第 四 章 氨 基 酸 与 蛋 白 质 1 掌 握 蛋 白 质 的 基 本 构 成 单 体 : 氨 基 酸 的 结 构 特 点, 从 各 氨 基 酸 的 结 构 特 点 上 理 解 氨 基 酸 的 分 类 2 掌 握 氨 基 酸 的 理 化 性 质, 重 点 掌 握 两 性 电 离 与 等 电 点 含 义 茚 三 酮 反 应 及 其 应 用 3 掌 握 氨 基 酸 纸 层 析 的 原 理 第 一 节 蛋 白 质 的 分 子 组 成 氨 基 酸 一 蛋 白 质 的 元 素 组 成 蛋 白 质 是 有 机 化 合 物, 离 不 开 C H O 三 种 元 素, 还 含 有 N P S 金 属 元 素 等 含 量 % 50 55 6 7 20 23 15 17 0.3 3 微 量 或 无 元 素 组 成 C H O N S 其 它 蛋 白 质 中 N 是 特 征 元 素, 且 含 量 恒 定, 为 16% 左 右, 即 16 克 氮 /100 克 蛋 白 质, 故 可 以 用 定 氮 法 测 量 蛋 白 质 含 量, 即 : 每 100 克 蛋 白 质 含 氮 16 克,100/16=6.25 克 蛋 白 质 含 氮 1 克 所 以, 每 克 样 品 含 氮 量 6.25 100=100 克 样 品 蛋 白 质 含 量 ( 克 %) 有 些 蛋 白 质 含 有 其 他 微 量 元 素 :P Fe Cu Mn Zn Co Mo I 等 二 蛋 白 质 分 子 的 基 本 组 成 单 位 氨 基 酸 ( 一 ) 氨 基 酸 的 结 构 通 式 : 如 下 图 所 示 : 从 氨 基 酸 的 结 构 通 式 可 以 看 出 : 1 构 成 蛋 白 质 的 氨 基 酸 均 为 L α 氨 基 酸 2 除 R 为 H( 甘 氨 酸 ) 外, 其 余 氨 基 酸 均 具 有 旋 光 性 3 各 种 氨 基 酸 的 区 别 在 于 侧 基 R 基 上 ( 二 ) 氨 基 酸 的 构 型 : 构 成 蛋 白 质 的 氨 基 酸 除 甘 氨 酸 外, 均 含 有 α 碳 原 子, 在 空 间 各 原 子 有 两 种 排 列 方 式 : L 构 型 与 D 构 型, 它 们 的 关 系 就 像 左 右 手 的 关 系, 互 为 镜 像 关 系, 下 图 以 丙 氨 酸 为 例 : ( 三 ) 氨 基 酸 的 结 构 与 分 类 1 按 氨 基 酸 分 子 中 羧 基 与 氨 基 的 数 目 分 : (1) 酸 性 氨 基 酸 : 一 氨 基 二 羧 基 氨 基 酸, 有 天 冬 氨 酸 谷 氨 酸 (2) 碱 性 氨 基 酸 : 二 氨 基 一 羧 基 氨 基 酸, 有 赖 氨 酸 精 氨 酸 组 氨 酸 (3) 中 性 氨 基 酸 : 一 氨 基 一 羧 基 氨 基 酸, 有 甘 氨 酸 丙 氨 酸 缬 氨 酸 亮 氨 酸 异 亮 氨 酸 甲 硫 氨 酸 半 胱 氨 酸 苯 丙 氨 酸 色 氨 酸 酪 氨 酸 脯 氨 酸 天 冬 酰 胺 谷 氨 酰 胺 丝 氨 酸 苏 氨 酸 2 按 侧 基 R 基 的 结 构 特 点 分 :
(1) 脂 肪 族 氨 基 酸 (2) 芳 香 族 氨 基 酸 : 苯 丙 氨 酸 色 氨 酸 酪 氨 酸 (3) 杂 环 氨 基 酸 : 脯 氨 酸 组 氨 酸 3 按 侧 基 R 基 与 水 的 关 系 分 : (1) 非 极 性 氨 基 酸 : 有 甘 氨 酸 丙 氨 酸 缬 氨 酸 亮 氨 酸 异 亮 氨 酸 甲 硫 氨 酸 半 胱 氨 酸 苯 丙 氨 酸 色 氨 酸 酪 氨 酸 脯 氨 酸 (2) 极 性 不 带 电 氨 基 酸 : 天 冬 酰 胺 谷 氨 酰 胺 丝 氨 酸 苏 氨 酸 (3) 极 性 带 电 氨 基 酸 : 天 冬 氨 酸 谷 氨 酸 赖 氨 酸 精 氨 酸 组 氨 酸 4 按 氨 基 酸 是 否 能 在 人 体 内 合 成 分 : (1) 必 需 氨 基 酸 : 指 人 体 内 不 能 合 成 的 氨 基 酸, 必 须 从 食 物 中 摄 取, 有 八 种 : 赖 氨 酸 色 氨 酸 甲 硫 氨 酸 笨 丙 氨 酸 缬 氨 酸 亮 氨 酸 异 亮 氨 酸 苏 氨 酸 (2) 非 必 需 氨 基 酸 : 指 人 体 内 可 以 合 成 的 氨 基 酸 有 十 种 (3) 半 必 需 氨 基 酸 : 指 人 体 内 可 以 合 成 但 合 成 量 不 能 满 足 人 体 需 要 ( 特 别 是 婴 幼 儿 时 期 ) 的 氨 基 酸, 有 两 种 : 组 氨 酸 精 氨 酸 注 : 写 出 二 十 种 氨 基 酸 的 结 构 总 结 结 构 特 点 支 链 氨 基 酸 有 : 缬 氨 酸 亮 氨 酸, 异 亮 氨 酸 含 羟 基 的 氨 基 酸 有 : 丝 氨 酸 苏 氨 酸 含 硫 的 氨 基 酸 有 : 半 胱 氨 酸 ( 含 巯 基 ) 甲 硫 氨 酸 ( 含 硫 甲 基 ) 含 苯 环 的 氨 基 酸 有 : 苯 丙 氨 酸 色 氨 酸 酪 氨 酸 含 胍 基 的 氨 基 酸 有 : 精 氨 酸 含 咪 唑 基 的 氨 基 酸 有 : 组 氨 酸 亚 氨 基 酸 有 : 脯 氨 酸 含 酰 胺 的 氨 基 酸 有 : 天 冬 酰 胺 谷 氨 酰 胺 含 吲 哚 基 的 氨 基 酸 有 : 色 氨 酸 含 ε 氨 基 的 氨 基 酸 有 : 赖 氨 酸 ( 四 ) 蛋 白 质 中 不 常 见 的 氨 基 酸 羟 脯 氨 酸 羟 赖 氨 酸 r 羧 基 谷 氨 酸 6 氮 甲 基 赖 氨 酸 ( 五 ) 非 蛋 白 氨 基 酸 鸟 氨 酸 胍 氨 酸 高 半 胱 氨 酸 高 丝 氨 酸 β 丙 氨 酸 γ 氨 基 丁 酸 等 三. 氨 基 酸 的 理 化 性 质 ( 一 ) 物 理 性 质 1. 形 态 : 均 为 白 色 结 晶 或 粉 末, 不 同 氨 基 酸 的 晶 型 结 构 不 同 2. 溶 解 性 : 一 般 都 溶 于 水, 不 溶 或 微 溶 于 醇, 不 溶 于 丙 酮, 在 稀 酸 和 稀 碱 中 溶 解 性 好
