中华损伤与修复杂志 电子版 年第 ６卷第 期 Ｃ ｈ ＪＩ ｊ ｙｒ ｐ ｄｗ ｄｈ ｇ Ｅ ｃ ｃｅｄ Ａｐ Ｖ ６ Ｎ 论著 转化生长因子 β诱导大鼠毛乳头细胞 转分化为成纤维细胞的研究 李厚东 舒斌 徐盈斌 祁少海 谢举临 作者简介 李厚东 男 ６年出生 毕业于中山大学 医学硕士 现工作于湖北宜昌 市中医医院 三峡大学中医临床医学院烧伤科 主治医师 主要研究方向 创面修复及瘢 痕的防治 摘要 目的 研究大鼠触须毛乳头细胞在转化生长因子 β ＴＧＦ β诱 导作用下转分化为成纤维细胞的可能性 从新的角度探讨增生性瘢痕的形成机 ｇ ｍｌ处理细胞 制 方法 消化收集第 代毛乳头细胞 处理组以 ＴＧＦ β ｄ 对照组加入正常培养基 不含胎牛血清的 ＤＭＥＭ Ｆ 培养液 每隔 ｈ观 察两组细胞生长形态及生长方式 分别用实时一步法 ＲＴ ＰＣＲ和流式细胞仪检测 细胞 α平滑肌肌动蛋白 α ＭＡ 波形蛋白 Ｖ 的 ｍｒｎａ表达和蛋白表 达 Ｗ ｂ ｇ检测成纤维细胞特异蛋白 Ｆ Ｐ的表达 结果 流式细胞仪 检测 ＴＧＦ ｈ ｈ后 α ＭＡ表达明显低于对照组 Ｐ ＴＧＦ β诱导 β 诱导 ｈ ｈ ６ｈ后 Ｖ 表达明显高于对照组 Ｐ 实时一步法 ＭＡ的 ｍｒｎａ表达在 ｈ后 ＲＴ ＰＣＲ检测 Ｖ 的 ｍｒｎａ表达逐渐增强 α 明显下降 Ｐ 但 ６ｈ后表达又有所增加 Ｗ ｂ ｇ法检测 Ｆ Ｐ表 达在诱导 ｈ后逐渐增加 Ｐ 结论 毛乳头细胞经 ＴＧＦ β诱导后 失 去其典型的细胞形态及生长方式 而表现出成纤维细胞的细胞形态及生长方式 其相对特异性标记物 α ＭＡ的表达下降 而成纤维细胞的相对特异性标记物 Ｖ 和 Ｆ Ｐ表达增加 故 ＴＧＦ β可诱导大鼠毛乳头细胞转分化为成纤维 细胞 关键词 转化生长因子 β 细胞系 转化 毛乳头细胞 成纤维细胞 ＤＯＩ ｃ ｍ ｊ ６ 基金项目 创伤 烧伤与复合伤国家重点实验室开放基金 ｋ ｋ ｆ 国家自然科学基金资助 作者单位 宜昌市中医医院 三峡大学中医临床医学院烧伤科 李厚东 广州 中山大学附属第一医院 烧伤科 舒斌 徐盈斌 祁少海 谢举临 通讯作者 谢举临 Ｅｍ ｘ ｊ ｃ ｍ
中华损伤与修复杂志 ( 电子版 )2011 年第 6 卷第 2 期 ChinJInjuryRepairandWoundHealing(ElectronicEdition),April2011,Vol6,No.2 203 Transdiferentiationofratvibrisadermalpapilacelsintofibroblastsinduced bytransforminggrowthfactor beta1 LIHou dong,shubin,xuying bin, QIShao hai,xieju lin.departmentofburns,yichanghospitaloftraditionalchi nesemedicine(clinicalcolegeoftraditionalchinesemedicineofchina,thregorges University),Yichang443000,China Corespondingauthor:XIEJu lin,email:xiejl90@sina.com Abstract Objective Toexploretheposibilityoftransdiferentiationofder malpapila celsinto fibroblastsinduced by transforming growth factor beta 1 (TGF β1).methods Thefourthpasagecelsweredigestedandcolected,which weretreatedwithtgf β1(10ng/ml)for4days.at24 hourintervalsaseriesof methodswereused,includingmorphologicalobservationunderinvertedphasecontrast microscope,reversetranscriptasepolymerasechainreaction(rt PCR)tovalidatethe mrnaexpresionofalphasmoothmuscleactinandvimentin,flowcytometrytoana