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目 录 一 概 述 3 二 细 胞 基 质 的 分 类 4 三 细 胞 基 质 存 在 的 潜 在 危 险 性...6 四 细 胞 基 质 的 一 般 技 术 要 求 和 评 价..8 五 新 细 胞 系 / 株 的 技 术 要 求.13 六 参 考 文 献..14 七 起 草 说 明..15 2

一 概 述 生 产 用 细 胞 基 质 是 指 培 养 病 毒 时 所 需 要 的 细 胞, 是 生 产 病 毒 疫 苗 必 不 可 少 的 原 材 料 任 何 微 生 物 的 生 长 繁 殖 都 有 各 自 的 最 基 本 的 条 件, 病 毒 的 生 长 和 繁 殖 必 须 在 细 胞 内 进 行 病 毒 疫 苗 是 以 培 养 收 获 足 够 量 的 病 毒 为 基 础 目 前 培 养 病 毒 的 方 法 主 要 有 二 种, 一 种 是 通 过 病 毒 的 细 胞 培 养 得 到 病 毒, 另 一 种 是 采 用 病 毒 感 染 动 物 ( 包 括 鸡 胚 ) 获 得 病 毒 生 物 制 品 的 质 量 控 制 不 仅 仅 是 对 终 产 品 的 质 量 控 制, 而 是 对 整 个 生 产 过 程 的 质 量 控 制, 包 括 原 材 料 中 间 产 品 终 产 品 以 及 生 产 过 程 的 质 控 等 等 细 胞 基 质 作 为 主 要 原 材 料, 其 质 量 的 优 劣, 直 接 影 响 疫 苗 的 质 量 和 产 量, 尤 其 是 疫 苗 的 安 全 性 一 般 认 为, 用 细 胞 基 质 生 产 疫 苗, 主 要 关 注 的 质 量 问 题 在 于 可 能 存 在 的 外 源 因 子 污 染 和 某 些 情 况 下 细 胞 本 身 的 特 性, 以 及 细 胞 培 养 中 各 个 环 节 的 操 作, 因 此, 只 有 妥 善 解 决 上 述 问 题, 才 能 达 到 对 疫 苗 的 质 量 控 制 本 原 则 主 要 阐 述 细 胞 基 质 的 分 类 各 类 细 胞 基 质 的 优 缺 点 力 求 从 科 学 的 角 度 分 析 和 认 识 潜 在 的 危 险 性, 以 及 科 学 客 观 评 价 细 胞 基 质 安 全 性 和 有 效 性 常 用 的 方 法 等 等 本 原 则 仅 为 一 般 性 技 术 要 求 和 原 则, 非 强 制 性 希 望 能 够 有 助 于 疫 苗 类 制 品 的 审 评 工 作, 同 时 促 进 药 品 审 评 机 构 与 疫 苗 生 产 企 业 疫 苗 研 制 者 之 间 的 交 流 此 外, 希 望 本 原 则 对 疫 苗 研 制 开 发 工 作 有 所 启 示 二 细 胞 基 质 的 分 类 本 原 则 将 细 胞 基 质 分 为 三 类, 即 原 代 细 胞 二 倍 体 细 胞 和 传 代 细 胞 ( 一 ) 原 代 细 胞 原 代 细 胞 是 指 直 接 来 源 于 动 物 组 织 的 细 胞, 动 物 组 织 经 胰 酶 消 化 培 养 成 单 3

层 细 胞 ( 通 常 贴 壁 生 长 ), 用 于 病 毒 的 培 养 如 地 鼠 肾 细 胞 猴 肾 细 胞 兔 肾 细 胞 鸡 胚 细 胞 等 原 代 细 胞 在 疫 苗 的 生 产 中 已 使 用 了 40 多 年, 证 明 是 安 全 有 效 的 我 国 已 上 市 的 疫 苗 中, 乙 型 脑 炎 疫 苗 肾 综 合 征 出 血 热 疫 苗 狂 犬 病 疫 苗 使 用 地 鼠 肾 细 胞, 麻 疹 腮 腺 炎 疫 苗 使 用 鸡 胚 细 胞, 风 疹 疫 苗 使 用 兔 肾 细 胞, 脊 髓 灰 质 炎 疫 苗 使 用 猴 肾 细 胞 原 代 细 胞 具 备 的 优 点 有 : 使 用 的 细 胞 培 养 液 相 对 简 单, 很 多 病 毒 都 可 以 在 原 代 细 胞 上 生 长 繁 殖, 具 有 广 泛 的 敏 感 性 ; 原 代 细 胞 的 来 源 比 较 容 易, 尤 其 是 地 鼠, 是 哺 乳 动 物 中 繁 殖 最 快 的 动 物 之 一 ; 由 于 原 代 细 胞 属 正 常 细 胞, 没 有 DNA 突 变, 无 致 肿 瘤 性 原 代 细 胞 的 缺 点 包 括 : 存 在 潜 在 的 病 毒 等 外 源 因 子 污 染 问 题 ; 来 自 不 同 个 体 动 物 的 细 胞 质 量 和 敏 感 性 有 差 异 鉴 于 原 代 细 胞 的 上 述 缺 点, 生 产 减 毒 活 疫 苗 的 动 物 应 尽 可 能 达 到 SPF 级, 至 少 不 应 低 于 清 洁 级 ; 生 产 灭 活 疫 苗 的 动 物 应 尽 可 能 达 到 清 洁 级 以 上, 至 少 应 采 用 健 康 动 物 ; 采 用 等 级 动 物 的 原 代 细 胞 或 传 代 细 胞 以 及 二 倍 体 细 胞 是 将 来 生 产 灭 活 疫 苗 的 发 展 方 向 ( 二 ) 传 代 细 胞 传 代 细 胞 是 可 在 体 外 连 续 传 代 的 细 胞 系, 理 论 上 具 有 无 限 传 代 的 寿 命 传 代 细 胞 系 可 以 通 过 以 下 方 法 衍 生 而 来,(1) 人 或 动 物 肿 瘤 细 胞 的 原 代 细 胞 的 系 列 培 养, 例 如 Hela 细 胞 Namalva 细 胞 等 ;(2) 携 带 致 癌 基 因 的 病 毒, 将 致 癌 基 因 转 化 给 正 常 细 胞, 成 为 肿 瘤 细 胞, 例 如 EB 病 毒 转 化 的 B 淋 巴 细 胞 ;(3) 骨 髓 瘤 细 胞 与 B 淋 巴 细 胞 融 合, 例 如 生 产 单 克 隆 抗 体 的 杂 交 瘤 细 胞 株 ;(4) 正 常 细 胞 群 的 连 续 传 代, 繁 衍 成 一 个 新 的 具 有 无 限 寿 命 的 细 胞 群, 例 如 非 洲 绿 猴 肾 细 胞 的 传 代 细 胞 系 Vero 细 胞 幼 仔 地 鼠 肾 的 传 代 细 胞 系 BHK21 细 胞 中 华 仓 鼠 卵 巢 细 胞 的 传 代 细 胞 系 (CHO 细 胞 ) 等 目 前 尚 无 用 于 疫 苗 生 产 的 来 源 于 4

