生物技术通报 BIOTECHNOLOGY 技术与方法 BULLETIN 牛奶中残留抗生素免疫检测方法研究进展 李周敏1 方惠群1 许丹科2 1 南京大学金陵学院 化学与生命科学学院 南京 210089 2 南京大学 生命分析化学国家重点实验室 南京 210093 摘 要 抗生素已经被广泛应用于人类及动物细菌感染的治疗与预防中 但由于它们有可能被添加至动物饲料中 而导致 牲畜及牛奶中抗生素残留量超过最大残留允许量 因此抗生素使用的水平是否会造成对人类健康的危害成为人们持续关注的问题 为了测定抗生素残留的含量 人们正在研发准确 简单和低成本的新型检测方法 几类用于检测牛乳及乳制品中残留抗生素的方 法已经建立 包括仪器分析方法 微生物检测法和免疫检测法等 主要综述基于抗原抗体特异性识别原理的免疫分析技术以及免 疫传感器 蛋白芯片与表面等离子体共振 SPR 等几种新的免疫检测方法 阐述这些方法所具有的简便 成本低 高灵敏和特异 性好等特点 关键词 抗生素 残留检测 免疫分析 蛋白芯片 生物传感器 Immunoassay Methods for Antibiotic Residues in Milk Li Zhoumin1 Fang Huiqun1 Xu Danke2 Chemistry and Life Science College Nanjing University Jinling College Nanjing 210089 2State Key Laboratory of Analytical Chemistry for Life Science, Nanjing University Nanjing 210093 1 Abstract: Antibiotics are widely used for therapeutic and prophylactic purposes against bacterial infection of both human beings and animals. However, antibiotics may be added into provender and thus lead the levels of residues in livestock and milk exceed the maximum residue limits MRLs. As a result, there is continuous concern on whether their levels used may generate serious problems to human health. To assay the level of the residues, there is increasing requirement to develop accurate, simple, economical novel monitoring methods. Several determination methods for the level of antibiotics residue in milk and dairy such as instrumental methods, microbiological assay and immunoassay have been developed. This paper reviews various immunoassay methods as well as new methods such as biosensor immunoassay BIA, protein chip and surface plasma resonance SPR, and presents their advantages such as simple, rapid and cost-effective, enough sensitivity and high specificity. Key words: Antibiotics Residues monitoring Immunoassay 抗生素作为兽药和饲料添加剂被广泛应用 可 能会造成抗生素在动物源性食品中的残留 牛奶等 Protein chip Biosensors 测尤为重要 1 2 