生物化学实验教案

生 物 化 学 实 验 教 案 实 验 须 知 : 一 验 课 的 目 的 1 培 养 锻 炼 科 学 的 思 维 方 法 实 事 求 是 的 科 学 态 度 和 严 谨 的 科 学 作 风, 提 高 分 析 问 题 和 解 决 问 题 的 能 力, 培 养 创 新 精 神 2 通 过 实 验 加 深 对 理 论 和 理 解, 掌 握 基 本 的 生 化 实 验 技 能 和 方 法, 为 今 后 的 学 习 研 究 和 生 产 打 下 一 定 的 基 础 二 一 般 要 求 1 要 有 实 验 报 告 和 预 习 报 告, 课 前 要 预 习, 了 解 实 验 内 容 基 本 原 理 和 大 体 的 步 骤 及 其 意 义, 做 到 心 中 有 数 2 实 验 中 要 正 确 操 作, 动 手 动 脑, 主 观 进 行 实 验 ; 掌 握 关 键, 力 求 得 出 正 确 的 结 论, 并 且 认 真 按 时 提 交 实 验 报 告 遵 守 制 度, 注 意 安 全, 爱 护 仪 器, 节 约 试 剂 三 注 意 的 问 题 及 几 项 规 定 1 实 验 报 告 : 实 验 名 称 目 的 和 要 求 试 剂 和 器 材 操 作 方 法, 详 细 解 释 实 验 现 象 2 每 次 实 验 前 清 点 仪 器, 如 有 缺 损 及 时 报 告, 填 写 损 耗 单 3 实 验 室 纪 律 : 不 得 迟 到 早 退, 有 病 有 事 必 须 请 假, 无 故 不 到 者, 按 旷 课 处 理 4 实 验 按 固 定 位 置, 仪 器 药 品 按 规 定 使 用, 严 禁 乱 用 乱 放, 严 禁 药 品 相 互 污 染 5 精 密 及 贵 重 仪 器 每 次 使 用 完 后 要 认 真 填 写 记 录 本 玻 璃 仪 器 使 用 完 后 要 清 洗 干 净, 放 回 自 己 的 柜 内 实 验 结 束 后, 台 面 要 收 拾 干 净, 预 习 报 告 批 阅 后 方 能 离 开 值 日 生 要 打 扫 干 净, 负 责 关 好 水 电 门 窗 四 实 验 成 绩 : 包 括 三 部 分 1 平 时 成 绩 : 操 作 实 验 报 告 和 预 习 报 告 实 验 纪 律 2 期 末 笔 试 考 试 3 期 末 操 作 考 试 第 1 页, 共 71 页

实 验 目 录 1 蛋 白 质 的 颜 色 反 应 2 蛋 白 质 的 等 电 点 测 定 及 沉 淀 反 应 3 氨 基 酸 的 分 离 鉴 定 纸 层 析 法 4 甲 醛 滴 定 法 测 定 氨 基 氮 5 血 清 蛋 白 的 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 6 糖 的 颜 色 反 应 7 糖 的 还 原 作 用 8 酶 的 特 性 ( 一 ) 温 度 对 酶 活 性 的 影 响 激 活 剂 和 抑 制 剂 对 酶 活 性 影 响 9 酶 的 特 性 ( 二 ) 酶 和 专 一 性 ph 对 酶 活 性 的 影 响 10 维 生 素 C 的 定 量 测 定 11 脂 肪 酸 的 β 氧 化 12 ALT 活 力 测 定 13 脂 肪 碘 值 的 测 定 * 14 总 氮 量 的 测 定 微 量 凯 氏 定 氮 法 * 15 酪 蛋 白 的 制 备 * 16 酵 母 RNA 的 分 离 与 组 分 鉴 定 17 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶 活 力 测 定 * 18 肌 糖 原 的 酵 解 作 用 19 小 麦 萌 发 前 后 淀 粉 酶 活 力 的 比 较 20 发 酵 过 程 中 无 机 磷 的 利 用 * 第 2 页, 共 71 页

蛋 白 质 蛋 白 质 一 切 生 物 体 内 重 要 的 组 成 成 分 蛋 白 质 是 由 二 十 种 氨 基 酸 以 肽 键 相 互 联 接 而 成 的 复 杂 的 高 分 子 化 合 物 溶 于 水 时 形 成 胶 体 溶 液 在 酸 碱 和 酶 的 作 用 下, 蛋 白 质 被 水 解 生 成 胨 肽, 最 后 形 成 氨 基 酸 蛋 白 质 分 子 依 靠 氢 键 盐 键 等 副 价 键 维 持 一 定 的 空 间 构 型 在 各 种 物 理 化 学 因 素 影 响 下, 由 于 副 价 键 的 破 裂, 使 其 空 间 结 构 遭 受 不 同 程 度 的 破 坏, 蛋 白 质 的 物 理 化 学 性 质 和 生 物 学 活 性 也 随 着 改 变 该 现 象 称 为 蛋 白 质 的 变 性 蛋 白 质 分 子 是 含 有 酸 性 基 团 和 碱 性 基 团 的 两 性 电 解 质 在 等 电 点 时, 蛋 白 质 分 子 的 酸 性 基 团 和 碱 性 基 团 的 解 离 度 相 等, 成 为 带 有 正 负 电 荷 相 等 的 两 性 离 子, 在 电 场 中 不 向 两 极 移 动, 并 且 极 易 沉 淀 氨 基 酸 组 成 不 同 的 蛋 白 质, 具 有 不 同 的 等 电 点 根 据 在 一 定 条 件 下 ( 如 ph 离 子 强 度 等 ) 它 们 所 带 电 荷 的 数 量 和 种 类 分 子 的 大 小 及 形 状 等 方 面 的 差 异, 可 以 采 用 电 泳 离 子 交 换 柱 层 析 等 方 法 对 它 们 进 行 分 离 分 析 许 多 化 学 因 素 可 以 改 变 蛋 白 质 的 水 中 的 溶 解 度, 产 生 可 逆 或 不 可 逆 沉 淀 这 些 因 素 ( 如 增 加 溶 液 的 离 子 强 度 降 低 溶 液 的 介 电 常 数 调 节 溶 液 的 ph 等 ) 以 及 一 些 沉 淀 剂 和 吸 附 剂 也 常 用 来 分 离 提 纯 蛋 白 质 或 除 去 蛋 白 质 一 目 的 和 要 求 实 验 一 蛋 白 质 的 性 质 实 验 ( 一 ) 蛋 白 质 及 氨 基 酸 的 呈 色 反 应 1. 了 解 构 成 蛋 白 质 的 基 本 机 构 单 位 及 主 要 连 接 方 式 2. 了 解 蛋 白 质 和 某 些 氨 基 酸 的 呈 色 反 应 原 理 3. 学 习 几 种 常 用 的 鉴 定 蛋 白 质 和 氨 基 酸 的 方 法 二 原 理 蛋 白 质 所 含 某 些 氨 基 酸 及 其 特 殊 结 构, 可 以 与 某 些 试 剂 发 生 反 应 生 成 有 颜 色 的 物 质 这 些 反 应 非 常 灵 敏, 常 用 为 蛋 白 质 或 氨 基 酸 的 定 性 和 定 量 测 定 的 依 据 下 面 分 别 介 绍 几 种 呈 色 反 应 1 双 缩 脲 反 应 一 切 蛋 白 质 及 二 肽 以 上 的 多 肽 Cu 2+ OH - 紫 红 色 化 合 物 尿 素 加 热 至 180 C 左 右, 生 成 双 缩 脲 并 放 出 一 分 子 氨 双 缩 脲 在 碱 性 环 境 中 能 与 Cu 2+ 结 合 生 成 第 3 页, 共 71 页

紫 红 色 化 合 物, 此 反 应 称 为 双 缩 脲 反 应 蛋 白 质 分 子 中 有 肽 键, 其 结 构 与 双 缩 脲 相 似, 也 能 发 生 此 反 应 可 用 于 蛋 白 质 的 定 性 或 定 量 测 定 反 应 如 式 下 : NH2 NH 2 C O C O NH2 180 NH + NH 3 NH2 C O C O NH 2 NH2 双 缩 脲 NH 2 O H H O 2 C O C N N C NH Cu 2+ HN.. Cu NH OH.. N C C O C N H O NH 2 O H 紫 红 色 化 合 物 双 缩 脲 反 应 不 仅 为 含 有 两 个 以 上 肽 键 的 物 质 所 有 含 有 一 个 肽 键 和 一 个 CS NH 2, CRH NH 2, CH 2 NH 2 CHNH 2 或 CHOHCH 2 NH 2 等 基 因 的 物 质 以 及 乙 二 酰 二 胺 等 物 质 也 有 此 反 应 NH 3 也 干 扰 此 反 应, 因 为 NH 3 与 Cu 2+ 可 生 成 暗 蓝 色 的 络 离 子 Cu(NH 3 ) 2+ 4 因 此, 一 切 蛋 白 质 或 二 肽 以 上 的 多 肽 都 有 双 缩 脲 反 应, 但 有 双 缩 脲 反 应 的 物 质 不 一 定 都 是 蛋 白 质 或 多 肽 2 茚 三 酮 反 应 所 有 的 蛋 白 质 和 氨 基 酸 + 茚 三 酮 蓝 紫 色 (Pro 和 Hyp 呈 黄 色 ) 除 脯 氨 酸, 羟 脯 氨 酸 和 茚 三 酮 反 应 产 生 黄 色 物 质 外, 所 有 α 氨 基 酸 及 一 切 蛋 白 质 都 能 和 茚 三 酮 反 应 生 成 蓝 紫 色 物 质 β 丙 氨 酸, 氨 和 许 多 一 级 胺 都 呈 正 反 应 尿 素, 马 尿 酸, 二 酮 吡 嗪 和 肽 键 上 的 亚 氨 基 不 呈 现 此 反 应 因 此, 虽 然 蛋 白 质 和 氨 基 酸 均 有 茚 三 酮 反 应, 但 能 与 茚 三 酮 呈 阳 性 反 第 4 页, 共 71 页

应 的 不 一 定 就 是 蛋 白 质 或 氨 基 酸 在 定 性, 定 量 测 定 中, 应 严 防 干 扰 物 存 在 该 反 应 十 分 灵 敏,1:1500 000 浓 度 的 氨 基 酸 水 溶 液 即 能 给 出 反 应, 是 一 种 常 用 的 氨 基 酸 定 量 测 定 方 法 茚 三 酮 反 应 分 为 两 步, 第 一 步 是 氨 基 酸 被 氧 化 形 成 CO 2,NH 3 和 醛, 水 合 茚 三 酮 被 还 原 成 还 原 型 茚 三 酮 ; 第 二 步 是 所 形 成 的 还 原 型 茚 三 酮 同 另 一 个 水 合 茚 三 酮 分 子 和 氨 缩 合 生 成 有 色 物 质 反 应 机 理 如 下 : O O C OH H C H C O C + H 2 N C COOH C + NH 3 + CO 2 + RCHO OH R R OH O 还 原 型 茚 三 酮 O O O O C H HO C C H C C + NH 3 + C C N C C + 3H 2 O C OH HO C C C O O O O 蓝 紫 色 此 反 应 的 适 宜 ph 值 为 5~7, 同 一 浓 度 的 蛋 白 质 或 氨 基 酸 在 不 同 ph 条 件 下 的 颜 色 深 浅 不 同, 酸 度 过 大 时 甚 至 不 显 色 3 黄 色 反 应 芳 香 族 氨 基 酸 和 所 含 芳 香 族 氨 基 酸 的 蛋 白 质 OH - 黄 色 物 质 含 有 苯 环 结 构 的 氨 基 酸, 如 酪 氨 酸 和 色 氨 酸 遇 硝 酸 后, 可 被 硝 化 成 黄 色 的 硝 基 苯 的 衍 生 物, 该 化 合 物 在 碱 性 溶 液 中 进 一 步 形 成 深 橙 色 的 硝 醌 酸 钠 ( 加 碱 后 颜 色 变 深 可 能 是 由 于 硝 醌 酸 化 合 物 的 生 成 ) 多 数 蛋 白 质 分 子 含 有 带 苯 环 的 氨 基 酸, 所 以 有 黄 色 反 应, 苯 丙 氨 酸 不 易 硝 化, 一 般 情 况 下 几 乎 无 黄 色 反 应, 若 同 时 加 入 少 量 浓 硫 酸, 则 能 得 到 明 显 的 正 反 应 皮 肤 指 甲 和 毛 发 等 遇 浓 硝 酸 变 黄 第 5 页, 共 71 页

即 为 这 种 反 应 的 结 果 OH + HNO 3 OH NaOH O NO 2 N ONa O 硝 基 酚 ( 黄 色 ) 邻 硝 醌 酸 钠 ( 橙 黄 色 ) 4 考 马 斯 亮 蓝 反 应 考 马 斯 亮 蓝 G250 具 有 红 色 和 蓝 色 两 种 色 调 在 酸 性 溶 液 中, 其 以 游 离 态 存 在 呈 棕 红 色 ; 当 它 与 蛋 白 质 通 过 疏 水 作 用 结 合 后 变 为 蓝 色 它 染 色 灵 敏 度 高, 比 氨 基 黑 高 3 倍 反 应 速 度 快, 约 在 2 分 钟 左 右 时 间 达 到 平 衡, 在 室 温 一 小 时 内 稳 定 在 0.01~1.0mg 蛋 白 质 范 围 内, 蛋 白 质 浓 度 与 A 595mm 值 成 正 比 所 以 常 用 来 测 定 蛋 白 质 含 量 三 器 材 1 度 管 及 试 管 架 2 吸 量 管 3 水 浴 锅 4 试 管 夹 5 电 炉 6 酒 精 灯 四 试 剂 2 卵 清 蛋 白 溶 液 2.5 ml/ 人 新 鲜 鸡 蛋 清 : 水 = 1:9 2 尿 素 3 10%NaOH 溶 液 3 ml/ 人 4 1% 硫 酸 铜 溶 液 3 滴 ml/ 人 5 0.5% 甘 氨 酸 溶 液 1 ml/ 人 6 0.1% 茚 三 酮 溶 液 1ml/ 人 7 大 豆 提 取 液 4 滴 ml/ 人 将 大 豆 浸 泡 充 分 吸 胀 后 研 磨 成 浆 状 再 用 纱 布 过 滤 8 0.5% 苯 酚 溶 液 滴 ml/ 人 9 0.3%Trp 溶 液 10 0.3%Tyr 溶 液 滴 ml/ 人 滴 ml/ 人 11 浓 硝 酸 3 ml/ 人 第 6 页, 共 71 页

12 头 发 13 指 甲 14 考 马 斯 亮 蓝 染 液 10 ml/ 人 考 马 斯 亮 蓝 G 250 100mg 溶 于 50ml95% 乙 醇 中, 加 100ml 85% 磷 酸 混 匀, 配 成 原 液 临 用 时 取 原 液 15ml, 加 蒸 馏 水 至 100ml, 用 粗 滤 纸 过 滤 后, 最 终 浓 度 为 0.01% 五 操 作 1 双 缩 脲 反 应 取 少 量 尿 素 结 晶, 放 在 干 燥 试 管 中 用 微 火 加 热 使 尿 素 熔 化 熔 化 的 尿 素 开 始 硬 化 时, 停 止 加 热, 尿 素 放 出 氨, 形 成 双 缩 脲 冷 后, 加 10% 氢 氧 化 钠 溶 液 约 1mL, 振 荡 混 匀, 再 加 1% 硫 酸 铜 溶 液 一 滴, 再 振 荡 观 察 出 现 的 粉 红 颜 色 要 避 免 添 加 过 量 硫 酸 铜, 否 则, 生 成 的 蓝 色 氢 氧 化 铜 能 掩 盖 粉 红 色 向 另 一 试 管 加 卵 清 蛋 白 溶 液 约 1mL 和 10% 氢 氧 化 钠 溶 液 约 2mL, 摇 匀, 再 加 1% 硫 酸 铜 溶 液 2 滴, 随 加 随 摇 观 察 紫 玫 瑰 色 的 出 现 2 茚 三 酮 反 应 (1) 取 2 支 试 管 分 别 加 入 蛋 白 质 溶 液 和 甘 氨 酸 溶 液 1mL, 再 各 加 0. 5mL0.1% 茚 三 酮 水 溶 液, 混 匀, 在 沸 水 浴 中 加 热 1~2 分 钟, 观 察 颜 色 由 粉 色 变 紫 红 色 再 变 蓝 (2) 在 一 小 块 滤 纸 上 滴 一 滴 0.5% 甘 氨 酸 溶 液, 风 干 后, 再 在 原 处 滴 一 滴 0.1% 茚 三 酮 乙 醇 溶 液, 在 微 火 旁 烘 干 显 色, 观 察 紫 红 色 斑 点 的 出 现 3. 黄 色 反 应 向 7 个 试 管 中 分 别 按 下 表 加 入 试 剂, 观 察 各 管 出 现 的 现 象, 有 的 试 管 反 应 慢 可 略 放 置 或 用 微 火 加 热 待 各 管 出 现 黄 色 后, 于 室 温 下 逐 滴 加 入 10% 氢 氧 化 钠 溶 液 至 碱 性, 观 察 颜 色 变 化 管 号 1 2 3 4 5 6 7 材 料 ( 滴 ) 鸡 蛋 清 溶 液 4 大 豆 提 取 液 4 指 甲 少 许 头 发 少 许 0.5% 苯 酚 4 0.3% 色 氨 酸 4 0.3% 酪 氨 酸 4 浓 硝 酸 /( 滴 ) 2 4 40 40 4 4 4 现 象 4 考 马 斯 亮 蓝 反 应 取 2 支 试 管, 按 下 表 操 作 第 7 页, 共 71 页

