研究以幾丁聚醣 -TPP 包覆兒茶素 ( 不帶電者 ) 製備其奈米顆粒, 亦發現 CS 分子量自 481.3 kda 降低至 163.2 kda, 其顆粒大小增大, 此與本研究類似 而 Gan 與 Wang(2007) 研究以幾丁聚醣 -TPP 包覆 Bovine serum albumin (BSA), 發現, 當 CS 分子量從低到高, 幾丁聚醣奈米微粒的平均粒徑自 388.4 nm 增加至 582.5 nm, 此與本研究結果不同, 是否被包覆者有帶電之關係, 即被包覆者同時由物理性包覆及正負電互相結合所致 3. 表面電位之影響
圖十七 幾丁聚醣分子量對 CS-TPP 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒粒徑大小 之影響 Fig. 17. Effect of chitosan molecular weight on the particle size of CS-TPP and CS-QT-TPP nanoparticles. (Quercetin concentration.. 0.75mg/ml;CS/TPP mass ratio.. 3/1) * A-C mean bars (chitosan Mw) with different letters are significantly different (p<0.05) * a-b mean bars (type of nanoparticles) with different letters are significantly different (p<0.05)
表十三 幾丁聚醣分子量對 CS-TPP 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒表面電位之影響 Table 13. Effect of chitosan molecular weight on the zeta potential of CS-TPP and CS-QT-TPP nanoparticles Type of nanoparticle CS MW(kDa) Unloaded QT-loaded ζpotential(mv) Original chitosan +41.3±2.9 Aa +36.3±1.2 Aa High Mw chitosan +39.7±2.4 Ba +30.7±0.9 Bb Medium Mw chitosan +38.8±2.4 ABa +29.5±0.5 Bb Low Mw chitosan +38.0±0.5 ABa +25.7±1.2 Cb (CS/TPP mass ratio: 3/1;Quercetin concentration:0.75mg/ml). * A-C mean in the same column (chitosan Mw) with different superscripts are significantly different (p<0.05) * a-b mean in the same column (type of nanoparticles) with different superscripts are significantly different (p<0.05)
表十三所示不同分子量 CS 對 CS-TPP( 即未包覆 QT) 及 CS-QT-TPP ( 即有包覆 QT) 奈米顆粒表面電位之影響 在未包覆 QT 奈米顆粒方面, 被降解之 CS, 其 CS-TPP 奈米顆粒之表面電位稍有減少之趨勢, 此可能由於臭氧氧化降解幾丁聚醣時有些胺基被切除之故 (Yue et al., 2007) 另外, 低分子量 CS, 其分子鏈較短, 結構立體障礙小, 其 CS 上之胺基與 TPP 之負電荷離子 (-P 3 O 5-4- 10 -HP 3 O 10 及 -OH - group) 有更多的機會產生交互作用, 亦使正電荷減少 有包覆 QT 奈米顆粒方面, 其表面電位均小於未包覆, 此可能由於 QT 蓋住 CS 上之胺基使正電荷偵測不到之關係 ; 而較低分子量之 CS, 其表面電位亦較小, 此與未包覆者有類似之原因 Wu 等人 (2005) 利用幾丁聚醣包覆甘草酸銨之研究指出, 隨著幾丁聚醣分子量的增加, 其表面電位差異不大 其結果與本研究不相同, 推論為臭氧降解幾丁聚醣過程使部分胺基 (NH + 3 ) 減少之故 ( 三 ) CS/TPP 重量比之影響 本試驗以 7mL QT 溶液 (con. 0.75 mg/ml) 與 5mL Original chitosan (380kDa,con. 2 mg/ml) 均勻混合形成混合液後, 將 2 ml 不同濃度 (0.84~1.67 mg/ml)tpp 溶液滴入混合液中, 探討不同 CS/TPP 重量比 (6/1 5/1 4/1 3/1) 對 CS-QT-TPP 奈米顆粒之包覆率 粒徑大小及表面電位之影響 1. 