肿瘤分子诊断与个体化诊疗临床应用 邵建永 中山大学肿瘤医院分子诊断科 2015.8 广州
NSCLC 治疗现状 : 从病理分型走向分子分型 鳞癌 大细胞癌 NSCLC 腺癌 W. Pao and N Girard, Lancet Oncol 2011. RET EGFR ALK 未知 未知 AKT BRAF VEGFR HER2 KRAS MAPK FGFR1 AMP EPHA/B PDGFR PI3K FGFR INSR EGFRvIII PI3KCA EGFR TK DDR2 腺癌 鳞癌
非小细胞肺癌基因变异类型及检测技术 基因突变 融合基因 基因扩增 或缺失 常见基因变异类型 EGFR,KRAS, BRAF,PIK3CA, BIM 缺失 ALK-EML4, RET, ROS1 融合基因, C-Met, EGFR,FGFR1 扩增 ; PTEN 缺失 常用检测技术 定量 PCR 基因分型飞行质谱基因分型 Sanger 测序 高通量测序 荧光原位杂交 (FISH) 免疫组化技术 (IHC)
分子诊断规范化 多层次技术体系建设 FISH 病原体含量 单基因突变 基于芯片技术的高通量多基因分型 全基因组测序 多层次检测平台的综合应用 检测的个体化策略应用
客观缓解率 (%) 100 80 60 40 20 0 易瑞沙一线治疗 EGFR 基因敏感突变患者的客观缓解率显著高于化疗 P<0.001 71.2 47.3 易瑞沙 P<0.001 73.7 化疗 P<0.001 62.1 30.7 32.2 n=132 n=129 n=114 n=114 n=58 n=59 易瑞沙卡铂 / 紫杉醇易瑞沙卡铂 / 紫杉醇易瑞沙顺铂 / 多西他赛 IPASS EGFR 基因突变亚组 NEJ002 WJTOG3405 11. Mok TS et al. N Engl J Med 2009, 361:947-957. 12. Maemondo M, et al. N Engl J Med 2010: 362:2380-2388. 13. Mitsudomi T, et al. Lancet Oncol 2010: 11:121-128.
易瑞沙一线治疗 EGFR 基因敏感突变患者较化疗显著延长 PFS, 降低进展风险 易瑞沙 (n=58) WJTOG3405 顺铂 / 多西他赛 (n=59) 易瑞沙 (n=114) NEJ002 卡铂 / 紫杉醇 (n-114) 易瑞沙 (n=132) IPASS EGFR 基因突变亚组 卡铂 / 紫杉醇 (n=129) HR=0.489 P<0.0001 HR=0.322 P<0.001 HR=0.48 P<0.0001 5.4 6.3 6.3 9.2 51% 68% 9.5 52% 10.8 易瑞沙 化疗 P<0.001 P<0.001 P<0.001 11. Mok TS et al. N Engl J Med 2009, 361:947-957. 12. Maemondo M, et al. N Engl J Med 2010: 362:2380-2388. 13. Mitsudomi T, et al. Lancet Oncol 2010: 11:121-128. 0 5 10 15 中位 PFS ( 月 )
100 80 生存概率 ( %) 60 40 20 0 易瑞沙的上市显著延长了患者的总生存期 11.5 易瑞沙上市前后韩国晚期 NSCLC 患者 OS 易瑞沙上市后 (n=334) 易瑞沙上市前 p<0.001 (n=334) 19.3 7.8 个月 0 20 40 60 80 100 时间 ( 月 ) 为了调查吉非替尼上市前后韩国晚期 NSCLC 患者生存期不同, 该研究对 334 位 1999-2001 年患者及 334 位 2002-2005 年患者 OS 进行回顾分析 14. Kim HS, et al. Oncolgy 2009; 76:239-246. 15. Takano T, et al. J Clin Oncol 2008; 26:5589-5595. 100 生存概率 (%) 80 60 40 20 0 易瑞沙上市前后日本 EGFR 突变患者 OS 13.6 易瑞沙上市后 (n=78) 易瑞沙上市前 (n=58) P<0.001 27.2 13.6 个月 0 12 24 36 48 60 时间 ( 月 ) 为了评估 EGFR 突变对晚期 NSCLC 患者生存获益的预测, 该研究对吉非替尼上市前后 136 位日本 EGFR 突变患者 OS 进行了回顾分析
无恶化率 易瑞沙一线治疗 EGFR 基因敏感突变患者较化疗显著改善生活质量, 并延长生活质量维持时间 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 FACT-L 3.0 12.6 个月 IPASS 研究 时间 ( 月 ) 15.6 易瑞沙 (n=131) 卡铂 / 紫杉醇 (n=128) P<0.05 0 4 8 12 16 20 24 16. Thongprasert S, et al. J Thorac Oncol 2011; 6(11):1872-1880. FACT-L 评分易瑞沙组 70.2% VS 化疗组 44.5%; OR,3.01; 95% CI, 1.79-5.07; P< 0.001