试 剂 蛋 白 质 溶 液 蒸 馏 水 考 马 斯 亮 蓝 染 液 管 号 (ml) (ml) (ml) 1 0 1 5 2 0.1 0.9 5 六 思 考 题 1 通 过 本 实 验 你 掌 握 了 几 种 鉴 定 蛋 白 质 和 氨 基 酸 的 方 法? 它 们 的 原 理? 2 如 果 蛋 白 质 水 解 作 用 一 直 进 行 到 双 缩 脲 反 应 呈 阴 性 结 果, 此 时 可 对 水 解 作 用 进 行 的 程 度 作 出 什 么 结 论? 3 如 果 蛋 白 质 中 的 氨 基 酸 的 平 均 分 子 量 为 125, 在 分 子 量 为 150000 的 蛋 白 质 分 子 中 存 在 着 多 少 个 上 述 化 学 基 团? 4 是 否 所 有 的 氨 基 酸 都 呈 现 黄 色 反 应 的 阳 性 结 果? 为 什 么? 是 否 大 部 分 蛋 白 质 呈 现 阳 性 结 果? 为 什 么? 第 8 页, 共 71 页

一 蛋 白 质 等 电 等 的 测 定 ( 一 ) 目 的 和 要 求 1 了 解 蛋 白 质 的 两 性 解 离 性 质 实 验 二 蛋 白 质 的 性 质 实 验 ( 二 ) 2 学 习 测 定 蛋 白 质 等 电 点 的 一 种 方 法 ( 二 ) 原 理 蛋 白 质 的 等 电 点 测 定 和 沉 淀 反 应 蛋 白 质 是 两 性 电 解 质, 在 溶 液 中 存 在 以 下 平 衡 : Pr COOH NH 2 蛋 白 质 分 子 COO - COO - COOH Pr OH - Pr H + Pr NH 2 + NH 3 NH + 3 阴 离 子 兼 性 离 子 阳 离 子 ph>pi ph = pi ph<pi 移 向 阳 极 不 移 动 移 向 阴 极 蛋 白 质 由 许 多 氨 基 酸 组 成, 虽 然 绝 大 多 数 的 氨 基 与 羧 基 成 肽 键 结 合, 但 是 总 有 一 定 数 量 自 由 的 氨 基 与 羧 基, 以 及 酚 基 巯 基 胍 基 咪 唑 基 等 酸 碱 基 团, 因 此 蛋 白 质 和 氨 基 酸 一 样 是 两 性 电 解 质 蛋 白 质 分 子 的 解 离 状 态 和 解 离 程 度 受 溶 液 的 ph 影 响 调 节 溶 液 的 酸 碱 度 达 到 一 定 氢 离 子 浓 度 时, 蛋 白 质 分 子 所 带 的 正 电 荷 和 负 电 荷 相 等, 以 兼 性 离 子 状 态 存 在, 在 电 场 中, 蛋 白 质 分 子 既 不 向 正 极 移 动 也 不 向 负 极 移 动, 此 时 溶 液 的 ph 值 称 为 蛋 白 质 的 等 电 点 不 同 蛋 白 质 各 有 其 特 异 的 等 电 点 在 等 电 点 时, 蛋 白 质 的 理 化 性 质 都 有 变 化, 可 利 用 此 种 性 质 的 变 化 测 定 各 种 蛋 白 质 的 等 电 点 最 常 用 的 方 法 是 测 其 溶 解 度 最 低 时 的 溶 液 的 ph 值 蛋 白 质 等 电 点 多 接 近 于 ph 7.0, 略 偏 酸 性 的 等 电 点 也 很 多, 如 白 明 胶 的 等 电 点 为 ph 4.7, 也 有 偏 碱 性, 如 精 蛋 白 等 电 点 为 ph 10.5 12.0 在 等 电 点 时 蛋 白 质 溶 解 度 最 小, 容 易 沉 淀 析 出 本 实 验 借 观 察 在 不 同 ph 溶 液 中 溶 解 度 以 测 定 酪 蛋 白 的 等 电 点 用 醋 酸 与 醋 酸 钠 ( 醋 酸 钠 混 合 在 酪 蛋 白 溶 液 中 ) 配 制 成 各 种 不 同 ph 值 的 缓 冲 液 向 诸 缓 冲 液 中 加 入 酪 蛋 白 后, 沉 淀 出 现 最 多 的 缓 冲 液 的 ph 值 即 为 酪 蛋 白 的 等 电 点 第 9 页, 共 71 页

( 三 ) 器 材 和 试 剂 1 器 材 (1) 试 管 和 试 管 架 (2) 吸 量 管 2 试 剂 (1)0.4% 酪 蛋 白 醋 酸 钠 溶 液 4 ml / 人 取 0.4g 酪 蛋 白, 加 少 量 水 在 乳 研 钵 中 仔 细 研 磨, 加 40ml 水 于 200ml 三 角 瓶 中, 加 入 1.00mol/L NaOH 溶 液 10ml 振 荡, 把 三 角 瓶 放 到 50 水 浴 中 使 酪 蛋 白 完 全 溶 解 然 后 加 入 1.00mol/L Hac 溶 液 10ml, 定 容 于 100ml 容 量 瓶 瓶 中 (2) 1.00mol/L HAc 溶 液 1.6 ml/ 人 1.00mol/L HAc 溶 液 的 配 制 : 取 冰 醋 酸 (99.5%W/W)59ml, 定 容 1000ml (3) 0.10mol/L HAc 溶 液 1.3 ml/ 人 (4) 0.01mol/L HAc 溶 液 0.6 ml/ 人 ( 四 ) 操 作 方 法 1 取 同 样 规 格 的 试 管 4 支, 按 下 表 顺 序 分 别 精 确 的 加 入 各 试 剂, 然 后 混 匀 试 管 编 号 1 2 32\ 4 蒸 馏 水 (ml) 8.4 8.7 8.0 7.4 0.01mol/L HAc 溶 液 (ml) 0.6 0.10mol/L HAc 溶 液 (ml) 0.3 1.0 1.00mol/L HAc 溶 液 (ml) 1.6 0.4% 酪 蛋 白 醋 酸 钠 溶 液 (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 溶 液 的 最 终 ph 5.9 5.3 4.7 3.5 沉 淀 出 现 的 情 况 酪 蛋 白 的 等 电 点 2 静 置 10 20 分 钟, 观 察 每 支 试 管 内 溶 液 的 混 浊 度, 以 - + ++ +++ 符 号 表 示 沉 淀 的 多 少 根 据 观 察 结 果, 指 出 哪 一 个 ph 是 酪 蛋 白 的 等 电 点 二 蛋 白 质 的 沉 淀 与 变 性 ( 一 ) 目 的 和 要 求 1 加 深 对 蛋 白 质 胶 体 溶 液 稳 定 因 素 的 认 识 ; 了 解 蛋 白 质 沉 淀 与 变 性 的 关 系 第 10 页, 共 71 页

2 区 分 可 逆 沉 淀 与 不 可 逆 沉 淀 ( 二 ) 原 理 在 水 溶 液 中 蛋 白 质 分 子 的 表 面 由 于 形 成 水 化 层 和 双 电 层 而 成 为 稳 定 的 胶 体 颗 粒 因 此 蛋 白 质 溶 液 和 其 它 胶 体 溶 液 相 类 似 但 这 种 稳 定 性 是 有 条 件 的 相 对 的 在 一 定 的 物 理 化 学 因 素 的 影 响 下, 蛋 白 质 颗 粒 失 去 电 荷 脱 水, 甚 至 变 性 而 丧 失 稳 定 因 素, 即 以 固 态 的 形 式 从 溶 液 中 析 出, 这 种 作 用 称 为 蛋 白 质 的 沉 淀 反 应 沉 淀 反 就 分 为 二 大 类 1 可 逆 沉 淀 : 在 发 生 沉 淀 反 应 时, 蛋 白 质 虽 然 已 沉 淀 析 出, 蛋 白 质 分 子 内 部 结 构 并 末 发 生 显 著 变 化, 基 本 上 保 持 原 有 的 性 质, 若 除 去 沉 淀 因 素 后, 蛋 白 质 沉 淀 可 再 溶 于 原 来 的 溶 济 中, 并 保 持 其 天 然 性 质 而 不 变 性, 因 此 这 种 沉 淀 称 为 可 逆 沉 淀 反 应 属 于 此 类 的 反 应 有 盐 析 作 用 用 乙 醇 或 丙 酮 在 低 温 下 的 短 时 间 作 用 于 蛋 白 质 的 反 应, 以 及 利 用 等 电 点 的 沉 淀 等 提 取 蛋 白 质 时 常 利 用 此 类 反 应 2 不 可 逆 沉 淀 : 在 发 生 沉 淀 反 应 时, 蛋 白 质 分 子 内 部 结 构 特 别 是 空 间 结 构 遭 到 破 坏, 推 动 其 天 然 蛋 白 质 的 原 来 性 质 蛋 白 质 变 性 而 沉 淀, 不 再 溶 于 原 来 的 溶 剂 中 可 能 是 结 构 遭 到 破 坏 时, 蛋 白 质 的 疏 水 基 团 大 量 外 露, 使 其 从 亲 水 胶 体 转 变 为 疏 水 胶 体 的 缘 故 加 热 引 起 的 蛋 白 质 沉 淀 与 凝 固 重 金 属 离 子 有 机 酸 有 机 溶 济 生 物 碱 过 酸 过 碱 震 荡 超 声 波 等 都 能 使 蛋 白 质 发 生 不 可 逆 沉 淀 而 析 出 蛋 白 质 变 性 后, 有 时 由 于 维 持 溶 液 稳 定 的 条 件 仍 然 存 在 ( 如 电 荷 ) 并 不 析 出 因 此 变 性 蛋 白 质 并 不 一 定 都 表 现 为 沉 淀, 而 沉 淀 的 蛋 白 质 末 必 都 已 变 性 ( 三 ) 试 剂 和 器 材 1 试 剂 (1) 卵 清 蛋 白 溶 液 : 新 鲜 鸡 蛋 清 : 水 = 1:9 14 ml / 每 人 (2)pH4.7HAc-NaAc 溶 液 1 ml / 每 人 0.2 mol/l HAc 溶 液 46ml 0.2 mol/l NaAc 溶 液 54ml (3) 饱 和 (NH 4 ) 2 SO 4 溶 液 5 ml / 每 人 溶 解 度 :10 52.5g/100g 水 20-25 75.4g/100g 水 (4)(NH 4 ) 2 SO 4 粉 末 (5)3%AgNO 3 溶 液 2 D/ 每 人 (6)5% 三 氯 乙 酸 溶 液 1 ml/ 每 人 (7)0.10mol/L HAc 溶 液 5 D/ 每 人 第 11 页, 共 71 页

(8)10% HAc 溶 液 10 D/ 每 人 (9)10%NaOH 溶 液 (10)0.10mol/L NaOH 溶 液 (11)0.10mol/L HCl 溶 液 2 D/ 每 人 1 ml/ 每 人 1 ml/ 每 人 1.0mol/L HCl 溶 液 的 配 制 : 取 浓 盐 酸 84ml, 定 容 1000ml (12)0.10mol/L Na 2 CO 3 溶 液 2 ml/ 每 人 (13) 0.1% 甲 基 红 溶 液 0.1g 于 60% 乙 醇 溶 液 100ml (14)95% 乙 醇 溶 液 3 ml/ 每 人 2 器 材 (1) 试 管 及 试 管 架 (2) 漏 斗 (3) 吸 量 管 (4) 烧 杯 (5) 水 浴 锅 (6) 滤 纸 ( 四 ) 操 作 方 法 1 可 逆 沉 淀 反 应 : 蛋 白 质 的 盐 析 作 用 用 大 量 的 中 性 盐 (Na 2 SO 4 (NH 4 ) 2 SO 4 NaCl 等 ) 使 蛋 白 质 从 溶 液 中 析 出 的 过 程 叫 做 蛋 白 质 的 盐 作 用 蛋 白 质 是 亲 水 胶 体, 在 高 浓 度 的 中 性 盐 影 响 下, 蛋 白 质 分 子 被 脱 去 水 化 层, 同 时 蛋 白 质 分 子 所 带 的 电 荷 被 中 和, 结 果 蛋 白 质 的 胶 体 稳 定 性 遭 到 破 坏 而 沉 淀 析 出 沉 淀 的 蛋 白 质 仍 保 持 其 天 然 的 蛋 白 质 性 质, 当 降 低 盐 浓 度 时, 析 出 的 蛋 白 质 仍 能 溶 解 沉 淀 不 同 的 蛋 白 质 所 需 中 性 盐 的 浓 度 不 同, 而 盐 类 不 同 也 有 差 异 如 向 含 有 球 蛋 白 和 清 蛋 白 的 鸡 蛋 清 溶 液 中 加 入 (NH 4 ) 2 SO 4 至 半 饱 和 时, 则 球 蛋 白 沉 淀 析 出 ; 加 (NH 4 ) 2 SO 4 至 饱 和 时, 则 清 蛋 白 沉 淀 析 出 另 外 在 等 电 点 时, 清 蛋 白 可 被 半 饱 和 的 (NH 4 ) 2 SO 4 溶 液 沉 淀 析 出 所 以 在 不 同 条 件 下, 采 用 不 同 浓 度 的 盐 类 可 将 各 种 蛋 白 质 从 混 合 溶 液 中 沉 淀 析 出 该 方 法 称 为 蛋 白 质 的 分 级 盐 析 加 5% 卵 清 蛋 白 溶 液 5ml 于 试 管 中, 加 等 量 的 饱 和 ( N H 4 ) 2 SO4 溶 液, 混 匀 后 静 置 数 分 钟 则 析 出 球 蛋 白 的 沉 淀 倒 出 少 量 混 浊 沉 淀, 加 少 量 水, 观 察 是 否 溶 解, 为 什 么? 将 管 内 容 物, 向 滤 液 中 添 加 硫 本 铵 粉 末 到 不 再 溶 解 为 止, 此 时 析 出 的 沉 淀 为 清 蛋 白 取 出 部 分 清 蛋 白, 加 少 量 水, 观 察 沉 淀 的 再 溶 解 2 不 可 逆 沉 淀 反 应 : (1) 重 金 属 离 子 沉 淀 蛋 白 质 重 金 属 盐 类 易 与 蛋 白 质 结 合 成 稳 定 的 沉 淀 而 析 出 蛋 白 质 在 水 溶 液 中 是 酸 碱 两 性 电 解 质 在 碱 第 12 页, 共 71 页