包覆率之影響 圖十八所示, 於 SAS 統計分析之結果可看出 CS/TPP 重量比對包覆率無顯著影響 但若以數值來討論, 可發現 CS/TPP 重量比 3/1 至 4/1 其包覆率有些微上升 (39.4 % 增加至 42.2 %), 應為適量 CS 之增加使 CS 其結構上之胺基與 TPP 產生交聯機會增加, 因此可形成較多的網狀結構包覆 QT; 而 CS/TPP 重量比自 4/1 至 6/1 包覆率略為下降
圖十八 CS/TPP 重量比對 QT 包覆率之影響 Fig. 18. Effect of CS/TPP mass ratio on the QT encapsulation efficiency. (Original chitosan;quercetin concentration.. 0.75mg/mL) * A mean bars (CS/TPP mass ratio) with different letters are significantly different (p<0.05)
(42.2 % 減少至 39.7 %), 推測應為 CS/TPP 重量比為 5/1 及 6/1 時, CS 與 TPP 產生的離子反應結合不如 3/1 及 4/1 緊密, 對 QT 之捕捉能力有限, 故使包覆率降低 孫 (2010) 分離大豆蛋白質水解物奈米顆粒之研究結果顯示 CS/TPP 重量比於 3/1 和 4/1 時包覆率約 65%, 但 CS/TPP 重量比上升至 5/1 及 6/1 時, 包覆率下降至約 52%, 與本文結果趨勢相符 2. 粒徑大小之影響 由圖十九所示,CS/TPP 重量比對 CS-TPP( 即未包覆 QT 者 ) 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒粒徑之影響 整體而言, 有包覆 QT 的顆粒大小皆比未包覆之 QT 大許多 未包覆 QT 之 CS-TPP 奈米顆粒大小方面, CS/TPP 重量比自 6/1 至 5/1 之過程, 因 TPP 含量增加使 CS 與 TPP 鍵結形成的網狀結構變多, 顆粒粒徑增大 ; 而 CS/TPP 重量比自 4/1 到 3/1, 粒徑有減小之趨勢, 推測因 CS 與 TPP 鍵結形成網狀結構更多, 使結構變更為緊密, 致使粒徑變小 有包覆 QT 之 CS-QT-TPP 奈米顆粒 CS/TPP 重量比增加時, 雖在統計分析的結果顯示各組別間的奈米顆粒有所差異, 粒徑由 759 nm 減小至 711 nm, 但以數值上來看差異不大, 此與圖二十包覆率無顯著差異之關係 Liu 與 Gao(2008) 指出 TPP 溶液濃度提高製備出的奈米顆粒可有較小的粒徑大小, 包覆 ciprofloxacin(ch) 其粒徑皆大於未包覆之組別, 即隨 CS/TPP 重量比增加, 顆粒大小有增加的趨勢 孫 (2010) 指出 CS/TPP 重量比由 6/1 減少至 4/1 時, 粒徑隨之增加 ; 而再自 4/1 減少至 2/1 時, 粒徑則呈現變小之趨勢, 此結果與本研究結果為相似 3. 表面電位之影響 表十四所示 : 未包覆 QT 之 CS-TPP 方面,CS/TPP 重量比增加時, 其奈米顆粒之表面電位幾乎差異不大 ; 而有包覆者之表面電位均較未
圖十九 CS/TPP 重量比對 CS-TPP 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒粒徑大小之影響 Fig. 19. Effect of CS/TPP mass ratio on the particle size of CS-TPP and CS-QT-TPP nanoparticles. (Original chitosan;quercetin concentration.. 0.75mg/mL) * A-C mean bars (CS/TPP mass ratio) with different letters are significantly different (p<0.05) * a-b mean bars (type of nanoparticles) with different letters are significantly different (p<0.05)
