污 水 生 物 毒 性 监 测 技 术 规 程 发 光 细 菌 急 性 毒 性 测 试 - 费 歇 尔 弧 菌 法 ( 试 行 ) 国 家 海 洋 局 生 态 环 境 保 护 司 2015 年 10 月
目 次 1 范 围... 1 2 规 范 性 引 用 文 件... 1 3 术 语 和 定 义... 1 4 方 法 原 理... 1 5 试 剂 和 材 料... 1 6 仪 器 和 设 备... 2 7 样 品 的 采 集 和 保 存... 3 8 样 品 预 处 理... 3 9 水 样 的 毒 性 测 试... 3 9.1 仪 器 预 热... 3 9.2 测 试 管 的 准 备... 3 9.3 复 苏 发 光 细 菌 冻 干 粉... 4 9.4 样 品 测 试... 4 10 参 比 毒 物 的 毒 性 测 试... 5 11 数 据 处 理... 5 11.1 样 品 的 发 光 抑 制 率 计 算... 5 11.2 半 数 抑 制 浓 度 IC 50 计 算... 5 12 毒 性 水 平 评 价... 6 13 分 析 测 试 报 告... 6 14 质 量 控 制 和 质 量 保 证... 6 15 注 意 事 项... 6 附 录 A ( 规 范 性 附 录 ) 发 光 细 菌 急 性 毒 性 的 分 析 测 试 报 告 内 容... 8 附 录 B ( 规 范 性 附 录 ) 样 品 信 息 及 测 试 条 件 的 报 表 格 式... 9 附 录 C ( 规 范 性 附 录 ) 测 试 结 果 的 报 表 格 式... 10 参 考 文 献... 11
1 范 围 本 规 程 规 定 了 以 发 光 细 菌 费 歇 尔 弧 菌 (Vibrio fischeri) 为 受 试 生 物 的 水 环 境 急 性 毒 性 测 试 与 毒 性 水 平 评 价 方 法 本 规 程 适 用 于 海 水 入 海 排 污 口 污 水 沉 积 物 间 隙 水 淡 水 及 实 验 室 条 件 下 化 合 物 溶 液 等 各 类 水 体 ( 盐 度 小 于 40) 的 急 性 毒 性 效 应 测 试 与 评 价 2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件, 仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件, 其 最 新 版 本 ( 包 括 所 有 的 修 改 单 ) 适 用 于 本 文 件 GB 17378.3 海 洋 监 测 规 范 第 3 部 分 样 品 采 集 贮 存 与 运 输 GB 17378.4 海 洋 监 测 规 范 第 4 部 分 海 水 分 析 GB/T 14914-2006 海 滨 观 测 规 范 HJ 506-2009 水 质 溶 解 氧 的 测 定 电 化 学 探 头 法 3 术 语 和 定 义 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 规 程 3.1 抑 制 率 inhibition rate,h 水 样 在 一 定 的 时 间 和 条 件 下 与 发 光 细 菌 接 触 后, 发 光 细 菌 的 发 光 量 所 降 低 的 百 分 比, 用 H 表 示 3.2 半 数 抑 制 浓 度 median inhibitory concentration,ic 50 水 样 在 一 定 的 时 间 和 条 件 下 与 发 光 细 菌 接 触 后, 发 光 细 菌 的 发 光 量 减 少 50% 的 浓 度 ( 参 比 毒 物 或 化 合 物 浓 度 以 mg/l 为 单 位 来 表 征, 环 境 水 样 以 样 品 液 的 百 分 浓 度 为 单 位 来 表 征 ) 4 方 法 原 理 水 样 在 一 定 的 时 间 和 条 件 下 与 发 光 细 菌 费 歇 尔 弧 菌 接 触 后, 发 光 细 菌 的 发 光 强 度 变 化 与 水 样 中 毒 性 组 分 总 浓 度 呈 负 相 关 关 系, 通 过 生 物 发 光 光 度 计 测 定 水 样 与 发 光 细 菌 接 触 15 min 后 的 发 光 抑 制 率 来 表 征 水 样 的 急 性 毒 性 水 平 5 试 剂 和 材 料 1