世界各国对牛奶的抗生素残留作了严格的规定 乳制品中抗生素残留不仅会影响乳制品的品质 如 我国乳制品国标中有明文规定 注射过抗生素的奶 严重影响发酵乳制品的生产 降低产量及破坏后期 牛 5 d 内所产的牛奶均不允许出售食用 美国规定 A 产品风味 给生产者造成经济损失 而且会对人体 级巴氏奶原料奶中应没有抗生素残留 对原料奶的 造成极大的伤害 如引起人体的过敏反应 皮疹 抗生素检测为强制性 欧盟亦对最大残留量 MRLs 过敏性休克等 抑制肠道中正常的敏感菌群的生长 作了详细的规定 表 1 为了达到日渐严格的残留 使致病菌 念珠菌大量增殖而导致全身或局部感染 限量检测的要求 保障牛奶的食用安全 各国在均 并且会导致人体对抗生素产生抗药性 给临床治疗 努力发展各种快速 准确 灵敏度高的新检测方法 带来很大的危害 目前 牛奶中抗生素的残留已引 起消费者的高度重视 因此 加强抗生素的残留检 目前 国内外用于检测乳及乳制品中残留抗生 素的方法很多 按照检测原理和使用的仪器可分为 收稿日期 : 2012-04-18 作者简介 : 李周敏, 女, 硕士研究生, 助教, 研究方向 : 食品安全检测 ; E-mail: lizhoumin@126.com
2012 年第 11 期李周敏等 : 牛奶中残留抗生素免疫检测方法研究进展 67 表 1 欧盟规定牛奶中常见抗生素 MRLs(Commission Regulation(EU)No 37/2010) 类别抗生素 MRLs(μg/kg) 类别抗生素 MRLs(μg/kg) β- 内酰胺类阿莫西林 4 大环内酯类红霉素 40 氨苄青霉素 4 林可霉素 150 头孢氨苄 100 替米考星 50 头孢匹林 60 泰乐菌素 50 头孢喹肟 20 氨基糖苷类庆大霉素 100 邻氯青霉素 30 链霉素 200 四环素类金霉素 100 二氢链霉素 200 土霉素 100 新霉素 1500 四环素 100 氯霉素类 MRL cannot be 氯霉素磺胺类所有磺胺类 100 established 沙星类恩诺沙星 100 甲砜霉素 50 理化检测法, 微生物检测法和免疫检测法等 [3] 近年来, 检测技术迅速发展, 已有大量准确 敏感性高的理化检测方法满足日趋严格的残留限量要求, 如 HPLC 法 GC 法和 MS 法, 仪器联用法如 LC-MS GC-MS CZE-MS 和 LC-NMR 等,LC-MS 则更有效 仪器联用技术和多残留分析技术体现了仪器分析方面的另一主要趋势, 但所有的这些方法均需要有精密的大型仪器 另外, 对于如氨基糖苷类抗生素如庆大霉素缺少发色基团, 用 HPLC 进行测定时常要对其衍生化处理 测定牛奶中其他抗生素残留量时, 同样存在样品前处理繁琐, 测定方法相当复杂, 设备要求高, 技术难度大, 需受过专门训练的人员才能操作, 检测通量小, 只能适合于中心实验室或作为确证 在我国目前动物养殖分散经营的情况下, 很难统一管理, 因此导致动物源性食品的质量很难一致, 单纯采用大型仪器检测监控产品质量, 很不现实, 而且仪器检测费用高, 很难普及使用 在乳品生产第一线, 高敏感性的快速检测方法和试剂盒则成为保障无抗奶的最重要的手段 微生物检测法作为筛选检测法, 其测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能 代谢的抑制作用, 来定性或定量确定样品中抗微生物药物残留, 主要包括杯碟法 纸片法 琼脂扩散法和氯化三苯基三氮唑法 (TTC) 其中, 纸片法和 TTC 法是牛奶中药物残留检测的两种常用的微生物检测法 采用传统的微生物检测方法的优点是费用低, 一般实验室都能操作 但也存在以下缺点 :(1) 时间长 ;(2) 显色状态判断通过肉眼辨别, 易产生误差, 对微红色 者无法作出准确判断 ;(3) 操作复杂 免疫分析法 (immunoassays,ias) 主要分为放射免疫分析 (RIA) 酶联免疫分析 (ELISA) 荧光免疫分析 (FIA) 化学发光法及固相免疫传感器(solid phase immune-sensor,spi) 等 免疫分析法最突出的优点是操作简单 速度快 分析成本低 目前大部分抗生素已经建立了免疫测定法, 如磺胺二甲基嘧啶 氯霉素 沙拉沙星 链霉素 四环素及莫能菌素等 现主要介绍基于抗原抗体特异性识别原理的放射免疫法 