接種 (inoculation) 及再分離 (reisolation) 人為接種主要目的為 (1) 測試疑似病原之病原性 test the pathogenicity of potential causal agent; (2) 評估作物抗病性 evaluate cultivars, lines, or selections for pathogen resistance; (3) 篩選供試菌 screen pathogen isolates for physiological specialization 在人為控制的環境條件下有些物體(agents) 會造成植物損傷 (induce leisons), 是自然界不曾出現的, 例如將高濃度的細菌接種在原本不是寄主的植物體內, 也會誘發植物損傷, 這是因為植物產生過敏性反應 (hypersensitive response), 不過過病徵出現快且侷限, 但仍易與病斑混淆 人為接種一般採取強勢接種, 也就是多採用高接種源濃度及最適發病環境條件, 故測試抗感病性時, 對於全抗與否的垂直式抗病 (Vertical resistance) 無影響, 但對於僅存有部分抗性的水平式抗病 (horizontal resistance) 則有影響, 應將接種源濃度及發病環境調整到適當, 並具有可重複性再分離 (resiolation) 為柯霍式假說的第四步驟, 以再確認病因為原則, 尤其在病因尚未明確之前, 此步驟不可忽略 接種出現病徵後, 應儘快再分離, 不可待寄主嚴重發病甚至枯死, 以致原接種之病原菌被其他腐生菌污染而無法再分離得 一 影響接種之因素 (Factors influencing disease establishment) 接種源之質與量會影響寄主植物的反應, 接種地上部或造成萎凋的病原菌一般採用孢子而少用菌絲, 且應注意最低的接種源量及接種源的活力, 以確保病害發生, 通常接種源量高則病徵出現快, 有時接種源添加養分可促進病害發生, 如胡瓜接種 Cladosporium cucumerinum 時, 孢子懸浮液添加 1%Czapek-Dox 養液較純粹無菌水易促進孢子發芽及病害發生 ; 接種白粉病菌 Podosphaera xanthii 通常用培養於葉片 20-24 10-14 天之分生孢子 接種培養條件亦是決定接種的品質, 如溫度 濕度 游離水 光照 等, 或寄主植物的養分條件 一般接種時需要高濕 ( 甚至保持有游離水 ), 如接種後 24-48 小時, 已接種之寄主植物需密封保濕, 但白粉病除外 二 根部接種 (Root inoculation) 病原菌與土壤中的微生物有互動 (interaction), 這些互動可能是促進 23
(stimulatory) 抑制(inhibitory) 或無關 (neutral) 於病害的發生, 但也是較符合自然界的現象, 故未確定其病原性前, 應將土壤 ( 或介質 ) 滅菌以使柯霍氏法試驗單純化, 待証明病原性後, 爾後的試驗才使用自然土 接種時注意溫度 土壤含水量 (water moisture, %) 或水潛勢 (water potential, -bar), 亦注意供試寄主植物的株齡 1. 土壤混菌 (soil infestation) 土壤 砂 泥炭土或其他易使接種試驗順利的介質, 滅菌或不滅菌, 土壤混菌均勻 ( 使用人工或機器 ), 最好應能定量, 如 5 10 2 spore/g soil 供爾後能重複相同的試驗, 然而菌絲塊不易定量 2. 水耕法 (hydroponic method) 先催芽育苗後, 移植於利用營養液提供植株生長的水耕系統, 將接種源加入養液中 圖 利用養液加入分生孢子測定萎凋病菌 Fusarium oxysporum f. sp. pisi race 5 對豌豆之病原性 (pathogenicity) (Dhingra 1995) 3. 浸根法 (root-dip method) 供試寄主植物之根浸漬孢子懸浮液 1-24 小時, 取出植株移植於土壤或介質中種植, 若浸漬 24 小時取出時可考慮根部須不須要表面消毒 在進行維 24
