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方 法 提 取 方 法 A, 非 衍 生 化 :9 取 0.1% 的 蚁 酸 溶 液 7 ml,2000 ng/ml 的 13C3- 丙 稀 酰 胺 溶 液 100 μl(cambridge Isotope Laborato - ries, Inc, Andover, MA) 和 1 g 粉 碎 的 食 物 样 品 加 入 腕 振 器 中 混 合 20 min 对 样 品 进 行 离 心 处 理, 除 去 油 层, 转 移 上 层 溶 液 到 另 一 试 管 在 抽 取 之 前, 如 果 样 品 有 明 显 的 浑 浊, 使 用 0.45 μ m Ionization Mode Component EI+SIM NCI SIM PCI SIM Acrylamide 71,55,44 70 13 C3-acrylamide 74,58 73 2-bromo-propenamide 167,169 2-bromo- 13 C3-propenamide 170,172 尼 龙 注 射 过 滤 器 (Restek Corp, Bellefonte, PA) 过 滤 将 丙 稀 酰 表 1: SIM 的 扫 描 质 量 和 离 子 化 模 式 胺 (Cambridge Isotope Laboratories, Inc) 溶 解 在 7 ml 0.1% 蚁 酸 溶 液 中 做 成 浓 度 为 5-500 ppb 的 梯 度 标 准 溶 液, 然 后 将 100 μl13 C3- 丙 稀 酰 胺 溶 液 加 入 到 每 个 标 准 溶 液 中 依 次 用 2 ml 甲 醇,2 ml 0.1% 的 蚁 酸 活 化 固 相 萃 取 小 柱 CarboPrepTM 200 cartridges (Restek Corp.), 在 重 力 作 用 下, 上 样 并 提 取 样 品 仪 器 方 法 使 用 PTV 进 样 口 在 不 分 流 模 式 下 设 置 TRACE DSQ 质 谱 仪 和 TRACE GC Ultra 气 相 ( 图 2), 利 用 程 序 转 移, 蒸 发 和 清 洁 系 统, 不 分 流 持 续 0.3 分 钟 炉 温 程 序 从 40 开 始 以 30 /min 梯 度 到 向 固 相 小 柱 中 加 入 500 μl 水, 然 后 固 相 小 柱 在 高 真 空 下 抽 5 min, 用 1 ml 丙 酮 在 重 力 作 用 下 洗 脱 样 品, 洗 脱 液 转 移 到 自 动 220 选 择 15 m x 0.25 mm i.d. x 0.25 Stabilwax TM bond Carbowax 柱 子 (Restek Corp) 作 为 分 析 柱 Cross- 进 样 瓶 中, 用 TRACE DSQ 质 谱 仪 在 EI SIM 和 NCI SIM 模 式 下 分 析, 用 甲 烷 作 为 反 应 气 提 取 方 法 B, 溴 化 处 理 :101 g 未 知 样 品 和 100 μ L 13 C3- 丙 稀 酰 胺 溶 液 (2000 ng/ml) 混 合 在 10 ml 水 中 标 准 品 同 样 也 溶 解 在 水 中,100 ul 内 标 物 质 添 加 到 每 个 标 准 溶 液 中 样 品 混 合 20 min 后, 离 心 上 层 溶 液 用 0.45 μm 的 尼 龙 注 射 过 滤 器 过 滤 在 EI, NCI, 和 PCI 分 析 模 式 下 建 立 TRACE DSQ 质 谱 分 析 方 法 EI, PCI 和 NCI 下 的 选 择 离 子 模 式 列 于 表 1 中 甲 烷 和 氨 气 作 为 反 应 气 每 个 方 法 中 反 应 气 的 流 速 都 是 2.0 ml/min TRACE DSQ 质 谱 仪 在 EI 模 式 下 调 谐, 由 于 丙 稀 酰 胺 分 子 有 很 低 的 质 核 比 (m/z), 所 以 降 低 预 四 极 杆 的 电 压 来 提 高 低 质 量 基 团 灵 敏 度 TRACE DSQ 仪 器 方 法 在 表 2 中 详 细 描 述 200-300 μl 溴 代 衍 生 化 试 剂 添 加 到 3 ml 过 滤 后 的 样 品 和 标 准 溶 液 中, 轻 轻 混 合, 然 后 在 冰 域 中 反 应 1 小 时 滴 一 滴 1.0 N 硫 代 硫 酸 钠 到 每 个 样 品 中 用 于 分 解 剩 余 的 溴 用 2ml 乙 酸 乙 酯 提 取 样 品 然 后 离 心 10 min 有 机 层 转 移 到 自 动 进 样 瓶 中 做 分 析 按 照 这 个 方 法 丙 稀 酰 胺 溴 化 产 生 2,3-dibromopropionamide 分 析 更 加 稳 定 的 2-bromopropenamide, 它 在 进 样 口 热 分 解 产 生, 使 用 氨 气 作 