八项随机研究奠定了 EGFR-TKI 在 EGFR 敏感突变患者中的一线治疗地位 LUX-3 LUX-6 EURTA C IPASS 8 项研究 OPTIM AL 17. Stravodimou A, Peters S. TJOP 2013; 1:63-71. 18. CC Zhou, Lancet Oncol 2011,12: 735 42 First- SIGNA L NEJ002 WJTOG 3405 4.6-6.9 8.4-13.1 八项随机研究中化疗中位 PFS 范围从 4.6-6.9 个月 ;EGFR-TKI 中位 PFS 范围从 8.4-13.1 个月
易瑞沙引领中国晚期 NSCLC 治疗进入靶向时代 第一个在中国上市的 EGFR-TKI 第一个开放慈善赠药项目的 EGFR-TKI 第一个证明 EGFR 突变状态可指导晚期 NSCLC 患者治疗的 TKI 第一个获得一线 EGFR 突变阳性晚期 NSCLC 适应症的 TKI 第一个向一线 EGFR 突变阳性晚期 NSCLC 患者开放慈善赠药的 TKI 第一个在中国进行 EGFR 突变状态大样本调查的 TKI 第一个在中国申请 ctdna 伴随诊断的 EGFR-TKI 19. 石远凯, 中国肿瘤杂志, 2014,7(36):555-558 21. 易瑞沙 中国产品说明书 2010 20. 中华慈善年鉴 7. YK shi et. al., JTO, 2014,9(2): 154-162 11. Mok TS et al. N Engl J Med 2009, 361:947-957. 22. JDDouillard et. al., BJC, 2014,110:55 62
2005 年 6 月 : The Lancet 易瑞沙通过大量临床研究点亮 EGFR-TKI 的探索之路 ISEL 研究亚洲亚组结果优势, 为后续研究提供一线曙光 2008 年 11 月 : The Lancet INTEREST 研究使易瑞沙成为 NSCLC 二线治疗首选 2009 年 9 月 : The New England Journal of Medicine IPASS 成为 EGFR-TKI 一线治疗领域里程碑 2010 年 2 月 : The Lancet Oncology, The New England Journal of Medicine WJTOG3405,NEJ002 与 IPASS 相互印证, 开启靶向治疗新时代 2012 年 4 月 : The Lancet Oncology INFORM 探索 EGFR-TKI 维持治疗之路 2014 年 10 月 :ESMO Oral IMPRESS 为 EGFR-TKI 耐药后治疗提供了探索方向 11. Mok TS et al. N Engl J Med 2009, 361:947-957. 23. Nick T. et. al., Lancet 2005; 366: 1527 37. 12. Mitsudomi T, et al. Lancet Oncol 2010: 11:121-128. 24. E. S Kim et. al., Lancet 2008; 372: 1809 18 13. Maemondo M, et al. N Engl J Med 2010: 362:2380-2388 25. Li Zhang et. al., Lancet Oncol. 2012, 4: 1-10 26. Mok TS et.al., ESMO, abstract
第一部分 EGFR 基因突变检测的技术选择
检测技术选择考虑要素 基于不同标本类型的技术选择 基于不同敏感性的技术选择 基于检测位点数目多少的技术选 择 基于定性或者定量的技术选择
样本的质量决定检测的结果 突变检测最少需要多少的肿瘤细胞? 检测样本中至少含 200~400 个肿瘤细胞 使用 DNA 测序法, 所需要的肿瘤细胞含量 不少于 50% 高敏感性的方法也至少需要 10% 的肿瘤细 胞的含量 Robert P, et al. JTO 2010;5:1076~1085
胸腹水 细胞蜡块 smear preparations 正确评价肿瘤细胞成分 保留原始诊断标本 为后续检测保存材料
肿瘤细胞成分大于 50% 组织标本 可以选择相对不敏感的检测技术
肿瘤细胞含量少于 10% 的穿刺活 检组织 适用方法 : 定量 PCR 基因突变检测技术 ; 定量 PCR 检测突变阳性, 测序检测突变阴性
标本不同石蜡组织分别进行检测 组织学图片刮取范围病理学评估检测结果图突变类型 手术 ( 中至低分化 ) 腺癌 >80%, 全 手术,FBAC 20%, 刮取 (70%) 手术,FBAC, 胶原化 + 淋巴 细胞浸润, 50%, 不易刮 取 E746-A750 L858R Ct=30 E746-A750 难以读图