5.1 发 光 细 菌 : 菌 株 为 费 歇 尔 弧 菌 (Vibrio fischeri,nrrl B-11177) 费 歇 尔 弧 菌 冻 干 粉 封 装 于 透 明 小 玻 璃 瓶 中, 于 -18 至 -20 下 储 存 使 用 前, 添 加 补 充 液 和 稀 释 剂 使 发 光 细 菌 恢 复 活 性 后 用 于 毒 性 测 试 5.2 补 充 液 : 超 纯 水, 在 2 ~8 下 保 存 注 : 可 直 接 购 置 与 费 歇 尔 弧 菌 冻 干 粉 配 套 的 补 充 液, 若 自 行 制 备 则 需 高 温 灭 菌 5.3 稀 释 剂 :2% 氯 化 钠 溶 液, 于 2 ~8 下 保 存 注 : 可 直 接 购 置 与 费 歇 尔 弧 菌 冻 干 粉 配 套 的 稀 释 剂, 也 可 用 超 纯 水 自 行 配 制, 但 需 高 温 灭 菌 后 使 用 5.4 硫 酸 锌 贮 备 液 (0.16 g/l): 准 确 称 取 0.016 g 七 水 硫 酸 锌 (ZnSO 4 7H 2 O, 分 析 纯, 预 先 在 干 燥 器 中 放 置 24 h 以 上 ) 于 50 ml 干 净 的 烧 杯 中, 用 少 量 稀 释 剂 (5.2) 溶 解 后, 全 量 转 入 100 ml 容 量 瓶 中, 用 稀 释 剂 (5.2) 定 容 至 标 线, 混 匀, 冷 藏 保 存 5.5 硫 酸 锌 使 用 液 : 移 取 1 ml 硫 酸 锌 贮 备 溶 液 (5.4), 用 稀 释 剂 定 容 至 10 ml 比 色 管, 配 制 浓 度 为 16 mg/l 硫 酸 锌 使 用 液 ; 再 移 取 5 ml 浓 度 为 16 mg/l 的 硫 酸 锌 使 用 液, 用 稀 释 剂 定 容 至 10 ml 比 色 管, 配 制 浓 度 为 8 mg/l 的 硫 酸 锌 使 用 液 ; 以 此 类 推, 采 用 逐 级 稀 释 的 方 法 配 制 浓 度 为 4 mg/l 2 mg/l 1 mg/l 的 硫 酸 锌 使 用 液 5.6 氯 化 钠 : 固 体, 分 析 纯 5.7 氢 氧 化 钠 溶 液 (1 mol/l): 称 取 4 g 分 析 纯 氢 氧 化 钠 溶 于 水, 并 用 水 稀 释 至 100 ml, 用 于 调 整 待 测 水 样 的 ph 值 5.8 盐 酸 溶 液 (1 mol/l): 取 8.5 ml 浓 盐 酸 ( 分 析 纯,ρ = 1.19 g/ml), 并 用 水 稀 释 至 100 ml, 用 于 调 整 待 测 水 样 的 ph 值 6 仪 器 和 设 备 仪 器 和 设 备 如 下 : 生 物 发 光 光 度 计, 带 控 温 反 应 模 块 (15 ±1 ) 和 控 温 培 养 模 块 (4 ±3 ); 测 试 管 : 仪 器 配 套 的 4 ml 玻 璃 试 管 ; 比 色 管 :10 ml; 容 量 瓶 :100 ml; 2