为 反 应 气 提 供 用 来 作 PCI SIM 方 法 的 稳 定 的 合 成 离 子 结 果 TRACE DSQ 质 谱 仪 在 分 析 食 品 中 丙 稀 酰 胺 方 面 是 很 有 价 值 的 工 具 缘 于 它 的 适 应 性 在 EI S IM 模 式 下, 丙 稀 酰 胺 单 体 的 线 性 范 围 在 5-500 ppb 当 甲 烷 作 为 反 应 气 时 NCI 的 线 性 范 围 为 2-500 ppb 在 PCI 模 式 下 分 析 2-bromopropenamide 的 线 性 范 围 为 5-1000 ppb Mode EI SIM Setting Electron Energy: 70 ev NCI SIM Electron Energy: 70 ev PCI SIM Electron Lens: 10 V Electron Energy: 120 ev 图 2: 带 有 真 空 连 锁 和 PTV 进 样 口 的 Finnigan TRACE DSQ 质 谱 仪 和 TRACE GC Ultra 气 相 表 2: TRACE DSQ 仪 器 参 数 Electron Lens: 10 V 46
简 易 的 固 相 萃 取 消 除 了 最 后 的 浓 缩 干 燥 步 骤, 为 EI SIM. 模 式 提 供 了 高 效 率 的 样 品 制 备 过 程 使 用 3 离 子 的 SIM 方 法 进 行 确 认, 在 5-500 ppb 浓 度 范 围 内 线 性 相 关 系 数 为 0.9992( 图 3) 运 行 时 间 大 约 是 7 分 钟 这 个 方 法 为 迅 速 测 定 食 品 中 丙 稀 酰 胺 单 体, 提 供 了 良 好 的 灵 敏 度 和 工 作 效 率 然 而, 由 于 在 可 用 质 量 范 围 内 可 能 存 在 干 扰 离 子, 化 学 电 离 方 法 也 被 进 行 了 评 估 以 提 高 该 方 法 的 应 用 性 反 应 气 的 选 择 取 决 于 实 用 性 和 亲 和 力 用 甲 烷 做 反 应 气 的 NCI 模 式 提 供 了 2ppb 的 灵 敏 度 在 2-500 ppb 浓 度 范 围 内 线 性 相 关 系 数 为 0.9993( 图 4) NCI SIM 模 式 能 够 消 除 EI SIM 模 式 下 存 在 的 化 学 干 扰, 如 图 5 图 5 中 上 面 的 谱 线 是 NCI 模 式 下 m/z 70 离 子 的 谱 图, 较 低 一 点 的 谱 线 是 EI SIM 模 式 下 m/z 55 离 子 的 谱 图 在 这 个 实 例 中 没 有 衍 生 化 的 马 铃 薯 碎 片 作 为 样 品 在 NCI 模 式 下 使 用 氨 气 作 为 反 应 气 分 析 溴 化 样 品 产 生 的 质 谱 图 始 终 与 单 质 溴 相 同, 此 中 离 子 化 技 术 没 有 用 来 做 溴 化 样 品 然 而, 在 P C I 模 式 下 使 用 氨 气 分 析 丙 稀 酰 胺 形 成 的 2-bromopropenamide, 会 得 到 两 个 主 要 加 合 物 离 子 的 信 息, m/z 167 和 169 为 没 有 标 记 的 化 合 物 形 成 的,170 和 172 是 标 记 13 C 化 合 物 形 成 的 使 用 这 些 基 团 建 立 方 法, 在 PCI 模 式 下 5-1000 ppb 浓 度 做 校 准 曲 线, 相 关 系 数 为 0.9998 ( 图 6) 图 7 为 5 ppb 标 准 溶 液 m/z 167 和 169 提 取 离 子 色 谱 图 的 重 叠 图 DSQ 质 谱 仪 允 许 用 户 通 过 使 用 适 当 的 自 动 调 谐, 自 动 优 化 PCI 和 NCI 模 式 下 的 调 谐 参 数 对 于 所 有 的 分 析, 质 谱 仪 上 预 四 极 杆 的 设 置 要 比 调 谐 结 果 低 一 些, 从 而 优 化 低 质 量 离 子 的 灵 敏 度 在 PCI 和 NCI 模 式 下 反 应 气 流 速 设 定 为 2.0 ml/min 使 用 数 字 流 量 控 制 器 控 制 化 学 反 应 气 流 速 确 保 流 量 精 确, 定 量 精 确 以 及 每 天 都 有 良 好 的 重 复 性 47