人 类 组 织 的 传 代 细 胞 系 由 于 肿 瘤 细 胞 或 携 带 肿 瘤 基 因 的 细 胞 具 有 致 肿 瘤 的 危 险, 所 以 该 类 细 胞 不 能 作 为 细 胞 基 质 用 于 疫 苗 生 产 ; 因 此 用 于 病 毒 组 织 培 养 的 细 胞 系 采 用 非 肿 瘤 细 胞 系, 即 正 常 细 胞 群 的 连 续 传 代 后 繁 衍 的 细 胞 系, 在 一 定 传 代 限 度 内 使 用, 使 用 最 多 的 是 Vero 细 胞 例 如, 人 用 狂 犬 病 纯 化 疫 苗 脊 髓 灰 质 炎 灭 活 ( 纯 化 ) 肾 综 合 征 出 血 热 纯 化 疫 苗 乙 型 脑 炎 纯 化 疫 苗 均 已 使 用 Vero 细 胞 生 产 传 代 细 胞 具 备 的 优 点 包 括 : 能 够 充 分 鉴 定 和 标 准 化 ; 使 用 细 胞 种 子 库 系 统 生 产, 有 利 于 质 量 控 制 ; 可 用 于 微 载 体 生 物 反 应 器, 可 大 规 模 生 产 ; 对 培 养 基 及 牛 血 清 的 营 养 成 份 要 求 不 高 传 代 细 胞 的 缺 点 有, 理 论 上 有 致 肿 瘤 性 的 危 险, 但 WHO 认 为 Vero 细 胞 在 150 代 以 内 使 用 是 安 全 的, 无 致 肿 瘤 性 ( 三 ) 人 二 倍 体 细 胞 人 二 倍 体 细 胞 是 采 用 人 源 细 胞 ( 通 常 为 胚 胎 组 织 ) 建 立 的 细 胞 株, 可 进 行 体 外 传 代 培 养, 但 具 有 一 定 的 传 代 寿 命, 超 过 一 定 代 次, 细 胞 衰 老, 如 2BS 细 胞 KMB-17 MRC-5 细 胞 等 上 述 细 胞 系 在 疫 苗 的 生 产 中 使 用 了 30 多 年, 证 明 是 安 全 有 效 的, 无 致 肿 瘤 性 我 国 已 上 市 的 疫 苗 中, 甲 型 肝 炎 疫 苗 脊 髓 灰 质 炎 疫 苗 风 疹 减 毒 活 疫 苗 水 痘 减 毒 活 疫 苗 分 别 使 用 了 2BS KMB-17 MRC-5 细 胞 二 倍 体 细 胞 与 原 代 细 胞 相 比, 具 有 能 够 充 分 鉴 定 和 标 准 化 的 优 点, 可 实 现 细 胞 种 子 库 系 统, 建 立 的 细 胞 库 可 多 年 用 于 生 产, 有 利 于 质 量 控 制 二 倍 体 细 胞 与 传 代 细 胞 相 比, 理 论 上 不 存 在 致 肿 瘤 的 潜 在 危 险 性 二 倍 体 细 胞 存 在 的 缺 点 是, 与 传 代 细 胞 相 比, 难 于 大 规 模 生 产 ; 对 培 养 液 及 牛 血 清 的 营 养 成 份 要 求 较 高 三 细 胞 基 质 存 在 的 潜 在 危 险 性 5