PCR: Real-time Detection 开展哪种方法检测 EGFR 突变? ARMS & PCR/ PNA-LNA TaqMan Pyro PCR/ PCR/ HRMA/ clamp assay Sequencing SURVEYOR RFLP dhplc 1% PCR: Real-time Detection ~10% Real-time PCR or qpcr ARMS-PCR TaqMan-PCR PCR Clean-up Pyrosequencing Rxn 5~10% O O O PCR SURVEYOR cleavage dhplc Sizing O Confirmation by sequencing O O PCR RFLP Electrophoresis Sizing PCR Heteroduplex Capillary Electrophoresis = Transfer product /add reagent/ open tube O O O Confirmation by sequencing O Confirmation by sequencing 3-10% 10% 3-12% O PCR/ Nested PCR/ ME-PCR/ Sequencing Sequencing Sequencing PCR Clean-up O O Sequencing Rxn Clean-up O O Capillary Sequencing 20~30% PCR PCR O O Clean-up O Sequencing Rxn O Clean-up O Capillary Sequencing PCR RFLP PCR O Clean-up O O O Sequencing Rxn Clean-up DNA 测序法 20~30% O O Capillary Sequencing <1% Steps 1 2 3 4 5 6 7
不同检测技术敏感度不同 检测技术 灵敏度 Sanger 测序法 20% PCR 基因扩增 qpcr >20% ARMS PNA-LNA clamp 等 1% TaqMan-PCR 10% 基因芯片 10% HRM-PCR <1% 焦磷酸测序 5% 焦磷酸测序 /COLD-PCR <0.5%
测序法与 qpcr 法比较 测序法 qpcr 敏感度 20% 1~10% 对 DNA 质 量要求高低 检测流程 扩增 - 电泳 - 纯化 - 单向引物扩增 - 终止 - 上机 - 读图 扩增 - 上机 - 读图 数据分析要求经验 直观严格执行说明书 仪器遗传分析仪荧光定量 PCR 仪 商用试剂盒无有 试剂成本低高 位点检测可以发现未知变异已知位点
EGFR 测序敏感性测试 测序结果比较. 由上至下突变型 DNA 分别为 0%, 5%, 10%, 15% 和 20% 浓度时的测序结果. 0 5% 10% 15% 20%
多基因多位点突变检测技术
肺腺癌 EGFR 突变检测亚型的多 少对阳性率的影响 ( 飞行质谱 ) 43 个亚型 野生型 突变型 检出例数 219 237 比例 219/456 (48.03%) 237/456 (51.97%) E18 G719X E19 Del E20 S768I 实现检测尽可能多的突变亚型!! E20 T790M E20 Ins E21 L858R 检出例数 7 98 4 2 8 120 比例 7/237 98/237 4/237 2/237 8/237 120/237 百分比 2.95% 41.35% 1.69% 0.84% 3.38% 50.63%
广州地区 422 例肺腺癌人群 EGFR 突变 检出率及其亚型分布 (ARMS-PCR 法 ) 21 和 20 exon 0.7% 19 和 20 exon 0.2% 20 exon 3.5% 19 exon 22.1% 21 exon 21.0% 18 exon 2.1% 18 和 20 exon 0.7% [ 类别名称 ]ild [ 百分比 ]
MassARRAY Assay Workflow Isolate DNA or RNA PCR >> Single Base Ext. or Cleavage chemistry Obtain primers Design assays Transfer assay products to SpectroCHIP 检测敏感度 :1% 突变体 DNA Marker selection Read assay products on Mass Spec; analyze data ~Days ~10 Hours
OncoCarta Panel v1.0 检测的 癌基因组合 19 个癌基因,238 突变类型 ; 检测的遗传变异包括单碱基置换, 不同长度片段插入和片段缺失 ; 仅限于检测报道的癌组织散发的, 已知编码区的突变 ; 检测广泛 RAS, RAF, CKIT 和 EGFR 等基因, 可以提供一个全面的发现基因变异的工具
高突变丰度 EGFR 基因 E746-A750del 突变, 突变丰度 = 突变 : 野生 =0.79:0.21
低突变丰度 EGFR 基因 E746-A750del 突变, 突变丰度 = 突变 : 野生 =0.3:0.7
156 例肺腺癌癌基因突变谱 野生型 突变型 多 41.7% 58.3% 23.1% 突 变 单突变 76.9% (70/91)
肺腺癌发生突变基因构成比 KIT 4.2% BRAF 4.2% PIK3CA 5.9% KRAS 10.9% EGFR 68.9% EGFR KRAS PIK3CA BRAF KIT AKT NRAS HRAS MET ERBB2 突变以 EGFR 为主,KRAS 次常见,PIK3CA KIT 及 BRAF 也占一定比例, 其他基因偶见突变 ;
规范化的 EGFR 基因突变技术选择 敏感突变 VS. 耐药突变 经典敏感突变 VS. 非经典敏感突变 定性检测 VS. 定量检测 更全面的 Exon19 缺失突变