溶 解 氧 测 量 探 头 ; 盐 度 传 感 器 ; 浊 度 计 ; 计 时 器 或 秒 表 ; 可 调 节 微 量 移 液 器 :10 μl ~100 μl,100 μl~ 1 000 μl,1 000 μl~ 5 000 μl; 250 ml 采 样 瓶 : 洁 净 干 燥 棕 色 细 口 玻 璃 瓶 或 聚 乙 烯 瓶 7 样 品 的 采 集 和 保 存 水 样 采 集 按 照 GB 17378.3-2007 中 规 定 执 行 将 水 样 注 满 采 样 瓶, 上 端 不 得 留 有 空 气 间 隙, 盖 上 瓶 盖 水 样 采 集 后, 常 温 条 件 下 应 在 24 h 内 测 试 完 毕 若 在 24 h 内 不 能 完 成 测 试, 水 样 可 在 2 ~6 下 避 光 贮 存, 并 于 48 h 内 完 成 测 试 8 样 品 预 处 理 8.1 适 宜 测 定 的 水 样 ph 范 围 为 6.0~8.5 当 水 样 ph 值 小 于 6.0 时, 加 氢 氧 化 钠 溶 液 (5.7), 调 节 ph 值 约 为 6.0~6.5; 当 水 样 ph 值 大 于 8.5 时, 加 盐 酸 溶 液 (5.8) 调 节 ph 值 约 为 8.0~8.5 适 宜 测 定 的 水 样 盐 度 为 20~40 若 盐 度 小 于 20, 则 应 加 入 氯 化 钠 固 体 (5.6) 将 盐 度 调 整 至 22±2 盐 度 测 定 参 考 GB/T 14914-2006 海 滨 观 测 规 范 中 要 求 8.2 样 品 浊 度 若 大 于 10 NTU, 离 心 或 过 滤 后 测 定 参 考 GB 17378.4-2007 海 洋 监 测 规 范 第 4 部 分 海 水 分 析 中 规 定 的 浊 度 计 法 测 定 样 品 浊 度 8.3 测 试 前 应 摇 匀 样 品 或 曝 气 15 min, 使 样 品 溶 解 氧 含 量 大 于 3 mg/l 参 考 HJ 506-2009 水 质 溶 解 氧 的 测 定 电 化 学 探 头 法 规 定 的 方 法 测 定 样 品 溶 解 氧 9 水 样 的 毒 性 测 试 9.1 仪 器 预 热 打 开 生 物 发 光 光 度 计, 预 热 10 min 9.2 测 试 管 的 准 备 根 据 样 品 数 量, 准 备 相 应 数 量 的 测 试 管, 包 括 : 补 充 液 管 :1 个, 温 度 控 制 在 4 ±3 ; 稀 释 剂 管 :1 个, 温 度 控 制 在 15 ±1 ; 3
样 品 管 : 根 据 待 测 样 品 数 量 设 置 样 品 测 试 管 以 及 对 照 样 测 试 管, 温 度 控 制 在 15 ±1 ; 反 应 管 : 反 应 管 数 量 是 样 品 管 数 量 的 2 倍, 以 作 平 行 测 定, 温 度 控 制 在 15 ±1 9.3 复 苏 发 光 细 菌 冻 干 粉 9.3.1 配 制 发 光 细 菌 水 合 液 从 冷 冻 环 境 (-18 ~ 20 ) 中 取 出 发 光 细 菌 冻 干 粉 ( 含 量 约 为 0.0015 g ~ 0.0018 g) 小 瓶, 在 冷 藏 环 境 (2 ~ 6 ) 下 放 置 30 min 后, 启 开 并 轻 敲 小 瓶, 确 保 冻 干 细 菌 充 分 落 在 小 瓶 底 部 移 取 1 ml 补 充 液 (5.2) 至 补 充 液 管 中, 放 置 5 min 后, 迅 速 将 预 冷 后 的 1 ml 补 充 液 转 移 至 冻 干 粉 小 瓶 中, 平 摇 3 至 4 次, 然 后 快 速 将 摇 好 的 溶 液 再 转 移 回 补 充 液 管 中 用 1000 µl 移 液 器 充 分 地 混 合 补 充 液 管 中 的 溶 液 ( 每 次 吸 出 500 µl 再 放 回 补 充 液 管, 反 复 操 作 至 少 10 次 ) 此 时 补 充 液 管 中 为 发 光 细 菌 水 合 液, 应 在 3 h 之 内 使 用 注 : 补 充 液 管 的 温 度 要 求 控 制 