第 25 卷第 3 期 2015 年 5 月 江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(edicineEdition) Vol.25 No.3 ay2015 弓形虫表面抗原 1 棒状体蛋白 18 真核表达载体的构建与体外表达 吴腊梅 1, 吴婷 1, 吴亮 1, 王晓 1, 苏丹华 1, 刘原 1, 陶思佳 1, 魏逸青 1, 姜旭淦 1, 陈盛霞, 曹建平 (1. 江苏大学医学院, 江苏镇江 212013;2. 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所, 上海 200025) [ 摘要 ] 目的 : 构建刚地弓形虫 (Toxoplasmagondi) 表面抗原 1(surfaceantigen1,SAG1) 及棒状体蛋白 18(rhoptry protein18,rop18) 的真核表达重组质粒, 并在真核细胞中表达目的蛋白 方法 : 设计 SAG1 ROP18 的特异引物, 采用 RCR 技术从弓形虫 RH 株基因组 DNA 中扩增编码 SAG1 ROP18 基因片段, 经克隆至 ptg19 T 载体后, 亚克隆至真核表达载体 p3 FLAG yc CV T 24, 构建真核表达重组质粒 p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 和 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18 将构建好的真核表达重组质粒转染人肾上皮细胞系 293 T 细胞, 分析转染细胞的表达情况 结果 :PCR 扩增弓形虫 SAG1 和 ROP18 基因片段分别为 1011bp 和 1665bp, 与预期大小相符 重组质粒经 PCR 酶切和测序鉴定结果均正确, 通过 RT PCR 和蛋白质印迹技术鉴定出重组质粒 p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 和 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18 在 293 T 细胞中表达 结论 : 成功构建了真核表达质粒 p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 和 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18, 该重组质粒能够在真核细胞中表达目的蛋白 [ 关键词 ] 刚地弓形虫 ;SAG1;ROP18; 真核表达质粒 [ 中图分类号 ] R382.5 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] 1671-7783(2015)03-0246-05 DOI:10.13312/j.isn.1671 7783.y140294 ConstructionandinvitroexpresionofToxoplasmagondi SAG1,ROP18eukaryoticexpresionplasmids WULa mei 1,WUTing 1,WULiang 1,WANGXiao 1,SUDan hua 1,LIUYuan 1,TAOSi jia 1, WEIYi qing 1,JIANGXu gan 1,CHENSheng xia 1,CAOJian ping 2 (1.Schoolofedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013;2.NationalInstituteofParasiticDiseases,ChineseCenterforDisease ControlandPrevention,Shanghai200025,China) [Abstract] Objective:Toconstructtworecombinanteukaryoticexpresionplasmidscontainingthesur faceantigen(sag)1andrhoptryprotein(rop)18geneoftoxoplasmagondi,andexpressag1and ROP18proteinsintheeukaryoticsystem.ethods:ThegenefragmentsencodingSAG1andROP18weream plifiedbypcrwithspecialprimersfrom ToxoplasmagondigenomicDNArespectively,andwereclonedinto ptg19 Tvector.Therightgenefragmentsweresubclonedintop3 FLAG yc CV T 24vectortoconstructthe eukaryoticexpresionplasmidsp3 FLAG yc CV T 24 SAG1andp3 FLAG yc CV T 24 ROP18.The recombinantplasmidsweretransfectedintohumanrenalepithelial293 