酶联免疫吸附法 酶联免疫受体法 荧光免疫法以及胶体金免疫层析技术等几种常见检测技术及其应用概况, 并介绍免疫传感器 蛋白芯片 表面等离子体共振 (SPR) 等几种新的免疫检测方法的研究进展 1 免疫检测法免疫分析是利用抗原与抗体的特异性结合反应为基础的分析方法, 它以对抗生素具有特异性识别作用的抗体为核心试剂, 具有高选择性 高灵敏度等特点 根据免疫学理论, 小分子化合物 ( 分子量低于 5 kd), 不具有免疫原性, 不能直接刺激动物产生抗体 若将结构上具有一定复杂性的有机小分子 ( 半抗原 ) 与生物大分子 ( 如蛋白质 ) 连接后可作为载体的抗原决定簇刺激动物产生特异性结合原小分子化合物的抗体, 即具有反应原性 免疫分析法中抗原的制备较为重要, 半抗原与载体蛋白常用的偶联的方法有碳二亚胺 (EDC) 法 戊二醛法 混合
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 68 酸酐法 生理生化反应等 半抗原或其衍生物与载 抗体 可以建立一种对多种磺胺类抗生素同时快速 体蛋白的偶联方法的不同 其抗体的特点也不同 检测方法 国内外已有多个课题组 6-8 建立了一 1.1 放射免疫法 RIA 种通用抗体同时广谱特异性测定多种磺胺类药物的 放射免疫法是一种应用放射性同位素的敏感性 ELISA 检测方法 Franek 等 7 通过选用合适的磺胺 和抗原抗体反应的特异性结合而成的体外微量分析 类药物 调节药物与载体蛋白之间的距离等 制备 方法 RIA 法的优点是灵敏 特异 简便易行 用 出一种能广谱特异性检测磺胺类药物的抗体 用该 样量少等 常可测至 pmol 缺点是使用放射性物质 抗体分别测定磺胺类药物时 各药物的检测限均低 有一定污染 但由于只是在测试样品时才加入标记 于最大允许残留量 MRL 发挥了通用抗体的检测 的同位素示踪物 且示踪物的放射性强度极低 因 潜力 但缺点是在测定实际样品时 无法测定单个 此一般不会对试验者造成辐射损伤 抗生素的含量 且其检测限较高 无法对样品进行 陆勤等 4 用放射免疫法检测牛奶中的 8 种磺胺 稀释等处理 类抗生素 筛选水平可达到 10 μg/l 对 8 种磺胺类 Watanabe 等 9 10 先后建立了直接竞争 ELISA 药物的混合标准溶液进行检测 检出率为 100% 检 法检测 6 种生物基质中卡那霉素以及双氢链霉素的 测限达 5 μg/l 陆勤等 含量 牛奶样品中卡那霉素的检测限为 4 ppb 双 5 同时用放射免疫法验证了 牛奶中四环素类抗生素残留检测 该法检测牛奶中 氢链霉素的检测限为 10 ng/ml 但仍远低于 MRLs 四环素 土霉素 金霉素 3 种四环素类药物的最低 Burkin 等 11 制备 3 种抗原 用 ELISA 方法测得牛 浓度可分别达到 30 100 和 50 μg/l 均低于 MRLs 奶中新霉素的含量 3 种抗原的检测限分别为 1.0 该方法特异性强 且与其他多种抗生素均无交叉反 0.1 和 0.01 ng/ml 基 于 欧 盟 规 定 的 MRL 为 1 500 应 因此 该法能达到牛奶中四环素类抗生素残留 ng/ml 因此在测定实际样品时 可将其稀释 100 倍 的检测要求 减少基质效应的影响 同时 用该方法对 106 份实 1.2 酶联免疫吸附法 ELISA 际样品进行的检测分析 可以较好的区分各样品中 ELISA 法是将待测目标物通过固定的抗体或抗 新霉素含量 Jeon 等 12 用间接竞争 ELISA 法 生物素 - 链 原的特异性捕捉而结合于固相支持物表面 再将酶 标记的抗体或抗原与之反应 利用酶在液相反应中 亲和素信号放大系统 测定了牛奶中残留的四环素 催化底物显色来达到测定待测目标物含量的目的 与其他文献中没有信号放大的免疫吸附方法相比 最常用的标记酶为辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶 检测限 0.048 μg/l 及灵敏度都大大提高 所以该 ELISA 方法把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高 方法可以被发展为 ELISA 试剂盒 用于测定牛奶中 效催化作用有机地结合起来 目标物既可是抗原 的四环素 但该方法的操作步骤繁琐 