性 溶 液 中 ( 对 蛋 白 质 的 等 电 点 而 言 ) 蛋 白 质 分 子 带 负 电 荷, 能 与 带 正 电 荷 的 重 金 属 离 子 结 合 成 蛋 白 质 盐 在 有 机 体 内, 蛋 白 质 常 以 其 可 溶 性 钠 盐 或 钾 盐 的 形 式 存 在, 当 加 入 Hg 2+ Pb 2+ Cu 2+ Ag + 等 重 金 属 盐 时, 则 蛋 白 质 形 成 不 溶 性 的 盐 类 而 沉 淀 重 金 属 ( 特 别 是 在 碱 金 属 盐 类 存 在 时 ) 沉 淀 蛋 白 质 的 反 应 通 常 很 完 全 因 此, 生 化 中 常 用 重 金 属 盐 除 去 溶 液 中 的 蛋 白 质, 临 床 上 则 用 蛋 白 质 解 除 重 金 属 盐 食 物 性 中 毒 取 1 支 试 管, 加 入 蛋 白 质 溶 液 2ml, 再 加 3%AgNO 3 溶 液 1-2 滴, 振 荡 试 管, 有 沉 淀 产 生 放 置 片 该, 倾 去 上 清 液, 向 沉 淀 中 加 入 少 量 的 水, 沉 淀 是 否 溶 解? 为 什 么? (2) 有 机 酸 沉 淀 蛋 白 质 有 机 酸 特 别 是 三 氯 乙 酸 能 破 坏 蛋 白 质 的 高 能 结 构 ( 氢 键 ) 使 蛋 白 质 沉 淀 而 变 性 如 三 氯 乙 酸 可 将 血 清 等 生 物 体 液 中 的 蛋 白 质 完 全 除 去, 因 此 得 到 广 泛 的 使 用 取 1 支 试 管, 加 入 蛋 白 质 溶 液 2ml, 再 加 入 1m l5% 三 氯 乙 酸 溶 液, 振 荡 试 管, 观 察 沉 淀 的 生 成 放 置 片 该, 倾 出 上 清 液, 向 沉 淀 中 加 入 少 量 水, 观 察 沉 淀 是 否 溶 解 (3) 有 机 溶 济 沉 淀 蛋 白 质 乙 醇 为 脱 水 剂, 破 坏 蛋 白 质 胶 体 颗 粒 的 水 化 层 而 使 其 沉 淀 析 出 故 临 床 上 常 用 70% 乙 醇 用 为 消 毒 剂 取 1 支 试 管, 加 入 蛋 白 质 溶 液 2ml, 再 加 入 2ml 95% 乙 醇 混 匀, 观 察 沉 淀 的 生 成 (4) 加 热 引 起 的 变 性 与 沉 淀 几 乎 所 有 的 蛋 白 质 都 因 加 热 变 性 而 凝 固, 变 成 不 可 逆 的 不 溶 状 态 盐 类 和 ph 对 蛋 白 质 加 热 凝 固 有 重 要 影 响, 少 量 盐 类 促 进 蛋 白 质 加 热 凝 固 当 蛋 白 质 处 于 等 电 点 时, 加 热 凝 固 最 完 全 最 迅 速 在 酸 性 或 碱 性 溶 液 中, 蛋 白 质 分 子 带 有 正 电 荷 或 负 电 荷, 虽 加 热 蛋 白 质 也 不 凝 固 若 同 时 有 足 量 的 中 性 盐 存 在, 则 蛋 白 质 可 因 加 热 而 凝 固 (5) 乙 醇 引 起 的 变 性 与 沉 淀 乙 醇 能 够 夺 去 蛋 白 质 胶 体 颗 粒 的 水 化 层, 也 能 够 破 坏 蛋 白 质 的 高 级 结 构 使 其 变 性 变 性 后 的 蛋 白 质 是 否 沉 淀 受 溶 液 酸 碱 度 的 影 响 当 蛋 白 质 溶 液 处 于 等 电 点 时, 乙 醇 能 使 蛋 白 质 沉 淀 而 析 出 ; 在 酸 性 或 碱 性 溶 液 中 ( 对 等 电 点 而 言 ), 蛋 白 质 分 子 带 有 正 电 荷 或 向 电 荷, 加 入 乙 醇 只 能 使 蛋 白 质 变 性 而 不 会 产 生 沉 淀 卵 清 蛋 白 pi=4.6 甲 基 红 的 变 色 范 围 : 红 色 ( 酸 性 ):4.2 黄 色 ( 碱 性 ):6.3 第 13 页, 共 71 页

取 3 支 试 管 编 号, 依 下 表 顺 序 加 入 试 剂 : 1 2 3 5% 卵 清 蛋 白 溶 液 (ml) 1 1 1 0.10 mol/l NaOH 溶 液 (ml) 1 0.10mol/L HCl 溶 液 (ml) 1 PH4.7 缓 冲 溶 液 (ml) 1 95% 乙 醇 溶 液 (ml) 1 1 1 振 荡 混 匀 后, 观 察 现 象 H 2 O (ml) 8 8 8 0.1% 甲 基 红 ( 滴 ) 1 1 0.10mol/L HAc 溶 液 (ml) 中 和 0.10mol/L Na 2 CO 3 溶 液 (ml) 中 和 现 象 五 尿 蛋 白 的 定 性 检 验 : 见 教 材 六 思 考 题 1 何 谓 蛋 白 质 的 等 电 点? 2 在 等 电 点 时 蛋 白 质 的 溶 解 度 为 什 么 最 低? 请 结 合 你 的 实 验 结 果 和 蛋 白 质 的 胶 体 性 质 加 以 说 明 3 在 本 实 验 中, 酪 蛋 白 处 于 等 电 点 时 则 从 溶 液 中 沉 淀 析 出, 所 以 说 凡 是 蛋 白 质 在 等 电 点 时 必 然 沉 淀 出 来 这 种 结 论 对 吗? 为 什 么? 请 举 例 说 明 4 你 如 何 从 低 分 子 量 的 胺 类 化 合 物 ( 非 蛋 白 氮 的 化 合 物 ) 中 分 离 出 蛋 白 质 来? 5 为 什 么 鸡 蛋 清 可 用 作 铅 或 汞 中 毒 的 解 毒 剂? 6 作 为 杀 菌 剂, 氯 化 汞 是 怎 样 起 作 用 的? 7 蛋 白 质 分 子 中 的 哪 些 基 团 可 以 与 (1) 重 金 属 离 子 作 用, 而 使 蛋 白 质 沉 淀? (2) 有 机 酸 有 机 溶 剂, 而 使 蛋 白 质 沉 淀? 8 高 浓 度 的 硫 酸 铵 对 蛋 白 质 溶 解 度 有 何 影 响? 为 什 么? 9 加 入 等 体 积 乙 醇 或 丙 酮, 对 大 部 分 蛋 白 质 会 产 生 什 么 影 响? 为 什 么? 哪 种 蛋 白 质 可 以 溶 解 于 70 80% 的 乙 醇 溶 液 中? 第 14 页, 共 71 页

实 验 三 氨 基 酸 的 分 离 鉴 定 纸 层 析 法 一 目 的 和 要 求 1 学 习 分 配 层 析 的 原 理 2 掌 握 氨 基 酸 纸 层 析 法 的 操 作 技 术 二 原 理 1 不 同 的 分 离 方 法 (1) 蒸 馏 : 利 用 沸 点 的 差 异 (2) 沉 淀 和 结 晶 : 利 用 溶 解 度 的 差 异 (3) 卒 取 : 利 用 分 配 系 数 的 差 异 (4) 层 析 ( 色 谱 ): 是 一 种 物 理 的 分 离 方 法 利 用 混 合 物 各 组 分 在 不 同 的 两 相 中, 溶 解 吸 附 和 其 它 亲 和 作 用 的 差 异, 使 各 组 分 以 不 同 程 度 分 布 在 两 个 相 中, 其 中 一 个 为 固 定 相, 另 一 个 为 流 动 相, 并 使 各 组 分 以 不 同 速 度 移 动, 而 达 到 分 离 的 目 的 2 层 析 的 分 类 按 机 理 分 : (1) 吸 附 层 析 : 利 用 吸 附 剂 表 面 对 不 同 组 分 吸 咐 性 能 和 差 异, 达 到 分 离 鉴 定 的 目 的 (2) 分 配 层 析 : 利 用 不 同 组 分 在 流 动 相 和 固 定 相 之 间 的 分 配 系 数 ( 或 溶 解 度 ) 的 不 同 (3) 离 子 交 换 层 析 : 利 用 不 同 组 分 对 离 子 交 换 剂 亲 和 力 的 不 同 (4) 凝 胶 层 析 : 利 用 某 些 凝 胶 对 不 同 组 分 因 分 子 大 小 不 同 阻 滞 作 用 不 同 甘 共 的 差 异 按 操 作 形 式 不 同 分 为 : (1) 柱 层 析 : 将 固 定 相 装 在 柱 中 使 样 品 沿 一 个 方 向 移 动 而 分 离 (2) 纸 层 析 : 用 滤 纸 作 液 体 的 载 体 ( 也 叫 担 体 ), 点 样 后 用 流 动 相 展 开 (3) 薄 层 层 析 : 将 适 应 颗 粒 的 吸 附 剂 涂 铺 成 薄 层, 以 纸 层 析 类 似 的 方 法 进 行 分 离 气 相 分 配 层 析 : 也 叫 气 液 层 析 法 (GLC) 气 相 层 析 气 相 吸 附 层 析 : 气 固 层 析 法 (GSC) 纸 层 析 (PC) 分 配 层 析 : 液 - 液 层 析 (LLC) 柱 层 析 () 离 子 交 换 层 析 (IEC) 薄 层 层 析 (TLC) 液 相 层 析 凝 胶 层 析 ( 凝 胶 过 滤 或 涨 胶 渗 透 层 析 GPC) 薄 层 层 析 吸 附 层 析 ( 液 固 层 析 LSC) 柱 层 析 第 15 页, 共 71 页

电 易 溶 于 有 机 溶 剂 而 难 溶 于 水 的 混 合 物 的 分 离 常 用 吸 附 层 析 法 ; 可 电 离 的 水 溶 性 混 合 物 最 适 应 用 离 子 交 换 层 析 分 离 ; 分 配 层 析 是 介 于 二 者 之 间, 在 水 和 有 机 溶 剂 都 可 溶 的 混 合 物 用 分 配 层 析 法 易 分 离 层 析 法 又 称 色 层 分 离 法,1903 年, 发 现 用 挥 发 油 冲 洗 菊 粉 柱 时, 可 将 叶 子 的 色 素 分 成 许 多 颜 色 的 层 圈 此 后, 把 这 种 利 用 有 色 物 质 在 吸 附 剂 上 吸 附 能 力 不 同 而 得 到 分 离 的 方 法 称 为 色 层 分 离 法 (Chromatography) 经 过 分 离 得 到 的 色 柱 称 为 色 层 谱 虽 然 后 来 将 色 层 分 离 法 应 用 于 无 色 物 质 分 离, 但 是 这 个 名 字 一 直 沿 用 下 来 当 把 一 种 物 质 在 两 种 互 不 相 溶 的 溶 剂 中 振 荡 时, 它 将 在 这 两 相 中 不 均 匀 的 分 配 达 到 平 衡 时, 这 种 物 质 在 两 种 溶 剂 中 的 浓 度 之 比 是 一 个 常 数, 即 分 配 系 数 α α= 溶 质 在 固 定 相 的 浓 度 (Cs) 溶 质 在 流 动 相 的 浓 度 (Cl) 一 个 物 质 在 某 溶 剂 系 统 中 的 分 配 系 数, 在 一 定 的 温 度 下 是 一 个 常 数 分 配 层 析 实 际 上 是 一 种 连 续 的 抽 提 过 程 在 这 里 一 种 溶 剂 通 常 是 被 结 合 在 固 定 惰 性 支 持 物 上 的 水, 另 一 相 为 流 动 的 被 水 饱 和 的 有 机 溶 剂 构 成 它 流 过 固 定 相 时, 如 果 某 混 合 物 的 各 组 分 在 这 两 相 中 的 分 配 系 统 (α) 有 足 够 的 差 异, 便 可 被 分 离 滤 纸 是 理 想 的 惰 性 支 持 物 在 纸 上 水 被 吸 附 在 纤 维 素 的 纤 维 之 间 形 成 固 定 相 由 于 纤 维 素 的 羟 基 具 有 亲 水 性, 和 水 以 氢 键 相 连, 使 这 部 分 水 不 易 扩 散, 与 有 相 溶 剂 形 成 不 相 混 合 的 两 相 当 有 相 相 沿 纸 流 动 经 过 层 析 点 时, 溶 质 就 在 有 机 相 和 水 相 之 间 进 行 分 配, 有 一 部 分 溶 质 离 开 原 点 随 有 机 相 移 动 而 进 入 无 溶 质 的 区 域, 这 时 又 重 新 进 行 分 配 ; 一 部 分 溶 质 从 有 机 相 进 入 水 相, 当 有 机 相 不 断 流 动 时, 溶 质 就 沿 着 有 机 相 流 动 的 方 向 移 动, 不 断 进 行 分 配 溶 质 中 各 组 分 的 分 配 系 数 不 同, 移 动 速 率 (G f ) 也 不 同, 因 而 可 以 彼 此 分 开 物 质 分 离 后, 层 析 点 图 谱 上 的 位 置, 即 在 纸 上 的 移 动 速 率, 用 G f 表 示 G f = 原 点 到 层 析 点 中 心 的 距 离 原 点 到 溶 剂 前 沿 的 距 离 混 合 物 各 组 分 大 有 机 相 中 溶 解 度 越 大, 即 分 配 系 数 越 小, 该 组 分 在 纸 上 沿 有 机 相 流 动 方 向 移 动 的 越 远, 也 就 是 移 动 速 率 越 大 每 一 种 物 质 的 移 动 速 率 决 定 于 该 物 质 在 两 相 间 的 分 配 系 数 和 两 相 的 体 积 比 两 相 体 积 比 在 同 一 试 验 条 件 下 是 不 变 的, 所 以 移 动 速 率 的 决 定 因 素 为 分 配 系 数 对 于 某 一 物 质 在 一 定 条 件 下 的 分 配 系 第 16 页, 共 71 页

数 是 个 常 数, 所 以 移 动 速 率 为 一 特 征 常 数 影 响 G f 值 的 因 素 概 括 如 下 : 1 物 质 结 构 的 影 响 : 极 性 物 质 易 溶 于 极 性 溶 剂 中 ( 水 ), 非 极 性 物 质 易 溶 于 非 极 性 溶 剂 ( 有 机 溶 剂 ) 中, 所 以 物 质 的 极 性 大 小 决 定 了 物 质 在 水 和 有 机 溶 剂 之 间 的 分 配 情 况 例 如 酸 性 和 碱 性 氨 基 酸 极 性 大 小 中 性 氨 基 酸, 所 以 前 者 有 水 ( 固 定 相 ) 中 分 配 较 多, 因 此 G f 值 低 于 后 者 CH 2 基 是 疏 水 性 基 团, 如 果 分 子 中 极 性 基 数 目 不 变, 则 CH 2 基 增 加, 整 个 分 子 的 极 性 就 降 低, 因 此 易 溶 于 有 机 溶 剂 ( 流 动 相 ) 中,G f 值 亦 随 之 增 加 例 如 氨 基 酸 G f 值 :Gly<Ala<Leu, 二 羧 基 氨 基 酸 中,Asp<Glu 极 性 基 团 的 位 置 不 同 也 会 引 起 G f 值 变 化, 例 如 在 正 丁 醇 - 甲 酸 - 水 系 统 中 层 析 时,α-Ala<β-Ala 2 溶 剂 的 影 响 : 同 一 物 质 在 不 同 溶 剂 G f 值 不 同, 选 择 溶 剂 系 统 时 应 使 被 分 离 物 质 在 适 当 的 G f 范 围 内 (0.05-0.85 之 间 ), 并 且 不 同 物 质 的 G f 至 少 差 别 为 0.05 才 能 彼 此 分 开 溶 剂 的 极 性 大 小 也 影 响 物 质 的 G f 值 在 用 与 水 互 溶 的 脂 肪 醇 作 为 溶 剂 时, 氨 基 酸 的 G f 值 随 着 溶 液 剂 碳 原 子 数 目 增 加 而 降 低 3 ph 值 的 影 响 : 溶 剂 系 统 的 ph 会 影 响 物 质 极 性 基 团 的 解 离 形 式, 例 如 氨 基 酸 在 酸 性 或 碱 性 溶 剂 中 变 化 如 下 : COO - COO - COOH R OH - R H + R NH 2 + NH 3 + NH 3 对 于 酸 性 氨 基 酸 则 在 酸 性 时 所 带 净 电 荷 比 碱 性 时 少 带 电 荷 越 少 亲 水 性 越 小, 因 此 在 酸 性 溶 剂 系 统 中 G f 值 较 碱 性 中 大 而 碱 性 氨 基 酸 则 与 此 相 反 借 此 性 质 用 酸 相 和 碱 相 溶 剂 进 行 双 向 层 析, 可 使 酸 碱 性 不 同 的 氨 基 酸 达 到 分 离 的 目 的 4 滤 纸 的 影 响 : 层 析 滤 纸 必 须 质 地 均 匀, 紧 密, 有 一 定 机 械 强 度, 并 且 杂 质 较 少, 如 纸 中 含 有 Cu 2+ Ca 2+ Mg 2+ 等 金 属 离 子 杂 质, 可 与 氨 基 酸 形 成 络 合 物 使 层 析 图 谱 出 现 阴 影, 可 用 稀 酸 (0.01 或 0.4mol/LHCl) 洗 涤 滤 纸 除 去 之 5 温 度 和 时 间 的 影 响 : 温 度 不 仅 影 响 物 质 在 溶 剂 中 的 分 配 系 数, 而 且 影 响 溶 剂 相 的 组 成 及 纤 维 素 的 水 合 作 用 温 度 变 化 对 G f 值 影 响 很 大, 所 以 层 析 最 好 在 恒 温 室 中 进 行, 控 制 温 度 相 差 不 超 过 ± 0.5 当 所 有 条 件 相 同 时, 氨 基 酸 层 析 时 间 短, 则 G f 值 要 小 由 于 纸 层 析 设 备 简 单, 操 作 方 便, 并 可 分 离 微 量 样 品, 所 以 目 前 在 生 化 分 析 和 研 究 中 纸 层 析 法 占 有 十 分 重 要 的 地 位, 广 泛 应 用 于 氨 基 酸 肽 糖 脂 肪 酸 和 维 生 素 的 分 离 鉴 定 第 17 页, 共 71 页