lysetheexpresionofalphasmoothmuscleactinandvimentin,andwesternblotingto validatetheexpresionoffibroblast specificprotein1(fsp1).results Flowcytom etryshowedtheexpresionofalphasmoothmuscleactinofthetreatmentgroupsobvi ouslylowerthanthatofthecontrolgroupsafterinductionfor48hand72h.theex presionofvimentinofthetreatmentgroupswasobviouslyhigherthanthatofthecon trolgroupsafterinductionfor48h,72hand96h.validatedbyrt PCR,themRNA expresionofvimentinofthetreatmentgroupsgradualyincreased,andthatofalpha smoothmuscleactindecreasedafterinductionfor48hand72hbutincreasedafterin ductionfor96h.validatedbywesternbloting,theexpresionoffibroblast specific protein1ofthetreatmentgroupsgradualyincreasedafterinductionfor48h,72hand 96h.Conclusions InducedbyTGF β1,dermalpapilacelslostitstypicalmor phologyandgrowthpaternandpresentedmorphologyandgrowthpaternoffibroblasts, expresionofrelativespecificmarkersofdermalpapilacels(α SMA)decreased, however,expresionofrelativespecificmarkersoffibroblasts(vimentinandfsp1) increased.sotgf β1couldinducethetransdiferentiationofratvibrisadermalpa pilacelsintofibroblasts. Keywords Transforminggrowthfactorbeta;Celline,transformed;Dermal papilacels;fibroblasts 研究表明体外培养的毛乳头细胞经条件诱导液定向诱导可以分化为类成骨细胞和类脂肪细胞, 提示此细胞具有多分化潜能, 表现干细胞特性 [1 3], 但转分化为成纤维细胞目前相关类似研究较为少见 本实验通过分离培养大鼠触须毛乳头细胞, 观察其在转化生长因子 β1(transforminggrowthfactor beta1,tgf β1) 诱
204 中华损伤与修复杂志 ( 电子版 )2011 年第 6 卷第 2 期 ChinJInjuryRepairandWoundHealing(ElectronicEdition),April2011,Vol6,No.2 导作用下向成纤维细胞转分化的可能性 材料与方法 一 实验材料 1. 实验对象 :4 周龄 Wistar 大鼠 10 只,80~90g, 由中山大学动物实验中心提供 2. 主要试剂和仪器 :Ⅰ 型胶原酶 DMEM/F12 干粉培养基 ( 美国 Gibco 公司 ); 小鼠抗大鼠波形蛋白 (Vimentin) 单克隆抗体 小鼠抗大鼠 α 平滑肌肌动蛋白 (α SMA) 小鼠抗大鼠层粘连蛋白 (LN) 抗体 CY3 标记的羊抗小鼠 IgG 抗体 异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的羊抗小鼠 IgG 抗体 Hoechest33258( 武汉博士德公司 );TGF β1( 美国 SantaCruz 公司 );PCR 试剂 (Qiagen 公司 ); 引物及探针 ( 上海生工合成 ); 倒置相差显微镜 ( 日本 OLYPUS 公司 ); 流式细胞仪 (BD 公司 ); 荧光 PCR 扩增仪 (ABI7500); 紫外分光光度计 (BeckmanDU530DNA/ProteinAnaly zer) 二 实验方法 1. 