Tcellinesrespectively,andtheexpres sionofsag1androp18intransfectedcelsweredetectedbyrt PCRandWesternbloting.Results:Thegene fragmentsencodingsag1,rop18were1011bpand1665bprespectively,whichwereconsistantwiththe expectedsize.theanalysisofenzymedigestion,pcrandsequencingshowedthattherecombinanteukary oticexpresionplasmidsp3 FLAG yc CV T 24 SAG1,p3 FLAG yc CV T 24 ROP18werecon structedcorectly.rt PCRandWesternblotinganalysisofcelstransfectedSAG1,ROP18genedisplayed [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 (81301453); 卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室开放课题 (WSBKTKT201302); 中国博士后科学基金资助项目 (2014561598); 江苏省博士后科研资助计划项目 (1402171C); 江苏大学高级人才启动基金资助项目 (13JDG023,13JDG127) [ 作者简介 ] 吴腊梅 (1989 ), 女, 硕士研究生 ; 陈盛霞 ( 通讯作者 ), 教授, 博士生导师,E mail:chensxia@ujs.edu.cn
第 3 期 吴腊梅, 等. 弓形虫表面抗原 1 棒状体蛋白 18 真核表达载体的构建与体外表达 247 positivebands.conclusion:recombinanteukaryoticexpresionplasmidsofsag1,rop18havebeensuc cesfulyconstructed,therecombinantplasmidscanexpressag1,rop18proteinsinaeukaryoticsystem. [Keywords] Toxoplasmagondi;SAG1;ROP18;eukaryoticexpresionplasmid 弓形虫 (Toxoplasmagondi) 是一种专性细胞内寄生虫, 可引起人兽共患弓形虫病 [1] 弓形虫病也是最常见的机会性致病寄生虫病 [2], 肿瘤患者 HIV 以及 AIDS 人群弓形虫抗体阳性率分别高达 63% 44.8% 和 95.0% [3-4] 另有研究表明, 弓形虫可影响患者的智力发育, 与精神分裂症的发生存在联系 [5] 常见的经济家畜如牛 羊和猪等普遍易感弓形虫, 每年由弓形虫感染造成的家畜流产 早产和死胎给畜牧业生产造成了严重的经济损失 [6-7] 猫 狗等宠物也易感染弓形虫, 是人类感染弓形虫的重要传染源 [8-9] 鉴于弓形虫病对人类健康造成的严重危害和对畜牧业生产造成的经济损失, 研制具有免疫保护作用的疫苗成为防治弓形虫病的一种有效手段 速殖子表面抗原 (surfaceantigen,sag)1 是最早被克隆表达的蛋白, 虽然只占虫体总蛋白量的 3% ~5%, 但其诱导机体产生的抗体量占总抗体量的 50%, 说明 SAGl 虽含量甚微, 但为速殖子的主要抗原成分, 是诱导宿主免疫应答的主要靶抗原 棒状体蛋白 (rhoptryprotein,rop)18 定位于纳虫泡中 [10], 是丝氨酸苏氨酸激酶, 是重要的毒力因子 [11] R0P18 可改变其感染的宿主细胞的信号传导, 使感染细胞的基因表达发生变化, 阻止宿主细胞发生凋亡 当弓形虫进入宿主细胞时, 会生成一层保护膜将自身包裹起来,R0P18 的作用则是让宿主细胞的某些蛋白失效而无法破坏这层保护膜 [12] 本研究旨在构建真核表达重组质粒 p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 和 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18, 为弓形虫 DNA 疫苗研制提供一定的基础 1 材料与方法 1.1 虫株 质粒及菌株弓形虫 RH 株速殖子 大肠埃希菌 (E.coli) DH5α 为本实验室保存,pTG19 T 载体购至上海捷瑞生物技术有限公司,p3 FLAG yc CV T 24 真核表达载体由江苏大学医学院龚爱华副教授惠赠 1.2 主要试剂和仪器限制性内切酶 第 1 链 cdna 合成试剂盒 ( 美国 Thermo 公司 ),T 4 DNA 连接酶 Ver.2.0 购于宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司,PCR 预混液 ( 美国 Promega 公司 ),DNA 提取纯化试剂盒 琼脂糖凝胶回收试剂 盒购于上海捷瑞生物技术有限公司,RPI1640 