骨 有 明 訊 肌 動 蛋 白 絲 與 細 胞 形 態 關 係 之 研 究 科 別 : 生 物 科 第 48 屆 科 學 展 覽 北 二 區 佳 作 作 者 : 呂 苹 瑋 范 競 勻 指 導 老 師 : 陳 季 瑄 老 師
壹 摘 要 本 研 究 以 人 類 的 子 宮 頸 癌 細 胞 (HeLa cell) 為 細 胞 骨 架 的 觀 察 對 象, 經 過 培 養 與 繼 代, 利 用 免 疫 螢 光 染 色, 以 山 羊 的 肌 動 蛋 白 絲 抗 體 (Goat anti-β-actin antibody) 偵 測 骨 架,4',6 - 二 脒 基 -2- 苯 基 吲 哚 (4',6-diamidino-2-phenylindole) 偵 測 細 胞 核 經 一 系 列 的 探 討 後, 發 現 當 細 胞 與 細 胞 間 密 度 越 高 時, 肌 動 蛋 白 絲 越 短 越 鬆 且 方 向 一 致 性 低, 我 們 推 測 極 有 可 能 是 因 為 伸 展 空 間 受 限 所 致, 密 度 低 則 反 之 另 外, 我 們 也 研 究 細 胞 有 絲 分 裂 (M phase) 到 不 同 階 段 時, 細 胞 形 狀 的 變 化 及 其 骨 架 的 關 係, 我 們 除 了 發 現 到 肌 動 蛋 白 絲 在 細 胞 分 裂 時, 會 較 分 裂 前 後 更 密 更 錯 綜 複 雜 之 外, 我 們 更 探 討 細 胞 核 內 在 分 裂 時 會 出 現 綠 色 點 狀 螢 光, 違 反 肌 動 蛋 白 絲 抗 體 的 專 一 性 貳 研 究 動 機 高 一 下 學 期 的 生 物 課, 同 學 間 在 做 書 報 討 論 時 有 聊 到 在 不 同 細 胞 週 期 時, 細 胞 形 態 會 有 變 化, 於 是 我 們 想 知 道, 在 分 裂 期 時 細 胞 要 如 何 利 用 骨 架 完 成 分 裂 又 同 時 要 維 持 細 胞 的 穩 定 性 此 外, 我 們 也 對 細 胞 的 形 狀 和 其 骨 架 變 化 的 關 係 十 分 感 興 趣 再 者, 生 物 界 存 在 各 種 形 狀 的 細 胞, 例 如 : 長 條 分 節 的 肌 肉 細 胞 扁 平 的 表 皮 細 胞 神 經 細 胞 雙 凹 圓 盤 狀 的 紅 血 球 細 胞 柱 狀 細 胞.. 除 了 部 分 原 因 是 為 了 適 應 環 境 及 發 揮 其 功 能 外, 細 胞 的 形 狀 想 必 也 跟 細 胞 骨 架 有 密 切 關 聯, 在 詢 問 老 師 後, 以 普 遍 利 用 的 HeLa cell 為 研 究 對 象, 並 開 始 著 手 構 思 在 閱 讀 科 學 期 刊 時, 我 們 得 知 骨 架 分 為 微 質 管 中 間 絲 與 肌 動 蛋 白 絲 三 種, 經 由 查 詢 資 料 後 發 現, 微 質 管 已 有 許 多 相 關 研 究 及 豐 富 的 資 料, 所 以 我 們 決 定 以 相 同 方 法 觀 察 較 少 人 探 討 的 肌 動 蛋 白 絲, 期 待 能 有 所 突 破 肌 動 蛋 白 絲 中 間 絲 197
微 質 管 參 研 究 目 的 實 驗 一 : 了 解 細 胞 間 疏 密 程 度 與 細 胞 骨 架 的 關 係 實 驗 二 : 細 胞 有 絲 分 裂 到 各 期 形 態 與 細 胞 骨 架 的 關 係 肆 研 究 器 材 與 材 料 1. 海 拉 細 胞 2. 培 養 皿 3. P-1000,P-200,P-20 的 微 量 吸 管 ( 分 注 器 ) 4. 1.5 ml 的 微 量 管 5. 蓋 玻 片 與 載 玻 片 6. 螢 光 顯 微 鏡 7. 1X PBS 緩 衝 液,pH 7.4 8. PBST 緩 衝 液 (1X PBS 加 0.05%Tween-20) 9. 