大鼠毛乳头细胞培养及传代 : 解剖显微镜下将包含有毛球部的毛囊下端剪下, 加入 0.2% 的 Ⅰ 型胶原酶 37 下消化 4~5h, 用移液器吸出形态典型 无组织附着的毛乳头, 磷酸盐缓冲液 (PBS) 漂洗毛乳头 3 次 将毛乳头转移至 100mm 3 培养皿中, 加入 10mL 含 15% 胎牛血清 (FBS) 的 DMEM/F12,37,5% CO 2 条件下培养, 每 2~3d 换液 1 次,24h 内即可见大部分毛乳头贴壁并有细胞迁移出来, 接近 80% 融合时 1 3 传代 2. 大鼠毛乳头细胞的鉴定 :(1) 形态学观察 : 每日在倒置相差显微镜下观察细胞形态和生态方式并拍照 (2) 流式细胞仪检测 : 收集第 3 代细胞悬液, 用 4% 多聚甲醛固定细胞, 加入一抗 ( 小鼠抗大鼠 α SMA 抗体和小鼠抗大鼠 Vimentin 抗体 ),PBS 漂洗 3 次后加入二抗 ( 羊抗小鼠 IgG), 以 PBS 代替一抗作为同型对照, 将上述细胞悬于 PBS 溶液中, 避光保存, 以流式细胞仪测定 α SMA 阳性细胞百分率及 Vimentin 阳性细胞百分率 (3) 免疫荧光检测 : 取第 3 代细胞,4% 多聚甲醛室温下固定, 冲洗, 分别加入稀释好的小鼠抗大鼠 α SMA 抗体 小鼠抗大鼠 LN 抗体和小鼠抗大鼠纤连蛋白 (FN) 抗体,4 过夜孵育,PBS 冲洗 3min 2 次, 分别加入 CY3 标记的羊抗小鼠 IgG 抗体和 FITC 标记的羊抗小鼠 IgG 抗体 同时以 PBS 代替一抗作为阴性对照, 荧光显微镜下观察, 拍照 3.TGF β1 诱导转分化实验 : 消化收集第 4 代毛乳头细胞, 分为处理组和对照组 以 5 10 5 悬液接种于 6 孔板, 每孔加含有 15%FBS 的 DMEM/F12 培养液 2mL, 在 37 5% CO 2 条件下培养 24h, 换无血清的 DMEM/F12 培养液培养 24h, 使细胞同步处于 G0 期 对照组加入正常培养基 ( 不含 FBS 的 DMEM/F12 培养液 ), 处理组加入条件培养基 ( 含 10ng/mLTGF β1 的 DMEM/F12 培养液 )
中华损伤与修复杂志 ( 电子版 )2011 年第 6 卷第 2 期 ChinJInjuryRepairandWoundHealing(ElectronicEdition),April2011,Vol6,No.2 205 两组分别培养 24h 48h 72h 96h, 每个时间点作 3 个复孔 光镜下观察细胞生长形态及生长方式 4. 细胞检测 :(1) 流式细胞检测 : 方法同前 (2) 实时一步法 RT PCR: 收集细胞, 提取总 RNA, 进行实时一步法 RT PCR 反应条件如下 :50,15min;95, 15min;95,15s;55,45s( 该步骤采集荧光 ),40 个循环 引物探针设计于 NCBI 网站上搜索内参基因 Vimentin 和 α SMAmRNA 序列 将引物分别设计在两个外显子内, 探针设计在外显子拼接处 (3)Westernbloting 检测 : 灌制聚丙烯酰胺凝胶后上样, 在 SDS 电泳缓冲液中电泳约 1~2h 经转膜后, 取出 PVDF 膜, 在 TBS 中洗 10min, 转至 TBST 洗膜 3 次, 每次 5min; 依次加入 1 500 稀释的一抗 ( 小鼠单克隆 FSP1 抗体 ) 和 HRP 标记的二抗 (1 3000), 显影 定影, 结果分析 三 统计学处理计量资料以均数 ± 标准差 ( 珋 x±s) 表示, 数据分析采用 SPSS11.0 软件, 配对资料采用 t 检验, 组间比较采用单因素方差分析,P<0.05 表示差异有统计学意义,P<0.01 表示差异有高度统计学意义 结 果 一 大鼠毛乳头细胞的鉴定 24h 内即可见大部分毛乳头贴壁 (90%) 并有细胞迁移出来, 第 2 天至第 7 天细胞生长加速, 中央区细胞出现多层化向上堆积,2 周后细胞生长范围不再扩大, 此时行第一次传代 传代后细胞形态表现为多形性, 多为宽扁状 不规则形 短梭形, 多极向排列, 可见凝集性生长现象 免疫荧光检测 : 第 3 代细胞爬片, 30min 左右即可见贴壁 伸展成近似圆形, 过夜后, 细胞表现为三角形或多角形, α SMA LN 均呈强阳性表达 ( 图 1,2) 流式细胞仪检测 : 第 3 代毛乳头细胞 α SMA 阳性表达的百分比为 77.1%;Vimentin 阳性表达的百分比为 57.7% 图 1 α 平滑肌肌动蛋白 (α SMA) 呈强阳性表达 ( 免疫荧光 200) 图 2 层粘连蛋白 (LN) 呈强阳性表达 ( 免疫荧 光 200)