管束病原菌之接種時時, 亦可利用剪根再浸菌液接種 (cut and dip method), 根部浸漬的時間半分鐘至十數分鐘即可 圖 亞克力箱內進行浸根接種 (Dhingra 1995) 4. 刺根法 (root stabbing method) 接種維管束病原菌用 植株種植於介質, 刀插含根之介質, 倒入孢子懸浮液以接種, 接種前數天勿澆水, 以利介質吸附較多的孢子懸浮液 5. 大型木質根接種法 (inoculation of large woody roots) 根挖凹口, 置入接種源, 封住接種部位, 以防土壤中的微生物干擾 圖 大型木質根接種 (Dhingra 1995) 6. 不干擾根的接種法 (root noculation without disturbing the roots) 可預埋接種管 直接倒入接種源 接種源預先埋入栽培介質下方 根未受人為的干擾, 較接近自然環境 25
圖 預埋接種管 ( 左圖 ) 或預埋接種源 ( 右圖 ) (Dhingra 1995) 7. in vitro method 可觀察病原菌如何感染根的接種法 圖 可觀察病原菌如何感染根的接種法 (Dhingra 1995) 三 莖部接種 (Stem inoculation) 多數接種前會製造傷口, 並可將接種源塞入傷口內 ( 可利用打孔器打孔再塞入接源, 再栓上原來的莖部組織 ), 最好接種後以膠帶或棉花封住接種處, 可 26
增加成功機會 須注意接種的部位, 如 Macrophomina phaseolina 通常感染子葉下方的莖節部位 接種維管束病原菌可以注射法將接種源 ( 孢子或細菌懸浮液 ) 直接注入莖內, 若草本植物亦可簡單以牙籤沾菌刺傷莖部接種 木本植物可以管柱圍莖幹, 再置入接種源 圖 木質莖幹接種圖示 (Dhingra 1995) 四 葉部接種 (Leaf inoculation) 孢子懸浮液噴佈, 可添加展著劑 ( 如 0.1-0.5% 之 Tween 20 或 Tween 80 ), 但須確定不會影響孢子發芽及侵入 ; 接種後大多需要保濕, 可密封 24 小時 ( 或更久 ), 再拆封, 通常會設計可將接種植物保濕的濕箱 (moist chamber) 葉部接種一般以孢子懸浮液接種較佳 ( 較不推薦菌絲塊 ), 但也有例外, 如甜瓜白粉病菌 Podosphaera xanthii 以孢子懸浮液接種會降低發病, 需利用乾孢子, 或乾孢子堆以滑石粉等粉狀物協助噴佈, 或用毛筆沾菌接種 亦可用最簡單的直接病葉接觸, 或棉花沾菌液直接貼上葉片, 甚至同一葉片可貼上多處 圖 同一片葉片接種多處理之菌 (Dhingra 1995) 27
圖 葉浸孢子懸浮液 ( 左圖 ) 及病葉接觸法 ( 右圖 ) (Dhingra 1995) 五 種子接種及果實接種 (Seed or fruit inoculation) 最簡單的種子接種方式是將種子沾附孢子或菌絲片段, 再種植於滅菌介質中, 或種子於水瓊脂上發芽, 水瓊脂放上菌塊 ; 而種子應注意表面消毒 果實表面消毒後, 表皮經傷口或無傷口處理, 再接種孢子或細菌懸浮液 六 田間接種 (Field inoculation) 一般要証明微生物之病原性於田間接種較不適宜, 因為環境因素難以控制, 但要確定作物抗病性, 仍以田間接種較可靠, 通常使用的接種源多半培養於植物組織, 如果實或葉片, 再置於田間自然感染 如田間接種胡瓜疫病菌, 通常以胡瓜果實培養疫病菌, 置於田間畦上種植胡瓜之畦溝內, 經由灌溉水將孢子傳播 ; 水稻稻熱病則以病葉置於塑膠布隧道內, 隨風傳播 圖 利用病葉為接種源於田間測試水稻品種對稻熱病抗感性 28
七 接種源之定量只是初步測定其病原性 (pathogenicity), 則以大量接種源強勢接種, 若要測試發病程度區分, 則接種源應定量 真菌孢子懸浮液多使用血球計數器 (Hemocytometer) 量測孢子數, 細菌則多用分光光度計 (spectrophotometer) 1 mm 1 mm 圖 以血球計數器 (Hemocytometer) 量測孢子數上述接種法若只是初步測定其病原性 (pathogenicity), 先以強勢接種篩掉不造成病徵的菌株, 強勢接種下有造成病徵的菌, 並不能保証是病原菌, 但不造成病徴幾乎可認定為非病原菌, 留下造成發病的菌株再進行較接近自然狀況下的接種條件, 儘量模擬自然環境 菌株的生物特性及寄主感染部位來進行接種試驗, 以自然狀況下造成病害的接種法可靠性較高 注意對照組的設立 本實習中, 胡瓜接種腐霉菌 Pythium aphanidermatum 是採用直接倒入接種源 ( 不干擾根 ), 而胡瓜接種鐮孢菌 Fusarium oxysproum f. sp. cucumerinum 採用剪根再浸菌液接種 (cut and dip method) 或刺根法 (root stabbing method), 而白菜接種炭疽病菌 Colletotrichum higginsianum 採用孢子懸浮液噴霧法 ( 可區分傷口之有無 ) 29