上 行 层 析 : 有 机 溶 剂 自 下 而 上 流 动 下 行 层 析 : 有 机 溶 剂 自 上 而 下 流 动 双 向 层 析 : 在 纸 的 一 角 上 点 样, 先 用 一 种 溶 剂 系 统 展 层 后, 使 纸 干 燥 然 后 将 纸 调 转 90 度, 再 用 另 一 种 溶 剂 系 统 展 层 三 器 材 1 层 析 缸 ( 或 培 养 皿 ) 2. 毛 细 管 3. 玻 璃 喷 雾 器 4 培 养 皿 5 层 析 滤 纸 ( 新 华 一 号 ) 6 分 液 漏 斗 7 吹 风 机 8 直 尺 园 规 剪 刀 和 铅 笔 四 试 剂 1 扩 展 剂 50 ml/ 人 是 4 份 水 饱 和 的 正 丁 醇 和 1 份 醋 酸 的 混 合 物 将 20mL 正 丁 醇 和 5mL 冰 醋 酸 放 入 分 液 漏 斗 中, 与 15mL 水 混 合, 充 分 振 荡, 静 置 后 分 层, 放 出 下 层 水 层 正 丁 醇 : 冰 醋 酸 : 水 = 20:5:15 2 氨 基 酸 溶 液 0. 5% 的 赖 氨 酸, 脯 氨 酸, 缬 氨 酸, 苯 丙 氨 酸, 亮 氨 酸 溶 液 及 他 们 的 混 合 液 ( 各 组 分 浓 度 均 为 0. 5%) 3 显 色 剂 50~100mL 0. 1% 水 合 茚 三 酮 正 丁 醇 溶 液 五 操 作 方 法 方 法 ( 一 ) 1 将 盛 有 平 衡 溶 剂 的 小 烧 杯 置 于 密 闭 的 层 析 缸 中 2 取 层 析 滤 纸 ( 长 22cm 宽 4cm) 一 张 在 纸 的 一 端 距 边 缘 2~3cm 处 用 铅 笔 画 一 条 直 线, 在 此 直 线 上 每 间 隔 2cm 作 一 记 号 如 右 图 3 点 样 用 毛 细 管 将 各 氨 基 酸 样 品 分 别 点 在 这 6 个 位 置 上, 干 后 再 点 一 次 每 点 在 纸 上 扩 散 的 直 径 最 大 不 超 过 3mm 4 扩 展 用 线 将 滤 纸 缝 成 筒 状, 纸 的 两 边 不 能 接 触 将 盛 有 约 20mL 扩 展 剂 的 培 养 皿 迅 速 置 于 密 闭 的 层 析 缸 中, 并 将 滤 纸 直 立 于 培 养 皿 中 ( 点 样 的 一 端 在 下, 扩 展 剂 的 液 面 需 低 于 点 样 线 1cm) 待 溶 剂 上 升 15~20cm 时 即 取 出 滤 纸, 用 铅 笔 描 出 溶 剂 前 沿 界 线, 自 然 干 燥 或 用 吹 风 机 热 风 吹 干 5 显 色 用 喷 雾 器 均 匀 喷 上 0. 1% 茚 三 酮 正 丁 醇 溶 液, 然 后 置 烘 箱 中 烘 烤 5 分 钟 (100 C) 或 用 第 18 页, 共 71 页

热 风 吹 干 即 可 显 出 各 层 析 斑 点 6 计 算 各 种 氨 基 酸 的 R f 值 方 法 ( 二 ) 取 园 形 层 析 纸 一 张, 在 滤 纸 中 心 剪 一 小 孔 ( 直 径 约 1-2mm), 并 以 圆 心 为 中 心 约 1cm 为 半 径 划 一 圆 做 为 底 线 在 此 底 线 上, 用 铅 笔 点 4 个 等 距 离 的 原 点, 标 明 1 2 3 4( 见 图 ) 用 4 根 毛 细 管 分 别 吸 取 以 上 四 种 样 品, 依 次 点 在 滤 纸 上 标 明 号 码 的 原 点 处, 用 吹 风 机 吹 干 后, 再 重 复 点 样 2-4 次 注 意 4 点 的 大 小 应 尽 量 一 致, 其 直 径 不 应 大 于 3mm 取 一 个 培 养 皿, 将 滤 纸 平 放 在 培 养 皿 上 另 取 一 滤 纸 小 条 卷 成 筒 状, 直 径 约 为 1-2mm, 将 其 下 端 剪 成 刷 状 将 此 小 筒 插 入 滤 纸 中 心 小 孔 ( 不 要 突 出 于 纸 面 上 ), 使 滤 纸 通 过 此 小 筒 与 展 层 剂 相 连 ( 注 意 勿 使 滤 纸 的 其 它 部 分 与 展 层 剂 接 触 ) 在 培 养 皿 中 加 入 展 层 剂 50ml, 另 取 一 同 样 大 小 的 培 养 皿 盖 在 滤 纸 上 ( 见 图 ), 此 时 展 层 剂 即 由 滤 中 心 孔 向 四 周 扩 展 当 展 层 剂 扩 展 到 距 离 纸 边 缘 约 1.5cm 时 ( 约 需 40-50 分 钟 ), 取 出 滤 纸 用 铅 笔 划 下 展 层 剂 扩 展 之 边 缘, 并 用 热 风 吹 干 用 喷 雾 器 喷 上 水 合 茚 三 酮 溶 液, 再 用 热 风 吹 干 用 铅 笔 圈 下 各 显 色 点 测 定 各 显 色 点 的 G f 值, 由 各 点 的 G f 值 分 析 实 验 结 果 补 充 : 固 定 相 : 色 谱 用 于 物 质 分 离 的 表 面 具 有 一 定 活 性 的 固 体 吸 附 剂 流 动 相 : 色 谱 中 携 带 样 品 组 分 通 过 分 离 柱 的 冲 洗 剂 固 定 液 : 即 液 体 固 定 相, 在 惰 性 固 体 颗 粒 表 面 涂 上 一 层 很 薄 的 某 种 高 沸 点 有 机 化 合 物 的 液 膜 这 种 高 沸 点 的 有 机 化 合 物 称 为 固 定 液 载 体 : 颗 粒 表 面 承 载 着 固 定 液 的 固 体 材 料 载 气 : 流 动 相 是 某 种 气 体 时, 我 们 称 此 气 体 为 载 气 毛 细 管 色 谱 ( 空 心 柱 色 谱 ): 固 定 相 附 着 在 中 心 空 的 管 子 的 内 壁, 一 般 其 内 径 0.1-0.5mm 玻 璃 尼 龙 塑 料 或 金 属 拉 制 的 毛 细 管 内 壁 六 思 考 题 1 何 谓 纸 层 析 法? 2 何 谓 R f 值? 影 响 R f 值 的 主 要 原 因 是 什 么? 3 怎 样 制 备 扩 展 剂? 4 酸 性 溶 剂 系 统 ( 或 碱 性 液 剂 系 统 ) 对 氨 基 酸 极 性 基 团 的 解 离 有 何 影 响? 5 酸 性 液 剂 系 统 ( 或 碱 性 液 剂 系 统 ) 对 碱 性 氨 基 酸 (Lys Arg His) 和 酸 性 氨 基 酸 (Asp Glu) 的 R f 值 有 什 么 影 响? 第 19 页, 共 71 页

实 验 四 甲 醛 滴 定 法 测 定 氨 基 氮 一 目 的 和 要 求 初 步 掌 握 甲 醛 滴 定 法 测 定 氨 基 酸 含 量 的 方 法 原 理 和 操 作 要 点 二 原 理 蛋 白 质 和 氨 基 酸 是 两 性 电 解 质, 在 水 溶 液 中 有 如 下 平 衡 : R-CH-COO - R-CH-COO - + H + NH 3 + NH 2 氨 基 酸 是 弱 酸, 完 全 解 离 时 ph 为 11-12 或 更 高, 若 用 碱 滴 定 NH 3 + 所 释 放 的 H + 测 定 氨 基 酸, 一 般 批 示 剂 变 色 域 小 于 10, 很 难 准 确 指 示 终 点 常 温 下, 甲 醛 能 迅 速 与 氨 基 酸 中 不 带 电 荷 的 氨 基 相 互 作 用, 促 使 -NH 3 + 上 H + 的 释 放 使 滴 定 终 点 移 至 ph9.0 左 右, 正 是 酚 酞 的 变 色 范 围 因 此 可 以 用 酚 酞 作 指 示 剂, 以 氢 氧 化 钠 来 滴 定 NH 3 + 上 的 H + 反 应 如 下 : R-CH-COO - R-CH-COO - + H + + OH H 2 O NH 3 + NH 2 R-CH-COO - +HCHO R CH-COO HCHO R CH-COO NH 2 NHCH 2 OH N(CH 2 OH) 2 羟 甲 基 氨 基 酸 二 羟 甲 基 氨 基 酸 在 ph 中 性 和 常 温 下, 甲 醛 迅 速 与 氨 基 酸 上 的 氨 基 或 亚 氨 基 结 合, 使 上 述 平 衡 向 右 移 动, 促 进 H + 的 释 放, 从 而 使 溶 液 酸 度 增 加 每 释 放 一 个 H + 就 相 当 于 一 个 氨 基 酸, 因 此, 从 滴 定 所 用 氢 氧 化 钠 溶 液 的 量, 可 以 算 出 样 品 中 氨 基 氮 的 含 量, 也 就 可 以 算 出 氨 基 酸 的 含 量 其 准 确 度 公 达 理 论 氨 基 酸 含 量 的 90% 如 果 样 品 为 一 种 已 知 的 氨 基 酸, 从 甲 醛 滴 定 的 结 果 可 以 算 出 氨 基 酸 的 含 量 ( 脯 氨 酸 与 甲 醛 作 用 生 成 不 稳 定 的 化 合 物, 使 滴 定 值 偏 低 酪 氨 酸 的 滴 定 值 偏 高 ) 如 果 样 品 是 多 种 氨 基 酸 的 混 合 物, 如 蛋 白 质 的 水 解 液, 则 滴 定 结 果 不 能 作 为 氨 基 酸 的 定 量 依 据 但 此 法 简 单 迅 速, 常 用 来 测 定 蛋 白 质 的 水 解 程 度 随 水 解 程 度 的 增 加 滴 定 值 也 增 加, 当 滴 定 值 不 再 增 加 时, 表 示 水 解 作 用 已 完 全 本 方 法 一 般 采 用 的 甲 醛 浓 度 是 2 3.0 mol/l, 即 滴 定 后 最 终 浓 度 为 6 9% 三 器 材 第 20 页, 共 71 页

1 100ml 三 角 瓶 2 微 量 滴 定 管 3 吸 量 管 四 试 剂 1 0.1 mol/l 标 准 甘 氨 酸 溶 液 6ml/ 人 准 确 称 取 7.5g 定 溶 于 1000ml 水 中 2 0.1 mol/l 标 准 氢 氧 化 钠 溶 液 约 10 ml/ 人 3 0.5% 酚 酞 指 示 剂 15D ml/ 人 0.5% 酚 酞 的 50% 乙 醇 溶 液 4 中 性 甲 醛 溶 液 10 ml/ 人 50ml36 37% 甲 醛 (AR) 加 入 0.5 ml 0.5% 酚 酞 指 示 剂, 用 0.1 mol/l 标 准 氢 氧 化 钠 溶 液 滴 定 至 微 红 色 此 试 剂 在 临 用 前 中 和, 如 已 放 置 一 段 时 间, 使 用 前 需 重 新 中 和 五 操 作 方 法 : 1 取 三 个 100ml 的 锥 形 瓶, 编 号, 向 第 一 二 号 瓶 内 各 加 入 2 ml 0.1 mol/l 标 准 甘 氨 酸 溶 液 和 5ml 水, 混 匀 向 三 号 瓶 内 加 入 7ml 水 然 后 向 三 个 瓶 中 各 加 入 5D 酚 酞 指 示 剂, 混 匀 后 各 加 入 2 ml 中 性 甲 醛 溶 液, 再 混 匀, 分 别 用 0.1 mol/l 标 准 氢 氧 化 钠 溶 液 滴 定 至 溶 液 显 微 红 色 重 复 以 上 实 验 二 次, 记 录 每 次 每 瓶 消 耗 标 准 氢 氧 化 钠 溶 液 的 毫 升 数 取 平 均 值, 计 算 甘 氨 酸 氨 基 氮 的 加 收 率 甘 氨 酸 氨 基 氮 的 加 收 率 % = 实 际 测 得 量 / 加 入 理 论 量 100 = (V V 0 ) C NaOH 14.008 / 2 C Gly 14.008 公 式 中 实 际 测 得 量 : 滴 定 第 一 和 二 号 瓶 消 耗 的 标 准 氢 氧 化 钠 溶 液 的 ml 数 的 平 均 值 与 第 三 号 瓶 消 耗 氢 氧 化 钠 溶 液 的 ml 数 之 差 乘 以 标 准 氢 氧 化 钠 的 浓 度, 再 乘 以 14.008 加 入 理 论 量 :2ml 乘 以 标 准 甘 氨 酸 的 浓 度 再 乘 以 14.008 即 为 加 入 理 论 量 的 mg 数 2 取 末 知 浓 度 的 甘 氨 酸 溶 液 2ml, 依 上 术 方 法 进 行 测 定, 平 行 做 二 份, 取 其 平 均 值 计 算 每 ml 甘 氨 酸 溶 液 中 含 有 氨 基 氮 的 mg 数 氨 基 氮 (mg/ml)= (V V 0 ) C NaOH 14.008 / 2 式 中 :V 表 示 滴 定 待 测 液 耗 用 标 准 氢 氧 化 钠 溶 液 的 ml 数 V 0 表 示 滴 定 对 照 管 ( 三 号 瓶 ) 耗 用 标 准 氢 氧 化 钠 溶 液 的 ml 数 注 : 本 实 验 为 定 量 实 验, 甘 氨 酸 和 氢 氧 化 钠 的 浓 度 要 严 格 标 定, 加 量 要 准 确, 全 部 操 作 要 按 分 第 21 页, 共 71 页

析 化 学 要 求 进 行 六 思 考 题 1 甲 醛 滴 定 时, 加 入 氢 氧 化 钠 溶 液 滴 定 的 是 氨 基, 而 不 是 羧 基, 为 什 么? 2 为 什 么 不 能 用 一 般 的 酸 碱 指 示 剂 来 指 示 氢 氧 化 钠 溶 液 滴 定 氨 基 酸 的 -NH + 3 第 22 页, 共 71 页