第二部分 测序技术在肿瘤临床诊疗的应用
测序技术的发展简史 DNA 双螺旋结构发现 桑格测序法 大肠杆菌全基因组测序 流感嗜血杆菌全基因组测序 秀丽隐杆线虫全基因组测序 人类 全基因组 测序 二代测序技术问世 仅供医药卫生专业人士参考 三个二代测序平台问世 (Illumina ABI ROCHE) 检测通量达到 30-100GB 每周 单分子测序技术问世 Hi-Seq2000: 检测通量达到 600GB 每周 (5 个人全基因组 ) 小型化测序仪陆续问世 ( 更大的临床应用潜力 ) 检测通量达到 350GB 每周 2013 临床用囊性纤维化测序试剂盒及测序平台获 FDA 批准
二代测序技术 DNA 变异检测分析 : 全基因组测序 (Whole genome Resequencing) 外显子测序 (Exome-seq) 个性化目标区域测序 (Target region seq) 35
体细胞 DNA 变异检测 Point mutations (nucleotide substitutions) Small coding insertions/deletions (indels) Copy number alterations (CNAs) Chromosomal rearrangements (Matthew Meyerson et.al, nature reviews genetics,2010) 36
二代测序技术 RNA 表达分析 (RNA-sequencing) 转录组测序 (Transcriptome seq) 表达谱测序 (Expression profile) 小 RNA 测序 (mirna seq) 长非编码 RNA 测序 (lncrna seq) 37
肿瘤 RNA 变异检测 Gene expression Gene Fusion SOAPfus e Human Cancer and Adjacent Tissues Alternative Splicing SOAPsplice RNA sequencing Mutation SOAPsnv Intergrative Pathway Analysis RNA Editing Systematic Cancer Transcriptome Analysis Long Non-coding RNA 38
二代测序技术 表观调控分析技术 : DNA 甲基化 全基因组重亚硫酸盐测序 (WGBS) 甲基化 DNA 免疫共沉淀测序 (MeDIP-seq) 基于双酶切消化的重亚硫酸盐测序 (drrbs) DNA 羟甲基化 HMST-Seq 羟甲基化 DNA 免疫共沉淀测序 RNA 甲基化 组蛋白修饰 染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-Seq) 39
Method Instrument Cost* Sequence yield per run Sequencing cost per Gb* NGS for diagnostic ( 适用于目标基因测序 ) NEG for discovery ( 适用于全基因组 / 全外显子组测序 ) Illumina Miseq Ion Torrent PGM PacBio RS Illumina GAIIx Illumina Hiseq 2000 $128K $80K $695K $256K $654K $100K 1.5-2Gb 20-50Mb (314 chip), 100-200Mb (316 chip), 1Gb (318 chip) 100Mb 30Gb 600Gb N/A 一代测序 Chain termination (Sanger sequencing) $502 $1,000 (318 chip) $2,000 $148 $41 $1,000,000 Time per run 27 hours 2 hours 2 hours 10 days 11 days Observed raw error rate Read length Typical DNA requirements 几种测序平台主要参数比较 0.80% 1.71% 12.86% 0.76% 0.26% 0.01% Up to 150 bases ~200 bases ~1500 bases Up to 150 bases Up to 150 bases 20 minutes to 3 hours <1,000 bases * 所有价格来自于厂家在美国的官方报价 50-1,000ng 100-1,000ng ~1,000ng 50-1,000ng 50-1,000ng ~1,000ng 仅供医药卫生专业人士参考 Source: BMC Genomics 2012;13:341, http://en.wikipedia.org
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肿瘤基因组研究进入大数据时代 42
依据分子靶点的个体化医疗时代 2003 2012 基于单基因 单位点检测已不能满足个体化治疗的需求, 基于二代测序技术的多靶点基因检测是未来个体化治疗的趋势 43
肿瘤个体化检测介绍 检测技术 检测内容 检测 508 个基因外显子序列 解读 88 种肿瘤药物 目标区域捕获 + 高通量测序 检测优势 可检测 5% 以上的突变 灵敏度 :99% 特异性 :99% 肿瘤个体化基因检测 适用人群 肿瘤患者 样本类型 肿瘤组织 : 新鲜组织穿刺样本, 石蜡切片 对照 : 外周血