各組實習材料可能是下列病害其中的一種病害 : 水稻紋枯病 (Rhizoctonia solani) 分離 : 組織分離法或以菌核分離之分離用培養基 :water agar 培養及保存用培養基 :PDA 接種法 : 菌絲塊接種法 (a) 由純粹培養的菌落, 切取適當大小之菌絲塊, 置入水稻葉鞘內 (b) 水稻植株套以大型塑膠袋, 保持高濕度 1-2 天 (c) 連續觀察 1-2 週, 並記錄病徵 (d) 以未接種菌源之培養基塊為對照 水稻白葉枯病 (Xanthomonas campestri pv. oryzae) 分離法 : 劃線平板法或稀釋平板法分離用培養基 :NA 或 PDA 接種法 : 剪葉接種法 (a) 挑起純粹培養之菌落至無菌水, 形成懸浮液 ( 略成混濁狀 ) (b) 以滅菌的剪刀沾細菌懸浮液 (c) 剪下部分水稻葉片 (d) 水稻植株套以大型塑膠袋, 保持高濕度 1-2 天 (e) 連續觀察 1-2 週, 並記錄病徵 (f) 以無菌剪刀沾無菌水剪葉以為對照 蕃茄青枯病 (Pseudomonsa solanacearum) 分離法 : 劃線平板法或稀釋平板法 分離用培養基 :NA 或 TCC medium 培養用培養基 :NA 或 523 mrdium 保存用培養基 :NA 或無菌水 30
接種法 : 剪根浸液接種法 (a) 取蕃茄幼苗, 洗淨培養基質 ( 蛭石或泥炭土 ) (b) 以滅菌剪刀剪去根部尖端 (c) 幼苗浸入無菌水配製之細菌懸浮液 1hr (d) 將幼苗植入土盆中, 連續觀察病徵 1-4 週並記錄之 (e) 以無菌水浸剪根幼苗為對照 蕃茄幼苗疫病 (Phytophthora capsici) 分離法 : 組織分離法或誘釣法分離用培養基 :WA 或 Ko s medium 培養 ( 產孢 ) 用培養基 :V-8 medium 或無菌水接種法 : 菌絲塊接種法 (a) 取培養於 CV8 瓊脂的菌絲塊 (b) 用膠帶將菌絲塊黏於蕃茄幼苗之莖部 ( 菌絲面與組織接觸 ) (c) 套上塑膠袋以保持高濕度 1-2 天 (d) 連續觀察病徵 1-2 週, 並記錄病徵 蕃茄萎凋病 (Fuasrium oxysporum f. sp. lycopersici) 分離法 : 組織分離法 ( 取維管束變色部位 ) 分離用培養基 :WA 或 PCNB medium 培養 ( 產孢 ) 用培養基 :PDB(potato dextrose broth):pda 不含 agar 即是 PDB Fuasrium oxysporum f. sp. lycopersici 於 PDB 中震盪培養 3-5 天, 即可產生大量小孢子 保存用培養基 :PDA 接種法 : 浸根法 (root dip method) (a) PDA 培養病原菌 7-14 天 (b) 以無菌水洗下分生孢子並計量 31
(c) 以無菌水懸浮孢子成懸浮液 (d) 拔取蕃茄幼苗 ( 造成根部傷口 ) (e) 浸入孢子懸浮液數分鐘 (f) 將幼苗植入土盆中, 並將孢子懸浮液倒入土盆內 (g) 連續觀察 l-4 週, 並記錄病徵 (h) 以無菌水取代孢子懸浮液為對照 蕃茄早疫病 (Alternaria solani) 分離法 : 組織分離或稀釋平板法分離用培養基 :WA 培養 ( 產孢 ) 用培養基 :V-8 medium 或 PDA 接種法 : 噴霧法 (a) 以無菌水配製孢子懸浮液 ( 含 0.5% Tween-80 展著劑, 有助於孢子懸浮 ) (b) 以噴霧器將孢子噴於葉面上 (c) 套袋保持高溼 1-2 天 (d) 連續觀察 1-4 週, 並記錄之 (e) 以無菌水 ( 含 0.5% Tween-80 展著劑 ) 取代孢子懸浮液為對照 十字花科蔬菜黑斑病 (Alternaria brassicicola) 分離法 : 組織分離法或稀釋平板法分離用培養基 :WA 培養 ( 產孢 ) 用培養基 :V-8 medium 保存用培養基 :V-8 或 PDA 接種法 : 噴霧接種法同蕃茄早疫病 十字花科蔬菜軟腐病 (Erwinia carotovora subsp. carotovora) 32