动 物 细 胞 用 于 疫 苗 生 产, 应 考 虑 其 带 来 的 潜 在 危 险 重 点 考 虑 病 毒 与 其 他 可 传 播 因 子 细 胞 DNA 和 促 生 长 蛋 白 等 ( 一 ) 携 带 潜 在 病 毒 和 其 他 可 传 播 因 子 细 胞 系 / 株 本 身 有 可 能 携 带 内 源 性 病 毒 和 外 界 污 染 的 病 毒 如 果 细 胞 基 质 被 病 毒 污 染, 则 生 产 出 来 的 疫 苗 也 会 含 有 污 染 的 病 毒, 直 接 影 响 疫 苗 的 安 全 性 ; 尤 其 是 减 毒 活 疫 苗, 由 于 没 有 灭 活 工 艺, 内 源 性 或 外 源 性 病 毒 的 污 染 可 能 会 导 致 严 重 的 后 果 人 类 或 灵 长 目 动 物 细 胞 系 可 能 携 带 潜 在 的 病 毒, 例 如 乙 型 肝 炎 病 毒 逆 转 录 病 毒 等 ; 还 有 可 能 含 有 整 合 在 细 胞 DNA 上 的 病 毒 基 因 虽 然 人 二 倍 体 细 胞 用 于 疫 苗 生 产 30 多 年, 未 见 有 病 毒 性 污 染 的 报 道, 但 仍 不 能 完 全 排 除 人 类 病 毒 潜 在 污 染 的 风 险 禽 类 组 织 细 胞 隐 藏 着 外 源 和 内 源 性 逆 转 录 病 毒, 但 目 前 没 有 证 据 表 明 这 些 细 胞 基 质 生 产 的 疫 苗 可 向 人 类 传 播 疾 病 例 如 多 年 前 使 用 含 有 禽 白 血 病 病 毒 的 鸡 胚 生 产 的 黄 热 病 疫 苗 麻 疹 疫 苗 流 感 疫 苗 尽 管 如 此, 仍 应 防 范 禽 类 外 源 和 内 源 性 逆 转 录 病 毒 给 人 类 可 能 带 来 的 危 害 啮 齿 类 动 物 细 胞 隐 藏 着 外 源 和 内 源 性 逆 转 录 病 毒 及 其 他 病 毒, 可 能 携 带 淋 巴 细 胞 脉 络 丛 脑 膜 炎 病 毒 出 血 热 病 毒 等, 其 可 以 直 接 感 染 人 类 而 致 病 ( 二 ) 细 胞 DNA 多 年 来, 原 代 细 胞 和 二 倍 体 细 胞 已 成 功 安 全 地 用 于 多 种 疫 苗 生 产, 已 认 为 这 类 细 胞 的 残 余 DNA 无 危 险 性 由 于 传 代 细 胞 调 控 生 长 的 基 因 失 调, 使 得 传 代 细 胞 系 具 有 无 限 的 寿 命 因 此, 理 论 上 认 为 传 代 细 胞 系 的 DNA 具 有 使 其 他 细 胞 生 长 失 控 和 产 生 致 肿 瘤 活 性 的 潜 在 能 力 6

人 类 对 传 代 细 胞 DNA 的 危 险 性 有 一 个 逐 步 认 识 的 过 程 1986 年 WHO 根 据 动 物 致 癌 基 因 模 型 提 出 危 险 性 评 估, 在 体 内 暴 露 1ng 的 细 胞 DNA( 该 基 因 组 中 含 有 1 个 活 化 致 癌 基 因 的 100 个 拷 贝 ), 可 引 起 1/10 9 个 受 体 发 生 转 化 并 认 为 疫 苗 中 含 有 100pg/ 剂 量 的 细 胞 DNA 的 危 险 性 可 忽 略 不 计 在 确 定 此 界 限 时, 考 虑 的 不 是 DNA 本 身, 而 是 编 码 活 化 致 癌 基 因 的 特 殊 DNA 序 列 减 少 到 最 少 细 胞 DNA 可 导 致 瘤 变 的 嵌 入 突 变 的 危 险 性 极 小 有 报 告 结 果 显 示, 通 过 嵌 入 诱 变 证 明,10ugDNA 可 导 致 1/10 7 个 受 体 的 一 个 细 胞 的 2 个 独 立 的 肿 瘤 抑 制 基 因 失 活 1998 年 发 表 的 文 章 表 明, 含 有 活 化 基 因 的 mg 级 DNA 注 射 灵 长 类 动 物,10 年 内 未 引 起 肿 瘤 目 前 认 为, 传 代 细 胞 系 的 DNA 是 一 种 细 胞 污 染, 而 不 是 一 种 需 要 降 低 到 极 低 水 平 的 严 重 危 险 因 素, 但 鉴 于 疫 苗 的 使 用 者 为 健 康 人 群, 并 且 采 用 传 代 细 胞 生 产 的 灭 活 疫 苗 逐 渐 增 多, 因 此 应 尽 量 降 低 疫 苗 中 残 余 DNA 含 量, 最 大 限 度 地 降 低 潜 在 的 危 险 生 产 工 艺 中 必 须 有 去 除 DNA 的 工 艺, 并 进 行 工 艺 验 证 此 外,β- 丙 内 酯 既 可 以 灭 活 病 毒, 也 可 以 降 解 核 酸 口 服 制 剂 的 残 余 DNA 含 量 的 危 险 性 可 忽 略 不 计 ( 三 ) 促 生 长 蛋 白 及 细 胞 残 留 蛋 白 传 代 细 胞 可 分 泌 生 长 因 子 ( 称 促 生 长 蛋 白 ), 该 生 长 因 子 可 以 促 进 细 胞 生 长, 但 作 用 通 常 是 短 暂 的 可 逆 的, 危 险 性 有 限 它 们 不 能 复 制, 而 且 大 部 分 在 体 内 迅 速 失 活 在 异 常 情 况 下 有 致 肿 瘤 作 用, 但 需 要 持 续 作 用 一 般 认 为, 疫 苗 中 含 有 微 量 的 已 知 的 促 生 长 蛋 白 不 构 成 严 重 危 险, 但 仍 需 关 注 其 带 来 的 潜 在 危 险 同 时, 疫 苗 当 中 的 细 胞 残 留 蛋 白 属 异 源 蛋 白, 有 可 能 引 起 机 7