实 验 五 血 清 蛋 白 的 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 一 目 的 和 要 求 1 掌 握 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 的 原 理 和 操 作 方 法 2 作 出 清 晰 合 格 的 人 血 清 蛋 白 的 电 泳 图 谱 二 原 理 COO - COO - COO - COOH 负 极 Pr H + COO - Pr OH - COO - Pr 正 极 (NH 3 ) + (NH 3 ) + (NH 3 ) + (NH 3 ) + (NH 3 ) + NH 2 ph < pi ph = pi ph > pi + 净 电 荷 = 0 - 带 电 颗 粒 在 电 场 的 作 用 下, 向 着 与 其 电 性 相 反 的 广 州 方 向 移 动, 这 种 现 象 称 为 电 泳 (Electrophoresis) 采 用 醋 酸 纤 维 薄 膜 为 支 持 物 的 电 泳 方 法, 叫 做 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 醋 酸 纤 维 素 是 纤 维 的 羟 基 乙 酰 化 所 形 成 的 纤 维 素 乙 酰 酯 将 它 溶 于 有 机 溶 剂, 如 丙 酮 氯 仿 氯 乙 烯 等 后 涂 抹 成 均 匀 的 薄 膜, 则 成 为 醋 酸 纤 维 薄 膜 任 一 质 点, 由 于 其 本 身 的 解 离 作 用 或 表 面 上 吸 附 有 其 它 事 业 电 质 点, 在 电 场 中 便 会 向 一 定 的 电 + 极 移 动 如 蛋 白 质 分 子, 由 于 它 具 有 许 多 可 解 离 的 酸 性 基 团 或 碱 性 基 团, 如 COOH NH 3 等, 它 是 一 典 型 的 两 性 电 解 质, 在 一 定 的 ph 条 件 下, 就 会 解 离 而 带 电, 带 电 的 性 质 和 多 少 决 定 于 蛋 白 质 的 ph 值 和 离 子 强 度 在 某 一 ph 条 件 下, 蛋 白 质 分 子 所 带 的 正 电 荷 数 恰 好 等 于 负 电 荷 数, 即 净 电 荷 等 于 零 此 时, 蛋 白 质 质 点 在 电 场 中 不 移 动, 溶 液 的 这 一 ph 值, 称 为 蛋 白 质 的 等 电 点 如 果 溶 液 的 ph < pi, 则 蛋 白 质 分 子 结 合 一 部 分 H + 而 带 正 电 荷, 在 电 场 中 就 会 向 负 极 移 动 相 反, 溶 液 ph > pi, 则 蛋 白 质 分 子 会 解 离 出 一 部 份 H + 而 带 负 电 荷, 此 时 蛋 白 质 分 子 在 电 场 中 就 会 向 正 极 移 动 不 同 的 带 电 颗 粒 在 同 一 电 场 中 的 泳 动 速 度 不 同, 常 用 泳 动 度 ( 或 称 迁 移 率 ) 来 表 示 泳 动 度 的 定 义 为 : 带 电 颗 粒 在 单 位 电 场 强 度 下 的 泳 动 速 度 U=V/E=d/t/V/L=dL/dt U: 泳 动 度 (cm 2 / 伏 特 秒 ) V: 泳 动 速 度 (cm/ 秒 ) E: 电 场 强 度 d: 质 点 泳 动 的 距 离 L: 支 持 物 的 有 效 长 度 (cm) V: 电 压 t: 时 间 ( 秒 ) 第 23 页, 共 71 页

带 电 颗 粒 在 电 场 中 的 泳 动 速 度 与 本 身 所 带 净 电 荷 的 量 质 点 的 大 小 及 形 状 有 关 一 般 来 说, 颗 粒 所 带 的 净 电 荷 愈 多, 颗 粒 愈 小, 且 愈 接 近 于 球 形, 则 在 电 场 中 的 泳 动 速 度 愈 快 反 之 则 愈 慢 泳 动 速 度 除 了 受 质 点 本 身 性 质 的 影 响 外, 还 受 其 它 外 界 因 素 的 影 响 如 溶 液 的 粘 度 介 电 常 数 : V=εED/CJ ε: 电 动 势 D: 介 电 常 数 C: 常 数 J: 粘 度 影 响 泳 动 速 度 的 主 要 外 界 因 素 : 1 电 场 强 度 E 电 场 强 度 对 泳 动 速 度 起 着 决 定 性 的 作 用, 电 场 强 度 是 指 每 1cm 的 电 位 降, 也 称 电 位 梯 度 如 进 行 纸 电 泳, 滤 纸 两 端 距 20cm 处 测 得 电 位 降 为 200 伏 特, 则 E=200/20=10V/cm 电 场 强 度 越 大, 泳 动 速 度 越 快 依 电 场 强 度 的 大 小, 可 将 电 泳 分 为 常 压 电 泳 (100 500V) 和 高 压 电 泳 (500 10000V) 常 压 电 泳 的 电 场 强 度 一 般 为 2 10 V/cm, 所 需 时 间 较 长, 几 小 时 到 几 天 高 压 电 泳 的 电 场 强 度 为 20 200 V/cm, 电 泳 分 离 时 间 较 短, 有 时 仅 需 几 分 钟 常 压 电 泳 一 般 多 用 于 分 离 蛋 白 质 等 大 分 子 物 质, 高 压 电 泳 则 用 于 分 离 氨 基 酸 小 肽 核 苷 酸 等 小 分 子 物 质 2 溶 液 的 ph 值 溶 液 的 ph 值 决 定 着 带 电 颗 粒 的 解 离 程 度, 亦 即 决 定 基 其 带 电 荷 的 多 少 对 蛋 白 质 氨 基 酸 这 些 两 性 电 解 质 而 言,pH 离 等 电 点 越 远, 则 颗 粒 所 带 净 电 荷 越 多, 泳 动 速 度 也 越 快, 反 之 则 越 慢 故 当 分 离 某 个 蛋 白 质 混 合 物 时, 应 选 择 一 个 合 适 的 ph, 使 各 种 蛋 白 质 所 带 的 电 荷 量 差 异 较 大, 有 利 于 彼 此 分 开 为 了 使 电 泳 过 程 中 ph 恒 定, 应 选 用 缓 冲 溶 液 3 溶 液 的 离 子 强 度 离 子 强 度 代 表 所 有 类 型 的 离 子 所 产 生 的 净 电 力, 也 就 是 说 全 部 的 离 子 效 应, 它 取 决 于 离 子 电 荷 的 总 数, 而 与 溶 液 中 盐 类 的 性 质 无 关 离 子 强 度 影 响 颗 粒 的 电 动 势, 溶 液 的 离 子 强 度 越 高, 电 动 势 越 小, 泳 动 速 度 越 慢 一 般 最 适 的 离 子 强 度 在 0.02-0.2 之 间 稀 溶 液 的 离 子 强 度 (I)= CZ 2 /2 4 电 渗 现 象 在 电 场 中 由 于 多 孔 支 持 物 吸 附 水 中 的 正 负 离 子, 使 溶 液 相 对 带 电, 在 电 场 的 作 用 下, 溶 液 就 向 一 定 的 方 向 移 动, 称 为 电 渗 现 象 第 24 页, 共 71 页

///////////////////////////// ///////////////////////////// - - - - - - -- - - - + + + + + + + + 负 极 + + + + + + + + - - - - - - -- - - - 正 极 如 在 纸 电 泳 时, 由 于 纸 上 带 有 负 电 荷, 而 与 纸 接 触 的 水 溶 液 由 于 静 电 感 应 带 有 正 电 荷, 在 电 场 的 作 用 下, 溶 液 便 向 负 极 移 动 并 带 动 质 点 向 负 极 移 动 假 若 这 时 进 行 电 泳, 则 质 点 移 动 的 表 面 速 度, 是 质 点 移 动 速 度 和 由 于 溶 液 移 动 而 产 生 电 渗 速 度 的 总 和 若 质 点 原 来 向 正 极 移 动, 则 其 表 面 速 度 比 电 泳 速 度 慢 因 此, 在 电 泳 时 应 尽 量 避 免 使 用 具 有 高 电 渗 作 用 的 支 持 物 5 其 它 因 素 的 影 响 如 缓 冲 液 的 粘 度 与 带 电 颗 相 互 作 用 以 及 电 泳 时 的 温 度 变 化 等 等 因 素 也 能 影 响 电 泳 速 度 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 是 一 种 新 技 术 已 广 泛 应 用 于 科 学 实 验 生 化 产 品 的 分 析 和 临 床 化 验 如 血 清 蛋 白 血 红 蛋 白 脂 蛋 白 糖 蛋 白 类 固 醇 同 工 酶 等 的 分 离 鉴 定 该 方 法 具 有 简 便 快 速 对 样 品 要 求 样 少 区 带 清 晰 灵 敏 度 高 便 于 照 相 和 保 存 等 血 清 蛋 白 的 纸 上 或 薄 膜 电 泳 已 成 为 临 床 生 化 实 验 的 重 要 而 且 常 用 的 方 法 电 泳 结 果 作 为 多 种 疾 病 如 肝 炎 肝 癌 肾 病 骨 髓 瘤 等 生 化 指 标, 为 临 床 诊 断 提 供 重 要 依 据 1 2 3 4 5 1 正 常 血 清 2 γ 球 蛋 白 缺 乏 症 3 胃 病 综 合 症 4 慢 性 肝 炎 5 多 发 性 骨 髓 瘤 正 常 人 血 清 蛋 白 的 相 对 含 量 清 蛋 白 :54.0-73.0 % α1- 球 蛋 白 : 2.8-5.1 % α2- 球 蛋 白 :6.3-10.6 % β- 球 蛋 白 : 5.2-11.0 % γ- 球 蛋 白 :12.5-20.0 % 第 25 页, 共 71 页

血 清 蛋 白 的 等 电 点 分 子 量 与 泳 动 度 的 关 系 蛋 白 质 名 称 等 电 点 分 子 量 泳 动 度 (cm 2 / 伏 特 秒 ) 清 蛋 白 4.88 6.9 10 4-5.9 10-5 α1- 球 蛋 白 5.06 2.0 10 5-5.1 10-5 α2- 球 蛋 白 5.06 3.0 10 5-4.1 10-5 β- 球 蛋 白 5.12 0.9-1.5 10 5-2.8 10-5 γ- 球 蛋 白 6.85-7.5 1.56-3.0 10 5-1.0 10-5 三 器 材 : 1 醋 酸 纤 维 薄 膜 (2 8cm) 2 电 泳 仪 3 点 样 器 4 培 养 皿 5 滤 纸 6 竹 镊 子 7 剪 刀 四 试 剂 : 1 新 鲜 血 清 ( 无 溶 血 现 象 ) 2 巴 比 妥 - 巴 比 妥 钠 缓 冲 液 ph8.6, 离 子 强 度 0.06 巴 比 妥 1.66g 巴 比 妥 钠 12.76g 定 容 于 1000ml 容 量 瓶 中 3 染 色 液 : 100ml / 组 氨 基 黑 10B 0.3g, 甲 醇 : 冰 醋 酸 : 水 =50 :10 :40ml ( 可 重 复 使 用 ) 4 漂 洗 液 : 250-300ml / 组 甲 醇 ( 或 乙 醇 ): 冰 醋 酸 : 水 =45 :5 :50ml 5 透 明 液 : 无 水 乙 醇 : 冰 醋 酸 =7 :3 五 操 作 方 法 : ( 一 ) 仪 器 和 薄 膜 的 准 备 1 醋 酸 纤 维 薄 膜 的 浸 泡 : 将 薄 膜 小 心 地 放 入 盛 有 缓 冲 液 的 方 瓷 盘 中, 使 它 漂 浮 在 表 面 若 迅 速 润 湿, 整 条 薄 膜 色 泽 深 浅 一 致, 则 表 明 薄 膜 质 地 均 匀 ; 若 润 湿 时, 薄 膜 上 出 现 深 浅 不 一 的 条 纹 或 斑 点 等, 则 为 薄 厚 不 匀 薄 膜 实 验 中 应 选 用 质 地 均 匀 的 薄 膜 因 为, 纤 维 素 薄 膜 的 质 量 对 电 泳 的 结 果 影 响 很 大 例 如, 膜 厚 薄 不 匀 可 第 26 页, 共 71 页

以 造 成 区 带 歪 扭 不 齐 各 区 带 界 线 不 清 背 景 脱 色 困 难 实 验 结 果 难 于 重 复 等 现 象 将 选 用 的 薄 膜 用 镊 子 轻 压, 使 它 全 部 浸 入 缓 冲 液 中, 待 薄 膜 完 全 浸 透 ( 约 半 小 时 ) 后 取 出, 夹 在 清 洁 的 滤 纸 中 间, 轻 轻 吸 去 多 余 的 缓 冲 液, 同 时 分 辨 出 光 泽 面 和 无 光 泽 面 2 制 作 滤 纸 桥 :18 2cm 对 折 取 双 层 滤 纸 附 着 在 电 泳 槽 的 支 架 上, 使 它 的 一 端 与 支 架 的 前 沿 对 齐, 而 另 一 端 浸 入 电 泳 槽 的 缓 冲 液 中 然 后 用 缓 冲 液 将 滤 纸 全 部 润 湿 并 驱 除 气 泡, 使 滤 纸 紧 贴 在 支 架 上, 即 为 滤 纸 桥 按 照 同 样 的 方 法, 在 另 一 个 电 极 槽 的 支 架 上 制 作 相 同 的 滤 纸 桥 它 们 的 作 用 是 联 系 薄 膜 和 两 极 缓 冲 液 之 间 的 中 间 桥 梁 3 平 衡 : 用 平 衡 装 置 使 两 个 电 极 槽 内 的 缓 冲 液 的 液 面 彼 此 处 于 水 平 的 状 态 一 般 需 要 平 衡 15-20 分 钟 ( 二 ) 点 样 : 在 薄 膜 无 光 泽 的 一 面 点 样 点 样 区 距 负 极 端 1.5cm 处 点 样 时 将 点 样 器 在 血 清 中 沾 一 下, 瑞 在 膜 条 一 端 轻 轻 地 水 平 地 落 下 并 随 即 提 起 注 意 应 使 血 清 均 匀 分 布 在 点 样 区, 形 成 具 有 一 定 宽 度 粗 细 匀 称 的 直 线, 事 先 可 在 滤 纸 上 练 习 点 样, 掌 握 点 样 技 术, 这 是 获 得 具 有 清 晰 区 带 电 泳 图 谱 的 重 要 环 节 之 一 8cm - + 1.5cm ( 三 ) 电 泳 : 将 已 点 样 的 薄 膜 使 无 光 泽 面 向 下 贴 在 电 泳 槽 支 架 的 滤 纸 桥 上 打 开 电 源 开 关, 调 节 电 压 为 80 伏 特,10 分 钟 后, 将 电 压 调 节 到 110 伏 特 电 流 0.6mA/cm 时 间 :60 分 钟 在 电 泳 过 程 中, 应 注 意 控 制 电 压 和 电 流 强 度, 防 止 过 高 或 过 低 待 电 泳 区 带 展 开 约 3.5cm 时, 则 关 闭 电 源 ( 四 ) 染 色 电 泳 完 毕 后 取 出 薄 膜 直 接 放 入 染 色 液 中, 染 色 5-10 分 钟 ( 五 ) 漂 洗 第 27 页, 共 71 页

用 漂 洗 液 漂 洗,, 每 隔 10 分 钟 左 右 换 一 次 漂 洗 液 连 续 更 换 三 次, 可 使 背 景 颜 色 脱 去 将 薄 膜 夹 在 干 净 的 滤 纸 上, 吸 去 多 余 的 溶 液 操 作 中 要 注 意 控 制 染 色 和 漂 洗 的 时 间, 防 止 背 景 过 深 或 某 些 区 带 太 浅 六 结 果 判 断 : 一 般 在 染 色 后 的 薄 膜 上 可 显 现 清 楚 的 五 条 区 带 从 正 极 端 起, 依 此 为 清 蛋 白 α1- 球 蛋 白 α2- 球 蛋 白 β- 球 蛋 白 γ- 球 蛋 白 定 量 测 定 时 可 将 膜 条 用 滤 纸 压 平 吸 干, 按 区 带 分 段 剪 开, 分 别 浸 泡 在 0.4mol/L NaOH 溶 液 中 半 小 时, 并 剪 取 相 同 大 小 的 无 色 带 膜 条 作 空 白 对 照, 在 A650nm 进 行 比 色 或 者 将 干 燥 的 电 泳 图 谱 膜 条 放 入 透 明 液 中 浸 泡 2-3 分 钟 后 取 出 贴 于 洁 净 玻 璃 板 上, 干 后 即 为 透 明 的 薄 膜 图 谱, 可 用 光 度 计 直 接 测 定 注 意 : 在 操 作 过 程, 不 能 作 手 动 膜, 不 要 对 着 薄 膜 说 话, 防 止 唾 液 蘸 到 膜 上 七 思 考 题 : 1 用 醋 酸 纤 维 薄 膜 做 电 泳 支 持 物 有 什 么 优 点? 2 电 泳 图 谱 清 晰 的 关 键 是 什 么? 如 何 正 确 操 作? 3 为 什 么 将 血 清 样 品 点 在 薄 膜 的 负 极 端, 而 不 点 在 正 极 端? 4 已 知 血 清 中 的 某 些 蛋 白 质 有 以 下 等 电 点 : 血 清 蛋 白 :4.9 脂 蛋 白 :5.5 γ- 球 蛋 白 :6.3-7.3 试 计 算 在 本 实 验 的 缓 冲 液 条 件 下, 三 者 的 相 对 离 子 电 荷, 并 指 出 电 泳 后 它 们 在 薄 膜 上 的 相 对 位 置 第 28 页, 共 71 页