分離法 : 劃線平板法或稀釋平板法分離用培養基 :NA PDA 或 CVP selective medium 培養用培養基 :NA 或 YDC medium 保存用培養基 :NA YDC 或無菌水接種法 : 穿刺法或注射法注射法 : (a) 以滅菌注射筒將細菌懸浮液注入表面消毒的葉柄內 (b) 套袋保持高溫 1 天 (c) 觀察 1-3 天, 記錄病徵後再分離 (d) 以無菌水取代細菌懸浮液為對照 胡瓜猝倒病 (Pythium aphanidermatum) 分離法 : 組織分離法或誘釣法 ( 分離時勿用 chlorox 表面消毒, 僅以無菌水漂洗即可 分離用培養基 :WA 茄子或黃瓜保存用培養基 :PDA 或無菌水接種法 : 土壤接種法 (a) 培養於 CV8 瓊脂之菌絲塊, 或製成游走子懸浮液 (b) 胡瓜催芽育苗 (c) 將接種源直接倒入幼苗介質內 ( 或分缽置於方盆中盛水倒入游走子懸浮液 ) (d) 連續觀察 1-2 週, 並記錄病徵 (e) 以未接種菌源之 CV8 瓊脂為對照 胡瓜炭疽病 (Colletotrichum lagenarium) 分離法 : 組織分離法 分離用培養基 :PDA 33
保存用培養基 :PDA 接種法 : 噴霧法 ( 同蕃茄早疫病和十字花科蔬菜黑斑病 ) 玉米鏽病 (Puccinia maydis f. sp. polysora) 分離法 : (a) 準備玉米幼苗數棵 (b) 葉面以了 70% 酒精消毒後, 以無菌水擦拭數次 ( 動作宜輕柔, 不要在葉面造成壞疽現像 ) (c) 以毛筆沾病斑上的夏孢子堆 (d) 在消毒的葉面上來回刷數次 (e) 套袋保持高濕 1-2 天 (f) 待葉片上出現夏孢子堆後, 重複上述步驟 1-2 (g) 分離時亦可改用離葉法 (detached leaves method) 取代全株植物進行 即切取玉米葉片, 表面消毒後置入滅菌的溫室 (moist chamber) 中, 再接上述步驟 3 分離 培養 ( 產孢 ) 保存均使用玉米葉片( 全株或葉 ) 接種法 : 同分離法, 以毛筆沾無菌水為對照, 但實驗組與對照組要隔離, 避免夏孢子掉落於對照組上引起病徵 柑桔綠黴病 (Penicillium digitatum) 分離法 : 劃線平板法或稀釋平板法 分離用培養基 :WA 培養 ( 產孢 ) 培養基 :PDA 保存用培養基 :PDA 接種法 : (a) 柑拮表面消毒後, 陰乾 (b) 滅菌的牙籤或移殖針, 在部份柑桔上穿剌造成傷口, 另一部份柑桔則不造成傷口 34
(c) 以棉花或毛筆沾取無菌水配製的孢子懸浮液, 塗抹於柑桔表面和傷口上 (d) 套袋保持高溫 1-2 天 (e) 連續觀察病徵 1-2 週, 並記錄之 (f) 以無菌水為對照 注意事項 : (1) 上述 1-14 項病害, 完成柯霍氏法則所需時間, 短者 2 週, 長者 8 週, 各分組應在學期結束前完成, 請盡早抽空完成之 (2) 各組所分離之病原菌, 接種之病徵及再分離的病原菌均應於報告中詳細描述或繪圖, 並於期末繳交報告時, 隨報告繳交病原菌菌株 (3) 細菌培養日久將會死亡或病原性降低, 因此接種前應先行移殖, 以新鮮菌落接種 (4) 用於接種的健株株齡會影響接種的成功與否 一般而言, 幼苗較成株感病 (5) 接種源濃度亦影響接種的成功與否 若接種失敗, 可考慮提高接種源濃度 (6) 接種部位與使用方法亦影響接種效率 一般而言, 接種部位與用以分離病原的組織部位相同 ( 萎凋病除外 ) 接種方法可用上述提供之法, 亦可參考 Dhingra and Sinclair. 1985. Basic plant pathology method. CRC Press. 書中第五章 (7) 環境因子亦會影響接種的效率 一取而言, 高濕度有助於病原菌之侵入, 套袋可達此效果 但套袋不宜過久, 且不應完全密閉造成缺氧狀況 高溫亦有助於發病, 由於本學期結束前, 氣候將逐漸轉涼, 建議你越快完成本實驗越好 (8) 實驗結束後, 各組繕交報告一份, 其內容應包括 : (a) 病徵描述與繪圖 : 文字描述病徵並繪彩圖 ( 或病徵相片 ) (b) 病原菌描述與採繪圖 : 文字描述病原菌特徵並繪圖 (c) 分離方法及材料 : 詳述分離步驟及材料之配製 (d) 接種方法 : 詳述接種方法 35
(e) 病徵記綠 : 逐日記錄病徵之表現, 描述並繪彩圖 ( 或附彩色照片 ) (f) 再分離之病原菌描述與繪圖 : 同 (b) 並與原先分離之菌株比較 (g) 討論 : 檢討實驗過程中發生之問題, 並說明其可能原因 (h) 參考文獻 36