88 种抗癌药物 27 种化疗药 物 TP53 TPMT ERCC2 XPC XRCC1 GSTP1 ABCB1 ERCC1 ABCC4 MTHFR CYP1B1 ABCC1 ABCC2 DPYD ------ 化疗药物 药物靶点基因 33 种 FDA 批 准靶药 EGFR KRAS NRAS BRAF ALK ROS1 KIT PDGFRA MET RET ERBB2 PIK3CA PTEN AKT1 ------- 肿瘤个体化治疗基因检测 Oseq(508 基因 ) 细胞生存细胞凋亡基因组稳定性 MAPK 信号 RTK 信号 PI3K 信号 STAT 信号 TGFβ 信号 细胞周期 / 凋亡 靶向药物 28 种临床期 靶药 ABL2 AKT2 AKT3 AURKB CDK6 CHEK1 JAK3 IGF1R MDM2 MDM4 NOTCH1 PIK3R1 MEN1 SRSF2 --------- 癌症 12 条信号 通路 HH 信号 APC 信号 NOTCH 信号 转录调节 染色质修饰 结直肠癌 APC TP53 KRAS PIK3CA FBXW7 NRAS SMAD4 SMAD2 BRAF CTNNB1 MLL4 PTCH1 RB1 CDH1 PTCH1 ARID1A MLL2 --- DNA 损伤控制 肺癌 TP53 EGFR MLL3 CDKN2A MLL2 NF1 STK11 SMARCA4 SETBP1 ATRX CREBBP KDR ATM KRAS KEAP1 MALAT1 CRIPAK --- EPHB6 乳腺癌 PIK3CA TP53 GATA3 MAP3K1 CDH1 MLL3 MAP2K4 PTEN RUNX1 AKT1 PIK3R1 TBX3 MALAT1 CBFB FOXA1 CTCF NCOR1 --- CDKN1B 其他实体瘤 AJUBA ARFRP1 B4GALT3 BACH1 BAK1 BCL2 BCL2A1 BCL2L1 BCL2L11 BCL2L2 BCL6 BCORL1 BCR BLM BTG1 BTK C11orf30 --- C1R 所有实体瘤
癌症药物治疗现状 : 化疗 + 靶向 基因检测能够有效预测药物疗效及毒副作用
常用二代测序平台能检测哪些生物标志物? 服务于药物研发和个性化医疗 全基因组测序 外显子组测序 基因组结构 基因拷贝数 基因序列 基因融合 (gene fusion) 拷贝数变异 (CNV) 等位基因表达 (Allelic expression) 基因突变 (SNPs, indels) 仅供医药卫生专业人士参考 融合转录本 RNA 拷贝数 RNA 序列 RNA 测序
药物研发 :the story of vemurafenib Nature 2002;417:949 54 Cancer Res 2005;65:2412-21 Nature 2010;467:596 9 N. Engl. J. Med 2010;363:809 19 从高通量全基因组数据中筛选与恶性黑色素瘤相关的生物标志物 生物信息学统计发现 :66% 的恶性黑色素瘤中发现 BRAF 错义体突变, 其中的 80% 是 V600E 点突变 细胞实验发现 : 突变型 BRAF(V600E) 蛋白表现出更高的激酶活性 动物模型发现 : 表达突变型 BRAF(V600E) 的恶性黑色素瘤表现出更强的血管生成能力和瘤体生长速度 成功合成突变型 BRAF(V600E) 的靶向抑制剂 PLX4032 Phase I clinical trial 结合分析其他利用低通量技术获得的相关生物标志物研究成果 基因突变频率研究 蛋白功能研究 靶向药物合成 临床实验 2011 年 8 月 17 日,Vemurafenib 获得 FDA 批准, 用于治疗晚期黑色素瘤 vemurafenib 的名字来自于 V600E mutated BRAF inhibition 仅供医药卫生专业人士参考
仅供医药卫生专业人士参考
生物标志物 转化医学中靶向药物研发和个性化医疗的核心 生物标志物 (biomarker): 一个可以被客观检测或评估的, 并且能够反映生理事件 病理事件或者特定疗法药物反应的生物学参数 生物标志物应用标志物分类 HER2; EGFR, RAS 突变 UGT1A1, TMPT 突变 Hormone receptors FDG-PET, CT 成像 HbA1c 指导靶向药物用药选择 预测药物毒性反应 ( 用于指导剂量调整 ) 指示预后 指示肿瘤反应 指示糖尿病患者血糖情况 NIH biomarker definitions working group, 2001 Predictive biomarker ( 预测生物标志物 ) Predictive biomarker ( 预测生物标志物 ) Prognostic biomarker ( 预后生物标志物 ) Pharmacodynamic biomarker ( 药效生物标志物 ) Surrogate endpoint biomarkers ( 替代性终点生物标志物 ) 靶向药物研发和个性医疗的关注重点 仅供医药卫生专业人士参考 Modified from: Pharm Stat 2011;10(6):494-507.