实 验 六 糖 类 的 性 质 实 验 ( 一 ) 糖 类 的 颜 色 反 应 糖 也 叫 碳 水 化 合 物 按 其 化 学 结 构, 糖 是 多 元 醇 的 醛 或 酮 及 其 衍 生 物 如 葡 萄 糖 为 醛 糖, 果 糖 为 酮 糖 通 常 根 据 分 子 中 单 糖 的 数 目 可 把 糖 分 为 单 糖 寡 糖 ( 低 聚 糖 ) 和 多 糖 三 类 单 糖 与 寡 糖 ( 低 聚 糖 ) 都 能 制 成 晶 体, 能 溶 于 水, 有 甜 味 ; 多 糖 不 能 制 成 晶 体, 绝 大 多 数 不 溶 于 水, 无 甜 味 糖 是 生 物 界 分 布 最 广 泛 的 有 机 化 合 物 在 植 物 组 织 中, 其 含 量 可 达 干 重 的 80%, 在 动 物 及 人 体 组 织 中 含 量 较 少, 约 占 干 重 的 2% 糖 是 生 命 活 动 的 主 要 能 量 来 源 一 目 的 和 要 求 1. 了 解 糖 类 某 些 颜 色 反 应 的 原 理. 2. 学 习 应 用 糖 的 颜 色 反 应 鉴 别 糖 类 以 及 区 分 醛 糖 和 酮 糖 的 方 法. 二 原 理 糖 经 浓 无 机 酸 处 理, 脱 水 产 生 糠 醛 或 糠 醛 衍 生 物 通 常 使 用 的 无 机 酸 为 硫 酸 如 用 盐 酸, 则 必 须 加 热 CH CH C 5 H 10 O 5 浓 H 2 SO 4 CH C CHO O 糠 醛 ( 呋 喃 醛 ) CH CH C 6 H 12 O 6 浓 H 2 SO 4 HO CH 2 C C CHO O 糠 醛 衍 生 物 ( 羟 甲 基 糠 醛 ) 这 些 糠 醛 或 糠 醛 衍 生 物 在 浓 无 机 酸 作 用 下, 能 与 酚 类 化 合 物 缩 合 生 成 有 色 物 质 常 用 的 酚 类 有 α- 萘 酚 ( 鉴 定 糖 类 ) 间 苯 二 酚 ( 区 别 醛 糖 和 酮 糖 ) 甲 基 苯 二 酚 ( 又 名 地 衣 酚, 检 验 戊 糖 ) 和 间 苯 三 酚 ( 检 验 戊 糖 ) 等 1 α 萘 酚 反 应 (Molisch 反 应 ) 糖 在 浓 无 机 酸 ( 硫 酸, 盐 酸 ) 的 作 用 下, 脱 水 生 成 抗 糠 醛 及 糠 醛 衍 生 物, 后 者 能 α 萘 酚 生 成 紫 红 色 物 质 在 糖 溶 液 与 浓 硫 酸 两 液 面 间 出 现 紫 色 环 因 此 也 叫 紫 环 反 应 此 法 为 鉴 定 糖 类 最 常 用 的 方 法 自 由 存 在 的 糖 和 结 合 存 在 的 糖 均 呈 阳 性 反 应 此 外, 丙 酮 甲 酸 乳 酸 葡 萄 糖 醛 酸 各 种 糠 醛 衍 生 物 等 皆 呈 颜 色 近 似 的 阳 性 反 应 因 此, 阴 性 反 应 证 明 没 有 糖 类 物 质 存 在, 而 阳 性 反 应, 则 只 能 说 明 有 糖 存 在 的 可 能 需 进 一 步 作 其 它 糖 的 定 性 试 验 才 能 肯 定 确 有 糖 的 存 在 第 29 页, 共 71 页

2 间 苯 二 酚 反 应 (Seliwanoff 反 应 ) 该 反 应 是 检 定 酮 糖 的 特 殊 反 应 在 酸 的 作 用 下, 已 酮 糖 脱 水 生 成 羟 甲 基 糠 醛 后 者 与 间 苯 二 酚 结 合 成 鲜 红 色 的 物 质, 反 应 迅 速 仅 需 20-30 秒 在 同 样 条 件 下, 醛 糖 形 成 羟 甲 基 糠 醛 较 慢 只 有 在 糖 浓 度 较 高 时, 或 煮 沸 时 间 较 长 时, 才 给 出 微 弱 的 阳 性 反 应 蔗 糖 被 盐 酸 水 解 生 成 果 糖 也 能 给 出 阳 性 反 应 三 器 材 1 试 管 及 试 管 架 2 滴 管 3 水 浴 锅 四 试 剂 1 莫 氏 (Molisch) 试 剂 :5% α 萘 酚 的 酒 精 溶 液 10 滴 / 人 称 取 α 萘 酚 5g, 溶 于 95% 酒 精 中, 总 体 积 达 100mL, 贮 于 棕 色 瓶 内 用 前 配 制 2 塞 氏 (Seliwanoff) 试 剂 :0.05% 间 苯 二 酚 盐 酸 溶 液 15 ml/ 人 称 取 间 苯 二 酚 0.05g 溶 于 30mL 浓 盐 酸 中, 再 用 蒸 馏 水 稀 释 至 100mL 3 1% 葡 萄 糖 溶 液 1.5mL/ 人 4 1% 果 糖 溶 液 1.5mL/ 人 5 1% 蔗 糖 溶 液 1.5mL/ 人 6 1% 淀 粉 溶 液 1 ml/ 人 7 0.1% 糠 醛 溶 液 1mL/ 人 8 浓 硫 酸 5mL/ 人 五 操 作 方 法 1 α 萘 酚 反 应 (Molisch 反 应 ) 试 管 1 2 3 4 5 1% 葡 萄 糖 溶 液 1% 果 糖 溶 液 1% 蔗 糖 溶 液 1% 淀 粉 溶 液 0.1% 糠 醛 溶 液 莫 氏 试 剂 ( 滴 ) 2 2 2 2 2 充 分 摇 匀 H 2 SO 4 (ml) 现 象 第 30 页, 共 71 页

取 5 支 试 管, 分 别 加 入 1% 葡 萄 糖 溶 液,1% 果 糖 溶 液,1% 蔗 糖 溶 液,1% 淀 粉 溶 液,0.1% 糠 醛 溶 液 各 1mL 再 向 5 只 试 管 中 各 加 入 2 滴 莫 氏 试 剂, 充 分 混 合 斜 执 试 管, 沿 管 壁 慢 慢 加 入 浓 硫 酸 约 1mL, 慢 慢 立 起 试 管, 切 勿 摇 动 浓 硫 酸 在 试 液 下 形 成 两 层 在 二 液 分 界 处 有 紫 红 色 环 出 现 观 察, 记 录 各 管 颜 色 注 意 : 操 作 中 注 意 滴 加 莫 氏 试 剂 时, 试 剂 勿 与 管 壁 接 触, 否 则 加 深 硫 酸 时, 与 莫 氏 试 剂 生 成 绿 色, 影 响 实 验 结 果 2 间 苯 二 酚 反 应 (Seliwanoff 反 应 ) 试 管 1 2 3 1% 葡 萄 糖 溶 液 0.5ml 1% 果 糖 溶 液 0.5ml 1% 蔗 糖 溶 液 0.5ml 塞 氏 试 剂 (ml) 5 5 5 混 匀, 置 沸 水 浴 中 现 象 取 3 支 试 管, 分 别 加 入 1% 葡 萄 糖 溶 液,1% 果 糖 溶 液,1% 蔗 糖 溶 液 各 0.5mL 再 向 个 试 管 分 别 加 入 塞 氏 试 剂 5mL, 混 匀 将 3 只 试 管 同 时 放 入 沸 水 浴 中, 注 意 观 察, 记 录 各 管 颜 色 的 变 化 及 变 化 时 间 注 : 果 糖 进 行 此 反 应 时, 有 时 有 沉 淀 产 生, 沉 淀 能 溶 于 乙 醇 成 红 色 溶 液 六 思 考 题 1 可 用 何 种 颜 色 反 应 鉴 别 酮 糖 的 存 在? 2 α 萘 酚 反 应 的 原 理 是 什 么? 3 α 萘 酚 及 间 苯 二 酚 的 结 构 是 什 么? 应 用 这 两 个 反 应 分 析 未 知 样 品 时, 应 注 意 些 什 么 问 题? 第 31 页, 共 71 页

实 验 七 糖 类 的 性 质 实 验 ( 二 ) 糖 类 的 还 原 作 用 一 目 的 和 要 求 学 习 几 种 常 用 的 鉴 定 糖 类 还 原 性 的 方 法 及 其 原 理 二 原 理 还 原 糖 : 分 子 中 含 有 半 缩 醛 羟 基 的 单 糖 或 双 糖 叫 还 原 糖 许 多 糖 类 由 于 其 分 子 总 含 有 自 由 的 或 潜 在 的 醛 基 或 酮 基, 故 在 碱 性 溶 液 中 能 将 铜, 铋, 汞, 铁, 银 等 金 属 离 子 还 原, 同 时 糖 类 本 身 被 氧 化 成 糖 酸 及 其 他 产 物 糖 类 这 种 性 质 常 被 利 用 于 检 测 糖 的 还 原 性 及 还 原 糖 的 定 量 测 定 2+ 本 实 验 进 行 糖 类 的 还 原 作 用 所 用 的 试 剂 为 斐 林 试 剂 和 本 尼 迪 克 特 试 剂 它 们 都 是 含 C u 的 碱 性 溶 液, 能 使 还 原 糖 氧 化 而 本 身 被 还 原 成 红 色 或 黄 色 的 Cu 2 o 沉 淀 生 成 Cu 2 o 沉 淀 的 颜 色 之 所 以 不 同 是 由 于 在 不 同 条 件 下 产 生 的 沉 淀 颗 粒 大 小 不 同 引 起 的, 颗 粒 越 小 呈 黄 色, 越 大 则 呈 红 色 如 有 保 护 性 胶 体 存 在 时, 常 生 成 黄 色 沉 淀 三 器 材 1 试 管 及 试 管 架 2 试 管 夹 3 水 浴 锅 4 电 炉 四 试 剂 1 斐 林 (Fehling) 试 剂 10mL/ 人 甲 液 ( 硫 酸 酮 溶 液 ): 称 取 34.5g 硫 酸 铜 (CuSO 4 5H 2 O) 溶 于 500mL 蒸 馏 水 中 乙 液 ( 碱 性 酒 石 酸 盐 溶 液 ): 称 取 125g 氢 氧 化 钠 和 137g 酒 石 酸 钾 钠 溶 于 500mL 蒸 馏 水 中 为 了 避 免 变 质, 甲, 乙 二 液 分 开 保 存 用 前, 将 甲, 乙 二 液 等 量 混 合 即 可 2 本 尼 迪 克 特 (Benedict) 试 剂 10mL/ 人 称 取 柠 檬 酸 钠 173g 及 碳 酸 钠 (Na 2 CO 3 H 2 O)100g 加 入 600mL 蒸 馏 水 中, 加 热 使 其 溶 解, 冷 却, 稀 释 至 850mL 另 称 取 17.3g 硫 酸 铜 溶 解 于 100mL 热 蒸 馏 水 中, 冷 却, 稀 释 至 150mL 最 后, 将 硫 酸 铜 溶 液 徐 徐 地 加 入 柠 檬 酸 钠 碳 酸 钠 溶 液 中, 边 加 边 搅 拌, 混 匀, 如 有 沉 淀, 过 滤 后 贮 于 试 剂 瓶 中 可 长 期 使 用 3 1% 葡 萄 糖 溶 液 2mL/ 人 4 1% 果 糖 溶 液 2mL/ 人 第 32 页, 共 71 页

5 1% 蔗 糖 溶 液 2mL/ 人 6 1% 麦 芽 糖 溶 液 2 ml/ 人 7 1% 淀 粉 溶 液 2 ml/ 人 五 操 作 先 取 一 支 试 管 加 入 斐 林 试 剂 约 1mL, 再 加 入 4mL 蒸 馏 水, 加 热 煮 沸, 如 有 沉 淀 生 成, 说 明 此 试 剂 已 不 能 使 用 经 检 验, 试 剂 合 格 后, 再 进 行 下 述 实 验 取 5 支 试 管, 分 别 加 入 2mL 斐 林 试 剂, 再 向 各 试 管 分 别 加 入 1% 葡 萄 糖 溶 液,1% 果 糖 溶 液,1% 蔗 糖 溶 液,1% 麦 芽 糖 溶 液,1% 淀 粉 溶 液 各 1mL 置 沸 水 浴 中 加 热 数 分 钟, 取 出, 冷 却 观 察 各 管 溶 液 的 变 化 另 取 5 支 试 管, 用 本 尼 迪 克 特 试 剂 重 复 上 述 实 验 比 较 两 种 试 法 的 结 果 Fehling 试 剂 Benedict 试 剂 1% 葡 萄 糖 溶 液 1% 果 糖 溶 液 1% 蔗 糖 溶 液 1% 麦 芽 糖 溶 液 1% 淀 粉 溶 液 注 :1 氯 仿 铵 盐 对 斐 林 试 剂 有 干 扰 作 用, 但 氯 仿 不 干 扰 本 尼 迪 克 特 试 剂 2 本 尼 迪 克 特 试 剂 是 改 良 的 斐 林 试 剂, 其 优 点 是 试 剂 稳 定 灵 敏 度 高, 即 使 葡 萄 糖 含 量 很 少 (0.1%) 也 能 生 成 大 量 沉 淀 六 思 考 题 1 斐 林 氏, 本 尼 迪 克 特 氏 试 法 检 验 糖 的 原 理 是 什 么? 2 试 比 较 斐 林 氏 和 本 尼 迪 克 特 氏 试 法 3 通 过 本 实 验, 你 对 于 在 科 学 实 验 中 如 何 运 用 分 析 对 比 的 方 法 认 识 客 观 事 物 的 本 质 有 什 么 体 会? 第 33 页, 共 71 页

实 验 八 温 度 对 酶 活 力 的 影 响 激 活 剂 和 抑 制 剂 对 酶 活 力 的 影 响 一 目 的 和 要 求 1 通 过 检 查 不 同 温 度 下 唾 液 淀 粉 酶 的 活 性, 了 解 温 度 对 酶 活 力 的 影 响 2 了 解 酶 促 反 应 的 激 活 和 抑 制, 检 查 激 活 剂 和 抑 制 剂 影 响 酶 促 反 应 的 方 法 的 原 理 二 原 理 淀 粉 有 色 糊 精 无 色 糊 精 麦 芽 糖 葡 萄 糖 依 分 子 量 的 大 小 +KI-I 2 蓝 色 紫 色 暗 褐 色 红 色 1 温 度 对 酶 活 性 影 响 酶 催 化 的 反 应 受 温 度 的 影 响 很 大, 一 方 面 与 一 般 化 学 反 应 一 样, 提 高 温 度 可 以 增 加 酶 促 反 就 的 速 度 通 常 温 度 每 升 高 10, 反 应 速 度 增 加 一 倍 左 右, 最 后 反 应 速 度 达 到 最 大 值 另 一 方 面, 酶 是 蛋 白 质, 温 度 过 高, 可 引 起 蛋 白 质 变 性, 导 致 酶 失 活 因 此 反 应 速 度 达 到 最 大 值 以 后, 随 着 温 度 的 升 高, 反 应 速 度 降 低, 直 至 完 全 停 止 酶 促 反 应 达 到 最 大 时 的 温 度 称 为 最 适 温 度 高 于 或 低 于 最 适 温 度, 反 应 速 度 都 会 降 低 大 多 数 动 物 酶 的 最 适 温 度 为 37-40, 植 物 酶 最 适 温 度 为 50-60 酶 对 温 度 的 稳 定 性 与 其 存 在 形 式 有 关, 有 些 酶 的 干 燥 试 剂, 虽 加 热 到 100, 其 活 性 并 无 明 显 变 化, 但 在 100 的 溶 液 中 却 很 快 完 全 失 去 活 性 低 温 能 降 低 或 抑 制 酶 的 活 性, 但 不 能 使 酶 失 去 活 性 2 酶 的 活 化 和 抑 制 酶 的 活 性 常 受 某 些 物 质 的 影 响, 能 使 酶 活 性 增 加 的 物 质, 称 为 酶 的 激 活 剂, 能 使 酶 活 性 降 低 的 物 质 称 为 酶 的 抑 制 剂 Cl - 是 唾 液 淀 粉 酶 的 激 活 剂,Cu + 为 其 抑 制 剂 很 少 量 的 激 活 剂 和 抑 制 剂 就 会 影 响 酶 的 活 性, 而 且 常 具 有 特 异 性 值 得 注 意 的 是 激 活 剂 和 抑 制 不 是 绝 对 的, 有 些 物 质 在 低 浓 度 时 为 某 种 酶 的 激 活 剂, 而 在 高 浓 度 时 则 为 该 酶 的 抑 制 剂 如 氯 化 钠 溶 液 的 浓 度 达 到 1/3 饱 和 度 时, 就 可 抑 制 唾 液 淀 粉 酶 的 活 性 三 器 材 : 1 试 管 及 试 管 架 2 恒 温 水 浴 锅 3 冰 浴 4 沸 水 浴 第 34 页, 共 71 页