耗时较长 也可是抗体 虽然 ELISA 法是目前研究较多的抗生 1.3 酶联免疫受体法 ELRA 素筛选检测方法 具有灵敏度高 检测量大 无需 免疫受体法是目前国际法规认可的一类专利检 复杂的样品前处理等优点 但也存在一些问题 如 测法 免疫受体检测法是酶联免疫分析 ELISA 的 因其载体的材质和包被技术的局限 在其包被载体 一个变换形式 基本原理是将特定抗生素类作为靶 孔内 一般为 96 孔酶标板 需要大剂量的抗原或 子 让固定在一定基质上的受体捕捉 大多数检测 抗体 才能达到良好的包被效果 且对显色时间要 法利用竞争性原理 使样品内的抗生素与内置抗生 求较高 结果只能一次性判读等 素标志物竞争结合受体 然后进行冲洗和显色 该 目前 食品中磺胺类药物的分析筛选方法 大 方法的检测限和灵敏度均与 ELISA 方法相当 多操作繁琐 灵敏度低 且只能针对一种抗生素的 Lamar 等 13 利用受体竞争结合原理 在 96 孔 特异性检测 磺胺类抗生素都有一个共同的对氨基 板中对不同基质中的无开环的 β-内酰胺类抗生素进 苯磺酰胺基团 因此 制备出一种针对共同基团的 行检测 该方法在牛奶样品中可检测到 1/2MRL 的
李周敏等 牛奶中残留抗生素免疫检测方法研究进展 69 浓度 且无需冗长而精细的前处理过程 Adrian 等 14 不影响蛋白质的生物特性 从而可以作为示踪标记 分别用 ELISA 酶联免疫分析 和 ELRA 酶联受 物应用于生物行业各领域中 Watanabe 等 9 建立了基于免疫层析法的快速 体分析 方法同时分析了 3 种不同大类的抗生素 磺胺类和喹诺酮类抗生素分别用 ELISA β-内酰胺 检测试纸条 检测牛奶中卡那霉素的检测限为 50 类抗生素用 ELRA 方法进行分析 将微孔板分成 3 ppb 低于 MRL 且该方法与微生物法对照 结果 个区域 在不同区域中分别包被上相应的抗原蛋白 有较好的一致性 2002 年 Watanabe 等 17 又报道 再将各待测抗生素混合加入各孔中 再在各孔中加 了快速试纸条法检测牛奶中恩诺沙星的含量 检测 入抗体或受体混合物 游离抗生素与固定在 96 孔板 限为 10 ppb 并且将其测定结果与 HLPC 法对比 中的抗生素竞争结合抗体或受体 再加酶标二抗 结果较为一致 同年 Watanabe 等 10 还报道了快 最终 TBM 显色 抗体或受体对相应抗生素种类下的 速试纸条检测牛奶中的双氢链霉素 检测限为 100 同系物均可识别 因此 该方法可以同时检测 3 大 ng/ml 除了链霉素 该方法与其他抗生素几乎无交 类中的 25 种不同的抗生素 而且在牛奶中的检测限 叉反应 且该方法与微生物法对照 结果有较好的 均低于欧盟规定的最大允许残留量 该方法同时实 一致性 该法的优点是可以作为现场快速检测技术 现了定量与半定量分析 可应用于大量牛奶样品的 缺点是筛选出的阳性结果需要其他方法进行验证 初步筛选 3 1.4 3.1 荧光免疫法 FIA 荧光免疫法是一种利用抗体标记的荧光素在特 定激发波长下发出的荧光来进行检测抗原抗体结合 信号的技术 该方法的优点是信号特异性好 灵敏 度高 线性范围宽 操作简便 不足是扫描设备价 格比较昂贵 难以进行普及应用 Korpimaki 等 15 用荧光免疫分析方法同时检测 13 种磺胺类抗生素 且 13 种磺胺类的 IC50 均低于 MRL 100 μg/kg Korpimaki 等 16 进一步建立了对 不同样品中的 18 种磺胺类抗生素同时进行快速检测 的方法 该法的优点是可以快速同时测定 18 种不同 的磺胺类抗生素 可用于样品的初筛试验 缺点是 在实际样品测定时 加样回收率偏低 且部分样品 中的精密度偏差 2 胶体金技术 试纸条 免疫分析新技术 免疫传感器 免疫传感器是生物传感器的一种 近年来已取 得迅速发展 18-20 传感器的生物敏感层与复杂样品 中特定的目标分析物之间通过抗体与抗原之间的识 别反应 产生一些物理化学信号的变化 这些变化 通过不同原理的传感器转换成第二信号 电信号 经放大后显示或记录 利用兽药与特异性抗体结合 反应特性研制出的免疫传感器 检测灵敏 携带方便 可用于相应兽药的快速定性定量检测 Haasnoot 等 18 报道了用免疫传感器检测牛奶 中链霉素 卡那霉素和新霉素等 5 种氨基糖苷类抗 生素的含量 检测限为 