3. 熔 点 : 氨 基 酸 的 熔 点 一 般 都 比 较 高, 一 般 都 大 于 200, 超 过 熔 点 以 上 氨 基 酸 分 解 产 生 胺 和 二 氧 化 碳 4. 光 吸 收 : 氨 基 酸 在 可 见 光 范 围 内 无 光 吸 收, 在 近 紫 外 区 含 苯 环 氨 基 酸 有 光 的 吸 收 5. 旋 光 性 : 除 甘 氨 酸 外 的 氨 基 酸 均 有 旋 光 性 ( 二 ) 化 学 性 质 : 1. 氨 基 酸 的 两 性 电 离 及 等 电 点 : 氨 基 酸 既 含 有 氨 基, 可 接 受 H+, 又 含 有 羧 基, 可 电 离 出 H+, 所 以 氨 基 酸 具 有 酸 碱 两 性 性 质 通 常 情 况 下, 氨 基 酸 以 两 性 离 子 的 形 式 存 在 氨 基 酸 在 酸 性 环 境 中, 主 要 以 阳 离 子 的 形 式 存 在, 在 碱 性 环 境 中, 主 要 以 阴 离 子 的 形 式 存 在 在 某 一 ph 环 境 下, 以 两 性 离 子 ( 兼 性 离 子 ) 的 形 式 存 在 该 ph 称 为 该 氨 基 酸 的 等 电 点 所 以 氨 基 酸 的 等 电 点 可 以 定 义 为 : 氨 基 酸 所 带 正 负 电 荷 相 等 时 的 溶 液 ph 氨 基 酸 的 水 溶 液 既 可 被 酸 滴 定, 又 可 被 碱 滴 定, 应 该 具 有 两 性 电 离 的 性 质, 现 以 甘 氨 酸 为 例 来 说 明 氨 基 酸 两 性 电 离 的 特 点 下 图 是 甘 氨 酸 的 电 离 酸 碱 滴 定 曲 线, 从 左 向 右 是 用 NaOH 滴 定 的 曲 线, 溶 液 的 ph 由 小 到 大 逐 渐 升 高 ; 从 右 向 左 是 用 HCL 滴 定 的 曲 线, 溶 液 的 ph 由 大 到 小 逐 渐 降 低 曲 线 中 从 左 向 右 第 一 个 拐 点 是 氨 基 酸 羧 基 解 离 50% 的 状 态, 第 二 个 拐 点 是 氨 基 酸 的 等 电 点, 第 三 个 拐 点 是 氨 基 酸 氨 基 解 离 50% 的 状 态 通 过 氨 基 酸 的 滴 定 曲 线, 可 用 下 列 Henderson Hasselbalch 方 程 求 出 各 解 离 基 团 的 解 离 常 数 (pk,): 根 据 pk, 可 求 出 氨 基 酸 的 等 电 点, 可 由 其 等 电 点 左 右 两 个 pk, 值 的 算 术 平 均 值 求 出 中 性 及 酸 性 氨 基 酸 : pi=(pk1,+pk2,)/2 中 性 氨 基 酸 :pk1, 为 α 羧 基 的 解 离 常 数,pK2, 为 α 氨 基 的 解 离 常 数 酸 性 氨 基 酸 : pk1, 为 α 羧 基 的 解 离 常 数,pK2, 为 侧 链 羧 基 的 解 离 常 数 碱 性 氨 基 酸 : pi=(pk2,+pk3,)/2 其 中 :pk2, 为 α 氨 基 的 解 离 常 数,pK3, 为 侧 链 氨 基 的 解 离 常 数 二 十 种 氨 基 酸 的 pk, 及 等 电 点 : 2. 由 α 氨 基 参 加 的 反 应 : (1) 硝 酸 反 应 : 放 出 氮 气, 氮 气 的 一 半 来 自 氨 基 氮, 一 半 来 自 亚 硝 酸, 在 通 常 情 况 下 测 定 生 成 的 氮 气 的 体 积 量 可 计 算 氨 基 酸 的 量, 此 反 应 可 用 于 测 定 蛋 白 质 的 水 解 程 度
(2) 与 甲 醛 的 反 应 : 用 过 量 的 中 性 甲 醛 与 氨 基 酸 反 应, 可 游 离 出 氢 离 子, 然 后 用 NaOH 滴 定, 从 消 耗 的 碱 量 可 以 计 算 出 氨 基 酸 的 含 量 此 法 称 为 间 接 滴 定 法 (3) 与 2,4 二 硝 基 氟 苯 (2,4 DNFB) 的 反 应 (Sanger 反 应 ): 生 成 黄 色 的 二 硝 基 苯 氨 基 酸 衍 生 物 (4) 与 苯 异 硫 氰 酸 酯 (PITC) 反 应 (Edman 反 应 ): 生 成 苯 乙 内 酰 硫 脲 氨 基 酸 (5) 与 丹 磺 酰 氯 (DNS Cl) 的 反 应 : 生 成 荧 光 物 质 DNS 氨 基 酸 (6) 反 应 用 于 蛋 白 质 的 N 末 端 的 测 定 3.α 羧 基 参 加 的 反 应 : (1) 与 碱 反 应 成 盐 : (2) 与 醇 反 应 成 酯 : 4.α 氨 基 与 α 羧 基 共 同 参 加 的 反 应 与 茚 三 酮 的 反 应 : 除 脯 氨 酸 与 羟 脯 氨 酸 外, 可 与 其 它 氨 基 酸 生 成 蓝 紫 色 化 合 物 脯 氨 酸 与 羟 脯 氨 酸 为 黄 色 化 合 物 5. 侧 链 反 应 ( 颜 色 反 应 ): (1) Millon 反 应 : 检 测 Tyr 或 含 Tyr 的 蛋 白 质 的 反 应 Millon 试 剂 : 汞 的 硝 酸 盐 与 亚 硝 酸 盐 溶 液 产 物 : 红 色 的 化 合 物 (2) Folin 反 应 : 检 测 Tyr 或 含 Tyr 的 蛋 白 质 的 反 应 Folin 试 剂 : 磷 钼 酸 磷 钨 酸 混 合 溶 液 产 物 : 蓝 色 的 钼 蓝 钨 蓝 (3) 坂 口 反 应 : 检 测 Arg 或 含 Arg 的 蛋 白 质 的 反 应 坂 口 试 剂 :α 萘 酚 的 碱 性 次 溴 酸 钠 溶 液 产 物 : 砖 红 色 的 沉 淀 (4) Pauly 反 应 : 检 测 His Tyr 及 含 His Tyr 蛋 白 质 的 反 应 试 剂 : 对 氨 基 苯 磺 酸 盐 酸 溶 液 亚 硝 酸 钠 碳 酸 钠 混 合 溶 液 产 物 : 橘 红 色 的 化 合 物 (5) 乙 醛 酸 的 反 应 : 检 测 Trp 或 含 Trp 蛋 白 质 的 反 应 当 Trp 与 乙 醛 酸 和 浓 硫 酸 在 试 管 中 叠 加 时, 产 生 分 层 现 象, 界 面 出 现 紫 色 环 (6)Cys 的 反 应 :Cys 或 含 Cys 蛋 白 质 与 亚 硝 基 亚 铁 氰 酸 钠 在 稀 氨 的 溶 液 中, 产 生 一 种 红 色 的 化 合 物 四. 氨 基 酸 的 分 离 测 定 ( 一 ). 层 析 法 层 析 法 是 利 用 被 分 离 样 品 混 合 物 中 各 组 分 的 化 学 性 质 的 差 异, 使 各 组 分 以 不 同 程 度 分 布 在 两 个 相 中, 这 两 个 相 一 个 为 固 定 相, 另 一 个 为 流 动 相 当 流 动 相 流 进 固 定 相 时, 由 于 各 组