四 试 剂 1 0.2% 淀 粉 的 0.3% 氯 化 钠 溶 液 4.5ml / 人 2 稀 释 50-200 倍 的 唾 液 用 蒸 馏 水 漱 口, 以 清 除 食 物 残 渣, 再 含 一 口 蒸 馏 水, 半 分 钟 后 使 其 流 入 量 筒 并 稀 释 50-200 倍 ( 稀 释 倍 数 可 根 据 各 人 唾 液 淀 粉 酶 活 性 调 整 ), 混 匀 备 用 3 KI-I 2 溶 液 KI 20g 及 I 2 10g 溶 于 100ml 水 中, 使 用 前 稀 释 20 倍 4 0.1ml 淀 粉 溶 液 6 ml / 人 5 1% NaCl 溶 液 0.5ml / 人 6 1% CuSO 4 溶 液 0.5ml / 人 7 1% Na 2 SO 4 溶 液 0.5ml / 人 五 操 作 方 法 : 1 温 度 的 影 响 : 淀 粉 和 可 溶 性 淀 粉 遇 碘 呈 蓝 色 糊 精 按 其 分 子 的 大 小, 遇 碘 可 呈 蓝 色 紫 色 暗 褐 色 或 红 色 最 简 单 的 糊 精 遇 碘 不 呈 颜 色, 麦 芽 糖 遇 碘 也 不 呈 颜 色 不 在 同 温 度 下, 淀 粉 被 唾 液 淀 粉 酶 水 解 的 程 度 可 由 水 解 混 合 物 遇 碘 呈 现 的 颜 色 来 判 断 取 3 支 试 管, 编 号, 各 加 入 1.5ml 0.2% 淀 粉 的 0.3% 氯 化 钠 溶 液, 将 1 3 号 试 管 放 入 37 恒 温 水 浴 中,2 号 试 管 放 入 冰 水 中 10 分 钟 后 1 2 号 试 管 加 入 稀 释 唾 液 各 1ml,3 号 试 管 加 入 煮 沸 过 的 稀 释 唾 液 1ml 15 分 钟 后 取 出 ( 将 2 号 试 管 内 的 液 体 分 为 两 半 ), 用 碘 化 钾 和 碘 溶 液 来 检 验 1 2 3 号 试 管 内 淀 粉 被 省 事 液 淀 粉 酶 水 解 的 程 度 记 录 并 解 释 实 验 结 果 将 2 号 试 管 剩 下 的 一 半 溶 液 放 入 37 恒 温 水 浴 中 继 续 保 温 10 分 钟 后, 再 用 碘 液 体 验, 结 果 如 何? 管 号 1 2 3 0.2% 淀 粉 的 0.3% 氯 化 钠 溶 液 (ml) 1.5 1.5 1.5 将 1 3 号 试 管 放 入 37 恒 温 水 浴 中,2 号 试 管 放 入 冰 浴 中 10 分 钟 稀 释 唾 液 (ml) 1 1 煮 沸 过 的 稀 释 唾 液 (ml) 1 反 应 15 分 钟 后 KI I 2 溶 液 1 滴 1 滴 1 滴 实 验 结 果 第 35 页, 共 71 页

2 唾 液 淀 粉 酶 的 活 化 和 抑 制 取 试 管 4 支, 编 号 后 按 下 表 加 入 试 剂 : 管 号 1 2 3 4 0.1ml 淀 粉 溶 液 (ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1%CuSO 4 溶 液 (ml) 0.5 1% NaCl 溶 液 (ml) 0.5 1% Na 2 SO 4 溶 液 (ml) 0.5 蒸 馏 水 (ml) 0.5 稀 释 唾 液 (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 37 恒 温 水 浴 保 温 15 分 钟 KI I 2 溶 液 2 滴 2 滴 2 滴 2 滴 实 验 结 果 解 释 结 果, 并 说 明 本 实 验 第 3 号 管 的 意 义 六 思 考 题 : 1 什 么 是 酶 的 最 适 温 度? 有 何 实 践 意 义? 2 酶 在 干 燥 的 状 态 下 与 水 溶 液 中, 它 的 活 性 受 温 度 的 影 响 是 否 相 同? 这 个 性 质 对 酶 的 保 存 有 何 意 义? 3 什 么 是 酶 的 激 活 剂 和 抑 制 剂? 抑 制 剂 与 变 性 剂 的 何 不 同? 试 举 例 说 明 4 为 什 么 可 以 用 碘 化 钾 - 钾 溶 液 作 指 示 剂 检 查 温 度 对 唾 液 淀 粉 酶 的 影 响? 第 36 页, 共 71 页

实 验 九 ph 对 酶 活 力 的 影 响 及 酶 的 专 一 性 一 目 的 和 要 求 : 1 了 解 ph 对 酶 活 力 的 影 响 2 学 习 测 定 酶 的 最 适 ph 的 方 法 3 掌 握 检 查 酶 的 专 一 性 的 方 法 和 原 理 二 原 理 : 1 ph 对 酶 活 力 的 影 响 : 酶 的 活 性 受 环 境 ph 的 影 响 极 为 显 著 通 常 各 种 酶 只 有 在 一 定 的 ph 范 围 内 才 能 表 现 出 它 的 活 性 一 种 酶 表 现 其 活 性 最 高 时 的 ph, 称 为 该 酶 的 最 适 ph 不 同 的 酶 最 适 ph 也 不 相 同 例 如, 胃 蛋 白 酶 的 最 适 ph 为 1.5-2.5, 胰 蛋 白 酶 的 最 适 ph 为 8 等 酶 的 最 适 ph 受 底 物 性 质 和 缓 冲 液 性 质 的 影 响 例 如 唾 液 淀 粉 酶 的 最 适 ph 为 6.8, 但 在 磷 酸 盐 缓 冲 液 中, 其 最 适 ph 为 6.4-6.6, 而 在 醋 酸 缓 冲 液 中 则 为 5.6 2 酶 的 专 一 性 酶 是 生 物 催 化 剂, 与 一 般 催 化 剂 最 主 要 的 区 别 是 酶 有 高 度 的 专 一 必 性 所 谓 专 一 性 是 指 一 种 酶 只 能 对 一 种 化 合 物 或 一 类 化 合 物 起 一 定 的 催 化 作 用, 而 不 能 对 别 的 物 质 发 生 催 化 反 应 本 实 验 以 唾 液 淀 粉 酶 对 淀 粉 和 蔗 糖 的 作 用 为 例, 说 明 酶 的 专 一 性 三 器 材 : 1 试 管 和 试 管 架 2 吸 量 管 3 三 角 瓶 4 白 瓷 板 5 量 筒 6 恒 温 水 浴 锅 四 试 剂 : 1 0.5 % 淀 粉 的 0.3 % 氯 化 钠 溶 液 ( 新 鲜 配 制 ) 8 ml / 人 2 稀 释 50-200 倍 的 新 鲜 唾 液 3 0.2 mol/l Na 2 HPO 4 溶 液 30 ml / 人 精 确 称 取 Na 2 HPO 4.2H 2 O(AR)107.43g 溶 于 1500ml 蒸 馏 水 中 4 0.1 mol/l 柠 檬 酸 溶 液 11 ml / 人 第 37 页, 共 71 页

精 确 称 取 分 析 纯 柠 檬 酸 21.01g 溶 解 于 1000ml 蒸 馏 水 中 5 1.0 % 淀 粉 的 0.3 % 氯 化 钠 溶 液 ( 新 鲜 配 制 ) 24D ml / 人 6 2% 蔗 糖 溶 液 (AR) 24D ml / 人 7 Benedict 试 剂 12 ml / 人 A 液 : 无 水 CuSO 4 17.4g 溶 于 100ml 热 水 中, 冷 却 后 稀 释 至 150ml B 液 : 取 柠 檬 酸 钠 173g, 无 水 Na 2 CO 3 100g 溶 于 600ml 水 中, 加 热 溶 解, 冷 却 后 加 水 至 850ml 将 A 液 缓 缓 倾 入 B 液 本 试 剂 可 以 长 期 保 存 8 蔗 糖 酶 溶 液 2 ml/ 人 取 干 酵 母 粉 100g, 置 于 乳 钵 内, 添 加 适 量 蒸 馏 水 及 少 量 大 石 英 砂 用 力 研 磨 提 取 约 1 小 时, 再 加 蒸 馏 水, 使 总 体 积 约 为 500ml, 过 滤 将 滤 液 保 存 于 冰 箱 内 备 用 9 KI I 2 溶 液 五 操 作 方 法 : 1 ph 对 酶 活 力 的 影 响 : 取 4 个 50ml 的 锥 开 形 瓶, 编 号, 用 吸 量 管 按 下 表 精 确 加 入 0.2 mol/l Na 2 HPO 4 溶 液 和 0.1 mol/l 柠 檬 酸 溶 液 以 制 备 ph5.0-8.0 的 4 种 缓 冲 液 锥 形 瓶 编 号 0.2 mol/l Na 2 HPO 4 (ml) 0.1 mol/l 柠 檬 酸 溶 液 (ml) ph 1 5.15 4.85 5.0 2 6.05 3.95 5.8 3 7.72 2.28 6.8 4 9.72 0.28 8.0 从 4 个 锥 形 瓶 中 各 取 缓 冲 液 3ml, 分 别 加 入 已 经 编 号 的 试 管 中, 随 后 于 每 个 试 管 中 添 加 0.5 % 淀 粉 的 0.3 % 氯 化 钠 溶 液 2ml 和 新 鲜 的 稀 释 唾 液 2ml, 向 各 试 管 中 加 入 稀 释 唾 液 的 时 间 间 隔 各 为 1 分 钟 将 各 试 管 中 的 物 质 混 匀, 并 依 次 置 于 37 恒 温 水 浴 保 温 待 向 第 4 支 试 管 加 入 唾 液 2 分 钟 后, 每 隔 1 分 钟 由 第 3 支 试 管 取 出 一 滴 混 合 液, 置 于 白 瓷 板 上, 加 1 滴 KI I 2 溶 液, 检 验 淀 粉 的 水 解 程 度 待 混 合 液 变 为 棕 黄 色 时, 向 所 有 试 管 依 次 添 加 1-2 滴 KI I 2 溶 液 添 加 KI I 2 溶 液 的 时 间 间 隔, 从 第 1 支 试 管 起, 亦 均 为 1 分 钟 观 察 各 试 管 中 物 质 呈 现 的 颜 色, 分 析 ph 对 唾 液 淀 粉 酶 活 性 的 影 响 2 酶 的 专 一 性 第 38 页, 共 71 页

(1) 唾 液 淀 粉 酶 的 专 一 性 取 试 管 6 支, 编 号 按 下 表 加 入 试 剂 : 试 管 号 1 2 3 4 5 6 1.0 % 淀 粉 溶 液 ( 滴 ) 4 4 4 2% 蔗 糖 溶 液 ( 滴 ) 4 4 4 稀 释 唾 液 (ml) 1 1 煮 沸 过 的 稀 释 唾 液 (ml) 1 1 蒸 馏 水 1 1 37 恒 温 水 浴 保 温 15 分 钟 Bemedict 试 剂 1 1 1 1 1 1 沸 水 浴 2-3 分 钟 现 象 解 释 实 验 结 果 ( 提 示 : 唾 液 除 含 有 淀 粉 酶 外, 还 含 有 少 量 的 麦 芽 糖 酶 ) (2) 蔗 糖 酶 的 专 一 性 试 管 号 1 2 3 4 5 6 1.0 % 淀 粉 溶 液 ( 滴 ) 4 4 4 2% 蔗 糖 溶 液 ( 滴 ) 4 4 4 蔗 糖 酶 溶 液 (ml) 1 1 煮 沸 过 的 蔗 糖 酶 溶 液 (ml) 1 1 蒸 馏 水 1 1 37 恒 温 水 浴 保 温 15 分 钟 Bemedict 试 剂 1 1 1 1 1 1 沸 水 浴 2-3 分 钟 现 象 解 释 实 验 结 果 六 思 考 题 第 39 页, 共 71 页

1 ph 对 酶 活 性 有 何 影 响? 什 么 是 酶 反 应 的 最 适 ph? 2 酶 反 应 的 ph 是 否 是 一 个 常 数? 它 与 哪 能 因 素 有 关? 这 种 性 质 对 于 选 择 测 定 酶 活 性 的 条 件 有 什 么 意 义? 3 什 么 是 酶 的 特 异 性? 本 实 验 结 果 为 什 么 能 说 明 酶 具 有 这 种 性 质? 4 通 过 几 个 酶 学 实 验, 你 对 下 面 问 题 如 何 认 识 : (1) 酶 作 为 生 物 催 化 剂 具 有 哪 些 特 性? (2) 进 行 酶 的 实 验 必 须 注 意 控 制 那 些 条 件? 为 什 么? 第 40 页, 共 71 页

实 验 十 维 生 素 C 的 定 量 测 定 一 目 的 和 要 求 : 1 学 习 定 量 测 定 维 生 素 C 的 方 法 和 原 理 2 进 一 步 熟 悉 和 掌 握 微 量 滴 定 法 的 基 本 操 作 技 术 3 了 解 蔬 菜 及 水 果 中 维 生 素 C 的 含 量 二 原 理 : 维 生 素 C 是 人 类 营 养 中 最 重 要 的 维 生 素 之 一, 人 体 不 能 合 成, 哺 乳 动 物 中 灵 长 类 和 豚 鼠 的 体 内 也 不 能 合 成 如 果 食 物 中 缺 乏 维 生 素 C, 就 会 出 现 坏 血 病, 故 称 为 抗 坏 血 酸 表 现 为 毛 细 管 脆 弱, 皮 肤 上 出 现 小 血 斑, 牙 龈 发 炎 出 血, 牙 齿 动 摇 等 它 是 具 有 L 糖 构 型 的 不 饱 和 多 羟 基 化 合 物, 属 水 溶 性 维 生 素 C 分 布 很 广, 植 物 的 绿 色 部 分 及 其 许 多 水 果 如 沙 棘 桔 类 西 红 柿 草 莓 山 楂 辣 椒 等 含 量 更 为 丰 富 维 生 素 C 有 很 强 的 还 原 性, 极 易 被 氧 化 而 破 坏 在 中 性 和 微 酸 性 环 境 中, 维 生 素 C 能 将 染 料 2,6 二 氢 酚 靛 酚 还 原 成 无 色 的 还 原 性 别,6 二 氢 酚 靛 酚 同 时 将 抗 坏 血 酸 氧 化 成 脱 氢 抗 坏 血 酸 氧 型 的 2,6 二 氯 酚 靛 酚 在 酸 性 溶 液 中 呈 玫 瑰 红 色, 在 中 性 或 碱 性 溶 液 中 呈 蓝 色, 当 其 被 还 原 时, 则 脱 色 Cl Cl OH - O N OH O N O - H + Cl Cl 玖 瑰 红 ( 酸 ) 蓝 色 ( 碱 ) 2,6 二 氯 酚 靛 酚 因 此, 当 用 2,6 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 滴 定 含 有 维 生 素 C 的 酸 性 溶 液 时, 在 维 生 素 C 尚 未 全 部 被 氧 化 时, 滴 下 的 2,6 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 立 即 被 还 原 成 无 色 但 溶 液 中 的 维 生 素 C 一 但 被 氧 化 时, 则 滴 下 的 2,6 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 立 即 使 溶 液 呈 现 玫 瑰 红 色 所 以, 当 溶 液 从 无 色 转 变 成 微 红 色 时, 即 表 示 溶 液 中 的 维 生 素 C 刚 刚 全 部 被 氧 化, 此 时 即 为 滴 定 终 点 从 滴 定 时 2,6 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 的 消 耗 量, 可 以 计 算 出 被 检 样 品 中 维 生 素 C 的 含 量 第 41 页, 共 71 页