15-60 ng/ml 低于 MRLs Park 等 19 采用化学发光免疫传感器检测氯霉素残 留 将辣根过氧化酶和抗氯霉素抗体交联固定在尼 龙膜上 尼龙膜放置于避光的黑盒中 一端与装有 胶体金快速诊断技术凭借其方便快捷 灵敏度 蠕动泵的流动注射系统相连 一端与光电倍增管相 高 稳定性强等特点 在医疗诊断领域和兽药残留 连 该方法的检测限可达到 1.0 10-8 mol/l 并将这 检测领域中被迅速推广 是牛奶抗生素检测商业化 种氯霉素的测定方法应用牛奶等实际样品基质中 应用较广泛的一种检测方法 与 ELISA 试剂盒相比 Loomans 等 20 采用新霉胺作为半抗原合成人工抗 其优点是更为简便快速 无需检测仪器 且成本低 原 制备的多克隆抗体可同时测定牛奶中的庆大霉 无污染 它是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原 素 卡那霉素和新霉素等氨基糖苷类抗生素的含量 抗体反应的一种新型的免疫标记技术 胶体金在弱 庆大霉素 卡那霉素及新霉素在牛奶中的 IC50 分别 碱环境下带负电荷 可与蛋白质分子的正电荷基团 为 9 21 和 113 ng/ml 同时 用该法测定了感染有 形成牢固的结合 由于这种结合是静电结合 所以 乳腺炎的牛所生产的牛奶中的新霉素含量 结果能
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 70 较好的区分 光标记二抗示踪 不同浓度的竞争标准品与检测荧 3.2 蛋白芯片 光强度作标准曲线 然后通过标准曲线对待检试样 蛋白质芯片又称蛋白质微阵列 protein microar- 中氯霉素和磺胺二甲嘧啶残留量进行定量分析 并 ray 是在基因芯片之后发展起来的 其原理是在固 同现行的免疫学测定方法进行了比较 其结果较为 相支持物表面高密度排列蛋白质探针 可特异地捕 一致 叶邦策等 24 又报道了利用间接竞争荧光免 获样品中分子 然后用 CCD 相机或激光扫描系统获 疫蛋白芯片法同时测定牛奶中磺胺二甲嘧啶 链霉 取信息 最后用计算机进行定性定量分析 该方法 素 泰乐菌素的含量 固定片基用琼脂糖修饰的三 在检测牛奶中抗生素残留上有潜在的巨大作用 可 维片基 4 块片基组合成 96 孔板 用单克隆抗体 以实现样品用量少 无需样品前处理 高通量 快 分别同时测定相应的待检抗生素 检测抗体用 Cy5 速检测的目的 标记的二抗 最终进行荧光扫描 3 种抗生素的检 利用硅烷化修饰的片基制备抗原 测限分别为 3.26 ng/ml 磺胺二甲氧嘧啶 2.01 点阵 自动化分析牛奶中 10 种抗生素含量 包括 β- ng/ml 链霉素 6.37 ng/ml 泰乐菌素 均低于 内酰胺类 磺胺类及氨基糖苷类 抗原蛋白通过点 各自的 MRLs 并对实际样品牛奶进行了测定 结果 阵的形式固定在流池中 抗生素及相应的抗体混合 取得了较好的加样回收率 后再加入 分别同时进行检测 信号的采集通过二 3.3 21 Knecht 等 抗标记过氧化物酶催化底物进行化学发光 再通过 表面等离子体共振 SPR 表面等离子体共振 SPR 是一种物理光学现象 高灵敏的 CCD 进行检测 整个检测过程自动化 且 SPR 对金属表面电介质的折射率非常敏感 不同电 只需 5 min 除了青霉素 G 与 MRL 相近 其他各抗 介质其表面等离子体共振角不同 同种电介质 其 生素的检测限均大大低于 MRLs 该方法可以实现 附着在金属表面的物质的量不同 则 SPR 的响应强 快速 高通量检测 可用于对乳品行业的牛奶质量 度不同 基于这种原理的生物传感器通常将一种具 22 建立的间接竞争化学发光免疫芯 特异识别属性的分子即配体固定于金属膜表面 监 片法 能在几分钟内同时定量检测牛奶中 13 种抗 控溶液中的被分析物与该配体的结合过程 在复合 生素含量 他们对片基采取了多步化学处理后 最 物形成或解离过程中 金属膜表面溶液的折射率发 终在玻片表面修饰上环氧树脂活化的 PEG 层 然后 生变化 随即被 SPR 生物传感器检测出来 该方法 加入磺胺类 β-内酰胺类 氨基糖苷类和氟喹诺酮 优点是无需对样品进行标记处理 可真正实现无标 类等的衍生物直接与环氧树脂进行共价结合 无需 记 在线检测 控制 Kloth 等 再加其他偶联剂 该方法灵敏度较高 