６ 中华损伤与修复杂志 电子版 年第 ６卷第 期 Ｃ ｈ ＪＩ ｊ ｙｒ ｐ ｄｗ ｄｈ ｇ Ｅ ｃ ｃｅｄ Ａｐ Ｖ ６ Ｎ 二 ＴＧＦ β诱导转分化实验 ＴＧＦ ｈ后出现较多长梭形细胞 诱导 ６ｈ后长梭形细胞进一步增 β诱导 多并呈旋涡状排列 失去凝聚性生长方式的特性 图 图 转化生长因子 ｈ后 β ＴＧＦ β诱导 光镜 图 对照组培养 ｈ后 光镜 流式细胞仪检测 ＴＧＦ ｈ ｈ后 α ＭＡ表达明显低于对照组 β诱导 Ｐ ｈ ｈ ６ｈ后 Ｖ 表达明显高于对照 表 ＴＧＦ β诱导 组 Ｐ 表 表 两组细胞培养后不同时间点 α ＭＡ阳性细胞表达情况 ｘ 珋± 组别 ｈ ｈ ｈ ６ｈ 对照组 ± ６ ± ± ６ ± 处理组 ± ± ± ± 表 两组细胞培养后不同时间点 Ｖ 阳性细胞表达情况 ｘ 珋± 组别 ｈ ｈ ｈ ６ｈ 对照组 ± ６ ± ６ ± ６ ± 处理组 ６ ± ± ± ± 实时一步法 ＲＴ ＰＣＲ检测和相对定量分析 ＴＧＦ ｈ后 α ＭＡ的 β诱导 ｍｒｎａ表 达 明 显 下 降 Ｐ 而 Ｖ 的 ｍｒｎａ表 达 增 强 Ｐ 表 表 ＴＧＦ ＭＡ Ｖ 的 ｍｒｎａ表达情况 ｘ β诱导细胞后不同时间点 α 珋± 检测指标 ＭＡ α Ｖ ｈ ｈ ｈ ｈ ６ｈ ｂ ± ± ± ± ± ± ± ± ｂ ± ± ｂ 注 α ＭＡ α平滑肌肌动蛋白 Ｖ 波形蛋白 与对照组 ｈ比较 Ｐ Ｐ
中华损伤与修复杂志 ( 电子版 )2011 年第 6 卷第 2 期 ChinJInjuryRepairandWoundHealing(ElectronicEdition),April2011,Vol6,No.2 207 Westernbloting 检测 :TGF β1 诱导 24h 48h 72h 96h 后 FSP1 表达 ( 用软件 QuantityOne 分析 ) 分别为 0.132±0.021 0.355±0.042 0.447±0.035 0.532±0.043,TGF β1 诱导 48h 72h 96h 后 FSP1 表达均明显高于对照组 (0.118±0.032)(P<0.01), 且随诱导时间的增加而逐渐增强, 呈时间依赖效应 讨 增生性瘢痕 (HS) 中成纤维细胞的来源尚不完全明确 成纤维细胞作为创伤修复的主要功能细胞, 其来源有二 : 一是邻近组织中未分化的间质细胞和成纤维细胞在某些生长因子和化学趋化物的作用下分化 迁移而来 ; 二是成纤维细胞在某些生长因子 ( 如 TGF β) 刺激下有丝分裂而增生 [4] 毛乳头位于毛囊深部, 其内的毛乳头细胞不仅可诱导毛囊形成 调控毛发生长, 而且在体外培养中能被定向诱导分化为类成骨细胞和类脂肪细胞, 表现干细胞特性 TGF β1 被认为是与瘢痕形成关系最密切的细胞因子 [5,6] 已证明 TGF β1 能诱导肾小管上皮细胞向成纤维细胞 ( 肌成纤维细胞 ) 转化 [7 9] 我们推测, 在深度烧伤 ( 尤其是深 Ⅱ 度 ) 创面, 位于皮下脂肪的毛乳头细胞作为残留的皮肤干细胞有可能在某些生长因子的诱导下转分化为成纤维细胞参与创面的修复, 并失去形成毛囊等皮肤附属器的能力, 从而愈合后形成缺乏毛发的瘢痕组织 实验中我们发现, 毛乳头细胞在 TGF β1(10ng/ml) 诱导 48h 后出现较多长梭形细胞, 诱导 96h 后见长梭形细胞大量出现并呈旋涡状排列, 失去凝聚性生长的特性, 而对照组的细胞仍表现为多形性, 可见凝聚性生长现象 流式细胞仪检测, 在 TGF β1 诱导 48h 72h 后处理组细胞的 α SMA 表达明显低于对照组 (P<0.01); 诱导 48h 72h 96h 后处理组细胞的 Vimentin 表达明显高于对照组, 且处理组随时间的延长细胞的 Vimentin 表达逐渐升高 ; 实时一步法 RT PCR 检测, 处理组细胞 α SMA 的 mrna 表达在 TGF β1 诱导 48h 后明显下降, 而 Vimentin 的 mrna 表达则在 TGF β1 诱导 48h 后逐渐升高 从实验结果可以看出毛乳头细胞经 