玻璃酸预防关节滑膜切除所致软骨退行性变的实验研究 王韶进戴国锋王永成贺艳丽汤继文 关节滑液内玻璃酸 (HA) 是由滑膜合成的 HA 是赋予滑液黏弹性和润滑性的主 要成分, 是滑液维持生理功能的基础,HA 与蛋白聚糖组成的蛋白聚糖聚集物 (PGA) 是构成软骨基质的基本单元 因此, 滑膜对维持关节生理功能具有重要的作用 采用滑膜切除疗法治疗类风湿性关节炎 (RA) 结核性关节炎 早期化脓性关 节炎 血友病性关节炎和慢性滑膜炎等, 均取得了好的疗效 但是, 切除受累滑 膜的同时, 也除去了一部分正常滑膜, 因此导致玻璃酸的合成减少, 滑液的黏度 和黏弹性降低, 对软骨的保护功能减弱,HA 对清除氧自由基的作用减弱 [1] Toyoshima 等的研究结果表明, 滑膜切除可导致软骨的退行性变 本研究观察滑膜切除后, 同时补充外源性高分子 HA, 是否可抑制关节软骨的 退行性变, 为 HA 在此方面的应用提供依据 1 材料与方法 1.1 材料 采用 2kg 左右的成兔 24 只, 雌雄皆可, 随机分为 Ⅰ 组和 Ⅱ 组 1%HA 注射液为 山东正大福瑞达制药有限公司生产, 所用 HA 系雄鸡冠提取制备 分子量为 1.5 10 6 1.2 方法 1.2.1 手术方法所有动物均行双侧膝关节大部滑膜切除术 以 1ml/kg 的剂量自 兔耳静脉注射 3% 戊巴比妥钠溶液进行麻醉 麻醉成功后, 刮除兔膝关节周围毛, 常规消毒, 取膝关节内侧切口, 自胫骨上端向上纵行延长, 切口长约 3cm 依次 切开皮肤, 皮下组织, 切开膝关节囊, 将滑膜及其下的疏松结缔组织切除 切除 范围 : 膝关节囊内 前 外侧及膑上囊的滑膜, 同时切除膑下脂肪垫 由于后囊 难于暴露切除, 故用纱布擦剥破坏其滑膜 冲洗刀口依次缝合切口 术后当即行 关节穿刺, 左膝注射 1% HA 0.4ml, 右膝注入相同体积的生理盐水 动物置笼中 喂养观察, 每隔 1 周两侧分别注射 1 次 1.2.2 标本制备术后 3 周 (Ⅰ 组 ) 和 6 周 (Ⅱ 组 ) 分别处死动物, 沿原切口切 开关节囊 行大体观察后, 用汽锯分别取股骨下端和胫骨上端相对面的软骨, 切
除内侧关节囊约 0.6cm 0.6cm 采用 Williams 和 Jackson 所用的方法, 把所采制的标本浸入 40% 甲醛溶液中加入 0.5% 的氯化十六烷基吡啶混合而成的固定液中 2~3d, 再将标本转移至 50 倍 5.5% 的 EDTA 磷酸盐缓冲液 (ph 7.0) 中进行脱钙, 每 5~6d 换液 1 次, 直至脱钙完全 按照常规方法对标本脱水 浸蜡 包埋, 切成 5~ 6nm 的切片 分别做 HE 沙红-O(safranin-O) 和奥新蓝 (alcian blue) 染色 奥新蓝染色在 ph 2.5 的条件下进行 1.2.3 组织生化学评价指标及标准参照 Mankin [2] 方法 2 结果 2.1 大体观察 Ⅰ 组 12 只兔中有 7 只右膝 ( 生理盐水处理膝 ) 关节滑液较对侧 (HA 处理膝 ) 明显稀薄, 有 1 只兔右膝关节囊与股骨下端内 外侧有纤维性粘连,6 只兔的右膝关节囊明显较对侧增厚 Ⅱ 组 12 只兔中有 9 只右膝关节滑液较对侧明显稀薄,6 只右膝关节囊较对侧增厚,1 只左侧较右侧厚 2.2 显微结构正常的软骨表层的软骨细胞呈椭圆形, 长径与关节面相平行 ; 中层和深层的软骨细胞呈近似圆形, 柱状排列 软骨基质自表层至深层由于所含蛋白聚糖的浓度依次增高, 因而对沙红 -O 的染色性依次增强 胶原纤维的排列与关节面相平行 Ⅰ 组注射生理盐水的右膝关节软骨有不同程度的退行性变 