二代测序技术在 遗传性肿瘤基因检测
肿瘤遗传易感基因检测 癌症分为散发性癌, 家族性癌和遗传性癌 ( 遵循孟德尔遗传规则的 ) 约 5-10% 的癌症是遗传的, 也就是说特定的基因上发生的突变会在家族中遗传, 遗传到这些突变的个体发生肿瘤的风险会极大地增加 目前, 已经有一些癌症的相关基因被发现 检测上述基因, 能够指导癌症患者及其亲属的癌症防治, 降低相应癌症的发生和死亡率 52
遗传性乳腺癌 / 卵巢癌 与遗传性乳腺癌 / 卵巢癌发生相关的基因包括 TP53, PTEN, STK11/, CDH1, CHEK2, ATM, MLH1, MSH2 等, 其中 最主要的是 :BRCA1/2 1 该突变基因携带率 : 遗传性乳腺癌 40%-45% 乳腺癌和卵巢癌高发家族 80% BRCA 突变基因携带者, 乳 腺癌和卵巢癌的患病风险显 著升高! 53
BRCA1 定位于 17q21, 约 100 kb, 含有 24 个外显子, 其中第 1 4 号外显子不编码氨基酸, 另外 22 个转录出 7.6 kb mrna, 最终可编码含 1863 个氨基酸的蛋白质 而第 11 号外显子较大, 长 3.4 kb 1810 54
BRCA2 定位在 13q12-13, 有 27 个外显子, 仅编码区就有 11.4K 其中 11 号外显子几乎含编码序列的一半, 完整的 BRCA2 编码 3418 个氨基酸的蛋白质 2036 55
女性,43 岁, 三阴癌, 双乳癌, 其姐同为乳腺癌患者 ; 检测结果 : Gene NM W/T Ratio Geno Function Sub_reg Mut_name BRCA1 NM_007294 0/1_152_98_249_0.39 Het Frameshift CDS5 c.335_335dela BRCA2 NM_000059 0/1_122_125_249_0.50 Het Missense CDS10 BRCA2 NM_000059 1/1_0_244_245_1 Hom Missense CDS13 Sanger 验证 注 : 红色标注后面空格位置表示删除该点的 reads 乳腺癌患者 control p.ile1929val (ATT>GTT) p.val2466ala (GTA->GCA) 注 : 该样本过滤掉同义突变等不影响基因功能的突变, 只保留非同义突变 剪切位点突变 插入 缺失等影响基因功能的突变, 在 CDS 区发现了以上三种变异 通过与现有数据库比对,BRCA2 两个突变目前与疾病意义不明确 BRCA1 中出现的该变异导致 BRCA 基因编码框截断, 如图红色部分 整个编码区在第 117 氨基酸处终止 ( 该基因编码 1863 个 AA) MDLSALAVEEVQNVINAMQKILECPICLELIKEPVSTKCDHIFCKFCMLKLLNQKKG PSQCPLCKNDITKASLQESTAFSQLVEELLKIICAFQLDTGLEYANSYNFAKKEITLLNI 117AA effect 1863AA X MDLSALAVEEVQNVINAMQKILECPICLELIKEPVSTKCDHIFCKFCMLKLLNQKKG PSQCPLCKNDITKASLQESTAFSQLVEELLKIICAFQLDTGLEYANSYNFAKKENNSP EHLKDEVSIIQSMGYANAAKALLQSEPENPSLQETSLSVQLSNLGTVATLATKQAIQ PQKTSVYIELGSDSSEDTVNKATYCSVGDQELLQITPQGTADEISLDSAKKAACEFS ETDVTNTEHHQPSNNDLNTTEKAAAEAHPEKYQGSSVSNLHVEPCGTNTHASSLQ HENSSLLLTKDAMNVEKAEFCNKSKQPGLAASQHNAWAGSKETCNDAATPSTEK KVDLNADPLCEAKEWNKQKLPCSENPADTEDVPWITLNSSIQKVNEWFSASDELL GSDDSHDGESESNAKVADVLDVLNEVDEYSGSSEKIDLLASDPHEALICKSEAVHS KSVESNIEDKIFGKTYAKKASLPNLSHVTENLIIGAFVTEPQIIQEAPLTNKLKAKAAP TSGLHPEDFIKKADLAVQKTPEMINQGTNQTEQNGQVMNITNSGHENKTKGDSI