表十四 CS/TPP 重量比對 CS-TPP 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒表面電位之影響 Table 14. Effect of CS/TPP mass ratio potential of CS-TPP and CS-QT-TPP nanoparticles Type of nanoparticle CS/TPP mass ratio Unloaded ζpotential(mv) QT-loaded 3/1 +41.3±2.9 Aa +36.3±1.2 Ca 4/1 +42.5±2.4 Aa +37.7±2.0 BCb 5/1 +40.7±1.2 Aa +39.8±1.0 ABa 6/1 +42.9±1.2 Aa +41.7±1.5 Aa (Original Chitosan ;Quercetin concentration:0.75mg/ml) * A-C mean in the same column (CS/TPP mass ratio) with different superscripts are significantly different (p<0.05) * a-b mean in the same column (type of nanoparticles) with different superscripts are significantly different (p<0.05)
包覆者低, 其理由可能因 QT 蓋住部分 CS-QT-TPP 表面上電位之故 ; 另外, 隨著 CS/TPP 重量比增加 CS-QT-TPP 之表面電位稍有增加的趨 勢, 推測由於 CS 含量增加胺基 (NH 3 + ) 亦增加之緣故 當表面電位 愈高, 顆粒之分散度愈穩定, 顆粒分散穩定性的界定一般認為在大於 +30 mv 或小於 -30mV Gan(2005) 研究藉由幾丁聚醣奈米顆粒作為 基因之傳遞系統, 結果指出 CS/TPP 重量比由 7/1 降低至 3/1 時, 其 表面電位會從 +45 mv 降低至 +30 mv 其結果與本文相同 四 幾丁聚醣 - 槲皮素 - 三聚磷酸鈉 (CS-QT-TPP) 奈米顆粒安定性之試驗 Zhang 與 Kosaraju(2007) 研究指出, 當 CS-TPP 奈米顆粒在 ph 值太高或太低之環境, 會造成幾丁聚醣與 TPP 之間離子交聯鍵結之特性改變, 導致奈米顆粒變為不安定或瓦解 因此本研究分別探討 CS-QT-TPP 奈米顆粒在模擬胃液 (ph 1.2) 及腸液 (ph 7.4) 下之安定性 孫 (2010) 研究包覆分離大豆蛋白質 (ISPH) 幾丁聚醣奈米顆粒之安定性試驗中, 指出以高分子量之幾丁聚醣,CS/TPP 重量比 3/1, 所製備之備 CS-ISPH-TPP 奈米顆粒安定性最佳, 本文 QT 濃度於 0.75 mg/ml 包覆總含量最多 因此,CS-QT-TPP 奈米顆粒製備條件為 :CS 使用 Original Mw (380kDa),QT 濃度 0.75 mg/ml,cs/tpp 重量比 3/1 ( 一 ) 模擬胃液中 (ph1.2) 之安定性 CS-QT-TPP 奈米顆粒置於 ph 1.2 緩衝溶液下 2 小時, 測試其安定性, 其結果如圖二十 (a) 所示 CS-QT-TPP 奈米顆粒於模擬胃液 (ph 1.2) 中,QT 釋放之情形, 其累積釋放率約 5-6%, 表示 94% 以上之 Quercetin 仍被包覆於顆粒中, 顯示其有良好安定性 有文獻指出, In
the ph 1.2 buffer (a) In the ph 7.4 buffer 圖二十 CS-QT-TPP 奈米顆粒在 (a) 模擬胃液 (ph 1.2 buffer) (b) 模擬腸液中 (ph 7.4 buffer) 安定性影響 Fig. 20. Stability of CS-QT-TPP nanoparticles in the ph1.2 buffer (a) and ph7.4 buffer (b). (Original chitosan;qt concentration: 0.75mg/mL;CS/TPP mass ratio:3/1)