培养液购于赛默飞世尔生物化学制品 ( 北京 ) 有限公司, 胎牛血清和新生牛血清购于杭州四季青公司, 基因转染试剂 Ronfect 购于上海荣柏生物科技有限公司,SAG1 和 ROP18 [13] 多克隆抗体由本实验室制备 CO 2 培养箱 (FormaseriesⅡ, 美国 Thermo 公司 ), 电泳仪 ( 美国 BioRad 公司 ), 冷冻型离心机 ( 德国 Ep pendorf 公司 ) 1.3 虫体的培养及 DNA 的提取 [14] 参考沈进等方法在 HeLa 细胞中传代培养弓形虫 RH 株速殖子 用含 10% 新生牛血清 RPI 1640 培养液培养 HeLa 细胞, 待细胞密度为 70% ~ 80% 时, 更换含 1% 胎牛血清的 RPI1640 培养液并感染虫体, 待虫体涨破细胞后, 收集虫体 参照捷瑞公司基因组 DNA 纯化试剂盒说明书提取弓形虫速殖子基因组 DNA,-20 冻存备用 1.4 SAG1 及 ROP18 基因的体外扩增和克隆根据数据库 ToxoDB 弓形虫基因组中 SAG1 和 ROP18 基因序列设计引物 SAG1 上游引物 P1:5 CCCAAGCTTATGTCGGTTTCGCTGCACC 3, 下游引物 P2:5 CGGAATTCGCCGCGACACAAGCTGCGAT A 3 SAG1PCR 反应条件 :94 预变性 10s;94 变性 5s,60 退火 30s,72 延伸 1min, 共 25 个循环 ;72 延伸 7min ROP18 上游引物 P1:5 GGCAAGCTTATGTTTTCGGTACAGCGGCCACCTCTT A 3, 下游引物 P2:5 GGCGGATCCGCTTCTGTGTG GAGATGTTCCTGCTGTTC 3 ROP18PCR 反应条件 :95 预变性 10s;94 变性 5s,60 退火 90s, 72 延伸 90s, 共 30 个循环 ;72 延伸 10min 1% 琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 产物, 并切胶回收后与 ptg19 T 载体于 16 连接过夜 转化 E.coliDH5α 感受态细胞, 氨苄西林筛选, 阳性克隆接种于 3mL LB 液体培养基中培养过夜 抽提质粒,PCR 酶切鉴定, 阳性克隆送上海尼桑生物科技有限公司测序 1.5 SAG1 及 ROP18 真核表达载体的构建分别扩增阳性克隆菌株和含 p3 FLAG yc CV T 24 的菌株, 碱裂解法抽提并纯化质粒 SAG1 和表达载体 p3 FLAG yc CV T 24 分别用 HindⅢ 和 EcoRⅠ 进行双酶切,ROP18 和表达载体 p3 FLAG yc CV T 24 分别用 BamH Ⅰ 和 Hind
248 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 25 卷 Ⅲ 进行双酶切 1% 琼脂糖凝胶电泳分离酶切后的目的片段和载体并回收, 将酶切后的载体和目的片段进行连接, 转化 E.coliDH5α 感受态细胞 抽提质粒 DNA, 用 PCR 和双酶切鉴定阳性重组质粒 1.6 重组质粒转染人肾上皮细胞系 293 T 细胞采用贴壁细胞的 DNA 转染法, 按非脂质阳离子聚合物 Ronfect T DNA 转染试剂使用说明进行 于转染前 1d, 将 293 T 细胞接种于 6 孔板中, 置于 37 5%CO 2 培养箱中培养, 待细胞密度为 60% ~ 80% 且状态良好时进行转染 在转染前 2h, 吸除细胞原有的培养液, 换为新鲜的含 15% 胎牛血清的 DE 将 2μg 质粒 DNA 用 100μL 无血清 DE 稀释, 充分混匀后制成 DNA 稀释液 向 DNA 稀释液中加入 2μLRonfect T, 轻轻混匀, 室温静置 15~ 30min 后, 将转染复合物加入细胞培养液中, 轻轻混匀 置于 CO 2 培养箱中继续培养 48h 后, 收集细胞, 于 -80 冻存备用 同时转染空质粒 p3 FLAG yc CV T 24 作为阴性对照 1.7 SAG1 ROP18 的体外表达分析 1.7.1 RT PCR 分析 SAG1 ROP18 的表达按 RNA 抽提试剂盒的使用说明提取细胞总 RNA, 溶于 DEPC 处理水中 将 RNA 与 oligo(dt)18 置于 65 反应 15min 后冰浴 30s, 再加入反应缓冲液 RNA 酶抑制剂 dntp 混合物和 LVRT, 轻轻混匀后置于 42 反应 60min,70 灭活 5min, 反转录成 cdna, 直接用于 PCR 分析, 扩增产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 1.7.2 蛋白质印迹分析 SAG1 ROP18 的表达收集转染的 293 T 细胞, 重悬于 20μL2 SDS PAGE 上样缓冲液中,100 水浴煮沸 5min,10000 g 离心 5min, 取上清行 SDS PAGE 电泳 先用 80V 电泳 15min 左右, 待样本被压成一条直线后换成 110 V 电泳结束后, 取下凝胶, 与 PVDF 膜紧贴,150mA 恒流电泳 