分 在 两 相 中 的 分 配 情 况 不 同 或 电 荷 分 布 不 同 或 离 子 亲 和 力 不 同 等, 而 以 不 同 的 速 度 前 进, 从 而 达 到 分 离 的 目 的 (Rf) 常 见 的 层 析 法 有 : 1. 滤 纸 层 析 : 2. 薄 层 层 析 3. 离 子 交 换 层 析 4. 亲 和 层 析 ( 二 ). 电 泳 法 电 泳 是 指 带 电 的 颗 粒 在 电 场 中 向 着 以 其 颗 粒 所 带 电 荷 相 反 的 电 极 移 动 的 现 象 第 二 节 蛋 白 质 化 学 目 的 与 要 求 1 了 解 蛋 白 质 对 生 物 体 的 重 要 意 义 2 了 解 蛋 白 质 的 分 类, 掌 握 蛋 白 质 元 素 组 成 的 特 点 5 掌 握 蛋 白 质 一 级 结 构 的 概 念 ; 了 解 蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定 方 法 与 思 路, 学 会 分 析 简 单 多 肽 的 氨 基 酸 顺 序 6 理 解 并 掌 握 蛋 白 质 二 级 结 构 的 概 念 ; 二 级 结 构 的 基 本 类 型 :α 螺 旋 及 β 折 叠 的 结 构 特 点 ; 了 解 几 种 常 见 纤 维 状 蛋 白 质 的 结 构 特 性 ; 了 解 超 二 级 结 构 及 结 构 域 的 概 念 7 了 解 蛋 白 质 三 级 结 构 四 级 结 构 的 概 念 及 稳 定 因 素 8 充 分 理 解 蛋 白 质 结 构 与 功 能 的 关 系 ; 从 核 糖 核 酸 酶 的 变 性 与 复 性 实 验 理 解 一 级 结 构 与 空 间 结 构 的 关 系 ; 以 细 胞 色 素 C 等 为 例 充 分 理 解 一 级 结 构 与 蛋 白 质 生 物 学 功 能 的 关 系 ; 从 血 红 蛋 白 与 肌 红 蛋 白 的 结 构 特 性 理 解 蛋 白 质 空 间 结 构 与 生 物 学 功 能 的 关 系 9 掌 握 蛋 白 质 的 理 化 性 质 : 胶 体 性 质 两 性 电 离 与 等 电 点 沉 淀 作 用 变 性 作 用 以 及 这 些 性 质 的 生 理 意 义 及 实 践 意 义 10. 了 解 蛋 白 质 分 离 提 纯 的 常 用 方 法 及 基 本 原 理 一 蛋 白 质 通 论 一 蛋 白 质 的 生 物 学 意 义 ( 一 ) 蛋 白 质 是 生 命 活 动 的 物 质 基 础 生 物 体 内 的 蛋 白 质 是 除 水 以 外, 机 体 组 织 中 最 多 的 组 分, 占 人 体 干 重 的 45% 占 细 菌 干 重 的 50 70% ( 二 ) 蛋 白 质 的 生 物 学 功 能 1 作 为 生 物 催 化 剂 : 在 体 内 催 化 各 种 物 质 代 谢 反 应 的 酶 几 乎 都 是 蛋 白 质 2 调 节 代 谢 反 应 : 一 些 激 素 是 蛋 白 质 或 肽, 如 胰 岛 素 生 长 素 3 运 输 载 体 : 如 红 细 胞 中 运 输 O 2 CO 2 要 靠 Hb(Hemoglobin 血 红 蛋 白 ) 运 输 脂 类 物 质 的 是 载 脂 蛋 白 运 铁 蛋 白 等 转 运 蛋 白 或 叫 载 体 蛋 白
4 参 与 机 体 的 运 动 : 如 心 跳 胃 肠 蠕 动 等, 依 靠 与 肌 肉 收 缩 有 关 的 蛋 白 质 来 实 现, 如 肌 球 蛋 白 肌 动 蛋 白 5 参 与 机 体 的 防 御 : 机 体 抵 抗 外 来 侵 害 的 防 御 机 能, 靠 抗 体, 抗 体 也 称 免 疫 球 蛋 白, 是 蛋 白 质 6 接 受 传 递 信 息 : 如 口 腔 中 的 味 觉 蛋 白 视 网 膜 中 的 视 觉 蛋 白 7 调 节 或 控 制 细 胞 的 生 长 分 化 遗 传 信 息 的 表 达 8 其 它 : 如 鸡 蛋 清 蛋 白 牛 奶 中 的 酪 蛋 白 是 营 养 和 储 存 蛋 白 ; 胶 原 蛋 白 纤 维 蛋 白 等 属 于 结 构 蛋 白 还 有 甜 味 蛋 白 毒 素 蛋 白 等 都 具 有 特 异 的 生 物 学 功 能 所 以, 我 们 不 难 理 解, 为 什 么 说 没 有 蛋 白 质 就 没 有 生 命 二 蛋 白 质 的 分 类 1 根 据 分 子 形 状 分 : 球 状 蛋 白 质 纤 维 状 蛋 白 质 2 根 据 功 能 分 : 活 性 蛋 白 质 结 构 蛋 白 质 3 根 据 组 成 分 : (1) 简 单 蛋 白 质 : 清 蛋 白 球 蛋 白 谷 蛋 白 醇 溶 谷 蛋 白 组 蛋 白 精 蛋 白 硬 蛋 白 (2) 结 合 蛋 白 质 : 色 素 蛋 白 金 属 蛋 白 磷 蛋 白 核 蛋 白 脂 蛋 白 糖 蛋 白 三 蛋 白 质 的 水 解 : 蛋 白 质 蛋 白 胨 多 肽 二 肽 氨 基 酸 Mr: 10 4 2x10 3 1000 500 200 100 1 酸 水 解 条 件 :5 10 倍 的 20% 的 盐 酸 煮 沸 回 流 16 24 小 时, 或 加 压 于 120 水 解 2 小 时 优 点 : 可 蒸 发 除 去 盐 酸, 水 解 彻 底, 终 产 物 为 L α 氨 基 酸, 产 物 单 一, 无 消 旋 现 象 缺 点 : 色 氨 酸 破 坏, 并 产 生 一 种 黑 色 的 物 质 : 腐 黑 质, 水 解 夜 呈 黑 色 2 碱 水 解 条 件 :4mol/L B a (OH) 2 或 6mol/L N a OH 煮 沸 6 小 时 优 点 : 水 解 彻 底, 色 氨 酸 不 被 破 坏, 水 解 夜 清 亮 缺 点 : 产 生 消 旋 产 物, 破 坏 的 氨 基 酸 多, 一 般 很 少 使 用 3 白 酶 水 解 条 件 : 蛋 白 酶 如 胰 蛋 白 酶 糜 蛋 白 酶, 常 温 37 40,pH 值 5 8 优 点 : 氨 基 酸 不 被 破 坏, 不 发 生 消 旋 现 象 缺 点 : 水 解 不 完 全, 中 间 产 物 多 蛋 白 质 酸 碱 水 解 常 用 于 蛋 白 质 的 组 成 分 析, 而 酶 水 解 用 于 制 备 蛋 白 质 水 解 产 物 二 蛋 白 质 的 结 构
