中华人民共和国国家标准 GB 5413.9 2010 食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素 A D E 的测定 National food safety standard Determination of vitamin A, D, E in foods for infants and young children, milk and milk products 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施 中华人民共和国卫生部 发布
前 言 本标准代替 GB/T 5413.9-1997 婴幼儿配方食品和乳粉维生素 A D E 的测定 本标准与 GB/T 5413.9-1997 相比, 主要变化如下 : 抗氧化剂由原来的焦性没食子酸改为抗坏血酸 ; 将处理方法中的加热回流改为恒温皂化操作 ; 增加了标准溶液的校正 ; 将原有的单点定量改为标准曲线法 ; 增加了维生素 D 回收率的测定 ; 将计算公式进行修改 本标准附录 A 为规范性附录, 附录 B 为资料性附录 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 : GB 5413-1985 GB/T 5413.9-1997 I
食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素 A D E 的测定 1 范围 本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素 A D E 的测定方法 本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素 A D E 的测定 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本标准 凡是不注日期的引用文件, 其最新版本 ( 包括所有的修改单 ) 适用于本标准 3 原理 试样皂化后, 经石油醚萃取, 维生素 A E 用反相色谱法分离, 外标法定量 ; 维生素 D 用正相色谱法净化后, 反相色谱法分离, 外标法定量 4 试剂和材料 除非另有规定, 本方法所用试剂均为分析纯或以上规格, 水为 GB/T 6682 规定的一级水 4.1 α- 淀粉酶 : 酶活力 1.5 U/mg 4.2 无水硫酸钠 4.3 异丙醇 : 色谱纯 4.4 乙醇 : 色谱纯 4.5 氢氧化钾水溶液 : 称取固体氢氧化钾 250 g, 加入 200 ml 水溶解 4.6 石油醚 : 沸程 30 ~60 4.7 甲醇 : 色谱纯 4.8 正己烷 : 色谱纯 4.9 环己烷 : 色谱纯 4.10 维生素 C 的乙醇溶液 (15 g/l) 4.11 维生素 A D E 标准溶液 4.11.1 维生素 A 标准储备液 ( 视黄醇 )(100 μg/ml): 精确称取 10 mg 的维生素 A 标准品, 用乙醇 (4.4) 溶解并定容于 100 ml 棕色容量瓶中 1
4.11.2 维生素 E 标准储备液 (α- 生育酚 )(500 μg/ml): 精确称取 50 mg 的维生素 E 标准品, 用乙醇 (4.4) 溶解并定容于 100 ml 棕色容量瓶中 4.11.3 维生素 D 2 标准储备液 (100 μg/ml): 精确称取 10 mg 的维生素 D 2 标准品, 用乙醇 (4.4) 溶解并定容于 100 ml 棕色容量瓶中 4.11.4 维生素 D3 标准储备液 (100 μg/ml): 精确称取 10 mg 的维生素 D 3 标准品, 用乙醇 (4.4) 溶解并定容于 100 ml 棕色容量瓶中 注 : 维生素 A D E 标准储备液均须 -10 以下避光储存 标准工作液临用前配制 标准储备溶液用前需校正, 见附录 A 5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪, 带紫外检测器 5.2 旋转蒸发器 5.3 恒温磁力搅拌器 :20 ~80 5.4 氮吹仪 5.5 离心机 : 转速 5000 转 / 分钟 5.6 培养箱 :60 ±2 5.7 天平 : 感量为 0.1 mg 6 分析步骤 6.1 试样处理 6.1.1 含淀粉的试样称取混合均匀的固体试样约 5 g 或液体试样约 50 g( 精确到 0.1 mg) 于 250 ml 三角瓶中, 加入 l g α- 淀粉酶 (4.1), 固体试样需用约 50 ml 45 ~50 的水使其溶解, 混合均匀后充氮, 盖上瓶塞, 置于 60 ±2 培养箱 (5.6) 内培养 30 min 6.1.2 不含淀粉的试样称取混合均匀的固体试样约 10 g 或液体试样约 50 g( 精确到 0.1 mg) 于 250 ml 三角瓶中, 固体试样需用约 50 ml 45 ~50 水使其溶解, 混合均匀 6.2 测定维生素 D 的试样需要同时做回收率实验 6.3 待测液的制备 6.3.1 皂化 : 于上述处理的试样溶液中加入约 100 ml 维生素 C 的乙醇溶液 (4.10), 充分混匀后加 25 ml 氢氧化钾水溶液 (4.5) 混匀, 放入磁力搅拌棒, 充氮排出空气, 盖上胶塞 1000 ml 的烧杯中加入约 300 ml 的水, 将烧杯放在恒温磁力搅拌器 (5.3) 上, 当水温控制在 53 ±2 时, 将三角瓶放入烧杯中, 磁力搅拌皂化约 45 min 后, 取出立刻冷却到室温 6.3.2 提取 : 用少量的水将皂化液全部转入 500 ml 分液漏斗中, 加入 100 ml 石油醚 (4.6), 轻轻摇动, 排气后盖好瓶塞, 室温下振荡约 10 min 后静置分层, 将水相转入另一 500 ml 分液漏斗中, 按上述方法进行第二次萃取 合并醚液, 用水洗至近中性 醚液通过无水硫酸钠过滤脱水, 滤液收入 500 ml 2