70min; 转印后的 PVDF 膜经 TBST 洗涤后, 用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 封闭, 室温下作用 30min 将兔多克隆抗体用 5% 脱脂奶粉 1 10 稀释, 于室温孵育 2h,TBST 洗涤 3 次 ; 与 1 5000 稀释的 HRP 标记羊抗兔 IgG 室温孵育 1h,TBST 洗涤 3 次 ; 将膜置于化学发光仪下, 滴加 ECL 显色液观察结果 2 结果 2.1 真核表达载体 p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 的鉴定 2.1.1 SAG1 基因的扩增 PCR 结果显示, 弓形虫 速殖子基因组 DNA 中扩增出 SAG1 的片段, 其长度约 1011bp, 与预期结果一致 ( 图 1) 进一步的测序结果表明,SAG1 的基因序列与基因库已发表的基因序列完全一致, 开放阅读框正确 :DNA 标准参照物 ;1:SAG1 基因 ;2: 阴性对照 图 1 SAG1 基因 PCR 扩增结果 2.1.2 真核表达载体 p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 的鉴定以构建成功的重组质粒 p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 为模板, 特异性 PCR 引物扩增 SAG1, 成功扩增出目的片段, 与预期结果相符 ( 图 2) 该质粒经 HindⅢ 和 EcoRⅠ 双酶切后得到与预期相同的两条条带, 与理论数值完全符合 ( 图 3) :DNA 标准参照物 ;1:p3 FLAG yc CV T 24 SAG1;2: 阴性对照 图 2 重组质粒 p3 FLAG yc CV T 24 SAG1PCR 扩增结果 1 4 800 bp :DNA 标准参照物 ;1:p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 图 3 重组质粒 p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 双酶切电泳结果 2.1.3 p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 体外表达分析分别用转染有 p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 p3 FLAG yc CV T 24 空质粒的 293 T 细胞提取的总 RNA 为模板行 RT PCR 扩增, 结果转染有 p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 的细胞扩增出约 1011bp 左右的条带, 与 SAG1 基因片段长度相符 ( 图 4) 蛋白质印迹结果显示, 只有 p3 FLAG yc
第 3 期 吴腊梅, 等. 弓形虫表面抗原 1 棒状体蛋白 18 真核表达载体的构建与体外表达 249 CV T 24 SAG1 转染的 293 T 细胞有特异性条带, 表明转染 p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 的 293 T 细胞表达了 SAG1( 图 5) :DNA 标准参照物 ;1:p3 FLAG yc CV T 24 ROP18;2: 阴性对照 图 7 重组质粒 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18PCR 扩增结果 :DNA 标准参照物 ;1:p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 转染的 293 T 细胞 ;2:p3 FLAG yc CV T 24 转染的 293 T 细胞图 4 RT PCR 鉴定转染细胞 SAG1 的表达 1 4 800 bp 40 000 35 000 SAG1 1:p3 FLAG yc CV T 24 转染的 293 T 细胞 ;2:p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 转染的 293 T 细胞 图 5 蛋白质印迹鉴定转染细胞 SAG1 的表达 2.2 真核表达质粒 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18 的鉴定 2.2.1 ROP18 基因的扩增从刚地弓形虫基因组 DNA 中扩增 ROP18 的 PCR 结果见图 6 PCR 扩增出 ROP18 的 DNA 片段长度约 1665bp, 与预期结果一致 进一步的测序结果表明,ROP18 基因序列与基因库已发表的基因序列完全一致, 开放阅读框正确 :DNA 标准参照物 ;1:ROP18 基因 ;2: 阴性对照 图 6 ROP18 基因 PCR 扩增结果 2.2.2 真核表达质粒 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18 的鉴定以构建成功的重组质粒 