蛋 白 质 的 结 构 具 有 多 种 结 构 层 次, 包 括 一 级 结 构 和 空 间 结 构, 空 间 结 构 又 称 为 构 象 空 间 结 构 包 括 二 级 结 构 三 级 结 构 和 四 级 结 构 在 二 级 与 三 级 之 间 还 存 在 超 二 级 结 构 和 结 构 域 这 两 个 结 构 层 次 一. 蛋 白 质 的 一 级 结 构 蛋 白 质 的 一 级 结 构 (Primary structure) 又 称 为 共 价 结 构 化 学 结 构 它 是 指 蛋 白 质 中 的 氨 基 酸 按 照 特 定 的 排 列 顺 序 通 过 肽 键 连 接 起 来 的 多 肽 链 结 构 ( 一 ) 肽 键 肽 链 与 肽 平 面 肽 氨 基 酸 借 肽 键 连 接 起 来 叫 肽, 肽 是 一 大 类 物 质, 即 : 1. 两 个 氨 基 酸 组 成 的 肽 叫 二 肽 ; 2.. 氨 基 酸 借 肽 键 连 成 长 链, 称 为 肽 链, 肽 链 两 端 有 自 由 NH 2 和 COOH, 自 由 NH 2 端 称 为 N 末 端 ( 氨 基 末 端 ), 自 由 COOH 端 称 为 C 末 端 ( 羧 基 末 端 ); 3.. 构 成 肽 链 的 氨 基 酸 已 残 缺 不 全, 称 为 氨 基 酸 残 基 ; 4. 肽 链 中 的 氨 基 酸 的 排 列 顺 序, 一 般 NH 2 端 开 始, 由 N 指 向 C, 即 多 肽 链 有 方 向 性,N 端 为 头,C 端 为 尾 肽 键 : 一 个 氨 基 酸 的 a COOH 和 相 邻 的 另 一 个 氨 基 酸 的 a NH 2 脱 水 形 成 共 价 键 如 图 所 示 肽 平 面 : 是 指 肽 链 中 从 一 个 Cα 原 子 到 另 一 个 Cα 原 子 之 间 的 结 构, 共 包 含 6 个 原 子 (Cα C O N H Cα), 它 们 在 空 间 共 处 于 同 一 个 平 面 肽 键 和 肽 的 结 构 如 图 所 示 :(P163) ( 二 ) 肽 的 理 化 性 质 1. 多 肽 等 电 点 注 意 : 多 肽 等 电 点 的 计 算 (P167) 注 意 常 见 基 团 的 pka 值 2. 双 缩 脲 反 应 是 肽 和 蛋 白 质 所 特 有 三 肽 及 更 长 的 肽 有 此 反 应 ( 三 ) 天 然 活 性 肽 自 然 界 中 有 自 由 存 在 的 活 性 肽, 主 要 有 : 1. 谷 胱 甘 肽 (GSH): 三 肽 (Glu Cys Gly), 广 泛 存 在 于 生 物 细 胞 中, 含 有 自 由 的 巯 基, 具 有 很 强 的 还 原 性, 可 作 为 体 内 重 要 的 还 原 剂, 保 护 某 些 蛋 白 质 或 酶 分 子 中 的 巯 基 免 遭 氧 化, 使 其 处 于 活 性 状 态 2. 促 甲 状 腺 素 释 放 激 素 : 三 肽 ( 焦 谷 氨 酰 组 氨 酰 脯 氨 酸 ), 可 促 进 甲 状 腺 素 的 释 放
3. 短 杆 菌 素 S: 环 十 肽, 含 有 D 苯 丙 氨 酸 鸟 氨 酸, 对 革 兰 氏 阴 性 细 菌 有 破 坏 作 用, 主 要 作 用 于 细 胞 膜 4. 青 霉 素 : 含 有 D 半 胱 氨 酸 和 D 缬 氨 酸 的 二 肽 衍 生 物 主 要 破 坏 细 菌 的 细 胞 壁 粘 肽 的 合 成 引 起 溶 菌 5. 牛 催 产 素 与 加 压 素 : 均 为 九 肽, 分 子 中 含 有 一 对 二 硫 键, 两 者 结 构 类 似 前 者 第 九 位 为 Gly 或 Lys 或 Phe, 后 者 为 Arg 前 者 可 刺 激 子 宫 的 收 缩, 促 进 分 娩 后 者 可 促 进 小 动 脉 收 缩, 使 血 压 升 高, 也 有 抗 利 尿 作 用, 参 与 水 盐 代 谢 的 调 节 牛 催 产 素 S S Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly NH 2 牛 加 压 素 S S Cys Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Ary Gly NH 2 6. 脑 啡 肽 : 为 五 肽, 具 有 镇 痛 作 用 ( 三 ) 蛋 白 质 的 一 级 结 构 研 究 一 级 结 构 的 研 究 包 括 : 蛋 白 质 的 氨 基 酸 组 成 测 定, 肽 链 数 目 的 确 定, 末 端 氨 基 酸 种 类 测 定, 氨 基 酸 的 排 列 顺 序 测 定, 二 硫 键 位 置 的 测 定, 酰 胺 位 置 的 确 定 大 致 步 骤 如 下 : 1. 获 取 一 定 量 纯 的 蛋 白 质 样 品, 测 其 分 子 量, 然 后 将 样 品 完 全 水 解, 确 定 该 蛋 白 质 的 氨 基 酸 种 类 数 目 及 每 种 氨 基 酸 的 含 量 2. 进 行 末 端 测 定, 确 定 该 蛋 白 质 的 肽 链 数 目,N 端 和 C 端 是 什 么 氨 基 酸 N 末 端 测 定 法 : 常 采 用 2,4 二 硝 基 氟 苯 法 Edman 降 解 法 丹 磺 酰 氯 法 C 末 端 测 定 法 : 常 采 用 肼 解 法 羧 肽 酶 法 3. 肽 链 的 拆 分 经 末 端 的 分 析, 若 该 蛋 白 质 含 有 两 条 以 上 的 肽 链, 而 且 肽 链 之 间 是 通 过 非 共 价 键 连 接, 使 用 蛋 白 质 变 性 剂 将 其 变 性 后 分 开 ; 若 蛋 白 质 肽 链 之 间 通 过 共 价 键 相 连, 则 可 采 取 过 甲 酸 氧 化 法 或 巯 基 乙 醇 还 原 法 将 其 分 开 4. 各 肽 链 中 氨 基 酸 排 列 顺 序 的 测 定 使 用 两 种 以 上 的 方 法 将 肽 链 部 分 水 解 成 肽 段, 测 各 肽 段 的 氨 基 酸 顺 序, 然 后 使 用 片 段 重 叠 法 推 测 出 完 整 肽 链 的 氨 基 酸 顺 序 5. 确 定 二 硫 键 和 酰 胺 的 位 置 ( 四 ) 胰 岛 素 的 一 级 结 构 二. 蛋 白 质 的 二 级 结 构 ( 一 ) 构 型 与 构 象