在 4 ±3 9.3.2 配 制 发 光 细 菌 复 苏 液 在 稀 释 剂 管 中, 用 稀 释 剂 (5.3) 以 1:10 的 比 例 稀 释 9.3.1 中 配 制 的 发 光 细 菌 水 合 液, 制 备 发 光 细 菌 复 苏 液, 温 度 控 制 在 15 ±1 发 光 细 菌 复 苏 液 的 配 制 量, 可 根 据 待 测 样 品 数 量 酌 定 9.4 样 品 测 试 移 取 2 ml 稀 释 剂 (5.3) 于 样 品 管 中 用 作 对 照 样 测 定, 再 移 取 2 ml 待 测 样 品 至 样 品 管 待 测, 放 置 10 min 预 冷 后 按 下 述 步 骤 测 定 : 自 稀 释 剂 管 中 分 别 移 取 100 µl 发 光 细 菌 复 苏 液 至 各 反 应 管 中, 静 置 15 min 后, 随 机 取 一 个 反 应 管 用 作 仪 器 初 始 发 光 强 度 校 正, 若 初 始 发 光 强 度 不 满 足 毒 性 测 试 要 求, 则 需 更 换 冻 干 粉 ; 以 5s/ 个 ~20s/ 个 的 速 度 测 试 并 记 录 各 个 反 应 管 中 发 光 细 菌 复 苏 液 的 初 始 发 光 强 度, 对 照 的 初 始 发 光 强 度 记 作 I C0, 样 品 初 始 发 光 强 度 记 作 I T0 ; 快 速 从 样 品 管 中 按 顺 序 逐 个 移 取 900 µl 对 照 样 和 待 测 样 溶 液, 至 已 加 入 发 光 细 菌 复 苏 液 的 对 应 反 应 管 中, 混 匀, 反 应 15 min; 注 : 自 第 一 个 样 品 加 样 开 始 15min 倒 计 时, 确 保 各 个 反 应 管 的 反 应 时 间 为 15 min 4
反 应 15 min 后, 以 5s/ 个 ~20s/ 个 的 速 度 按 顺 序 逐 个 测 定 并 记 录 反 应 后 各 反 应 管 的 15 min 发 光 强 度, 对 照 样 品 的 15 min 发 光 强 度 记 作 I Ct, 测 试 样 品 的 15 min 发 光 强 度 记 作 I Tt 10 参 比 毒 物 的 毒 性 测 试 使 用 参 比 毒 物 硫 酸 锌 (ZnSO 4 7H 2 O) 来 评 估 发 光 细 菌 复 苏 后 的 相 对 敏 感 性 和 可 靠 性, 至 少 一 个 月 测 试 一 次, 或 者 在 启 用 一 批 新 的 发 光 细 菌 冻 干 粉 试 剂 时 进 行 测 试 测 试 步 骤 同 9.4 11 数 据 处 理 11.1 样 品 的 发 光 抑 制 率 计 算 本 规 程 中 规 定 使 用 反 应 15min 时 的 样 品 发 光 抑 制 率 H 进 行 毒 性 水 平 评 价, 计 算 方 法 见 式 (1): H = [(f I T0 ) I Tt ]/(f I T0 ) 100% = 1 I Tt /(f I T0 ) 100% (1) 式 中 : I T0 测 试 样 品 的 初 始 发 光 强 度 ; I Tt 测 试 样 品 反 应 15 min 时 的 发 光 强 度 ; f 反 应 15 min 校 正 因 子, 计 算 公 式 见 式 (2): f = I Ct /I C0 (2) 式 中 : I C0 对 照 样 品 的 初 始 发 光 强 度 ; I Ct 对 照 样 品 在 反 应 15 min 时 的 发 光 强 度 11.2 半 数 抑 制 浓 度 IC 50 计 算 发 光 强 度 的 减 弱 可 用 γ 量 度, 各 个 反 应 管 中 待 测 样 品 的 γ 值 计 算 方 法 见 式 (3): γ = [(f I T0 ) I Tt ]/I Tt = (f