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18 为模板, 特异性 PCR 引物扩增 ROP18, 成功扩增出目的片段, 与预期结果相符 ( 图 7) 真核表达质粒 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18 经 HindⅢ 和 BamH Ⅰ 双酶切之后得到与预期相同的 2 条条带 ( 图 8) :DNA 标准参照物 ;1:p3 FLAG yc CV T 24 ROP18 图 8 重组质粒 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18 双酶切电泳结果 2.2.3 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18 体外表达分析分别用转染有 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18 和 p3 FLAG yc CV T 24 空质粒的 293 T 细胞提取的总 RNA 作模板行 RT PCR 扩增, 只有转染有 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18 的细胞扩增出约 1665bp 左右的条带, 与 ROP18 基因片段长度相符 ( 图 9) 蛋白质印迹结果表明, 只有 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18 转染的 293 T 细胞有特异性条带, 表明转染 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18 的 293 T 细胞表达了 ROP18( 图 10) :DNA 标准参照物 ;1:p3 FLAG yc CV T 24 ROP18 转染的 293 T 细胞 ;2:p3 FLAG yc CV T 24 转染的 293 T 细胞 图 9 RT PCR 鉴定转染细胞 ROP18 的表达 70 000 55 000 ROP18 1:p3 FLAG yc CV T 24 转染的 293 T 细胞 ;2:p3 FLAG yc CV T 24 ROP18 转染的 293 T 细胞 图 10 蛋白质印迹鉴定转染细胞 ROP18 的表达
250 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 25 卷 3 讨论 弓形虫病疫苗研制经历了全虫疫苗 虫体特异组分疫苗 基因工程疫苗和核酸疫苗 4 个阶段, 其中核酸疫苗以其优异性能成为当前弓形虫疫苗研制的热点 核酸疫苗是编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质粒 DNA( 有时也可是 RNA), 其可经一定的途径进入动物体内, 经宿主细胞摄取后, 通过转录和翻译表达出抗原蛋白, 刺激机体产生非特异性和特异性两种免疫应答反应, 从而起到免疫保护作用 速殖子是弓形虫的主要致病阶段, 在侵入细胞的过程中, 可溶性蛋白 SAG1 可以直接结合到宿主细胞表面 速殖子表膜是宿主细胞免疫防御识别和 [15] 杀伤虫体的主要作用部位 占国清等用重组真核表达质粒 PBK P30 肌肉注射免疫 BALB/c 小鼠, [16] 诱导其产生了体液及细胞免疫应答 高世同等 用构建的 pvax1 SAG2 免疫小鼠, 诱导其产生了特异性的 IgG 抗体 ROPs 对弓形虫入侵宿主细胞起重要作用, 目前已知有 30 多种 ROPs 蛋白,Chen [17] 等用构建的 ROP1 基因重组质粒免疫小鼠, 诱导 [18] 其产生了细胞免疫及体液免疫 Wang 等用构建的真核表达质粒 PVAX ROP13 制成 DNA 疫苗, 用肌肉注射的方法免疫小鼠, 小鼠特异性抗体 IgG 水平明显升高, 弓形虫感染后小鼠的存活率显著提高 上述研究结果表明, 弓形虫表面蛋白 SAG ROPs 对于弓形虫感染具有良好的免疫保护作用, 是研制弓形虫核酸疫苗有力的候选基因 本研究采用的真核表达载体 p3 FLAG yc CV T 24 含有人巨细胞病毒 (CV) 高效启动子 / 增强子序列, 是能够使外源基因在哺乳动物细胞内高效表达的良好载体, 常用于构建核酸疫苗 本研究用基因工程的方法, 将弓形虫 SAG1 ROP18 基因分别连接至真核表达载体, 成功构建了真核表达质粒 p3 FLAG yc CV T 24 SAG1 和 p3 FLAG yc CV T 24 ROP18, 为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础 [ 参考文献 ] [1] BlackW,BoothroydC.LyticcycleofToxoplasma gondi[j].icrobiololbiolrev,2000,64(3):607-623. [2] DubeyJP.AdvancesinthelifecycleofToxoplasma gondi[j]. IntJParasitol, 1998, 28(7): 