幾丁聚醣溶液黏度會影響顆粒之釋放行為, 增加幾丁聚醣溶液黏度 ( 高分子量之幾丁聚醣及高濃度之幾丁聚醣溶液 ) 與 TPP 溶液交聯反應, 形成之顆粒結構較為緊密且穩定, 因此釋放速率會降低 (Ko et al., 2002;Deng et al., 2006) 張(2005) 包覆降血脂藥物奈米顆粒之研究指出經模擬胃部 2 小時後其累積釋放率約為 4% 楊(2008) 指出經包覆兒茶素之幾丁聚醣奈米顆粒經模擬胃部 2 小時候其累積釋放率約 5% ( 二 ) 模擬腸道中 (ph7.4) 之安定性 圖二十 (b) 所示,CS-QT-TPP 奈米顆粒置於 ph 7.4 緩衝溶液下 6 小時內其安定情形 於頭 1 小時 QT 之釋放率為 10%, 延至 6 小時後, 其累積釋放率為 12%, 此顯示 CS-QT-TPP 奈米顆粒在模擬腸液中亦為安定 楊 (2008) 研究幾丁聚醣 -TPP 奈米顆粒包覆兒茶素指出置於模擬胃液 (ph 1.2)2 小時後接著置於模擬腸液 (ph 7.4)6 小時結果皆顯示幾丁聚醣分子量愈大, 其安定性愈佳, 累積釋放率小於 7% 孫(2010) 研究包覆分離大豆蛋白水解物之奈米顆粒其在腸道經 6 小時, 累積釋放率已達約 40%, 並同時指出 CS 分子量愈高, 其奈米顆粒安定性較佳
五 掃描式電子顯微鏡 (SEM) 觀察 CS-QT-TPP 奈米顆粒外觀型態 圖二十一分別為 CS-TPP 奈米顆粒與 CS-QT-TPP 奈米顆粒之 SEM 圖, 可以明顯看出二者均為立體之球狀, 且經乾燥後照相之結果與粒徑分析儀之結果相比, 可發現顆粒較小 (CS-TPP 奈米顆粒未乾燥為 439 nm 及已乾燥約 200 nm;cs-qt-tpp 奈米顆粒未乾燥約為 760 nm 即以乾燥後約 500 nm) 應是顆粒於液態中膨脹所致 Ko 等人 (2002) 透過幾丁聚醣與 TPP 離子交聯作用製備奈米顆粒, 並包覆 felodipine 可得表面平滑且呈球狀之微 / 奈米顆粒, 與本實驗結果相符 Acosta (2009) 研究指出利用奈米顆粒來傳遞營養及保健物質, 若顆粒粒徑小於 500 nm 可提高物質之吸收率
(a) (b) 圖二十一 CS-TPP 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒之掃描式電子顯微鏡 (SEM) 觀察 (a)cs-tpp 奈米顆粒及 (b)cs-qt-tpp 奈米顆粒 Fig. 21. SEM of CS-TPP and CS-QT-TPP nanoparticles. (a), CS-TPP nanoparticles(cs/tpp mass ratio:3/1;original chitosan) (b), CS-QT-TPP nanoparticles(cs/tpp mass ratio:3/1;original chitosan;quercetin concentration:0.75mg/ml)
伍 結論 由以上試驗之結果, 有幾點值得注意 : 一 不同分子量幾丁聚醣之製備 幾丁聚醣 (Original Mw:380 kda) 分別以臭氧濃度 0.55 及 6.3 g/m 3 氧化至不同時間, 得知於臭氧濃度 0.55 g/m 3 時, 降解速率慢, 經 120 min 後分子量僅降解至 216 kda 但臭氧濃度 6.3g/m 3 之降解曲 線可明顯看出 CS 於處理 30min 即可得到 45.8 kda 並於降解 60 min 時到達 23.9 kda 低分子量之幾丁聚醣, 因此確定此方法效率佳 二 槲皮素 (Quercetin,QT) 之溶解性 槲皮素 (Quercetin,QT) 可完全溶解於 DMSO 及絕對酒精兩種 溶劑, 但由於 DMSO 有毒性, 故本研究選用絕對酒精 酒精濃度若 小於 50% 則 QT 難溶解 因此, 製備幾丁聚醣 - 槲皮素 - 三聚磷酸鈉奈 米顆粒時, 酒精濃度不宜小於 50% 三 幾丁聚醣 (CS)- 三聚磷酸鈉 (TPP) 奈米顆粒懸浮液之巨觀觀察 加入順序由 TPP 溶液滴入 CS 溶液所得到 CS-TPP 奈米顆粒懸浮液其均勻懸浮狀況較佳, 較不易有沉澱之現象, 達奈米級顆粒之數量較多 四 CS-QT-TPP 奈米顆粒之製備及特性之影響因子 本研究利用 ph 4.7 之 CS 溶液與 ph 9.0 之 TPP 溶液, 包覆 QT,