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实 验 化 学 品 和 试 剂 : 丙 稀 酰 胺 (>99.0%) 购 买 于 Fluka(Buchs SG, 瑞 士 ) 氘 代 丙 稀 酰 胺 2,3,3-d3-acrylamide (98%) 购 自 剑 桥 同 位 素 实 验 室 (Andover, 麻 萨 诸 塞 州, 美 国 ) 色 谱 级 水 购 自 于 Burdick and Jackson(Muskegon, 密 歇 根, 美 国 ) 所 有 化 学 品 都 直 接 使 用 而 没 有 进 一 步 纯 化 样 品 制 备 标 准 溶 液 配 制 : 用 水 稀 释 丙 稀 酰 胺 氘 代 丙 稀 酰 胺 标 准 品, 得 到 浓 度 分 别 为 1.0mg/mL 1.0mg/mL 储 备 液 储 备 液 储 存 4, 不 超 过 二 星 期 购 买 两 种 品 牌 薯 条 和 两 种 品 牌 早 餐 谷 物 食 品, 在 室 温 下 储 藏, 直 至 拿 来 处 理 分 析 匀 浆 大 约 50g 食 物, 称 量 2 克 匀 浆 食 物 放 入 到 35mL 的 聚 丙 烯 离 心 管 中, 向 离 心 管 内 加 入 20mL 水 和 1000ng 氘 代 丙 稀 酰 胺 ( 内 标 终 浓 度 为 50ng/ml), 萃 取 丙 稀 酰 胺 样 品 涡 旋 30 秒 后,18000g 下 离 心 15min 将 10mL 上 清 夜 移 至 干 净 35mL 离 心 管 内 后,18000g 下 离 心 10 分 钟 用 0.45μm 膜 (Millipore 公 司, 贝 尔 福 德 Bedford, 马 萨 诸 塞 州, 美 国 ) 过 滤 0.49mL 的 提 取 液,9000g 下 离 心 5min, 进 样 分 析 碰 撞 能 量 : 13 ev 扫 描 宽 度 : 1.0 u 扫 描 时 间 : 0.3 s ( 每 个 SRM) Q1,Q3 分 辨 率 : 单 位 分 辨 率 (0.7 μfwhm) 结 果 和 讨 论 丙 稀 酰 胺 标 准 品 数 据 采 集 之 前, 确 认 系 统 是 否 存 在 任 何 可 检 出 的 来 自 于 内 标 重 氢 交 换 而 成 的 丙 稀 酰 胺, 是 很 重 要 的 如 图 1 所 示, 在 浓 度 50ng/m L 的 氘 代 丙 稀 酰 胺 的 保 留 时 间, 没 有 观 察 到 丙 稀 酰 胺 m/z 72 55 SRM 迁 移 Finnigan TSQ Quantum Discovery 质 谱 测 定 丙 稀 酰 胺 的 LOQ 是 0.25ng/mL, 等 同 于 上 样 量 2.5pg( 图 2) 与 其 它 研 究 组 先 前 报 道 的 检 测 限 相 比, 使 用 LC/APCI-MS/MS 的 检 测 下 限, 比 LC/ ESI-MS/MS 提 高 8 倍 (20pg) 1, 比 TSQ7000 提 高 40 倍 (10ng/ ml) 5 样 品 分 析 液 相 试 验 使 用 Finnigan Surveyor 液 相 色 谱 系 统 ( 赛 默 飞 世 尔 科 技, 圣 何 塞, 加 利 福 尼 亚, 美 国 ) 色 谱 柱 为 Hypercarb 2.1 50 mm( 赛 默 飞 世 尔 科 技,Bellafonte, 宾 西 法 尼 亚 州, 美 国 ) 丙 稀 酰 胺 分 离 采 用 等 梯 度 洗 脱,100% 水 作 为 流 动 相, 流 速 0.4 ml/min 进 样 体 积 均 为 10uL 为 避 免 采 用 固 相 萃 取 技 术 纯 化 食 物 样 品, 而 采 用 了 柱 切 换 液 相 色 谱 技 术 简 单 讲, 将 提 取 的 样 品 注 射 到 位 于 六 通 阀 前 的 2.1 50 mm Aquasil C18 色 谱 柱 上 ( 赛 默 飞 世 尔 科 技,Bellafonte, 宾 西 法 尼 亚 州, 美 国 ) 该 C18 柱 的 流 出 物 被 切 换 到 废 液, 丙 稀 酰 胺 从 该 C18 柱 流 出 的 时 间 段 内 不 被 切 换, 进 入 Hypercarb 色 谱 柱, 进 行 MS/MS 检 测 柱 切 换 技 术 需 要 第 二 个 Finnigan Surveyor MS 泵, 这 个 泵 能 在 0.4mL/min 流 速 下 传 输 100% 水 相 Finnigan Surveyor 质 谱 泵 和 六 通 阀 都 被 Xcalibur 1.3 版 软 件 控 制 图 1. 50 ng/ml 氘 代 丙 稀 酰 胺 (d3-acrylamide)srm 色 谱 图 Finnigan TSQ Quantum Discovery 质 谱 仪 ( 赛 默 飞 世 尔 科 技, 生 赫 斯, 加 利 福 尼 亚, 美 国 ) 实 验 条 件 如 下 : 离 子 源 : APCI 离 子 化 模 式 : 正 喷 雾 器 温 度 : 375 电 荷 电 流 : 5 μa 离 子 传 输 管 温 度 : 250 源 内 CID: 6 V 扫 描 模 式 : 选 择 反 应 监 测 Q2 压 力 : 1.0 mtorr 氩 气 SRM 迁 移 : 丙 稀 酰 胺 m/z 72 55 氘 代 丙 稀 酰 胺 m/z 75 58 50
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