圆底烧瓶中, 于旋转蒸发器上在 40 ±2 充氮条件下蒸至近干 ( 绝不允许蒸干 ) 残渣用石油醚转移至 10 ml 容量瓶中, 定容 6.3.3 从上述容量瓶中准确移取 2.0 ml 石油醚溶液放入试管 A 中, 再准确移取 7.0 ml 石油醚溶液放入另一试管 B 中, 将试管置于 40 ±2 的氮吹仪 (5.4) 中, 将试管 A 和 B 中的石油醚吹干 向试管 A 中加 5.0 ml 甲醇 (4.7), 振荡溶解残渣 向试管 B 中加 2.0 ml 正己烷 (4.8), 振荡溶解残渣 再将试管 A 和试管 B 以不低于 5000 转 / 分钟的速度离心 10 min, 取出静置至室温后待测 A 管用来测定维生素 A E,B 管用来测定维生素 D 6.4 测定 6.4.1 维生素 A E 的测定 6.4.1.1 色谱参考条件色谱柱 :C 18 柱,250 mm 4.6 mm,5 μm, 或具同等性能的色谱柱 流动相 : 甲醇 (4.7) 流速 :1.0 ml/min 检测波长 : 维生素 A:325 nm; 维生素 E:294 nm 柱温 :35 ±1 进样量 :20 μl 6.4.1.2 维生素 A E 标准曲线的绘制分别准确吸取维生素 A 标准储备液 (4.11.1)0.50 ml 1.00 ml 1.50 ml 2.00 ml 2.50 ml 于 50 ml 棕色容量瓶中, 用乙醇定容至刻度混匀 此标准系列工作液浓度分别为 1.00 μg/ml 2.00 μg/ml 3.00 μg/ml 4.00 μg/ml 5.00 μg/ml 分别准确吸取维生素 E 标准储备液 (4.11.2)1.00 ml 2.00 ml 3.00 ml 4.00 ml 5.00 ml 于 50 ml 棕色容量瓶中, 用乙醇定容至刻度混匀 此标准系列工作液浓度分别为 10.0 μg/ml 20.0 μg/ml 30.0 μg/ml 40.0 μg/ml 50.0 μg/ml 分别将维生素 A E 标准工作液注入液相色谱仪中 ( 色谱图参见附录 B), 得到峰高 ( 或峰面积 ) 以峰高 ( 或峰面积 ) 为纵坐标, 以维生素 A E 标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素 A E 标准曲线 6.4.1.3 维生素 A E 试样的测定将试液 (6.3.3 中 A 管 ) 注入液相色谱仪中, 得到峰高 ( 或峰面积 ), 根据各自标准曲线得到待测溶液中维生素 A E 的浓度 6.4.2 维生素 D 的测定 6.4.2.1 维生素 D 待测液的净化 6.4.2.1.1 色谱参考条件 色谱柱 : 硅胶柱,150 mm 4.6 mm, 或具同等性能的色谱柱 流动相 : 环己烷 (4.9) 与正己烷 (4.8) 按体积比 1:1 混合, 并按体积分数 0.8 % 加入异丙醇 (4.3) 流速 :1 ml/min 波长 :264 nm 柱温 :35 ±1 进样体积 :500 μl 6.4.2.1.2 取约 0.5 ml 维生素 D 标准储备液 (4.11.4) 于 10 ml 具塞试管中, 在 40 ±2 的氮吹仪 (5.4) 上吹干 残渣用 5 ml 正己烷振荡溶解 取该溶液 50 μl 注入液相色谱仪中测定, 确定维生素 D 保留时间 然后将 500 μl 待测液 (6.3.3 中 B 管 ) 注入液相色谱仪中, 根据维生素 D 标准溶液保留时间收集维生素 D 馏分于试管 C 中 将试管 C 置于 40 ±2 条件下的氮吹仪中吹干, 取出准确加入 1.0 ml 甲醇 (4.7), 残渣振荡溶解, 即为维生素 D 测定液 3
6.4.2.2 维生素 D 测定液的测定 6.4.2.2.1 参考色谱条件色谱柱 :C 18 柱,250 mm 4.6 mm,5μm, 或具同等性能的色谱柱 流动相 : 甲醇 (4.7) 流速 :1 ml/min 检测波长 :264 nm 柱温 :35 ±1 进样量 :100 μl 6.4.2.2.2 标准曲线的绘制分别准确吸取维生素 D 2 ( 或 D 3 ) 标准储备液 (4.11.3 4.11.4)0.20 ml 0.40 ml 0.60 ml 0.80 ml 1.00 ml 于 100 棕色容量瓶中, 用乙醇定容至刻度混匀 此标准系列工作液浓度分别为 0.200 μg/ml 0.400 μg/ml 0.600 μg/ml 0.800 μg/ml 1.000 μg/ml 分别将维生素 D 2 ( 或 D 3 ) 标准工作液注入液相色谱仪中, 得到峰高 ( 或峰面积 ), 参见附录 B 以峰高 ( 或峰面积 ) 为纵坐标, 以维生素 D 2 ( 或 D 3 ) 标准工作液浓度为横坐标分别绘制标准曲线 6.4.2.2.3 维生素 D 试样的测定吸取维生素 D 测定液 (6.4.2.1 中 C 管 )100 μl 注入液相色谱仪中 ( 色谱图参见附录 B), 得到峰高 ( 或峰面积 ), 根据标准曲线得到维生素 D 测定液中维生素 D 2 ( 或 D 3 ) 的浓度 维生素 D 回收率测定结果记为回收率校正因子 f, 代入测定结果计算公式 (2), 对维生素 D 含量测定结果进行校正 7 分析结果的表述 7.1 维生素 A 含量的计算 维生素 A 含量按 (1) 计算 : cs 10 / 2 5 100 X = (1) m 式中 : X 试样中维生素 A 的含量, 单位为微克每百克 (μg/100 g); c s 从标准曲线得到的维生素 A 待测液的浓度, 单位为微克每毫升 (μg/ml); m 试样的质量, 单位为克 (g) 注 :1 μg 视黄醇 = 3.33 IU 维生素 A 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示, 结果保留三位有效数字 7.2 维生素 D 含量的计算 维生素 D 含量按 (2) 计算 : X cs 10/ 7 2 2 100 = (2) m f 式中 : X 试样中维生素 D 2 ( 或 D 3 ) 的含量, 单位为微克每百克 (μg/100 g); c s 从标线得到的维生素 D 2 ( 或 D 3 ) 待测液的浓度, 单位为微克每毫升 (μg/ml); m 试样的质量, 单位为克 (g); 4
f 回收率校正因子 注 : 试样中维生素 D 的含量以维生素 D 2 和 D 3 的含量总和计 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示, 结果保留三位有效数字 7.3 维生素 E 含量维生素 E 含量按 (3) 计算 : X = c s 10 / 2 5 100 m 1000 (3) 式中 : X 试样中维生素 E(α- 生育酚 ) 的含量, 单位为毫克每百克 ( mg/100 g); c s 从标准曲线得到的维生素 E 待测液的浓度, 单位为微克每毫升 (μg/ml); m 试样的质量, 单位为克 (g) 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示, 结果保留三位有效数字 8 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值, 维生素 A E 不得超过算术平均值的 5%, 维生素 D 不得超过算术平均值的 10 % 9 其他 本标准检出限 : 维生素 A 为 1 µg/100 g 维生素 E 为 10.00 µg/100 g 维生素 D 为 0.20 µg/100 g 5
附录 A ( 规范性附录 ) 标准溶液浓度校正方法 维生素 A D E 标准储备液配制后需要进行校正, 具体操作如下 : 分别取维生素 A D E 标准储备液若干微升, 分别注入至含有 3.00 ml 乙醇的比色皿中, 根据给定波长测定各维生素的吸光值, 按表 A.1 给定的条件进行测定, 通过下列公式计算出该维生素的浓度 表 A.1 各维生素吸光值的测定条件 1% 标准品加入标准储备液的量 (μl) 比吸光系数 E cm 波长 λ(nm) 视黄醇 (A) V 1835 325 α- 生育酚 (E) V 71 294 麦角钙化甾醇 (D 2 ) V 485 264 胆钙化醇 (D 3 ) V 462 264 浓度计算按式 (4): A 1 3.00 C = (4) E 3 100 V 10 式中 : C 维生素 A D E 浓度, 单位为克每毫升 (g/ml); A 维生素 A D E 的平均紫外吸光值 ; V 加入标准储备液的量, 单位为微升 (μl); E A D E 维生素 1 % 比色光系数 ; 3.00 标准储备液稀释倍数 3 V 10 6
附录 B ( 资料性附录 ) 标准品液相色谱图 B.1 维生素 A E D3 D2 标准品液相色谱图 维生素 A E D 3 D 2 标准品液相色谱图见图 B.1~ 图 B.4 0.030 0.025 0.020 维生素 A - 5.158 AU 0.015 0.010 0.005 0.000 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 分钟 图 B.1 维生素 A 标准品液相色谱图 0.018 0.016 0.014 0.012 AU 0.010 0.008 0.006 维生素 E - 14.059 0.004 0.002 0.000 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 分钟 图 B.2 维生素 E 标准品液相色谱图 7
0.0018 0.0016 0.0014 AU 0.0012 0.0010 0.0008 0.0006 0.0004 维生素 D3-11.486 0.0002 0.0000-0.0002-0.0004-0.0006-0.0008 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 分钟 图 B.3 维生素 D3 标准品液相色谱图 0.0032 0.0030 0.0028 0.0026 0.0024 0.0022 0.0020 维生素 D2-10.384 0.0018 AU 0.0016 0.0014 0.0012 0.0010 0.0008 0.0006 0.0004 0.0002 0.0000 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 分钟 图 B.4 维生素 D2 标准品液相色谱图 8