並比較 QT 添加濃度 CS 分子量 CS/TPP 重量比對 CS-QT-TPP 奈米 顆粒之包覆率 顆粒大小 及表面電位影響 ( 一 ) QT 濃度之影響 使用未降解幾丁聚醣 (380 kda),cs/tpp 重量比 3/1 來包覆不同濃度 (0.15~0.75 mg/ml) 之 QT 時, 濃度 0.15 mg/ml 上升至 0.45 mg/ml, 包覆率隨之增大, 並於 0.45 mg/ml 時, 其包覆率最高約 44%,CS-QT-TPP 顆粒大小也自 714 nm 至 823 nm 逐漸增大 ; 其濃度再自 0.6 mg/ml 增加至 0.75 mg/ml, 包覆率呈現下降, 顆粒稍有減小之趨勢 ( 範圍約 758 nm ~ 823 nm) 隨著 QT 濃度增加,CS-QT-TPP 奈米顆粒表面電位差異不大, 電荷分佈於 + 34.3 ~ + 36.3 mv 之間 ( 二 ) CS 分子量之影響 使用未水解者 380 kda (Original Mw) 200~250 kda (High Mw) 100~150 kda (Medium Mw) 以及 50 kda 以下者 (Low Mw) 之不同分子量 CS, 固定 QT 濃度為 0.75 mg/ml,cs/tpp 重量比為 3/1 製備 CS-QT-TPP 奈米顆粒時, 隨 CS 分子量之減少對包覆率無顯著差異 未包覆者方面,Original Mw 之 CS, 其 CS-TPP 奈米顆粒之大小比降解 CS 大, 且被降解之 CS, 其 CS-TPP 奈米顆粒之表面電位稍有減少之趨勢 在包覆者方面, 無論 CS 分子量大小, 其 CS-QT-TPP 奈米顆粒大小均較未包覆者大,Medium Mw 之 CS 及 Low Mw 之 CS, 其 CS-QT-TPP 奈米顆粒稍比 Original Mw 之 CS 及 High Mw 之 CS 者較大 ( 自約 758 nm 增加至 864 nm) 有包覆 QT 奈米顆粒方面其表面電位均小於未包覆 ( 三 ) CS/TPP 重量比之影響
使用未降解幾丁聚醣 (380 kda), 固定 QT 濃度為 0.75 mg/ml, 探討不同 CS/TPP 重量比 (3/1 4/1 5/1 及 6/1) 對 CS-QT-TPP 奈米顆粒特性之影響, 由結果得知,CS/TPP 重量比 3/1 至 4/1,QT 包覆率有些微上升 (39.4 % 增加至 42.2 %), 而 CS/TPP 重量比自 4/1 至 6/1 包覆率略為下降 (42.2 % 減少至 39.7 %) 整體而言, 有包覆 QT 的顆粒大小皆比未包覆之 QT 大許多 未包覆 QT 之 CS-TPP 奈米顆粒大小方面,CS/TPP 重量比自 6/1 至 5/1, 顆粒粒徑增大 ; 而 CS/TPP 重量比自 4/1 到 3/1, 粒徑有減小之趨勢, 但其顆粒之表面電位差異不大 有包覆 QT 之 CS-QT-TPP 奈米顆粒 CS/TPP 重量比增加時, 粒徑由 759 nm 減小至 711 nm, 表面電位稍有增加的趨勢 五 CS-QT-TPP 奈米顆粒於胃 腸液中之安定性 以未降解幾丁聚醣 (380 kda), 固定 QT 濃度為 0.75 mg/ml, CS/TPP 重量比 3/1 製備之 CS-QT-TPP 奈米顆粒, 測試其於 ph1.2 及 ph 7.4 緩衝液之安定性 CS-QT-TPP 奈米顆粒置於 ph 1.2 緩衝溶液下 2 小時,QT 累積釋放率約 5-6%, 顯示其有良好安定性 CS-QT-TPP 奈米顆粒置於 ph 7.4 緩衝溶液下 6 小時內, 其累積釋放率為 12%, 此顯示 CS-QT-TPP 奈米顆粒在模擬腸液中亦為安定 六 掃描式電子顯微鏡 (SEM) 觀察 CS-TPP 及 CS-QT-TPP 奈米顆粒之外觀型態 二者均為立體之球狀, 且經乾燥後照相之結果與粒徑分析儀之結 果相比, 可發現顆粒較小 (CS-TPP 奈米顆粒未乾燥為 439 nm 及已乾 燥約 200 nm;cs-qt-tpp 奈米顆粒未乾燥約為 760 nm 即以乾燥後約
500 nm) 七 總結 本研究結果皆為奈米級, 且顆粒表面皆帶高度正電荷 以 ph 4.7 之高分子量幾丁聚醣溶液, 與 ph 9.0 之 TPP 溶液, 於 CS/TPP 重量比 3/1 條件下包覆 QT, 製備 CS-QT-TPP 奈米顆粒, 外觀呈球型, 且於模擬胃 腸液中安定性良好 未來可進一步以 Caco-2 細胞試驗與動物試驗, 探討 CS-QT-TPP 奈米顆粒對於促進營養物質或藥物在體內之吸收
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