构 型 : 指 一 个 不 对 称 的 化 合 物 中 不 对 称 中 心 上 的 几 个 原 子 或 基 团 的 空 间 排 布 方 式 如 单 糖 的 α β 构 型, 氨 基 酸 的 D L 构 型 当 从 一 种 构 型 转 换 成 另 一 种 构 型 的 时 候, 会 牵 涉 及 共 价 键 的 形 成 或 破 坏 构 象 : 指 一 个 分 子 结 构 中 的 一 切 原 子 绕 共 价 单 键 旋 转 时 产 生 的 不 同 空 间 排 列 方 式 一 种 构 象 变 成 另 一 种 构 象 不 涉 及 共 价 键 的 形 成 或 破 坏 ( 二 ) 蛋 白 质 的 二 级 结 构 二 级 结 构 的 概 念 : 多 肽 链 在 一 级 结 构 的 基 础 上, 按 照 一 定 的 方 式 有 规 律 的 旋 转 或 折 叠 形 成 的 空 间 构 象 其 实 质 是 多 肽 链 在 空 间 的 排 列 方 式 1. 蛋 白 质 分 子 构 象 的 立 体 化 学 原 则 Linus Pauling 和 Robert Corey 于 20 世 纪 40 年 代 末 至 50 年 代 初, 应 用 X 射 线 衍 射 法 (X ray diffraction) 技 术 对 α 角 蛋 白 等 研 究 结 果, 提 出 了 蛋 白 质 分 子 构 象 的 立 体 化 学 原 则, 要 点 如 下 : (1) 肽 链 空 间 构 象 的 基 本 结 构 单 位 为 肽 平 面 或 肽 单 位 所 谓 的 肽 平 面 是 指 肽 链 中 从 一 个 Cα 原 子 到 另 一 个 Cα 原 子 之 间 的 结 构, 共 包 含 6 个 原 子 (Cα C O N H Cα), 它 们 在 空 间 共 处 于 同 一 个 平 面 如 图 所 示 : (2) 肽 键 上 的 原 子 呈 反 式 构 型 (3) 肽 键 C N 键 长 为 0.132nm, 比 一 般 的 C N 单 键 (0.147nm) 短, 比 C=N 双 键 (0.128nm) 要 长, 具 有 部 分 双 键 的 性 质 (partial double bond character), 不 能 旋 转 而 Cα COOH C NH 2, 为 真 正 单 键 (pure single bond), 可 以 旋 转 (4) 邻 肽 平 面 构 成 二 面 角 : 一 个 Cα 原 子 相 连 的 两 个 肽 平 面, 由 于 N 1 Cα 和 Cα C 2 ( 羧 基 碳 ) 两 个 键 为 单 键, 肽 平 面 可 以 分 别 围 绕 这 两 个 键 旋 转, 从 而 构 成 不 同 的 构 象 一 个 肽 平 面 围 绕 N 1 Cα( 氮 原 子 与 α 碳 原 子 ) 旋 转 的 角 度, 用 Φ 表 示 另 一 个 肽 平 面 围 绕 Cα C 2 (α 碳 原 子 与 羧 基 碳 ) 旋 转 的 角 度, 用 Ψ 表 示 这 两 个 旋 转 角 度 叫 二 面 角 (dihedral angle) 通 常 二 面 角 (Φ,Ψ) 确 定 后, 一 个 多 肽 链 的 二 级 结 构 就 确 定 了 2. 蛋 白 质 二 级 结 构 主 要 类 型 有 :a 螺 旋 β 折 叠 β 转 角 a 螺 旋 (a Helix) 又 称 为 3.6 13 螺 旋,Φ= 57,Ψ= 47 结 构 要 点 : (1) 多 个 肽 键 平 面 通 过 α- 碳 原 子 旋 转, 主 链 绕 一 条 固 定 轴 形 成 右 手 螺 旋 (2) 每 3.6 个 氨 基 酸 残 基 上 升 一 圈, 相 当 于 0.54nm (3) 相 邻 两 圈 螺 旋 之 间 借 肽 键 中 C=O 和 N H 形 成 许 多 链 内 氢 健, 即 每 一 个 氨 基 酸 残 基 中 的 NH 和 前 面 相 隔 三 个 残 基 的 C=O 之 间 形 成 氢 键, 这 是 稳 定 α- 螺 旋 的 主 要 键 (4) 肽 链 中 氨 基 酸 侧 链 R, 分 布 在 螺 旋 外 侧, 其 形 状 大 小 及 电 荷 影 响 α- 螺 旋 的 形 成 影 响 螺 旋 稳 定 的 因 素 :
酸 性 或 碱 性 氨 基 酸 集 中 的 区 域, 由 于 同 电 荷 相 斥, 不 利 于 α- 螺 旋 形 成 ; 较 大 的 R( 如 苯 丙 氨 酸 色 氨 酸 异 亮 氨 酸 ) 集 中 的 区 域, 也 妨 碍 α- 螺 旋 形 成 ; 脯 氨 酸 因 其 α- 碳 原 子 位 于 五 元 环 上, 不 易 扭 转, 加 之 它 是 亚 氨 基 酸, 不 易 形 成 氢 键, 故 不 易 形 成 上 述 α- 螺 旋 ; 甘 氨 酸 的 R 基 为 H, 空 间 占 位 很 小, 也 会 影 响 该 处 螺 旋 的 稳 定 a 螺 旋 在 许 多 蛋 白 中 存 在, 如 α 角 蛋 白 血 红 蛋 白 肌 红 蛋 白 等, 主 要 由 a 螺 旋 结 构 组 成 螺 旋 的 结 构 通 常 用 S N 来 表 示,S 表 示 螺 旋 每 旋 转 一 圈 所 含 的 残 基 数,N 表 示 形 成 氢 键 的 C=O 与 H N 原 子 之 间 在 主 链 上 包 含 的 原 子 数 β 折 叠 ( β pleated sheets) 又 称 β 片 层 β 结 构, 其 结 构 要 点 如 下 : (1) 多 肽 链 呈 锯 齿 