股骨下端负重部关节软骨表层结构紊乱 软骨细胞呈散在或团状增生, 软骨细胞的柱状排列消失 ; 胶原纤维排列不规则, 有的聚集成纤维束, 与关节面不相平行 关节软骨边缘有时可见有类血管翳样物覆盖软骨表面 沙红染色性有不同程度的降低 个别可见有潮线不完整, 被血管翳穿过 有的软骨内有异常钙化现象 Ⅱ 组 : 病变率和病变程度更明显, 软骨细胞增生明显, 沙红 -O 染色性降低更明显, 有的几乎不着色, 纤维束较明显, 沿软骨裂隙平行排列 病变发生率和积分结果, 见表 1 2 表 1 各组标本组织学检查病变率 (%) 组别标本右膝 ( 生理盐 左膝 (HA) 水 ) Ⅰ 股骨下端 83.3(10/12) 50.0(6/12) * 胫骨上端 83.3(10/12) 33.3(4/12) **
Ⅱ 股骨下端 100(12/12) 58.3(7/12) ** 胫骨上端 91.7(11/12) 41.7(5/12) ** 注 :*P<0.05,**P<0.01 vs 右膝 表 2 各组标本组织学检查积分值 ( - x±s) 组别标本右膝 ( 生理盐 左膝 (HA) 水 ) Ⅰ 股骨下端 8.4±0.7 4.1±1.1 ** 胫骨上端 5.6±1.1 2.9±1.0 * Ⅱ 股骨下端 10.9±1.2 5.3±0.8 ** 胫骨上端 7.5±1.0 3.1±1.3 * 注 : * P<0.05, ** P<0.01 vs 右膝 Ⅰ 组软骨发生病变的百分率生理盐水处理膝股骨上端为 83.3%, 胫骨下端也为 83.3%, 尽管两者的病变率没有差异, 但后者的病变程度较前者明显轻 (5.6vs8.4,P<0.05);HA 处理膝股骨上端病变率为 50%, 而胫骨上端为 33.3%, 同样, 后者的病变程度也有较前者轻的趋势 (2.9vs4.1,P>0.05) 无论是股骨下端还是胫骨上端,HA 组与生理盐水组相比, 病变积分值均明显低 (4.1vs8.4, 2.9vs5.6) Ⅱ 组的病变率及积分值如下, 生理盐水处理膝的股骨下端的病变率为 100%, 积分值为 10.9, 胫骨上端则分别为 91.7% 和 7.5, 胫骨上端的病变程度明显较股骨下端轻 (P<0.05);HA 组股骨下端的病变率为 58.3%, 积分值 5.3, 胫骨上端则分别为 41.7% 和 3.1, 胫骨上端的病变程度明显轻于股骨下端 (3.1vs5.3,P<0.05) HA 处理膝与生理盐水处理膝相比较, 无论是股骨下端还是胫骨上端的病变率 (58.3%vs100% 41.7%vs91.7%) 和病变程度 (5.3vs10.9 3.1vs7.5) 均具有显著性差异 (P<0.01) Ⅱ 组与 Ⅰ 组相比较, 生理盐水处理膝的股骨下端和胫骨上端病变程度均明显增加 (10.9vs8.4,P<0.05 ;7.5vs5.6,P<0.05), 而 HA 处理膝的股骨下端和胫骨上端病变程度和病变率有加重的趋势 (5.3vs4.1,P>0.05;3.1vs2.9,P>0.05)
此外,Ⅰ 组显微镜下观察发现, 关节囊内面无滑膜组织生成, 纤维组织增生, 有大量的炎细胞浸润, 以分叶核细胞和淋巴细胞为主 ;Ⅱ 组可见关节囊增厚, 纤 维组织增生更加明显, 也未见滑膜样物生成, 炎细胞浸润以淋巴细胞为主 3 讨论 滑膜内衬细胞合成和分泌的 HA 是维持滑液的润滑性和黏弹性的基础 合成 HA 的滑膜组织对关节功能的发挥具有重要作用 尽管有些类型的关节炎早期采用滑 膜切除法治疗能取得一定的疗效, 但从长远的观点来看, 这种疗法对关节的破坏 