1019-1024. [3] YazarS,YamanO,EserB,etal.Investigationofanti Toxoplasmagondiantibodiesinpatientswithneoplasia [J]. Jed icrobiol, 2004, 53(Pt12): 1183-1186. [4] NisapatornV,LeeC,QuekKF,etal.Toxoplasmosis inhiv/aidspatients:acurentsituation[j].jpnjin fectdis,2004,57(4):160-165. [5] FlegrJ,Preis,KloseJ,etal.Decreasedlevelof psychobiologicalfactornoveltyseekingandlowerinteli genceinmenlatentlyinfectedwiththeprotozoanparasite ToxoplasmagondiDopamine,amisinglinkbetween schizophreniaand toxoplasmosis[j]. BiolPsychol, 2003,63(3):253-268. [6] DubeyJP.Statusoftoxoplasmosisinsheepandgoatsin theunitedstates[j].jamvetedasoc,1990,196 (2):259-262. [7] BuxtonD. Protozoaninfections(Toxoplasma gondi, Neosporacaninum andsarcocystisspp.)insheepand goats:recentadvances[j].vetres,1998,29(3/4): 289-310. [8] EtheredgeGD,ichaelG,uehlenbeinP,etal. TherolesofcatsanddogsinthetransmisionofToxo plasmainfectioninkunaandemberachildrenineastern Panama[J].RevPanamSaludPublica,2004,16(3): 176-186. [9] Smielewska Los'E,PacońJ.Toxoplasmagondiinfec tionofcatsinepizootiologicalandclinicalaspects[j]. PolJVetSci,2002,5(4):227-230. [10] SinaiAP. ThetoxoplasmakinaseROP18: anactive memberofadegeneratefamily[j].plospathog,2007, 3(2):e16. [11] SaeijJP,BoyleJP,ColerS,etal.Polymorphicsecre tedkinasesarekeyvirulencefactorsintoxoplasmosis [J].Science,2006,314(5806):1780-1783. [12] FentresSJ,BehnkeS,DunayIR,etal.Phosphoryl ationofimmunity relatedgtpasesbyatoxoplasmagon di secretedkinasepromotesmacrophagesurvivaland virulence[j].celhosticrobe,2010,8(6):484-495. [13] 鞠爱萍, 吴亮, 沈进, 等. 弓形虫棒状体蛋白 18 的原核表达及鉴定 [J]. 江苏大学学报 : 医学版,2013,23 (3):207-211. [14] 沈进, 陈颖婷, 吴亮, 等. 弓形虫速殖子感染对 HeLa 细胞凋亡的影响 [J]. 江苏大学学报 : 医学版,2014, 24(5):399-402,407. ( 下转第 255 页 )
第 3 期 刘原, 等. 弓形虫棒状体蛋白 16 的原核表达及多克隆抗体制备 255 致 [11,16], 可能是制备的多抗特异性没有单抗强 下一步我们将构建带有 yc 标签的 ROP16 突变株, 用 yc 单抗来检测 ROP16 蛋白在宿主细胞核内的分布 [ 参考文献 ] [1] ZhaoY,FergusonDJ,WilsonDC,etal.VirulentTox oplasmagondievadeimmunity relatedgtpase mediated parasitevacuoledisruptionwithinprimedmacrophages [J].JImmunol,2009,182(6):3775-3781. [2] GilbertLA,RavindranS,TuretzkyJ,etal.Toxoplas magonditargetsaproteinphosphatase2ctothenuclei ofinfectedhostcels[j].eukaryotcel,2007,6(1): 73-83. [3] 赵桂华, 尹淑霞, 尹昆. 弓形虫棒状体蛋白与宿主细胞互作的研究进展 [J]. 中国血吸虫病防治杂志, 2014,26(4):453-456. [4] 郑斌, 陆绍红. 