且抗原芯片 Haasnoot 等 25 建立了 SPR 同时测定重组脱脂 活化后 可重复使用 50 次 因此 增加了测定的 牛奶中的 5 种氨基糖苷类抗生素 4 种氨基糖苷类 稳定性以及便捷性 减少重新制备片基 利用这种 抗生素固定在传感器表面的 4 个通道上 牛奶样品 可再生性芯片能够快速检测牛奶中的抗生素 且结 和 4 个特异性的抗体混合物同时注入到 4 个连续串 果与试剂盒中的结果较为一致 缺点是 制备片基 联的通道中 流速为 20 μl/min 在注入再生缓冲 的化学处理过程较为繁琐 化学发光信号的采集需 液之前 测定牛奶样品中残留抗生素的含量 该 采用极其灵敏的 CCD 检测器 且信号只能一次性 方法的检测限为 15-60 ng/ml 远低于 MRLs 100- 采集 500 ng/ml 且 每 个 样 品 的 分 析 时 间 仅 为 7 min 23 研究了蛋白芯片法快速定量检测 Haasnoot 等 26 同时构建了用 SPR 技术测定双氢链 牛奶中氯霉素和磺胺二甲嘧啶残留检测 芯片上固 霉素和链霉素的含量 并比较了直接生物传感免 定氯霉素和磺胺二甲嘧啶人工抗原 芯片反应区内 疫分析与竞争抑制生物传感免疫分析方法 牛奶 加入氯霉素和磺胺二甲嘧啶单克隆抗体和其标准品 样品中两种方法的检测限均可达到 20 ng/ml 低于 或待测样品混合物 待抗原抗体完全反应后加入荧 MRLs Fernández 等 27 建 立 了 六 通 道 SPR 传 感 器 叶邦策等
2012 年第 11 期李周敏等 : 牛奶中残留抗生素免疫检测方法研究进展 71 同时检测牛奶中多种抗生素含量 选 3 个代表性的抗生素族 ( 氟喹诺酮类 磺胺类和氯霉素类 ) 作为研究对象 样品或标准品与特异性的多克隆抗体混合后再注入传感器中, 缓冲液中的检测限分别为 0.3 μg/l( 恩诺沙星 ),0.29 μg/l( 磺胺吡啶 ),0.26 μg/l( 氯霉素 ) 对于实际样品的检测, 氯霉素的结果稍有影响, 而其他氟喹诺酮类, 磺胺类的抗生素的检测限均低于 MRLs 4 小结从近 10 年来以免疫反应为基础的检测方法在牛奶抗生素残留检测中的研究进展及应用状况看, 免疫分析技术最突出的优点是操作简单 速度快 分析成本低 以使用微孔板的 ELISA 为例, 免疫测定法取样量小, 前处理简单 容量大, 仪器化程度低, 检测极限与 GC-MS 或 GC-ECD 相似, 可方便地达到 ng/g-pg/g 数量级, 分析效率则为 HPLC 或 GC 的几十倍以上 目前大部分抗生素已经建立了免疫测定法, 如 β- 内酰胺类 磺胺类 氨基糖苷类 氯霉素类和四环素类等 国内外已有多种商品化的检测试剂盒, 取得了显著成果, 但还存在限制其商业化应用问题 如免疫分析法的应用受到抗体种类少 样品的固定化及片基的再生等诸多条件的制约, 使得大部分技术仍然停留在实验室水平 ; 其次, 如何实现检测仪器与技术的全自动化也是推动免疫检测方法商品化应用的必要条件 随着纳米技术的日趋成熟, 抗原或抗体修饰方法的改进, 可大大降低免疫分析法的检测限和提高灵敏度, 其中胶体金技术利用金颗粒催化银离子还原成金属银这一原理, 采用银增强试剂增强金颗粒的可见性, 使结果可视化, 大大提高测定灵敏度 目前, 纳米银技术发展迅速, 研究发现纳米银与胶体金相比催化银增强试剂的显色效果更好 [28] 试验仪器的微型化 便捷化是 21 世纪分析化学发展的主题之一, 将免疫传感器与微流控芯片 蛋白芯片相结合是未来发展的必然趋势 近年来, 随着微机械电子加工技术及微刻蚀技术应用于免疫传感器, 研究与开发的多通道 阵列式免疫传感集成化芯片将会逐步应用到牛奶抗生素残留的检测应用中 参考文献 [1] Zhang H, Wang S. Review on enzyme-linked immunosorbent assays for sulfonamide residues in edible animal products. J Immunol Methods, 2009, 350(1-2): 1-13. [2] Zhang HY, Wang S, Fang GZ. Applications and recent developments of multi-analyte simultaneous