状 ( 或 扇 面 状 ) 排 列 成 比 较 伸 展 的 结 构 ; (2) 相 邻 两 个 氨 基 酸 残 基 的 轴 心 距 离 为 0.35nm, 侧 链 R 基 团 交 替 地 分 布 在 片 层 平 面 的 上 下 方, 片 层 间 有 氢 键 相 连 ; (3) 有 平 行 式 和 反 平 行 式 两 种, 平 行 式 的 折 叠 其 Φ= 119,Ψ=+113 反 平 行 折 叠 其 Φ= 139,Ψ=+135 这 种 片 层 在 丝 心 蛋 白 里 大 量 存 在 结 构 如 图 所 示 β 转 角 又 称 β 弯 曲,β 回 折 或 发 夹 结 构 指 蛋 白 质 的 多 肽 链 在 形 成 空 间 构 象 时 经 常 会 出 现 180 的 回 折, 回 折 处 的 结 构 就 称 为 β 转 角 一 般 由 四 个 连 续 的 氨 基 酸 组 成, 第 一 个 氨 基 酸 的 羧 基 与 第 四 个 氨 基 酸 的 氨 基 形 成 氢 键 也 有 一 些 是 由 第 一 个 氨 基 酸 的 羧 基 与 第 三 个 氨 基 酸 的 氨 基 形 成 氢 键 结 构 如 图 所 示 维 持 二 级 结 构 的 作 用 力 : 氢 键 ( 三 ) 超 二 级 结 构 和 结 构 域 1. 超 二 级 结 构 超 二 级 结 构 (Super secondary structure) 的 概 念 是 M.Rossmann 于 1973 年 提 出 来 的 蛋 白 质 分 子 中 的 多 肽 链 在 三 维 折 叠 中 往 往 形 成 有 规 则 的 二 级 结 构 聚 集 体, 在 球 蛋 白 中 充 当 三 级 结 构 的 构 件 常 见 的 有 :αα ββ βαβα β 等 2. 结 构 域 (structural domain) 在 一 些 相 对 较 大 的 蛋 白 质 分 子 中, 在 空 间 折 叠 时 往 往 先 分 别 折 叠 成 几 个 相 对 独 立 的 区 域, 再 组 装 成 更 复 杂 的 球 状 结 构, 这 种 在 二 级 或 超 二 级 结 构 基 础 上 形 成 的 特 定 区 域 称 为 结 构 域 它 的 结 构 层 次 介 于 超 二 级 结 构 和 三 级 结 构 之 间 如 图 所 示 : 三. 蛋 白 质 的 三 级 结 构
一 条 多 肽 链 中 所 有 原 子 在 三 维 空 间 的 整 体 排 布, 称 为 三 级 结 构, 是 包 括 主 侧 链 在 内 的 空 间 排 列 大 多 数 蛋 白 质 的 三 级 结 构 为 球 状 或 近 似 球 状 在 三 级 结 构 中, 大 多 数 的 亲 水 的 R 侧 基 分 布 于 球 形 结 构 的 表 面, 而 疏 水 的 R 侧 基 分 布 于 球 形 结 构 的 内 部, 形 成 疏 水 的 核 心 三 级 结 构 主 要 靠 次 级 键 ( 非 共 价 键,noncovalent) 维 系 固 定, 主 要 有 : 氢 键 离 子 键 ( 盐 键 ) 疏 水 的 相 互 作 用 ( 疏 水 键 ) 范 德 华 力 配 位 键, 另 外 二 硫 键 ( 共 价 键 ) 也 参 与 维 系 三 级 结 构 三 级 结 构 形 成 后, 生 物 学 活 性 必 需 基 团 靠 近, 形 成 活 性 中 心 或 部 位, 即 蛋 白 质 分 子 表 面 形 成 了 某 些 发 挥 生 物 学 功 能 的 特 定 区 域 结 构 如 图 所 示 : 四. 蛋 白 质 的 四 级 结 构 二 个 或 二 个 以 上 具 有 独 立 的 三 级 结 构 的 多 肽 链 ( 亚 基 ), 彼 此 借 次 级 键 相 连, 形 成 一 定 的 空 间 结 构, 称 为 四 级 结 构 具 有 独 立 三 级 结 构 的 多 肽 链 单 位, 称 为 亚 基 或 亚 单 位 (subunit), 亚 基 可 以 相 同, 亦 可 以 不 同 四 级 结 构 的 实 质 是 亚 基 在 空 间 排 列 的 方 式 单 独 亚 基, 多 无 生 物 学 功 能, 二 个 以 上 亚 基 聚 合 成 为 有 完 整 四 级 结 构 的 蛋 白 质, 才 有 功 能 ( 血 红 蛋 白 结 构 如 图 所 示 ): 三 蛋 白 质 结 构 与 功 能 的 关 系 一 蛋 白 质 一 级 结 构 与 功 能 的 关 系 ⒈ 一 级 结 构 是 空 间 构 象 的 基 础 RNase 是 由 124 氨 基 酸 残 基 组 成 的 单 肽 链, 分 子 中 8 个 Cys 的 SH 构 成 4 对 二 硫 键, 形 成 具 有 一 定 空 间 构 象 的 蛋 白 质 分 子 在 蛋 白 质 变 性 剂 ( 如 8 摩 尔 的 尿 素 ) 和 一 些 还 原 剂 ( 如 巯 基 乙 醇 ) 存 在 下, 酶 分 子 中 的 二 硫 键 全 部 被 还 原, 酶 的 空 间 结 构 破 坏, 肽 链 完 全 伸 展, 酶 的 催 化 活 性 完 全 丧 失 当 用 透 析 的 方 法 除 去 变 性 剂 和 巯 基 乙 醇 后, 发 现 酶 大 部 分 活 性 恢 复, 所 有 的 二 硫 键 准 确 无 误 地 恢 复 原 来 状 态 若 用 其 他 的 方 法 改 变 分 子 中 二 硫 键 的 配 对 方 式, 酶 完 全 丧 失 活 性 这 个 实 验 表 明, 蛋 白 质 的 一 级 结 构 决 定 它 的 空 间 结 构, 而 特 定 的 空 间 结 构 是 蛋 白 质 具 有 生 物 活 性 的 保 证 ⒉ 前 体 与 活 性 蛋 白 质 一 级 结 构 的 关 系 由 108 个 氨 基 酸 残 基 构 成 的 前 胰 岛 素 原 pre proinsulin), 在 合 成 的 时 候 完 全 没 有 活 性, 当 切 去 N 端 的 24 个 氨 基 酸 信 号 肽, 形 成 84 个 氨 基 酸 的 胰 岛 素 原 (proinsulin), 胰 岛 素 原 也 没 活 性, 在 包 装 分 泌 时,A B 链 之 间 的 33 个 氨 基 酸 残 基 被 切 除, 才 形 成 具 有 活 性 的 胰 岛 素 ⒊ 蛋 白 质 一 级 结 构 的 种 属 差 异 与 分 子 进 化 对 于 不 同 种 属 来 源 的 同 种 蛋 白 质 进 行 一 级 结 构 测 定 和 比 较, 发 现 存 在 种 属 差 异, 这 种 差 异 可