HO C C O Cl HO C C + O N OH C HO C H Cl CH 2 OH 抗 坏 血 酸 ( 还 原 型 ) 2,6 二 氯 酚 靛 酚 玖 瑰 红 ( 氧 化 型 ) O C C O Cl O C O + HO NH OH C HO C H Cl CH 2 OH 抗 坏 血 酸 ( 氧 化 型 ) 2,6 二 氯 酚 靛 酚 无 色 ( 还 原 型 ) 该 法 简 便 易 行, 但 有 下 列 缺 点 : 1 在 生 物 组 织 内 和 组 织 提 取 物 内, 维 生 素 C 还 能 以 脱 氢 维 生 素 C 及 结 合 维 生 素 C 的 形 式 存 在 它 们 同 样 地 具 有 维 生 素 C 的 生 理 作 用, 但 不 能 将 2,6 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 还 原 色 2 生 物 组 织 提 取 物 和 生 物 体 液 中 常 含 有 其 它 还 原 性 物 质, 其 中 有 些 也 可 在 同 样 实 验 条 件 下 使 2, 6 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 还 原 脱 色 3 在 生 物 组 织 提 取 物 中, 常 有 色 素 类 物 质 存 在, 给 滴 定 终 点 的 观 察 造 成 困 难 三 器 材 1 研 钵 2 吸 量 管 3 容 呈 瓶 4 锥 形 瓶 (50ml) 5 微 量 滴 定 管 6 漏 斗 7 纱 布 8 滤 纸 四 试 剂 和 材 料 1 绿 豆 牙 30g / 人 2 酸 化 水 : 每 10ml 蒸 馏 水 加 1 滴 10%HCl 3 偏 磷 酸 醋 酸 溶 液 5 ml + 5ml / 人 第 42 页, 共 71 页

称 取 偏 磷 酸 15g, 溶 于 40ml 冰 醋 酸 和 450ml 蒸 馏 水 中, 过 滤 置 于 冰 箱 内, 此 液 保 存 不 得 超 过 10 天 4 标 准 抗 坏 血 酸 溶 液 5ml / 人 准 确 称 取 分 析 纯 抗 坏 血 酸 结 晶 50mg 溶 于 偏 磷 酸 醋 酸 溶 液, 定 容 到 250ml 装 入 棕 色 瓶, 贮 于 冰 箱 内 5 2,6 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 20ml / 人 将 0.21g 碳 酸 氢 钠,0.26g 2,6 二 氯 酚 靛 酚 溶 于 250ml 热 蒸 馏 水 中, 冷 却 后, 稀 释 至 1000ml 装 入 棕 色 瓶 内, 置 于 冰 箱 内 保 存 每 周 必 须 重 新 配 制, 使 用 前 需 按 照 下 法 标 定 : 取 5ml 标 准 抗 坏 血 酸 溶 液, 加 入 5ml 偏 磷 酸 醋 酸 溶 液, 以 2,6 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 呈 微 玫 瑰 红 色, 并 在 15 秒 钟 内 不 退 色 为 终 点 计 算 2,6 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 的 浓 度, 以 每 ml 2,6 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 相 当 于 抗 坏 血 酸 的 mg 来 表 示 五 操 作 方 法 1 样 品 的 制 备 称 取 50g 绿 豆 芽 (37 发 芽 3 7 天 ) 置 于 研 钵 中 研 磨, 放 置 约 10 分 钟, 用 2 层 纱 布 过 滤, 将 滤 液 滤 入 50ml 溶 量 瓶 中 反 复 抽 提 2 3 次, 将 滤 液 并 入 同 一 容 量 瓶 中 最 后 用 1% 盐 酸 溶 液 定 容, 混 匀 备 用 2 样 品 的 测 定 量 取 样 品 提 取 液 化 10ml 于 锥 形 瓶 中, 以 2,6 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 滴 定 呈 微 弱 的 玫 瑰 红 色, 持 续 5 秒 钟 不 退 色 为 终 点 记 录 消 耗 2,6 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 的 ml 数 滴 定 过 程 要 迅 速, 不 要 超 过 2 分 钟 因 为 在 本 滴 定 条 件 下, 一 些 非 维 生 素 C 还 原 物 质 的 还 原 作 用 比 较 迟 缓, 快 速 滴 定 可 以 避 免 或 减 少 它 们 的 影 响 另 取 10ml 1% 盐 酸 溶 液 作 空 白 对 照 滴 定 提 取 液 和 空 白 对 照 各 做 三 份, 滴 定 结 果 取 平 均 值 进 行 计 算 维 生 素 C mg/100g 样 品 =(V A -V B ) S 稀 释 倍 数 100/W 式 中 :V A 为 滴 定 样 品 提 取 液 所 消 耗 2,6 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 的 平 均 毫 升 数 ; V A 为 滴 定 空 白 对 照 所 消 耗 2,6 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 的 平 均 毫 升 数 ; S 为 1ml 2,6 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 相 当 于 维 生 素 C 的 毫 克 数 ; W 为 被 检 样 品 的 克 数 六 思 考 题 第 43 页, 共 71 页

1 指 出 几 种 维 生 素 C 含 量 丰 富 的 物 质 2 指 出 本 实 验 采 用 的 定 量 测 定 维 生 素 C 的 方 法 有 何 优 缺 点? 3 试 简 述 维 生 素 C 的 生 理 意 义 方 法 二 一 试 剂 1 0.01mol/L KIO 3 溶 液 50 ml/ 人 称 取 经 120 烘 箱 至 恒 重 的 碘 酸 钾 ( 大 约 2 小 时 )0.3566g 于 1000ml 水 中 2 1% KI 溶 液 3 ml/ 人 3 0.5% 淀 粉 溶 液 6 ml/ 人 4 2%HCl 溶 液 3 ml/ 人 二 操 作 方 法 1 样 品 的 处 理 : 同 上 2 样 品 测 定 吸 取 待 测 液 20ml 于 250 ml 的 锥 形 瓶 中, 加 入 2% HCl 溶 液 1ml,1% KI 溶 液 1ml, 淀 粉 指 示 剂 2ml, 用 0.01mol/L KIO 3 溶 液 滴 定 到 浅 蓝 色, 记 录 消 耗 碘 酸 钾 溶 液 的 ml 数 空 白 对 照 : 取 蒸 馏 水 20ml, 其 余 操 作 同 上 提 取 液 和 空 白 对 照 各 做 三 份, 滴 定 结 果 取 平 均 值 进 行 计 算 3 计 算 Vc mg/100g 样 品 =(V A -V B ) C KIO3 88 100/V 式 中 :V A 表 示 滴 定 样 品 消 耗 碘 酸 钾 溶 液 的 ml 数 V B 表 示 滴 定 空 白 对 照 消 耗 碘 酸 钾 溶 液 的 ml 数 V 所 取 样 品 的 ml 数 第 44 页, 共 71 页

实 验 十 三 脂 肪 碘 值 的 测 定 一 目 的 和 要 求 1 掌 握 测 定 碘 值 的 原 理 和 操 作 方 法 2 了 解 测 定 碘 值 的 意 义 二 原 理 碘 值 ( 价 ) 是 指 100g 脂 肪 在 一 定 条 件 下 吸 收 碘 的 克 数 碘 值 是 鉴 别 脂 肪 的 一 个 重 要 常 数, 可 用 以 判 断 脂 肪 所 含 脂 肪 酸 的 不 饱 和 程 度 碘 值 高 低 之 所 以 能 表 示 脂 肪 不 饱 和 度 的 大 小 是 因 为 : 脂 肪 中 常 含 有 不 饱 和 脂 肪 酸, 不 饱 和 脂 肪 酸 具 有 双 键, 能 与 卤 素 起 加 成 反 应 而 吸 收 卤 素 由 于 氟 和 氯 与 油 脂 作 用 剧 烈, 除 能 起 加 成 作 用 外 还 能 取 代 氢 原 子, 而 碘 在 一 定 条 件 下 和 要 是 与 双 键 起 加 成 作 用, 故 用 碘 与 脂 肪 中 不 饱 和 脂 肪 酸 的 双 键 起 加 成 作 用 脂 肪 和 不 饱 和 程 度 越 高, 所 含 的 不 饱 和 脂 肪 酸 越 多, 与 其 双 键 起 加 成 作 用 的 碘 量 就 越 多, 碘 值 就 越 高 故 可 用 碘 值 表 示 脂 肪 的 不 饱 和 度 由 于 碘 与 不 饱 和 脂 肪 酸 中 双 键 的 加 成 作 用 较 慢, 所 以 测 定 时 常 用 氯 化 碘 (ICl) 或 溴 化 碘 (IBr) 代 替 碘 其 中 的 氯 原 子 或 溴 原 子 能 使 碘 活 化 本 实 验 采 用 的 是 溴 化 碘 (Hanus 试 剂 ) 用 一 定 量 的 ( 必 须 过 量 ) 溴 化 碘 和 待 测 的 脂 肪 作 用 后, 用 硫 代 硫 酸 钠 滴 定 的 方 法 测 定 溴 化 碘 剩 余 量, 根 据 后 面 所 给 的 公 式 计 算 出 待 测 脂 肪 吸 收 的 碘 量, 求 得 脂 肪 的 碘 值 具 体 反 应 过 程 如 下 : 加 成 反 应 :IBr + CH=CH -CHI = CHBr 剩 余 溴 化 碘 中 碘 的 释 放 :Ibr + KI KBr + I 2 用 硫 代 硫 酸 钠 滴 定 释 放 出 来 的 碘 : I 2 + 2Na 2 S 2 O 3 2NaI + Na 2 S 4 O 6 样 品 最 适 量 碘 值 和 作 用 时 间 具 的 一 定 的 关 系, 参 考 下 表 : 样 品 的 最 适 量 和 碘 值 的 关 系 碘 值 样 品 克 数 作 用 时 间 ( 小 时 ) 碘 值 样 品 克 数 作 用 时 间 ( 小 时 ) 30 以 下 约 1.0 0.5 100-140 0.2-0.3 1.0 30-60 0.5-0.6 0.5 140-160 0.15-0.26 1.0 60-100 0.3-0.4 0.5 160-210 0.13-0.15 1.0 几 种 油 油 脂 的 碘 值 第 45 页, 共 71 页

名 称 碘 值 名 称 碘 值 亚 麻 子 油 175-210 花 生 油 85-100 鱼 肝 油 154-170 猪 油 48-64 棉 籽 油 104-116 牛 油 25-41 三 器 材 1 碘 瓶 (250ml) 2 量 筒 (10 50ml) 3 滴 定 管 (50ml) 4 吸 量 管 (5 10ml) 5 滴 管 6 分 析 天 平 四 试 剂 和 材 料 1 花 生 油 或 猪 油 1.0g / 人 2 Hanus 试 剂 50 ml/ 人 称 取 12.2g 碘 溶 于 1000ml 冰 醋 酸 (99.5%) 中, 溶 时 冰 醋 酸 要 慢 慢 加 入, 边 加 边 摇, 在 水 浴 中 加 热, 使 碘 溶 解, 冷 却, 加 溴 约 3ml 贮 于 棕 色 瓶 中 注 : 本 实 验 所 用 试 剂 均 需 高 纯 度 如 Hanus 试 剂 中 的 冰 醋 酸, 不 能 含 有 还 原 剂, 冰 醋 酸 与 硫 酸 及 重 铬 酸 钾 共 热 不 呈 绿 色 时 才 算 合 格 3 纯 四 氯 化 碳 20 ml/ 人 4 10%KI 溶 液 20 ml/ 人 5 0.05 mol/l Na 2 S 2 O 3 溶 液 约 100 ml/ 人 称 取 25g Na 2 S 2 O 3 5H 2 O 溶 于 新 煮 沸 后 冷 却 的 蒸 馏 水 ( 除 去 CO 2, 杀 死 细 菌 ) 中, 加 入 Na 2 CO 3 约 0.2g, 稀 释 至 1000ml 用 此 法 配 制 的 Na 2 S 2 O 3 溶 液 比 较 稳 定 贮 于 棕 色 瓶 中 置 暗 处, 一 天 后 进 行 标 定 6 1% 淀 粉 溶 液 2 ml/ 人 五 操 作 方 法 用 玻 璃 小 管 ( 约 0.5 2.5ml) 准 确 称 量 0.3-0.4g 花 生 油 ( 或 者 约 0.1g 蓖 麻 油, 约 0.5g 猪 油 )2 份 将 样 品 和 小 管 一 起 放 入 两 个 干 燥 的 碘 值 测 定 瓶 内 ( 实 验 中 使 用 的 仪 器, 包 括 碘 值 测 定 瓶 量 筒 滴 管 和 称 样 瓶 用 的 玻 璃 小 管, 都 必 须 是 斗 净 干 燥 的 ) 切 勿 使 油 粘 在 瓶 颈 或 壁 上 各 加 四 氯 化 碳 10ml, 轻 轻 摇 动, 使 油 全 部 溶 解 用 滴 定 管 仔 细 地 向 每 个 碘 瓶 内 准 确 加 入 汉 诺 斯 (Hanus) 溶 液 25ml, 勿 使 溶 液 接 触 瓶 颈 塞 好 玻 璃 塞, 在 玻 璃 塞 与 瓶 口 之 间 加 数 滴 10%KI 溶 液 封 闭 缝 隙, 以 防 止 碘 升 华 溢 第 46 页, 共 71 页

出 造 成 测 定 误 差 然 后 在 20-30 暗 处 放 置 30 分 钟 根 据 经 验, 测 定 碘 值 在 110 以 下 的 油 脂 时 放 置 30 分 钟, 碘 值 高 于 此 值 则 需 放 置 1 小 时 ; 放 置 温 度 应 保 持 20 以 上, 若 温 度 过 低, 放 置 时 间 应 增 至 2 小 时 放 置 期 间 应 不 时 摇 动 卤 素 的 加 成 反 应 是 可 逆 反 应, 只 有 在 卤 素 绝 对 过 量 时, 该 反 应 才 能 进 行 完 全, 所 以, 油 吸 收 的 碘 量 不 应 超 过 Hanus 溶 液 所 含 碘 量 的 一 半 若 瓶 内 混 合 液 和 颜 色 很 浅, 表 示 油 用 量 过 多 应 再 称 取 较 少 量 的 油, 重 作 放 置 30 分 钟 后, 立 刻 小 心 打 开 玻 璃 塞, 使 塞 旁 KI 溶 液 流 入 瓶 内, 切 勿 丢 失 用 新 配 制 的 10 KI 溶 液 10ml 和 蒸 馏 水 50ml 把 玻 璃 塞 上 和 瓶 颈 上 的 液 体 冲 入 瓶 内, 混 匀 用 0.05 mol/l Na 2 S 2 O 3 溶 液 迅 速 滴 定 至 瓶 内 溶 液 呈 浅 黄 色 加 入 1 ml 1% 淀 粉 溶 液, 继 续 滴 定 将 近 终 点 时, 用 力 振 荡, 使 碘 由 四 氯 化 碳 层 全 部 进 入 水 溶 液 中 再 滴 至 蓝 色 消 失 为 止, 即 达 到 滴 定 终 点 用 力 振 荡 是 本 滴 定 成 败 关 键 之 一, 否 则 容 易 滴 过 头 或 不 足 如 果 振 荡 不 够, 四 氯 化 碳 层 呈 现 紫 色 或 红 色, 此 时 需 继 续 用 力 振 荡 使 碘 全 部 进 入 水 层 滴 定 完 毕 放 置 一 定 时 间 后, 滴 定 液 应 返 回 蓝 色, 否 则 就 表 示 滴 过 量 ( 为 什 么?) 另 作 两 份 空 白 对 照, 除 去 不 加 油 样 品 外, 其 余 操 作 同 上 滴 定 的, 将 废 液 倒 入 废 液 瓶, 以 便 回 收 四 氯 化 碳 碘 值 表 示 100g 脂 肪 所 能 吸 收 的 碘 的 克 数, 因 此 样 品 的 碘 值 计 算 如 下 : 碘 值 = (A-B)T 100/ 样 品 的 重 量 (g) 式 中 :A 为 滴 定 空 白 用 去 的 Na 2 S 2 O 3 溶 液 平 均 ml 数 B 为 滴 定 样 品 用 去 的 Na 2 S 2 O 3 溶 液 平 均 ml 数 T 为 与 1ml0.05 mol/l Na 2 S 2 O 3 溶 液 相 当 的 碘 的 克 数 在 本 实 验 中 :T = 0.05 126.9/1000 测 定 脂 肪 酸 和 其 他 脂 类 物 质 的 碘 值 时, 操 作 方 法 完 全 相 同 六 思 考 题 1 固 体 脂 肪 与 液 体 脂 肪 的 碘 值 有 何 不 同? 反 映 了 什 么 问 题? 2 一 分 子 甘 油 三 硬 脂 酸 酯 甘 油 三 油 酸 酯 及 甘 油 三 亚 油 酸 酯 各 吸 收 几 个 碘 原 子? 1 上 述 三 种 甘 油 的 碘 值 是 多 少?( 碘 的 原 子 量 为 126.9, 三 种 甘 油 酸 的 分 子 量 分 别 为 891,885, 879)? 第 47 页, 共 71 页