QNEKNPNPIESLEKESAFKTKAEPISSSISNMELELNIHNSKAPKKNALAAKSSTAHI HALELVVSANLSPPNCTELQIDSCSSSEEIKKKKYNQMPVAHSANLQLMEGKEPAT GAKKSNKPNEQTSKAHDSDTFPELKLTNAPGSFTKCSNTSELKEFVNPSLPAEEKEE KLETVKVSNNAEDPKDLMLSGEAVLQTEASVESSSISLVPGTDYGTQESISLLEVSTL GKAKTEPNKCVSQCAAFENPKGLIHGCSKDNANDTEGFKYPLGHEVNHSAETSIE MEESELDAQYLQNTFKVSKAQSFAPFSNPGNAEEECATFSAHSGSLKKQSPKVTFE CEQKEENQGKNESNIKPVQTVNITAGFPVVGQKDKPVDNAKCSIKGGSAFCLSSQ FAGNETGLITPNKHGLLQNPYAIPPLFPIKSFVKTKCKKNLLEENFEEHSMSPEAEM GNENIPSTVSTISANNIAENVFKEASSSNINEVGSSTNEVGSSINEIGSSDENIQAEL GANAGPKLNAMLALGVLQPEVYKQSLPGSNCKHPEIKKQEYEEVVQTVNTDFSPY LISDNLEQPMGSSHASQVCSETPDDLLDDGEIKEDTSFAENDIKESSAVFSKSVQKG ELSASPSPFTHTHLAQGYAAGAKKLESSEENLSSEDEELPCFQHLLFGKVNNIPSQST AHSTVATECLSKNTEENLLSLKNSLNDCSNQVILAKASQEHHLSEETKCSASLFSSQC SELEDLTANTNTQDPFLIGSSKQMAHQSESQGVGLSDKELVSDDEEAGTGLEENN QEEQSMDSNLGEAASGCESETSVSEDCSGLSSQSDILTTQQADTMQHNLIKLQQE MAELEAVLEQHGSQPSNSYPSIISDSSALEDLANPEQSTSEKAVLTSQKSSEYPISQ NPEGLSADKFEVSADSSTSKNKEPGVEASSPSKCPSLDDAWYMHSCSGSLQNANY PSQEELIKVVDVEEQQLEESGPHDLTETSYLPAQDLEGTPYLESGISLFSDDPESDPS EDAAPESAAVGNIPSSTSALKVPQLKVAESAQSPAAAHTTDTAGYNAMEESVSAE KPELTASTEAVNKAMSMVVSGLTPEEFMLVYKFAAKHHITLTNLITEETTHVVMK TDAEFVCEATLKYFLGIAGGKWVVSYFWVTQSIKEAKMLNEHDFEVAGDVVNGA NHQGPKAAAESQDAKIFAGLEICCYGPFTNMPTDQLEWMVQLCGASVVKELSSF TLGTGVHPIVVVQPDAWTEDNGFHAIGQMCEAPVVTAEWVLDSVALYQCQELD TYLIPQIPHSHYX 56
针对常见的一些遗传性肿瘤相关基因进行检测, 可为这些肿 瘤的患者及其家庭成员提供疾病诊断 筛查以及风险预测的 参考依据 检测疾病种类 检测基因数目 检测疾病种类 检测基因数目 乳腺癌 2/21 甲状旁腺癌 2 卵巢癌 2/21 嗜铬细胞瘤 8 结直肠癌 5/14 多发性神经纤维瘤 2 胃癌 7 软骨肉瘤 2 肾癌 4 黑色素瘤 2 前列腺癌 7 多发性内分泌瘤 3 家族性副神经节瘤 4 视网膜母细胞瘤 1 甲状腺癌 2 参考 : 权威文献报道以及相关肿瘤变异数据库 http://www.sanger.ac.uk/genetics/cgp/census/germline_mutation.shtml
第三部分 分子诊断的个体化服务模式现状
第一部分 : 检测成熟度模式 Gene tests: 已发现 3007 种基因疾病,2776 种已经进入临床检测 成熟的规范化检测 明确进入指南 明确方法学 明确解读 明确应用 - HBV-DNA - BCR-ABL1 - EGFR KRAS - HER2 探索式的检测 明确进入指南 方法学层次多样 解读多样化 干预手段多样化 - 甲基化检测 - 大基因 BRCA1 检测 - CTC cfdna 检测 - 化疗药物敏感性预测 不朽的经典!! OR 忽悠病人钱财的肿瘤个体化检测? 退出临检的舞台!! 盲从式的检测 未进入指南 东西方差异明显 眉毛胡子一把抓 - 300~500 个基因测序 - 无人群数据支持的 SNP 筛查 - 噱头 基因的筛查