体 的 过 敏 反 应 因 此, 使 用 传 代 细 胞 生 产 的 疫 苗, 应 进 行 纯 化, 尽 可 能 去 除 细 胞 蛋 白, 并 且 要 进 行 纯 化 工 艺 的 验 证 鉴 于 目 前 尚 无 特 异 性 传 代 细 胞 蛋 白 ( 包 括 促 生 长 蛋 白 ) 的 检 测 手 段, 现 仍 以 疫 苗 蛋 白 总 量 进 行 间 接 质 控 目 前, 我 国 部 分 生 产 企 业 的 工 艺 可 将 个 别 疫 苗 蛋 白 总 量 降 至 10 ug/ 剂 量 以 下, 其 细 胞 蛋 白 残 留 量 相 对 较 少 四 细 胞 基 质 的 一 般 技 术 要 求 本 节 所 阐 述 的 细 胞 基 质 的 一 般 技 术 要 求 和 评 价, 是 针 对 国 内 外 已 研 究 成 功 并 多 年 用 于 疫 苗 生 产 的 细 胞 系 / 株, 企 业 使 用 或 引 进 该 细 胞 系 / 株 时, 需 要 重 点 考 虑 的 问 题 和 需 要 进 行 验 证 性 工 作 不 适 用 于 新 的 细 胞 系 ( 一 ) 鉴 别 试 验 一 般 针 对 细 胞 的 特 点 设 计 试 验 方 法, 以 确 定 该 细 胞 的 正 确 性 一 般 可 采 用 1~2 种 方 法, 例 如 可 采 用 核 型 分 析, 生 物 化 学 法 ( 如 同 功 酶 分 析 ), 免 疫 学 方 法, 细 胞 遗 传 学 实 验 ( 如 染 色 体 标 记 ), 基 因 标 记 试 验 ( 如 DNA 图 谱 ) 等 ( 二 ) 细 胞 基 质 对 病 毒 的 敏 感 性 : 细 胞 培 养 的 目 的 是 获 得 足 够 量 的 病 毒, 如 果 病 毒 不 能 在 细 胞 上 很 好 地 适 应 和 复 制, 就 失 去 了 细 胞 培 养 的 目 的 ; 达 不 到 规 模 化 生 产 的 能 力, 产 品 研 制 开 发 的 前 景 不 容 乐 观 因 此, 选 择 适 宜 的 细 胞 基 质 是 疫 苗 研 制 的 基 础 一 般 选 择 有 充 足 来 源 的 对 研 发 的 目 的 病 毒 敏 感 的 能 够 大 规 模 生 产 的 可 以 进 行 质 量 控 制 的 细 胞 基 质 有 些 病 毒 对 一 些 细 胞 基 质 不 够 敏 感, 但 可 以 通 过 在 该 细 胞 基 质 上 适 应 传 代 的 方 式, 使 病 毒 逐 步 适 应 该 细 胞 基 质, 最 终 在 一 定 的 代 次 后 达 到 一 定 的 滴 度, 满 足 生 产 疫 苗 的 需 求 由 于 每 种 病 毒 感 染 细 胞 的 滴 度 不 同, 每 种 疫 苗 所 需 要 的 病 毒 量 ( 免 疫 原 ) 也 不 同, 所 以 目 前 对 于 疫 苗 毒 种 8

的 滴 度 要 求 没 有 统 一 的 尺 度, 不 同 的 疫 苗 有 不 同 的 标 准 例 如 目 前 已 上 市 的 疫 苗 中, 麻 疹 减 毒 活 疫 苗 毒 株 的 滴 度 要 求 为 4.5LgCCID50/ml, 乙 型 脑 炎 减 毒 活 疫 苗 毒 株 的 滴 度 要 求 为 7.2LgPFU/ml 因 此, 对 细 胞 基 质 敏 感 性 的 评 价 不 仅 仅 是 结 果, 同 样 重 要 的 是 病 毒 在 细 胞 基 质 上 适 应 的 全 过 程 细 胞 基 质 的 敏 感 性 直 接 影 响 疫 苗 的 产 量, 只 有 达 到 规 模 化 生 产, 才 有 生 产 疫 苗 的 可 能, 才 能 起 到 预 防 传 染 性 疾 病 的 作 用 此 外, 应 重 点 考 虑 在 细 胞 培 养 中, 接 种 尽 可 能 少 的 病 毒 量, 收 获 尽 可 能 多 的 病 毒 量 ( 三 ) 外 源 因 子 一 个 合 格 的 细 胞 系 / 株 应 无 任 何 外 源 因 子 污 染, 所 谓 外 源 因 子 是 指 除 细 胞 以 外 污 染 的 细 菌 真 菌 支 原 体 病 毒 ( 包 括 细 胞 系 / 株 本 身 携 带 的 病 毒 和 外 界 污 染 的 病 毒 ) 如 果 细 胞 基 质 被 外 源 因 子 污 染, 则 生 产 出 来 的 疫 苗 也 会 含 有 被 污 染 的 外 源 因 子, 直 接 影 响 疫 苗 的 安 全 性 ; 另 一 方 面, 疫 苗 生 产 的 目 的 病 毒 会 被 外 源 因 子 干 扰, 可 严 重 影 响 疫 苗 的 有 效 性 一 般 进 行 以 下 项 目 的 外 源 因 子 检 测 : 1. 无 菌 试 验 ( 细 菌 真 菌 支 原 体 ): 按 照 国 家 规 定 的 方 法 进 行 2. 细 胞 法 检 测 病 毒 外 源 因 子 : 至 少 用 10 7 细 胞 和 培 养 上 清 液 转 种 人 二 倍 体 细 胞 本 细 胞 系 的 其 他 批 次 其 他 种 属 的 细 胞 系, 应 无 细 胞 病 变 产 生 和 血 无 吸 附 现 象 3. 用 动 物 和 鸡 胚 检 测 病 毒 因 子 : 采 用 动 物 体 内 接 种 法 检 测 外 源 病 毒 因 子, 对 动 物 的 要 求 接 种 途 径 接 种 剂 量 观 察 时 间 结 果 判 定 见 表 1 9