I T0 )/I Tt 1 (3) 用 C 表 征 样 品 浓 度 ( 参 比 毒 物 或 化 合 物 浓 度 以 mg/l 为 单 位 来 表 征, 环 境 水 样 以 样 品 液 的 百 分 浓 度 为 单 位 来 表 征 ), 将 γ 和 C 转 换 成 自 然 对 数 或 者 以 10 为 底 的 对 数 形 式, 采 用 最 小 二 乘 法 回 归, 然 后 将 γ 对 C 作 图, 线 性 拟 合, 见 式 (4): lnγ = blnc + lna (4) 式 中 : 5
C 样 品 浓 度 ; lna 回 归 直 线 的 截 距 ; b 回 归 直 线 的 斜 率 ; lnγ 对 应 浓 度 下 的 毒 性 响 应 方 程 的 显 著 性 水 平 取 0.05, 若 概 率 (P)< 0.05, 则 回 归 方 程 成 立 γ = 1 时, 发 光 量 损 失 50% 时 对 应 的 样 品 浓 度 即 为 IC 50, 计 算 公 式 见 式 (5): 50 - lna b IC e (5) 12 毒 性 水 平 评 价 样 品 毒 性 水 平 的 表 征 方 法 采 用 检 测 结 果 中 的 15min 发 光 抑 制 率 H 进 行 评 价 根 据 H 大 小 将 毒 性 等 级 分 为 3 级, 相 应 等 级 分 别 为 低 度 毒 性 风 险 中 度 毒 性 风 险 高 度 毒 性 风 险, 分 级 方 法 见 表 1 表 1 污 水 样 品 毒 性 风 险 等 级 评 价 方 法 毒 性 等 级 H 毒 性 风 险 等 级 Ⅰ < 30% 低 度 毒 性 风 险 Ⅱ 30% H < 80% 中 度 毒 性 风 险 Ⅲ 80% 高 度 毒 性 风 险 13 分 析 测 试 报 告 分 析 测 试 报 告 与 结 果 报 表 应 满 足 附 录 A 附 录 B 和 附 录 C 的 要 求 14 质 量 控 制 和 质 量 保 证 发 光 细 菌 急 性 毒 性 测 试 的 质 量 控 制 和 质 量 保 证 要 求 如 下 : 为 保 证 发 光 细 菌 冻 干 粉 活 性, 除 初 始 发 光 强 度 应 满 足 生 物 发 光 光 度 计 要 求 外, 对 照 样 的 反 应 15min 校 正 因 子 f 应 为 0.6~1.8, 否 则 需 要 更 换 冻 干 粉 ; 精 密 度 : 样 品 3 次 重 复 测 定 结 果 的 变 异 系 数 小 于 15%; 反 应 15 min, 参 比 毒 物 ZnSO 4 7H 2 O 的 IC 50 范 围 应 为 0.6 mg/l ~ 6 mg/l [1] 注 :ISO 标 准 方 法 中,14 家 实 验 室 的 参 比 毒 物 ZnSO 4 7H 2 O 的 IC 50 变 异 系 数 为 33.6%, 均 值 为 2.17 mg/l 15 注 意 事 项 本 方 法 执 行 中 应 注 意 以 下 事 项 : 除 非 另 作 说 明, 本 方 法 所 用 试 剂 均 为 分 析 纯, 水 为 去 离 子 水 或 蒸 馏 水 ; 6
对 于 色 度 较 高, 尤 其 是 红 色 棕 色 或 黑 色 的 水 样, 若 在 不 经 稀 释 的 情 况 下 测 得 发 光 抑 制 率 80%, 则 该 水 样 不 适 用 于 本 测 定 方 法 ; 调 节 ph 的 氢 氧 化 钠 或 盐 酸 加 入 液 的 体 积 不 得 多 于 样 品 总 体 积 的 5%; 本 方 法 所 用 发 光 细 菌 为 商 品 化 大 支 菌, 水 合 后 应 在 3 h 内 使 用 ; 商 品 化 小 支 菌 复 苏 时 不 使 用 补 充 液, 直 接 添 加 稀 释 剂 即 可 复 苏 (4 ±3 ), 复 苏 后 应 在 30 min 内 使 用 ; 注 : 其 他 商 品 化 发 光 细 菌 冻 干 粉 复 苏 的 具 体 步 骤 参 照 其 商 品 说 明 书 若 水 样 在 48 h 内 不 能 完 成 测 定, 将 水 样 采 集 于 聚 乙 烯 采 样 瓶 中, 于 -20 下 冷 冻 贮 存, 贮 存 时 间 不 得 大 于 2 个 月, 测 定 前 化 冻, 恒 温 至 室 温 后 测 定 7
