采用安捷伦三重四极杆液质联用系统对动物源食品中氯霉素类药物残留进行分析 应用简报 食品检测和农业 作者李建中 马鑫 薄涛 安蓉 张之旭 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司 摘要 本文采用 Agilent 9 Infinity 液相色谱系统 /69 三重四极杆液质联用系统建立了氯霉素 氟苯尼考 甲砜霉素和琥珀氯霉素的分析方法 动物源性样品 ( 肌肉 内脏 蜂产品 水产品 乳制品等 ) 经过提取后, 采用薄壳型填料反相 C8 色谱柱 Agilent Poroshell EC-C8 色谱柱分离, 经配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子源的安捷伦三重四极杆液质联用系统在负离子模式下监测 该方法氯霉素在.- ng/ml 和其他化合物在 - ng/ml 浓度范围内线性相关性良好, 相关系数 R.998; 在. µg/kg( 氯霉素 ) 和 µg/kg( 其他化合物 ) 添加浓度下, 各化合物峰面积 RSD 在.6%-.7% 之间 ; 定量下限氯霉素达到. µg/kg, 其他化合物达到. µg/kg 通过对方法灵敏度 精密度和线性范围等方法学参数进行考察, 得到所建立的方法能在 min 内对 种氯霉素类药物完成快速 高灵敏度的检测分析, 同时采用同位素内标法进行定量测定, 完全满足法规监测要求 前言 氯霉素 (Chloramphenicol, CAP) 是一种人工合成的广谱抗生素, 能引起人的再生障碍性贫血 粒状白细胞缺乏症 新生儿灰色综合症等疾病, 尤其是氯霉素的低浓度药物残留会诱发致病菌的耐药性 氯霉素的残留不但对人体造成危害, 而且严重影响我国动物性食品的出口 3 年欧盟规定牛奶 肉 蛋 水产品 蜂蜜等食品中氯霉素残留检测的最低极限值 (MRPL) 为.3 µg/kg
氯霉素类药物的检测方法目前有 GC/MS 法 LC/MS 法和酶联免疫法等 近年来, 随着液质联用系统和相关技术的快速普及以及对此类禁用药物越来越苛刻的检测限要求, LC/QQQ 技术因其灵敏度高 无需衍生化等特点, 已成为动物源性食品中氯霉素类药物残留量的主要检测确证技术手段 [-3], 被广泛应用于监督监管 目前国内检测氯霉素类药物的主要参照标准包括 : GB/T 76-6 可食动物肌肉 肝脏和水产品中氯霉素 甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱 - 串联质谱法 农业部 78 号公告 --6 动物源食品中氯霉素残留量的测定高效液相色谱 - 串联质谱法 和 SN/T 86-7 进出口动物源食品中氯霉素残留量的检测方法液相色谱 - 串联质谱法 等 [-] 由于氯霉素类药物属于禁用类药物, 其检出为 零允许量 (Zero tolerance), 考虑到 LC/QQQ 检测灵敏度能力, 氯霉素最低检测限为. µg/kg 针对此类禁用性药物的严格及苛刻的监测需求, 本文采用 Agilent 9 Infinity 液相色谱系统 /69 三重四极杆液质联用系统建立了快速检测 种氯霉素类药物的确证定量方法 该方法可以满足动物肌肉 内脏 水产品 蜂产品 乳制品 饲料等动物源性食品中氯霉素类药物残留量的监测 实验部分 试剂与化学品所有试剂和化学品均为色谱纯级或者分析纯级 甲醇 乙腈 正己烷和乙酸乙酯购自德国默克 (MERCK) 所用实验用水为 Millipore Milli-Q 超纯水系统现制备的高纯去离子水 氯霉素类药物标准品及同位素内标 (D-Cap) 购自德国奥格斯堡 (Dr. Ehrenstorfer) 所有标准品用甲醇配制为 mg/ml 储备液, 储存在 - C 冰箱内 ( 有效期 年左右 ) 用乙腈 : 水 (:) 配制混合工作液, 储存在 C 下 ( 有效期 个月左右 ) 仪器配置实验采用 Agilent 9 Infinity 液相色谱系统进行分离, 其由下列部件组成 : Agilent 9 Infinity 二元泵 (GA) Agilent 9 Infinity 标准自动进样器 (G6A) Agilent 9 Infinity 自动进样器冷却器 (G33B) Agilent 9 Infinity 柱温箱 (G36C) 采用配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子源的 Agilent 69 三重四极杆液质联用系统, 在正离子模式下进行检测 采用 Agilent MassHunter 工作站软件 (B.7 或以上版本 ) 进行数据采集 定性和定量分析 样品前处理称取 g 均质后的样品 ( 精确至. g) 于 ml 聚四氟乙烯离心管中, 用 ml 乙酸乙酯分两次提取, 振荡 3 min, 转 /min 离心 min, 合并提取液, 于 C 水浴旋转蒸发近干 残余物用 ml % 氯化钠溶液转移至离心管中, 分两次每次加入 ml 正己烷进行液 - 液分配去脂肪 水相用 ml 乙酸乙酯分两次提取, 合并提取液, 于 C 水浴旋转蒸发至干 SPE-C8 柱依次用 3 ml 甲醇和 3 ml 水活化, 用 ml % 甲醇水溶液溶解残渣全部转移至固相萃取柱, 用 ml 甲醇洗脱, 收集滤液, 氮气下吹干, 残留物用 ml 流动相溶解, 过滤膜或高速离心后上机测定
液相色谱条件 色谱柱 : Agilent Poroshell EC-C8 3. x mm,.7 µm 柱温 : C 进样量 : µl 自动进样器温度 : C 流动相 : A) 水 B) 乙腈 流速 :. ml/min 梯度程序 : 时间 B% 3. 3. 6. 98 8. 98 停止时间 : 8 min 后运行时间 : min 质谱条件 离子模式 : 负离子 干燥气温度 : C 干燥气流量 : L/min 鞘气温度 : 37 C 鞘气流量 : L/min 雾化器压力 : 3 psi 毛细管电压 : 3 V 喷嘴电压 : V EMV: V MS 和 MS 分辨率 : Unit MRM 参数 : 如表 所示 表. 化合物 MRM 参数列表 化合物 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 7 碎裂电压 (V) 碰撞能量 (V) 碰撞池加速器电压 (V) 保留时间 (min) 氯霉素 3 38 (Chloramphenicol) 3. D -Cap 36 7 38 3. 氟苯尼考 336 36 38 (Florfenicol) 8 3.7 甲砜霉素 9 6 3 38 (Thiamphnicol) 8 3 3.3 琥珀氯霉素 3 8 38 (Chloramphenicol Succinate) 3 6.76 结果与讨论 本文采用含有薄壳型填料颗粒的 Poroshell EC-C8 色谱柱对氯霉素类药物进行了有效的色谱分离, 此填料 (.7 µm) 和规格 (3. x mm) 的色谱柱具有较高的分离柱效和柱载量, 同时具有较低的色谱压力, 非常适合分析动物源样品基质中的药物残留 采用 Poroshell EC-C8 色谱柱分析氯霉素类药物混合工作液所得 MRM 色谱图如图 所示 3
甲砜霉素 (Thiamphnicol) (3. -> 8.) x 3 3. x 3 甲砜霉素 (Thiamphnicol) (3. -> 9.) 3.. x 3 氟苯尼考 (Florfenicol) (36. -> 8.).7 x 3 氟苯尼考 (Florfenicol) (36. -> 336.).73. x 3 氯霉素 (Chloramphenicol) (3. ->.).3 x 3 氯霉素 (Chloramphenicol) (3. -> 7.).3 x 琥珀氯霉素 (Chloramphenicol Succinate) (. ->.) 6.73 x 3 琥珀氯霉素 (Chloramphenicol Succinate) (. -> 3.) 6.7..6..8..6 3 3. 3.8..6..8 6. 6.6 7 响应 vs. 采集时间 (min) 图.. ng/ml 氯霉素及 ng/ml 氟苯尼考 / 甲砜霉素 / 琥珀氯霉素的混合工作液的 MRM 色谱图 69 三重四极杆液质联用系统可充分满足对此类药物的检测要求, 在 MRM 方法列表中给出了 69 的碎裂电压 (Fragmentor) 参考值 69 具有新型的预四极杆离子传输聚焦技术 弯曲锥形碰撞池及高能电子倍增管检测器设计, 可以大大提高离子的聚焦传输, 产生更有效的离子碎片及更多的离子 / 电子转化率, 从而大大提高了灵敏度 稳定性及抗污染能力 氯霉素在.