表 1 动 物 体 内 接 种 法 检 测 外 源 病 毒 因 子 动 物 组 要 求 数 量 接 种 途 经 乳 鼠 24h 内 10(2 窝 ) 成 鼠 15~20g 10 脑 内 腹 腔 脑 内 腹 腔 细 胞 浓 度 ( 活 细 胞 数 量 / ml) 接 种 量 (ml/ 只 ) 0.01 >10 7 0.1 0.03 >2 10 6 0.5 观 察 天 数 结 果 判 定 21 应 健 存 21 应 健 存 鸡 胚 * 9~11 日 龄 10 尿 囊 腔 >5 10 6 0.2 3~4 尿 液 血 凝 试 验 阴 性 鸡 胚 5~6 日 龄 10 卵 黄 囊 >2 10 6 0.5 5 应 存 活 豚 鼠 350~500g 5 腹 腔 >4 10 5 5.0 42 应 健 存, 解 剖 无 结 核 病 变 家 兔 1.5~ 2.5kg 5 皮 下 皮 内 # >2 10 5 9.0 0.1 10. 21 无 异 常 健 存 * 经 尿 囊 腔 接 种 的 鸡 胚, 在 观 察 末 期, 应 用 豚 鼠 红 细 胞 和 鸡 红 细 胞 混 合 悬 液 进 行 直 接 活 细 胞 凝 集 试 验 # 每 只 家 兔 于 皮 内 注 射 10 处, 每 处 0.1ml 乳 鼠 和 成 鼠 脑 内 腹 腔 注 射, 系 检 测 嗜 神 经 病 毒 ; 豚 鼠 腹 腔 注 射, 系 检 测 结 核 杆 菌 ; 家 兔 皮 下 注 射, 系 检 测 猴 源 性 B 病 毒 ; 鸡 胚 是 检 测 正 粘 病 毒 和 副 粘 病 毒, 如 流 感 病 毒 呼 吸 道 合 胞 病 毒 等 4. 逆 转 录 病 毒 的 检 测 : 一 般 用 高 敏 感 性 的 细 胞 扩 增 待 检 细 胞 培 养 物 中 的 逆 转 录 病 毒, 以 扩 增 浓 度 可 能 很 低 的 任 何 逆 转 录 病 毒 污 染 物, 然 后 进 行 检 测 4.1 逆 转 录 酶 分 析 : 可 考 虑 采 用 最 新 的 高 敏 感 逆 转 录 酶 分 析 方 法 对 逆 转 录 酶 阳 性 结 果 判 定 应 谨 慎, 因 为 逆 转 录 酶 不 是 逆 转 录 病 毒 独 有 的, 也 有 其 他 来 源, 例 如 不 能 编 码 完 整 基 因 的 类 逆 转 录 病 毒 因 子 或 细 胞 DNA 聚 合 酶 因 此, 对 逆 转 录 酶 阳 性 的 样 本 应 进 一 步 进 行 联 合 培 养, 验 证 是 否 存 在 逆 转 录 病 毒 4.2 透 射 电 镜 检 测 4.3 感 染 性 检 测 : 主 要 用 于 鼠 源 性 逆 转 录 病 毒 的 检 查 二 倍 体 细 胞 和 传 代 细 胞 应 采 用 上 述 方 法 进 行 外 源 因 子 检 定, 原 代 细 胞 因 不 能 建 立 种 子 库, 其 外 源 因 子 的 检 测 只 能 在 生 产 的 同 时, 进 行 对 照 细 胞 的 检 测, 10

一 般 采 用 细 胞 病 变 法 和 血 吸 附 法, 检 测 结 果 阴 性, 相 应 的 疫 苗 外 源 因 子 合 格 由 于 目 前 的 认 识 和 检 验 方 法 存 在 的 局 限 性, 可 能 还 有 未 知 的 微 生 物 因 子 没 有 被 发 现 当 这 些 因 子 能 够 被 确 认 时, 需 要 重 新 检 测 细 胞 系 / 株 中 有 无 这 些 因 子 ( 四 ) 致 肿 瘤 性 原 代 细 胞 和 二 倍 体 细 胞 的 残 余 DNA 无 致 肿 瘤 性 理 论 上 传 代 细 胞 具 有 无 限 的 寿 命, 低 于 一 定 传 代 水 平 时, 可 以 表 现 出 无 致 肿 瘤 性, 但 随 着 代 次 的 增 加, 其 出 现 致 肿 瘤 性 的 可 能 性 也 会 增 加, 因 此 确 定 一 个 体 外 培 养 代 次 的 界 限 非 常 重 要, 细 胞 超 过 该 界 限 不 能 使 用 该 界 限 应 模 拟 生 产 条 件 并 超 过 实 际 生 产 代 次 检 测 方 法 包 括 动 物 法 和 软 琼 脂 法 1. 动 物 法 : 裸 鼠, 经 抗 胸 腺 血 清 处 理 的 新 生 小 鼠 或 大 鼠 均 可 用 于 试 验 可 选 用 其 中 一 种 动 物 方 法 和 判 定 : 每 只 动 物 皮 下 注 射 10 7 细 胞 /0.2ml, 以 Hela 细 胞 (10 6 细 胞 /0.2ml) 作 阳 性 对 照, 有 结 节 的 观 察 1~2 周, 解 剖 做 病 理 检 查 无 结 节 的, 一 般 观 察 21 天, 另 一 半 观 察 12 周, 解 剖 做 病 理 检 查, 阴 性 者 为 合 格, 阳 性 对 照 应 为 阳 性 2. 软 琼 脂 法 ( 五 ) 二 倍 体 细 胞 染 色 体 分 析 为 了 证 实 二 倍 体 细 胞 系 的 一 般 特 性, 对 于 主 细 胞 库 的 细 胞, 经 连 续 传 代 至 衰 老, 设 立 不 同 传 代 代 次 组,8-12 代 测 定 一 次, 至 少 进 行 4 次 染 色 体 检 测 一 个 良 好 的 细 胞 系, 应 在 细 胞 有 限 的 生 命 期 内, 染 色 体 分 析 符 合 国 家 的 相 关 要 11