刚地弓形虫免疫逃避相关分子的研究进展 [J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2012,30 (5):396-400. [5] 吴亮, 章秋霞, 李婷婷, 等. 人包皮成纤维细胞和人子宫颈癌细胞体外培养弓形虫速殖子 [J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2009,27(3):229-231. [6] 鞠爱萍, 吴亮, 沈进, 等. 弓形虫棒状体蛋白 18 的原核表达及鉴定 [J]. 江苏大学学报 : 医学版,2013, 23(3):207-211. [7] LimDC,CookeB,DoerigC,etal.Toxoplasmaand Plasmodiumproteinkinases:rolesininvasionandhost celremodeling[j].intjparasitol,2012,42(1):21-32. [8] ReichmannG,DlugonskaH,FischerHG.Characteriza tionoftgrop9(p36),anovelrhoptryproteinoftoxo plasmagonditachyzoitesidentifiedbytcelclone[j]. olbiochemparasitol,2002,119(1):43-54. [9] ButzowR,AlfthanH,StenmanUH,etal.Immunoflu orometricdemonstrationandquantificationofplacental protein5intheabsenceofpregnancy[j].clinchem, 1988,34(8):1591-1593. [10] DubremetzJF.RhoptriesaremajorplayersinToxoplas magondiinvasionandhostcelinteraction[j].cel icrobiol,2007,9(4):841-848. [11] SaeijJP,ColerS,BoyleJP,etal.Toxoplasmaco opts hostgeneexpresionbyinjectionofapolymorphickinase homologue[j].nature,2007,445(7125):324-327. [12] CaruthersV,BoothroydJC.Pulingtogether:aninte gratedmodeloftoxoplasmacelinvasion[j].curopin icrobiol,2007,10(1):83-89. [13] 高慎阳, 查恩辉, 王糰, 等. 一种 高性价比 切胶纯化原核表达蛋白的方法 [J]. 中国农学通报,2010, 26(22):24-26. [14] 于在江, 马学恩, 周建华. 切胶纯化表达蛋白包涵体的可行性分析 [J]. 生物技术,2007,17(3):46-48. [15] 姜静, 孙其飞, 陈勇, 等. 切胶免疫制备腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体 [J]. 北京口腔医学,2007,15 (5):254-256. [16] BradleyPJ,WardC,ChengSJ,etal.Proteomicanaly sisofrhoptryorganelesrevealsmanynovelconstituents forhost parasiteinteractionsintoxoplasmagondi[j].j BiolChem,2005,280(40):34245-34258. [ 收稿日期 ] 2014-11-15 [ 编辑 ] 陈海林 ( 上接第 250 页 ) [15] 占国清, 吴少庭, 李国光, 等. 弓形虫表面抗原 P30DNA 疫苗免疫小鼠诱导细胞免疫应答的研究 [J]. 中国寄生虫病防治杂志,2001,14(4):257-259. [16] 高世同, 吴少庭, 龙彩虹, 等. 弓形虫 pvax1 SAG2 真核表达质粒的构建及其诱导的小鼠免疫应答 [J]. 中国人兽共患病杂志,2004,20(8):658-661. [17] ChenG,GuoH,LuF,etal.Constructionofarecombi nantplasmidharbouringtherhoptryprotein1geneof ToxoplasmagondiandpreliminaryobservationsonDNA immunity[j].chinedj(engl),2001,114(8): 837-840. [18] WangPY,YuanZG,PetersenE,etal.Protectiveefi cacyofatoxoplasmagondirhoptryprotein13plasmid DNA vaccinein mice[j]. Clin Vaccine Immunol, 2012,19(12):1916-1920. [ 收稿日期 ] 2014-11-17 [ 编辑 ] 刘星星