analysis by enzyme-linked immunosorbent assays. Journal of Immunological Methods, 2011, 368(1-2): 1-23. [3] Wang S, Zhang HY, Wang L, et al. Analysis of sulphonamide residues in edible animal products: A review. Food Additives And Contaminants, 2006, 23(4): 362-384. [4] 陆勤, 林峰, 朱柳明. 牛奶中磺胺类抗生素的快速检测分析. 乳品加工, 2006(11): 51-53. [5] 陆勤, 林峰, 张美金. 牛奶中四环素类抗生素放射免疫检测方法验证分析. 中国兽药杂志, 2007, 41(5): 37-39. [6] Cliquet P, Cox E, Haasnoot W, et al. Generation of group-specific antibodies against sulfonamides. J Agric Food Chem, 2003, 51(20): 5835-5842. [7] Franek M, Diblikova I, Cernoch I, et al. Broad-specificity immunoassays for sulfonamide detection: immunochemical strategy for generic antibodies and competitors. Anal Chem, 2006, 78(5): 1559-1567. [8] Adrian J, Font H, Diserens JM, et al. Generation of broad specificity antibodies for sulfonamide antibiotics and development of an enzyme-linked immunosorbent assay(elisa)for the analysis of milk samples. J Agric Food Chem, 2009, 57(2): 385-394. [9] Watanabe H, Satake A, Kido Y, et al. Production of monoclonal antibody and development of enzyme-linked immunosorbent assay for kanamycin in biological matrices. Analyst, 1999, 124(11): 1611-1615. [10] Watanabe H, Satake A, Kido Y, et al. Monoclonal-based enzymelinked immunosorbent assay and immunochromatographic rapid assay for dihydrostreptomycin in milk. Analytica Chimica Acta. 2002, 472(1-2): 45-53. [11] Burkin MA, Galvidis IA. Development and application of indirect competitive enzyme immunoassay for detection of neomycin in milk. Applied Biochemistry and Microbiology, 2011, 47(3): 321-326. [12] Jeon M, Kim J, Paeng KJ, et al. Biotin-avidin mediated competitive enzyme-linked immunosorbent assay to detect residues of tetracyclines in milk. Microchemical Journal, 2008, 88(1): 26-31.
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