求, 而 且 不 同 代 次 的 结 果 基 本 相 近 目 前 我 国 规 定 检 测 1000 个 或 500 个 分 裂 中 期 的 细 胞, 计 算 染 色 体 数 目 染 色 单 体 和 染 色 体 断 裂 数 量 分 别 不 得 超 过 47/1000 或 26/500; 结 构 异 常 者 不 得 超 过 17/1000 或 10/500; 超 二 倍 体 不 得 超 过 8/1000 或 5/500; 亚 二 倍 体 不 得 超 过 180/1000 或 90/500; 多 倍 体 不 得 超 过 30/1000 或 17/500 ( 六 ) 种 子 库 的 建 立 和 检 定 为 了 保 证 用 于 生 产 的 细 胞 系 及 生 产 出 的 疫 苗 没 有 外 源 因 子 污 染, 避 免 因 传 代 过 多 引 起 遗 传 变 异, 需 建 立 细 胞 库 一 般 由 发 明 者 或 权 威 机 构 保 存 一 定 代 次 细 胞 种 子 ( 原 始 细 胞 库 ), 分 发 或 出 售 给 生 产 企 业, 生 产 企 业 利 用 细 胞 种 子 制 备 主 细 胞 库 和 工 作 细 胞 库 分 发 或 出 售 者 应 提 供 细 胞 的 分 离 历 史 传 代 检 定 等 背 景 资 料, 及 分 发 或 出 售 给 企 业 的 证 明 文 件 主 细 胞 库 是 由 原 始 细 胞 种 子 经 传 代 扩 增 后 得 到 均 一 的 细 胞, 分 装 于 多 个 容 器 中 并 在 深 低 温 保 存 主 细 胞 库 应 具 备 一 定 的 量 并 经 过 严 格 全 面 的 检 定 主 细 胞 库 的 一 支 或 多 支 种 子 可 用 于 制 备 工 作 细 胞 库 工 作 细 胞 库 是 由 主 细 胞 库 的 种 子 经 传 代 扩 增 后 得 到 均 一 的 细 胞, 分 装 于 多 个 容 器 中 并 在 深 低 温 保 存 ; 工 作 细 胞 库 只 能 为 一 个 代 次, 应 具 备 一 定 的 量 并 经 过 严 格 的 全 面 检 定 工 作 细 胞 库 的 一 支 或 多 支 种 子 可 用 于 同 一 批 疫 苗 生 产 主 细 胞 库 代 次 工 作 细 胞 库 代 次 及 主 细 胞 库 与 工 作 细 胞 库 之 间 相 隔 的 代 次 应 该 有 明 确 的 限 定, 保 证 用 于 生 产 的 细 胞 代 次 保 持 恒 定 或 在 相 对 早 期 建 议 将 主 细 胞 库 工 作 细 胞 库 各 自 分 别 保 存 在 至 少 两 个 不 同 的 远 离 的 区 域, 以 防 意 外 丢 失 细 胞 系 12

为 了 避 免 交 叉 污 染, 在 进 行 一 种 细 胞 开 放 操 作 的 同 时, 不 要 进 行 其 他 细 胞 系 的 开 放 操 作 工 作 人 员 在 进 行 细 胞 培 养 的 当 天, 不 得 进 行 动 物 或 感 染 性 微 生 物 的 操 作 有 关 人 员 应 身 体 健 康 并 定 期 进 行 健 康 检 查 ( 七 ) 传 代 稳 定 性 在 疫 苗 的 实 际 生 产 过 程 中, 从 工 作 细 胞 库 取 出 一 支 或 多 支 种 子, 细 胞 种 子 经 复 苏 后 扩 增, 经 多 次 传 代 才 可 以 扩 增 到 生 产 所 需 要 的 细 胞 量, 然 后 感 染 病 毒, 培 养 收 获 病 毒 因 此, 需 要 控 制 从 工 作 种 子 库 毒 种 至 生 产 收 获 之 间 细 胞 的 质 量 细 胞 扩 增 往 往 通 过 多 次 细 胞 倍 增 的 传 代 而 实 现, 所 以 细 胞 代 次 的 研 究 显 得 极 为 重 要, 需 要 进 行 细 胞 传 代 稳 定 性 研 究 一 般 采 用 模 拟 疫 苗 生 产 中 细 胞 传 代 扩 增 的 方 式 进 行 细 胞 连 续 传 代 每 隔 一 定 代 次 测 定 细 胞 的 生 长 特 性 对 病 毒 的 敏 感 性 外 源 因 子 检 测 等, 均 应 符 合 有 关 要 求 最 末 代 次 的 检 测, 还 应 增 加 致 肿 瘤 试 验 建 议 传 代 稳 定 性 研 究 的 最 末 代 次 应 超 过 实 际 生 产 代 次 的 10 代 以 上 五 新 细 胞 系 / 株 的 技 术 要 求 建 立 一 个 生 产 疫 苗 的 新 细 胞 系 / 株, 属 于 创 新 性 研 究 研 制 者 除 按 照 细 胞 基 质 一 般 要 求 进 行 基 本 研 究 外, 还 要 增 加 其 他 工 作 ( 一 ) 历 史 来 源 及 基 本 资 料 建 立 一 个 新 的 细 胞 系 / 株, 必 须 详 细 记 录 历 史 例 如 建 立 二 倍 体 细 胞 株, 所 用 的 胎 儿 的 胎 龄 和 性 别, 终 止 妊 辰 的 原 因 胎 儿 父 母 的 年 龄 职 业 及 健 康 情 况, 胎 儿 父 母 系 三 代 应 无 明 显 遗 传 缺 陷 疾 病 和 恶 性 肿 瘤 历 史 原 始 组 织 的 类 型 数 量 生 长 情 况, 细 胞 的 培 养 方 法 传 代 历 史 生 长 特 征 寿 命 的 代 次 等 等 13