第二部分 : 检测机构模式 医院内设科室
全方位地对社会开放 特色专项诊断服务 --- 综合型 / 专业型 起点高 -- 高新技术平台 -- 高端检测 -- 与国际药厂 仪器试剂公司建立合作关系 质量管理日趋完善 不惜血本打造质量文化 第三方检测的模式 力求 PK 监督管理体系和政策不完善 与临床脱钩, 管中窥豹 缺乏富于临床及诊断双重经验的一线人员 临床 患者对外包的认知度偏低 外包的 奖励 机制
分子检测的 5 大制约因素 认识局限 技术限制 场地限制 人员限制 设备限制 现状 : 一搭台 二唱戏 三级甲等医院必须开展分子病理检测!? 最简单 较原始的配置 分子病理实验室水平参差不齐 无专职医生及技术员 无专业培训 病例零散, 成本极高 基层医院的尴尬 分子检测 = FISH= + PCR= + 什么情况? 基因? AND / OR
百家争鸣 省市中心医院 病理科检验科胸科遗传实验室血液科妇科产科传染科 化零为整 : 设立分子检测中心科室 小时代 资源分散 各自为阵 无整体协调 大时代 集中投入 整合优势资源 培养专业队伍 医学精细管理
国内医院首家独立进行分子检测的 二级科室
联合实验室的成立 中山大学肿瘤医院 - 华大基因研究 院联合实验室成立 基层医院分子检测 / 分子病理联合 实验室成立 标志着区域化中心检测模式的形成
检验 病理 外科 分子检测 区域中心实验室 影像 --- 形成 2 个中心 内科 多学科的协作中心 预后分层 药物毒性预测 发病风险预测 分子检测 靶向药物筛选 辅助诊断 多项目的整合中心
实现院内的中心科室检测 区域中心实验室 达到区域性 国家级的建设标准 向省市 基层医院 社会全面开放 区域性资源整合 以检测为纽带, 带动区域临床多学科综合治疗 打破医院界限, 团结一致谋发展 实现区域性完美协作
医 院 海南 安徽 院 中心化检测 区域性学术 技术辐射 华南地区分子病理/ 分子诊断主任论坛 暨国家级继续教育 分子病理技术在现代肿瘤诊治中的应用 广州.2014 基层帮扶 :7 省 11 家名院互访 广东省抗癌协会分子诊断专业委员会成立在即
个体化医学检测试点单位 契机 : 任务 : 2014.2: 卫计委叫停 测序 检测 2014.3: 高通量基因检测技术临床试点单位申报 2014.6: 个体化医学检测试点单位正式授牌 2014.7: 基因测序仪及检测试剂盒获市场准入资格 承担个体化医学检测相关管理办法及技术指南验证 ; 实验室开发的个体化医学检测项目进行验证 评价及先期试行 ; 在项目 技术或产品的准入 审批 收费 物价审批及推广应用方面与相关部门沟通
速度与质量的平衡 各级监管机构的保驾护航各类技术规范的严格控制 -- 体外诊断试剂市场准入技术评估 医疗器械监督管理条例 个体化医学检测 LDT 研制技术规范 转化医学 临床需求 的强大推动力
检测模式观念的转变 4P 医学 (4P medicine) 时代来临 联合基因建立以基因组技术为核心的 4P 医学 新模式
当今 : 重点在治疗 健康 医疗保健重点的转移 未来 : 重点在发病的全过程 健康 --- 疾病医学 向 健康医学 发展 易感 受袭 重点 : 发病全程, 更广泛意义的个体化 易感 受袭 重点 患病 患病
个体化检测在疾病预防及预测中的作用 基因型 表型 通过检验诊断技术分析 基因生物标志物 SNPs... 对环境 / 家族史的研究 预测疾病可能性 个体疾病筛查医学预防干预 生活方式调整 如进行肠镜 / 乳腺 X 光 /PSA 筛查等 通过戒烟 运动 调节饮食等 更健康的生活
患者 筛查者 遗传性肿瘤筛查模式 个体化提供医疗保健服务 检测通道咨询解释 临床 保健医生 提供检测信息咨询报告 检测中心 接受咨询 决定检测项目并送检 解释检测结果的临床意义 送检 送检 检测中心
小结 在遗传性肿瘤基因检测领域应用广泛, 可同时检 测点突变, 插入缺失, 已知及未知拷贝数变化, 相对传统技术具有强大优势 ; 针对肿瘤个体化治疗基因检测, 能够解决临床组 织样本量少, 一次检测多个基因, 全面了解患者治 疗相关突变信息, 灵敏度较高 ; 高通量测序技术对血浆循环肿瘤 DNA 检测在用药 检测和疾病进展监测具有广泛的应用潜力
谢谢!