能 是 分 子 进 化 的 结 果 但 与 活 性 和 蛋 白 质 空 间 结 构 密 切 相 关 的 氨 基 酸 残 基 高 度 保 守 总 之, 蛋 白 质 一 定 的 结 构 执 行 一 定 的 功 能 功 能 不 同 的 蛋 白 质 总 是 有 着 不 同 的 序 列 ; 比 较 种 属 来 源 不 同 而 功 能 相 同 的 蛋 白 质 的 一 级 结 构, 可 能 有 某 些 差 异, 但 与 功 能 相 关 的 结 构 也 总 是 相 同 若 一 级 结 构 变 化, 蛋 白 质 的 功 能 可 能 发 生 很 大 的 变 化 ⒋ 蛋 白 质 的 一 级 结 构 与 分 子 病 现 知 几 乎 所 有 遗 传 病 都 与 蛋 白 质 分 子 结 构 改 变 有 关, 都 称 之 为 分 子 病 例 如 镰 刀 型 贫 血 症, 它 是 由 于 血 红 蛋 白 的 β 亚 基 上 的 第 六 位 氨 基 酸 由 谷 氨 酸 变 成 了 缬 氨 酸, 导 致 血 红 蛋 白 的 结 构 和 功 能 的 改 变, 其 运 输 氧 气 的 能 力 大 大 地 降 低, 并 且 红 细 胞 呈 镰 刀 状 二 蛋 白 质 的 空 间 结 构 与 功 能 的 关 系 以 血 红 蛋 白 (Hb) 为 例 加 以 说 明 (Hb 的 结 构 如 图 所 示 ) Hb 由 4 条 肽 链 组 成 :2α 2β, 功 能 是 运 载 O 2 ; 在 去 氧 Hb 亚 基 中 有 下 列 几 对 盐 键 : α 1 α 2 :α 2 亚 基 Arg 141 COOH α 1 亚 基 Val 1 NH 2 α 1 α 2 :α 2 亚 基 Arg 141 胍 基 α 1 亚 基 Asp 126 COOH α 1 β 2 :a 1 亚 基 Lys 40 的 ξ NH 2 β 2 亚 基 His 146 COOH β 1 β 2 :β 2 亚 基 His 146 咪 唑 基 β 1 亚 基 Asp 94 β COOH 由 于 血 红 蛋 白 亚 基 之 间 存 在 大 量 盐 键, 使 其 构 象 呈 紧 张 态, 对 氧 的 亲 和 力 很 低, 第 一 个 亚 基 与 O 2 结 合 时, 盐 键 的 破 坏 较 难, 所 需 要 的 能 量 较 多 当 血 红 蛋 白 的 一 个 亚 基 结 合 氧 之 后 引 起 它 的 构 象 从 紧 张 态 变 成 松 弛 态, 其 它 的 盐 键 也 依 次 破 坏, 此 时 破 坏 盐 键 所 需 要 的 能 量 也 少, 构 象 的 变 化 导 致 血 红 蛋 白 对 氧 的 亲 和 力 大 大 增 强, 因 此 第 四 个 亚 基 结 合 氧 的 能 力 比 第 一 个 大 几 百 倍 血 红 蛋 白 分 子 中 的 盐 键 如 图 所 示 : 上 述 Hb 与 O 2 结 合 后,Hb 的 构 象 发 生 变 化, 这 类 变 化 称 为 变 构 效 应, 即 通 过 构 象 变 化 影 响 蛋 白 质 的 功 能 像 血 红 蛋 白 这 种 具 有 变 构 效 应 的 蛋 白 质 称 为 变 构 蛋 白 (allosteric protein) 血 红 蛋 白 的 这 种 变 构 效 应 能 更 有 效 地 行 使 其 运 氧 的 生 物 学 功 能 总 之, 各 种 蛋 白 质 都 有 特 定 的 空 间 构 象, 而 特 定 的 空 间 构 象 又 与 它 们 特 定 的 生 物 学 功 能 相 适 应, 蛋 白 质 的 结 构 与 功 能 是 高 度 统 一 的 四 蛋 白 质 的 理 化 性 质 及 分 离 纯 化 一 蛋 白 质 的 两 性 电 离 和 等 电 点 蛋 白 质 与 氨 基 酸 相 似, 也 具 有 两 性 电 离 的 性 质 蛋 白 质 的 多 肽 链 含 有 末 端 氨 基 和 羧 基, 一 些 侧 链 上 含 有 可 解 离 的 基 团, 有 的 可 以 接 受 氢 离 子, 有 的 可 以 电 离 出 氢 离 子, 因 此 蛋 白 质 具 有 酸 碱 两 性 电 离 的 性 质 它 的 两 性 电 离 比 氨 基 酸 复 杂 对 某 一 蛋 白 质 而 言, 在 某 一 ph 下, 当 它 所 带 正 负 电 荷 相 等 的 时 候, 该 溶 液 的 ph 就 称 为 该 蛋 白 质 的 等 电 点 蛋 白 质 的 等 电 点 的 大 小 与 蛋 白 质 的 氨 基 酸 组 成 有 关 二 蛋 白 质 的 高 分 子 性 质
蛋 白 质 溶 液 有 许 多 高 分 子 溶 液 的 性 质, 如 : 扩 散 慢 易 沉 降 粘 度 大 不 能 透 过 半 透 膜, 在 水 溶 液 中 可 形 成 亲 水 的 胶 体 蛋 白 质 胶 体 溶 液 的 稳 定 因 素 : 水 化 膜 带 电 荷 当 破 坏 这 两 个 因 素 时, 蛋 白 质 中 从 溶 液 中 析 出 而 产 生 沉 淀 三 蛋 白 质 的 沉 淀 作 用 使 蛋 白 质 从 溶 液 中 析 出 的 现 象 称 为 沉 淀, 方 法 有 : 1. 盐 析 : 在 蛋 白 质 的 水 溶 液 中, 加 入 大 量 高 浓 度 的 强 电 解 质 盐 如 硫 酸 胺 氯 化 钠 硫 酸 钠 等, 使 蛋 白 质 从 溶 液 中 析 出, 称 为 蛋 白 质 的 盐 析 而 低 浓 度 的 盐 溶 液 加 入 蛋 白 质 溶 液 中, 会 导 致 蛋 白 质 的 溶 解 度 增 加, 该 现 象 称 为 盐 溶 盐 析 的 机 理 : 破 坏 蛋 白 质 的 水 化 膜, 中 和 表 面 的 净 电 荷 盐 析 法 是 最 常 用 的 蛋 白 质 沉 淀 方 法, 该 方 法 不 会 使 蛋 白 质 产 生 变 性 2. 