附 录 A ( 规 范 性 附 录 ) 发 光 细 菌 急 性 毒 性 的 分 析 测 试 报 告 内 容 A.1 样 品 与 实 验 室 等 相 关 信 息 样 品 的 详 细 信 息, 包 括 样 品 类 型 采 样 地 点, 采 样 者 姓 名 和 采 样 方 法 ; 样 品 采 集 运 输 以 及 保 存 信 息 ; 实 验 室 名 称 ; 实 验 日 期 ; 实 验 名 称 ; 测 试 者 姓 名 ; 测 试 仪 型 号 等, 具 体 报 表 见 附 录 B A.2 毒 性 测 试 方 法 和 条 件 样 品 的 ph 值 溶 解 氧 盐 度 浊 度 等 信 息 ; 预 处 理 过 程 的 详 细 描 述 : 样 品 的 ph 值 溶 解 氧 盐 度 浊 度 色 度 等 调 整 信 息, 具 体 报 表 见 附 录 B A.3 测 试 结 果 参 比 毒 物 测 试 结 果 样 品 测 试 结 果 及 毒 性 风 险 等 级 等 测 试 结 果 报 表 见 附 录 C 8
附 录 B ( 规 范 性 附 录 ) 样 品 信 息 及 测 试 条 件 的 报 表 格 式 样 品 与 实 验 室 等 相 关 信 息 样 品 类 型 采 样 地 点 采 样 者 姓 名 测 试 日 期 实 验 室 名 称 样 品 运 输 条 件 发 光 细 菌 名 称 菌 株 编 号 采 样 时 间 采 样 方 法 样 品 数 量 仪 器 名 称 型 号 样 品 采 集 条 件 样 品 储 存 条 件 室 温 备 注 样 品 预 处 理 信 息 样 品 编 号 ph 值 溶 解 氧 (mg/l) 盐 度 浊 度 (NTU) 调 整 前 调 整 后 调 整 前 调 整 后 调 整 前 调 整 后 调 整 前 调 整 后 备 注 9
附 录 C ( 规 范 性 附 录 ) 测 试 结 果 的 报 表 格 式 样 品 对 照 试 验 测 试 序 列 号 初 始 发 光 强 度 I C0 测 量 值 15 min 发 光 强 度 I Ct 校 正 因 子 f f 均 值 1 2 样 品 测 试 试 验 及 评 价 等 级 样 品 编 号 测 试 序 列 号 1 2 3 4 5 6 测 量 值 I T0 I Tt 毒 性 风 险 等 H H 均 值 级 参 比 毒 物 对 照 试 验 测 试 序 列 号 测 量 值 初 始 发 光 强 度 I C0 15 min 发 光 强 度 I Ct 校 正 因 子 f f 均 值 1 2 参 比 毒 物 测 试 试 验 浓 度 测 试 序 列 号 (mg/l) 1 1 2 3 2 4 测 量 值 I T0 I Tt γ H H 均 值 4 8 16 参 比 毒 物 IC 50 : 5 6 7 8 9 10 测 试 人 签 字 : 审 核 人 签 字 : 10
参 考 文 献 [1] ISO. Water quality-determination of inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test), part 3, 11348-3. 2007: International Organization for Standardization, Geneva, Switzerland. 11