TGF β1 诱导后, 失去其典型的细胞形态及生长方式, 而表现出成纤维细胞的细胞形态及生长方式 ; 其相对特异性标记物 α SMA 的表达下降, 而成纤维细胞的相对特异性标记物 Vimentin 表达增加 需要注意的是 TGF β1 长时间 (96h) 诱导后, 细胞 α SMA 的表达较强烈, 而 Vimentin 表达增加, 我们推测有可能是毛乳头细胞转分化为成纤维细胞之后又向肌成纤维细胞分化 [10] FSP1 是细胞的骨架蛋白之一, 属于细胞内钙结合蛋白, 可作为成纤维细胞的特异性标记物 [11] 我们对此蛋白进行了检测后发现, 毛乳头细胞也可少量表达该蛋白, 经过 TGF β1 诱导之后, 其表达随诱导时间延长而逐渐增强, 这也辅助验证了毛乳头细胞在 TGF β1 诱导作用下可向成纤维细胞转分化 本实验虽然成功诱导大鼠触须毛乳头细胞向成纤维细胞转分化, 但诱导转分 论
208 中华损伤与修复杂志 ( 电子版 )2011 年第 6 卷第 2 期 ChinJInjuryRepairandWoundHealing(ElectronicEdition),April2011,Vol6,No.2 化与 TGF β1 剂量的关系尚不清楚, 另外, 实验未对所转分化的细胞进行功能性研究, 即是否和瘢痕中的成纤维细胞分泌的胶原和其他细胞外基质相同, 需进一步研究 参考文献 1 JahodaCA,WhitehouseJ,ReynoldsAJ,etal.Hairfolicledermalcelsdiferentiateintoadipogenicandosteogeniclineages[J]. ExpDermatol,2003,12(6):849 859. 2 RichardsonGD,ArnotEC,WhitehouseCJ,etal.Culturedcelsfromtheadulthumanhairfolicledermiscanbedirectedtoward adipogenicandosteogenicdiferentiation[j].jinvestdermatol,2005,124(5):1090 1091. 3 刘坡, 祁少海, 徐盈斌, 等. 胎儿毛乳头细胞的培养和鉴定及其体外诱导分化 [J]. 中华医学美学美容杂志,2006,12 (6):354 357. 4 王正国. 创伤愈合与组织修复 [M]. 济南 : 山东科学技术出版社,1999:12. 5 SpornMB,RobertsAB.Transforminggrowthfactor beta:recentprogresandnewchalenges[j].jcelbiol,1992,119(5): 1017 1021. 6 AbdouAG,MaraeeAH,AI BaraAM,etal.ImmunohistochemicalexpresionofTGF β1inkeloidsandhypertrophicscars[j]. AmJDermatopathol,2011,33(1):84 91. 7 LeaskA,AbrahamDJ.TGF betasignalingandthefibroticresponse[j].fasebj,2004,18(7):816 827. 8 IwanoM.EMTandTGF betainrenalfibrosis[j].frontbiosci(scholed),2010,2:229 238. 9 B tingerep,bitzerm.tgf betasignalinginrenaldisease[j].jamsocnephrol,2002,13(10):2600 2610. 10 谢举临, 利天增, 祁少海, 等. 转化生长因子 β1 对培养的瘢痕成纤维细胞挛缩功能的作用 [J]. 中国临床康复,2004,8 (29):6370 6371. 11 StrutzF,OkadaH,LoCW,etal.Identificationandcharacterizationofafibroblastmarker:FSP1[J].JCelBiol,1995,130 (2):393 405. ( 收稿日期 :2011 01 14) ( 本文编辑 : 谷俊朝 ) 李厚东, 舒斌, 徐盈斌, 等. 转化生长因子 β1 诱导大鼠毛乳头细胞转分化为成纤维细胞的研究 [J/CD]. 中华损伤与修复杂志 : 电子版,2011,6(2):202 208.