( 二 ) 细 胞 株 的 检 定 1. 鉴 别 试 验 : 新 细 胞 系 / 株 需 要 自 己 建 立 鉴 别 试 验 方 法, 并 进 行 方 法 学 认 证 对 原 始 种 子 库 主 种 子 库 和 工 作 种 子 库 均 进 行 鉴 别 试 验 检 测, 在 传 代 稳 定 性 研 究 中, 每 8-12 代 进 行 一 次 鉴 别 试 验 2. 外 源 因 子 检 查 : 一 个 新 的 细 胞 系 / 株, 还 应 选 择 性 进 行 病 毒 检 测 例 如, 鼠 细 胞 系 可 采 用 大 鼠 小 鼠 仓 鼠 的 抗 体 产 生 试 验, 以 检 测 特 异 性 病 毒 人 类 细 胞 系 可 采 用 适 当 的 技 术 进 行 对 人 类 致 病 病 毒 的 检 测, 如 EB 病 毒 巨 细 胞 病 毒 乙 型 肝 炎 病 毒 丙 型 肝 炎 病 毒 人 类 逆 转 录 病 毒 乳 头 瘤 病 毒 腺 病 毒 Ⅵ 和 Ⅶ 型 疱 疹 病 毒 等 可 以 考 虑 采 用 基 因 探 针 PCR 方 法 检 测 特 异 性 病 毒 序 列 及 病 毒 标 志 物, 以 提 供 附 加 信 息 3. 致 肿 瘤 性 试 验 : 按 照 常 规 的 方 法, 每 8-12 代 进 行 一 次 致 肿 瘤 试 验 检 测 六 参 考 文 献 1.WHO /TRS8781998:Requirements for use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals 2.ICH/ Q5d:Derivation and characterization of cell substrates used for production of biotechnological/ biological product 3. 中 华 人 民 共 和 国 药 典 /2005 年 版 三 部 : 生 物 制 品 生 产 用 动 物 细 胞 基 质 制 备 及 检 定 规 程 14

七 起 草 说 明 1. 关 于 起 草 背 景 ( 含 技 术 背 景 ) 的 介 绍 : 细 胞 基 质 是 生 产 疫 苗 必 不 可 少 的 原 材 料,WHO ICH 和 中 华 人 民 共 和 国 药 典 收 载 了 有 关 生 产 用 细 胞 基 质 的 规 程, 阐 述 了 有 关 质 量 要 求 但 多 年 来 国 内 始 终 没 有 相 关 指 导 原 则, 导 致 部 分 研 制 者 对 实 验 的 目 的 意 义 不 清 楚, 在 试 验 设 计 方 面 不 清 晰 不 科 学 不 规 范, 以 至 于 延 误 了 新 药 开 发 的 进 度 希 望 通 过 本 文 阐 述 的 原 则 和 依 据, 对 注 册 申 请 人 开 发 疫 苗 的 工 作 有 所 提 示, 提 高 研 发 水 平 2. 指 导 原 则 起 草 的 指 导 思 想 和 一 般 原 则 : 在 遵 循 药 品 研 发 规 律 的 基 础 上, 讨 论 药 品 评 价 者 的 关 注 点, 试 图 减 少 药 品 研 究 中 研 究 者 与 评 价 者 关 注 点 的 剪 刀 差 阐 述 国 际 上 对 细 胞 基 质 研 究 的 认 识 和 要 求, 并 结 合 中 国 国 情, 力 求 具 有 可 操 作 性 本 指 导 原 则 仅 为 一 般 性 技 术 要 求 和 原 则, 非 强 制 性 3. 与 其 他 指 导 原 则 的 关 联 性 及 适 用 范 围 : 本 文 主 要 针 对 各 类 细 胞 基 质 本 身 的 安 全 性 和 有 效 性, 以 及 保 证 安 全 性 和 有 效 性 所 需 要 进 行 的 研 究 和 验 证 没 有 涉 及 到 培 养 细 胞 的 要 求, 如 GMP 要 求 牛 血 清 的 要 求 胰 酶 的 要 求 此 外, 本 文 不 包 括 对 重 组 DNA 的 传 代 细 胞 治 疗 用 单 克 隆 抗 体 的 技 术 要 求, 有 关 技 术 指 导 原 则 另 行 撰 写 4. 内 容 设 置 的 说 明 : 本 原 则 主 要 阐 述 细 胞 基 质 的 分 类 各 类 细 胞 基 质 的 优 缺 点 力 求 从 科 学 的 角 度 分 析 和 认 识 潜 在 的 危 险 性, 以 及 科 学 客 观 评 价 细 胞 基 质 安 全 性 和 有 效 性 常 用 的 方 法 等 等 但 是, 目 前 我 国 在 细 胞 基 质 研 究 的 方 法 学 方 面 存 在 不 足, 15