非 離 子 界 面 活 性 劑 (triton X-100), 用 PBS 作 為 溶 劑 10. 4% 的 福 馬 林, 用 PBS 作 為 溶 劑 螢 光 顯 微 鏡 11. 安 佳 脫 脂 奶 粉 12. 山 羊 的 肌 動 蛋 白 絲 一 級 抗 體 (Goat anti-β-actin antibody 以 下 簡 稱 一 級 抗 體 ) 13. 驢 子 的 肌 動 蛋 白 絲 二 級 抗 體 (Fluorescein-conjugated anti-donkey IgG 及 Rhdamine Red 以 下 簡 稱 二 級 抗 體 ) 14. 4',6- 二 脒 基 -2- 苯 基 吲 哚 (4',6-diamidino-2-phenylindole 簡 稱 DAPI) 15. Mounting Solution( 甘 油 加 水 或 加 PBS 緩 衝 液 ) 16. Immersion( 油 鏡 ) 198
伍 研 究 過 程 與 方 法 一 細 胞 的 繼 代 與 保 存 ( 一 ) 細 胞 之 繼 代 細 胞 培 養 3~4 天 左 右, 可 將 細 胞 株 或 初 代 細 胞 繼 代 (passage) 培 養 1. 將 細 胞 培 養 液 移 去 後, 以 PBS 緩 衝 液 洗 細 胞 面, 再 將 PBS 緩 衝 液 倒 去 2. 加 入 少 許 之 TV 溶 液 ( 以 能 覆 蓋 細 胞 面 為 原 則 ) 在 37 作 用 數 分 鐘 單 層 的 細 胞 將 會 逐 漸 變 成 單 一 細 胞, 然 後 從 培 養 角 瓶 脫 落 3. 取 細 胞 培 養 液 於 800rpm 離 心 10 分 鐘 然 後 將 細 胞 消 化 液 倒 掉, 再 將 細 胞 懸 浮 於 培 養 基 內, 置 於 37 培 養 ( 二 ) 細 胞 之 保 存 與 解 凍 1. 取 培 養 兩 天 左 右 之 細 胞, 以 蛋 白 酶 將 單 層 細 胞 消 化 為 單 一 細 胞 後, 將 細 胞 懸 浮 於 細 胞 保 存 液 (90% 胎 牛 血 清 及 10%DMSO) 然 後 將 細 胞 液 分 裝 於 1.5ml 的 微 量 離 心 管, 並 置 於 保 麗 龍 內, 以 紗 布 包 裹, 隨 後 置 於 -70 過 夜 再 將 細 胞 移 入 -196 液 態 氮 保 存 2. 若 要 解 凍 細 胞, 可 將 細 胞 從 液 態 氮 桶 取 出, 並 迅 速 置 於 37 之 水 浴 內, 使 其 迅 速 解 凍, 隨 後 離 心 將 DMSO 移 去, 再 將 細 胞 懸 浮 於 培 養 基 內, 於 37 培 養 箱 培 養 二 細 胞 免 疫 螢 光 染 色 1. 將 培 養 在 蓋 玻 片 上 的 細 胞, 置 於 35mm 的 培 養 皿 2. 吸 去 培 養 液, 加 入 PBS 緩 衝 液 清 洗 ( 照 片 一 ) 3. 吸 去 福 馬 林, 加 入 PBS 緩 衝 液 清 洗 4. 用 非 離 子 界 面 活 性 劑 打 洞, 靜 置 10 分 鐘 5. 吸 去 非 離 子 界 面 活 性 劑, 加 入 PBS 緩 衝 液 清 洗 6. 加 入 酪 蛋 白, 靜 置 約 一 小 時 ( 亦 可 置 於 4 冰 箱 放 隔 夜 ) 7. 吸 去 酪 蛋 白, 加 入 PBST 緩 衝 液 清 洗 ( 照 片 二 ) 8. 吸 去 PBST 緩 衝 液, 加 入 一 級 抗 體 ( 與 PBS 稀 釋 成 1:4) 成 表 面 張 力, 靜 置 3 小 時 ( 可 放 隔 夜 ) ( 照 片 三 ) 9. 吸 去 一 級 抗 體 加 入 PBST 緩 衝 液 清 洗 三 次 各 20 分 鐘 10. 