作用是不可忽视的, 因为大部分滑膜切除后,HA 的合成量明显减少, 导致滑液的 成分改变, 使其正常的生理功能不能维持, 势必对关节软骨产生不良影响 本研 究结果验证滑膜切除可导致软骨病变的结论 在滑膜切除的同时, 补充外源性 HA 可降低病变发生率和减轻病变的程度 其作用机制可能有以下几方面 :1 对软骨 及糖胺聚糖的作用, 大量研究表明, 关节腔内注入高分子 HA 对多种 OA 动物模型的 软骨具有保护作用, 抑制由内侧或外侧半月板切除 前十字韧带切除 滑膜切除 关节压迫 关节固定 关节腔内注入玻璃酸酶或木瓜蛋白酶 中断骨骺血流等手 段导致的软骨退行性变 对已造成软骨退行性病变的模型注入 HA 治疗, 对病变软 骨具有明显修复和改善作用 [4] ;2 对细胞功能的影响, 研究发现, 高分子 HA 可抑 制兔滑膜细胞 鸡胚胎成纤维细胞及软骨细胞的增殖, 有助于关节减少炎性渗出 [4] [5] Akatsuka 等研究表明,HA 可抑制兔软骨细胞合成前列腺素 E 2 高分子 HA 可 抑制人多形核白细胞 中性白细胞及淋巴细胞的趋化性, 对巨噬细胞的吞噬作用 具有抑制作用 [6] 体外研究表明, 外源性高分子 HA 可促进 RA 患者滑膜高分子 HA 的 合成 低分子 HA 对细胞的作用与高分子 HA 相反, 前者是通过细胞 HA 受体发生作用而 后者是通过 HA 的大分子网状结构 在细胞周围形成分子笼蔽 (pericelluar matrix,pcm) 所致 3 对超氧离子的灭活及抗炎作用 对关节疾病的病理研究发 现, 氧衍生的自由基 (ODFR) 是引发和参与病变的重要因素, 对滑液中以及构成 PGA 骨架的 HA 发生作用, 导致软骨蛋白聚糖的释放 ODFR 对软骨中的蛋白聚糖和胶原 纤维也有破坏作用 [7] 研究表明, 低分子 HA 可促使巨噬细胞表达一些与炎症有关 的因子, 产生的一系列因子是引发和加剧关节炎症的因素 当发生 OA 和 RA 时, 滑 液中的 HA 受 ODFR 等作用产生大量的低分子 HA, 产生的低分子 HA 进而促进炎症因子
的释放, 导致组织的损伤 高分子 HA 以及组成 HA 的半糖 -D- 葡糖醛酸是滑液清除 ODFR 的有效物质, 可保护软骨免受 ODFR 的损害 [8] 参考文献 1 Toyoshima H. J Tokyo Wom Coll, 1978, 48: 890 2 Mankin HJ, Dorfman H, Lippiello L, et al. J Bone Joint Surg, 1971, 53: 523 3 凌沛学, 苏淮, 贺艳丽, 等. 中国生化药物杂志,1997,18:12 4 Cortivo R, DeGalateo A, Castellani I, et al. Cell Biol Int Reports, 1990, 14: 111 5 AkatsukAM, Yamamoto Y, Tobetto K, et al. Agents Actions, 1993, 38: 122 6 Suzuki Y, Yamaguchi T. Agents Actions, 1993, 18: 23 7 KvamBJ, Fragonas E, Degrassi A, et al. Exp Cell Res, 1995, 218: 79 8 Sato H, Takahashi T, Tde H, et al. Arthritis Rheum, 1988, 31: 63 [ 原文发表于 : 山东大学学报 ( 医学版 ),2002,40(3):252~254]