尚 未 建 立 部 分 检 测 方 法, 例 如 逆 转 录 病 毒 的 联 合 培 养 法 致 肿 瘤 试 验 的 软 琼 脂 法 等 因 此 本 指 导 原 则 只 提 出 需 要 采 用 上 述 方 法 检 测, 没 有 对 方 法 进 行 描 述, 待 我 国 建 立 方 法 并 成 熟 后 再 具 体 写 入 本 指 导 原 则 5. 有 关 数 据 和 资 料 来 源 的 说 明 : 主 要 技 术 数 据 和 资 料 来 源 于 WHO /TRS8781998:Requirements for use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals 和 中 华 人 民 共 和 国 药 典 2005 版 三 部 6. 有 关 重 要 问 题 的 讨 论 过 程 及 结 果 : 有 关 逆 转 录 病 毒 的 检 测, 我 国 目 前 积 累 的 经 验 不 多, 疫 苗 生 产 企 业 尚 未 进 行 逆 转 录 病 毒 的 检 测, 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 已 建 立 逆 转 录 酶 的 检 定 方 法, 疫 苗 生 产 企 业 掌 握 有 关 方 法, 是 加 强 质 量 控 制 的 重 要 环 节 关 于 细 胞 系 / 株 的 鉴 别 试 验,WHO 有 相 关 要 求, 因 我 国 疫 苗 生 产 企 业 均 使 用 常 规 的 细 胞 系, 如 2BS Vero 细 胞 等, 企 业 未 对 细 胞 系 进 行 鉴 别 试 验 的 检 测 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 已 建 立 Vero 细 胞 的 鉴 别 试 验 ( 同 功 酶 试 验 ), 疫 苗 生 产 企 业 掌 握 有 关 方 法 ( 至 少 进 行 核 型 鉴 别 ), 是 加 强 质 量 控 制 的 重 要 环 节 目 前, 采 用 Vero 细 胞 生 产 灭 活 疫 苗 逐 渐 增 多,Vero 细 胞 残 余 蛋 白 ( 包 括 促 生 长 蛋 白 ) 可 能 对 人 体 有 潜 在 的 危 害, 特 异 性 检 测 Vero 细 胞 蛋 白 的 方 法 的 研 究, 是 今 后 制 定 相 关 质 量 控 制 标 准 的 基 础 此 外, 目 前 阶 段 应 尽 量 降 低 疫 苗 总 蛋 白 含 量, 间 接 控 制 细 胞 残 留 蛋 白 WHO 提 出 有 的 国 家 采 用 探 针 法 或 PCR 法 测 定 细 胞 基 质 中 的 特 定 潜 在 病 毒, 因 我 国 尚 未 开 展 该 方 面 的 检 测 及 方 法 学 认 证, 所 以 本 文 仅 对 新 细 胞 系 / 株 提 出 16

相 关 要 求 有 关 Vero 细 胞 的 使 用 代 次 问 题,WHO 推 荐 134~150 代, 认 为 在 该 代 次 内 未 发 现 致 肿 瘤 性 国 外 疫 苗 生 产 企 业 通 常 将 Vero 细 胞 的 使 用 代 次 限 定 在 150 代 之 内, 使 用 150 代 或 更 低 代 次 的 Vero 细 胞 生 产 疫 苗, 相 对 降 低 了 Vero 细 胞 致 肿 瘤 性 的 潜 在 风 险 关 于 Vero 细 胞 残 余 DNA 问 题, 目 前 认 为 Vero 细 胞 残 余 DNA 的 潜 在 危 害 除 了 与 残 余 DNA 含 量 的 多 少 有 关 外, 还 与 残 余 DNA 片 断 的 大 小 有 关, 残 余 DNA 含 量 越 高 片 断 越 大, 其 潜 在 的 致 肿 瘤 性 越 大 因 此, 强 化 纯 化 工 艺 是 尽 量 降 低 残 余 DNA 含 量 的 有 效 措 施 ; 此 外, 研 究 并 建 立 检 测 Vero 细 胞 残 余 DNA 片 断 大 小 的 方 法, 可 为 今 后 制 定 相 关 质 量 控 制 标 准 奠 定 基 础 关 于 Vero 细 胞 残 余 DNA 含 量 的 要 求, 不 同 国 家 和 地 区 有 所 不 同, 美 国 FDA 要 求 10pg/ 剂 量, 欧 盟 EMEA 要 求 100pg/ 剂 量, 我 国 要 求 100pg/ 剂 量,WHO 要 求 10ng/ 剂 量 此 外, 我 国 已 开 始 研 制 采 用 Vero 细 胞 生 产 的 脊 髓 灰 质 炎 灭 活 ( 纯 化 ) 疫 苗 和 乙 型 脑 炎 纯 化 疫 苗, 这 些 疫 苗 是 实 施 计 划 免 疫 的 产 品, 用 于 婴 幼 儿 的 免 疫 接 种, 因 此 对 其 质 量 要 求 应 相 对 严 格, 需 考 虑 Vero 细 胞 DNA 残 余 量 10pg/ 剂 量 的 标 准 17