- ng/ml 及其他化合物在 - ng/ml 的浓度范围内测试了其定量线性 如图 所示, 所有化合物在此浓度范围内具有良好的线性相关性, 相关系数 R 均大于.998 响应 响应 氯霉素 (Chloramphenicol) x 6 y = 979.78339 * x - 6.39.8 R^ =.999669.6...8.6.. x 7 6 3 3 6 7 8 9 甲砜霉素 (Thiamphnicol) y = 7778.897 * x - 66.637 R^ =.99869 响应响应 氟苯尼考 (Florfenicol) x 6 y = 973.6 * x - 8336. R^ =.99968... x 6 3 3 6 7 8 9 琥珀氯霉素 (Chloramphenicol Succinate) y = 63.868 * x - 39.876 R^ =.998763 3 6 7 8 9 3 6 7 8 9 图. 氯霉素标准曲线 (.- ng/ml) 和氟苯尼考 / 甲砜霉素 / 琥珀氯霉素标准曲线 (- ng/ml)
在鸡肉基质提取液中添加混合工作液, 从而获得氯霉素. µg/kg 和其他化合物 µg/kg 的基质加标样品, 连续进样 针测试稳定性 如图 3 所示, 种化合物在基质低浓度添 加下峰面积 RSD 在.6%-.7% 之间, 完全满足测试的稳定性 要求 x.9.8.7.6...3....6..8..6 3 3. 3.8..6..8 6. 6.6 7 响应 vs. 采集时间 (min) 图 3. 鸡肉基质中添加氯霉素 (. µg/kg) 和氟苯尼考等 ( µg/kg) 的样品的 TIC 叠加谱图 由于采用负离子模式分析氯霉素类药物, 所以流动相系统中应避免酸对灵敏度的影响 本方法适用于肌肉组织 内脏 蜂产品 水产品 乳制品 饲料等样品中氯霉素类药物的测试分析 注意对于不同基质类型样本的处理方法有所区别, 可参考标准方法进行样本的前处理 结论 本文所述方法采用 9 Infinity 液相色谱系统 /69 三重四极杆液质联用系统成功实现了对动物源性食品中氯霉素类禁用药物残留量的高灵敏 快速地确证定量分析 本方法以国内发布的检测标准为依据, 方法学各项参数完全满足或高于国家标准的检测要求, 并可应用于各类动物源性样品基质中氯霉素类药物残留的快速检测 参考文献. 中华人民共和国农业部公告第 93 号 : 食品动物禁用的兽药及其它化合物清单. 中华人民共和国农业部公告 3 号 : 动物性食品中兽药最高残留限量 3. GB/T 76-6 可食动物肌肉 肝脏和水产品中氯霉素 甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱 - 串联质谱法. GB 9688-3 食品安全国家标准牛奶中氯霉素残留量的测定液相色谱 - 串联质谱法. GB/T 338-8 动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定 6. GB/T 99-8 河豚鱼 鳗鱼和烤鳗中氯霉素 甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱 - 串联质谱法 7. GB/T 8-7 饲料中氯霉素的测定高效液相色谱串联质谱法 8. GB/T 893.9-3 蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法液相色谱 - 串联质谱法 9. 农业部 78 号公告 --6 动物源食品中氯霉素残留量的测定高效液相色谱 - 串联质谱法. SN/T 63-8 进出口蜂王浆中氯霉素残留量的检测方法液相色谱串联质谱法. SN/T 86-7 进出口动物源食品中氯霉素残留量的检测方法液相色谱 - 串联质谱法. 岳振峰等, 高效液相色谱 - 电喷雾三级四极杆质谱测定鸡肉组织中氯霉素残留的研究. 分析测试学报,():8-8 3. 王新丽,LC-MS/MS 法测定鱼肉中氯霉素残留. 中国卫生检验杂志,7,3:6-7
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