有 机 溶 剂 沉 淀 法 : 在 蛋 白 质 溶 液 中, 加 入 能 与 水 互 溶 的 有 机 溶 剂 如 乙 醇 丙 酮 等, 蛋 白 质 产 生 沉 淀 有 机 溶 剂 沉 淀 法 的 机 理 : 破 坏 蛋 白 质 的 水 化 膜 有 机 溶 液 沉 淀 蛋 白 质 通 常 在 低 温 条 件 下 进 行, 否 则 有 机 溶 剂 与 水 互 溶 产 生 的 溶 解 热 会 使 蛋 白 质 产 生 变 性 3. 重 金 属 盐 沉 淀 ( 条 件 :ph 稍 大 于 pi 为 宜 ): 在 蛋 白 质 溶 液 中 加 入 重 金 属 盐 溶 液, 会 使 蛋 白 质 沉 淀 重 金 属 沉 淀 法 的 机 理 : 重 金 属 盐 加 入 之 后, 与 带 负 电 的 羧 基 结 合 重 金 属 沉 淀 蛋 白 质 会 使 蛋 白 质 产 生 变 性, 长 期 从 事 重 金 属 作 业 的 人 应 多 吃 高 蛋 白 食 品, 以 防 止 重 金 属 离 子 被 机 体 吸 收 后 造 成 对 机 体 的 损 害 4. 生 物 碱 试 剂 沉 淀 法 ( 条 件 :ph 稍 小 于 pi) 生 物 碱 是 植 物 组 织 中 具 有 显 著 生 理 作 用 的 一 类 含 氮 的 碱 性 物 质 能 够 沉 淀 生 物 碱 的 试 剂 称 为 生 物 碱 试 剂 生 物 碱 试 剂 一 般 为 弱 酸 性 物 质, 如 单 宁 酸 苦 味 酸 三 氯 乙 酸 等 生 物 碱 试 剂 沉 淀 蛋 白 质 的 机 理 : 在 酸 性 条 件 下, 蛋 白 质 带 正 电, 可 以 与 生 物 碱 试 剂 的 酸 根 离 子 结 合 而 产 生 沉 淀 柿 石 症 的 产 生 就 是 由 于 空 腹 吃 了 大 量 的 柿 子, 柿 子 中 含 有 大 量 的 单 宁 酸, 使 肠 胃 中 的 蛋 白 质 凝 固 变 性 而 成 为 不 能 被 消 化 的 柿 石 5. 弱 酸 或 弱 碱 沉 淀 法 : 用 弱 酸 或 弱 碱 调 节 蛋 白 质 溶 液 的 ph 处 于 等 电 点 处, 使 蛋 白 质 沉 淀 弱 酸 或 弱 碱 沉 淀 法 机 理 : 破 坏 蛋 白 质 表 面 净 电 荷 四 蛋 白 质 的 变 性 作 用 结 絮 和 凝 固 蛋 白 质 变 性 的 概 念 : 天 然 蛋 白 质 受 物 理 或 化 学 因 素 的 影 响 后, 使 其 失 去 原 有 的 生 物 活 性, 并 伴 随 着 物 理 化 学 性 质 的 改 变, 这 种 作 用 称 为 蛋 白 质 的 变 性
使 蛋 白 质 的 变 性 因 素 : 1) 物 理 因 素 : 高 温 高 压 射 线 等 2) 化 学 因 素 : 强 酸 强 碱 重 金 属 盐 等 变 性 的 本 质 : 分 子 中 各 种 次 级 键 断 裂, 使 其 空 间 构 象 从 紧 密 有 序 的 状 态 变 成 松 散 无 序 的 状 态, 一 级 结 构 不 破 坏 蛋 白 质 变 性 后 的 表 现 : 1) 生 物 学 活 性 消 失 2) 理 化 性 质 改 变 : 溶 解 度 下 降, 粘 度 增 加, 紫 外 吸 收 增 加, 侧 链 反 应 增 强, 对 酶 的 作 用 敏 感, 易 被 水 解 五 蛋 白 质 的 颜 色 反 应 蛋 白 质 的 颜 色 反 应 主 要 与 其 定 性 定 量 测 定 有 关 : 茚 三 酮 反 应 : 多 肽 与 蛋 白 质 都 能 与 之 反 应 生 成 蓝 色 化 合 物 双 缩 脲 反 应 : 多 肽 与 蛋 白 质 都 能 和 双 缩 脲 试 剂 反 应, 随 着 肽 键 的 数 目 越 多, 颜 色 依 次 为 粉 红 紫 红 紫 蓝 酚 试 剂 反 应 : 多 肽 与 蛋 白 质 与 酚 试 剂 生 成 蓝 色 的 化 合 物 另 外, 前 面 提 到 的 氨 基 酸 颜 色 反 应 蛋 白 质 都 具 有 六 蛋 白 质 的 紫 外 吸 收 特 征 蛋 白 质 溶 液 能 吸 收 一 定 波 长 的 紫 外 线, 主 要 是 由 带 芳 香 环 的 氨 基 酸 决 定 的 其 对 紫 外 光 吸 收 能 力 的 强 弱 顺 序 为 : 色 (Trp)> 酪 (Tyr)> 苯 丙 (Phe) 五 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 与 测 定 一. 分 离 纯 化 蛋 白 质 的 意 义 研 究 蛋 白 质 的 结 构 与 功 能 : 要 求 纯 度 高, 不 变 性 ; 提 取 活 性 的 酶 或 蛋 白 质 : 必 须 保 持 天 然 活 性 状 态 ; 作 为 药 物 或 食 品 添 加 剂 : 纯 度 要 求 一 般 二. 蛋 白 质 分 离 纯 化 的 一 般 步 骤 材 料 的 选 择 原 料 的 预 处 理 蛋 白 质 的 抽 提 从 抽 提 液 中 沉 淀 蛋 白 质 纯 化 蛋 白 质 的 结 晶 1. 原 料 的 选 择 : 要 求 含 待 分 离 的 蛋 白 质 丰 富, 廉 价, 易 得, 容 易 收 集, 新 鲜 无 腐 败 2. 原 料 的 预 处 理 : 如 果 待 分 离 蛋 白 质 为 胞 外 蛋 白 质, 材 料 破 碎 后, 用 适 当 的 溶 剂 直 接 抽 提 ; 若 待 分 离 蛋 白 质 为 胞 内 蛋 白 质, 则 需 要 破 碎 细 胞 膜, 再 用 适 当 的 溶 剂 抽 提 3. 从 抽 提 液 中 沉 淀 蛋 白 质 : 常 用 盐 析 法 低 温 乙 醇 沉 淀 法 等 电 点 沉 淀 法 4. 将 沉 淀 的 蛋 白 质 溶 解, 再 选 择 适 当 的 纯 化 方 法, 得 到 纯 度 比 较 高 的 蛋 白 质 溶 液
纯 化 方 法 : 透 析 或 超 滤 电 泳 法 凝 胶 过 滤 法 离 子 交 换 层 析 吸 附 层 析 法 超 速 离 心 法 等 5. 蛋 白 质 的 结 晶 : 从 溶 液 中 重 新 沉 淀 蛋 白 质 几 种 常 见 的 纯 化 蛋 白 质 的 方 法 如 图 所 示 : 凝 胶 电 泳 法 :