加 入 二 級 抗 體 ( 與 PBS 緩 衝 液 稀 釋 成 1:20), 靜 置 半 小 時 ( 照 片 四 ) 11. 吸 去 二 級 抗 體 ( 可 回 收 ), 加 入 PBST 清 洗 三 次, 每 次 40 分 鐘 越 久 越 好 12. 吸 去 PBST 緩 衝 液, 加 入 DAPI( 與 PBS 稀 釋 成 1:1) 在 蓋 玻 片 上 形 成 表 面 張 力, 靜 置 半 小 時 13. 吸 去 DAPI, 加 入 PBST 緩 衝 液 清 洗 14. 吸 去 PBST 緩 衝 液, 加 入 去 離 子 水 ( 立 即 吸 出 ), 重 複 2 次 15. 在 載 玻 片 上 滴 一 滴 Mounting Solution 將 蓋 玻 片 緩 慢 反 蓋 上 照 片 五 16. 吸 去 玻 片 邊 緣 多 餘 之 Mounting Solution 並 在 蓋 玻 片 四 周 塗 上 指 甲 油 封 片 照 片 六 * 補 充 說 明 : 1. 所 有 實 驗 步 驟 皆 在 室 溫 完 成 199
2. 清 洗 若 無 註 明, 則 皆 是 三 次, 每 次 間 隔 10 分 鐘 3. 加 入 的 溶 液 皆 須 漫 過 整 個 蓋 玻 片 4. 酪 蛋 白 來 自 安 佳 脫 脂 奶 粉, 並 用 PBS 作 為 溶 劑, 調 成 5%, 代 替 小 牛 血 清 蛋 白 (BSA) 5. 一 級 抗 體 若 要 放 隔 夜 需 覆 蓋 過 整 個 培 養 皿, 且 濃 度 要 較 高 6. 其 中 實 驗 一 因 不 需 觀 察 細 胞 核, 故 可 跳 過 步 驟 12 13 照 片 一 : 吸 去 培 養 液 照 片 二 :Blocking 照 片 三 : 一 級 抗 體 做 表 面 張 力 照 片 四 : 二 級 抗 體 做 表 面 張 力 照 片 五 : 滴 Mounting Solution 並 蓋 蓋 玻 片 照 片 六 : 以 指 甲 油 封 片 200
陸 步 驟 原 理 說 明 原 理 一 : 肌 動 蛋 白 絲 的 螢 光 染 色 間 接 免 疫 螢 光 抗 體 (IndirectImmunofluorescence) 先 用 一 級 抗 體 去 跟 抗 原 結 合, 再 用 標 有 螢 光 物 質 的 抗 體 ( 二 級 抗 體 ) 去 偵 測 一 級 抗 體 而 因 為 抗 原 與 一 級 抗 體 結 合 後 再 用 二 級 抗 體 去 偵 測 時, 一 個 ( 抗 原 - 一 級 抗 體 ) 複 合 物 可 能 與 兩 個 以 上 標 有 螢 光 物 質 的 二 級 抗 體 結 合, 便 因 此 使 螢 光 反 應 放 大, 就 是 所 謂 的 訊 息 放 大 反 應 以 牛 奶 ( 或 血 清 ) 覆 蓋 住 triton 所 產 生 的 雜 質, 即 抑 制 非 特 異 性 物 質 的 結 合 方 法 一 : 細 胞 膜 的 打 洞 Triton X-100 Triton X-100 細 胞 膜 雜 質 及 釋 出 的 細 胞 質 以 非 離 子 界 面 活 性 劑 (triton X-100) 洞 穿 細 胞 膜, 使 一 級 抗 體 能 夠 通 過 細 胞 膜 並 偵 測 骨 架 打 洞 後 會 有 胞 內 與 胞 外 的 物 質 進 出, 由 細 胞 釋 出 的 物 質, 會 在 之 後 用 緩 衝 液 清 洗 掉 201
方 法 二 :Blocking 酪 蛋 白 或 小 牛 血 清 蛋 白 (BSA) 抑 制 非 特 異 性 結 合, 如 此 一 級 抗 體 便 可 偵 側 到 肌 動 蛋 白 絲, 帶 有 螢 光 團 的 二 級 抗 體 再 與 一 級 抗 體 結 合, 發 出 螢 光 原 理 二 : 細 胞 核 的 螢 光 染 色 (DAPI 為 染 劑 ) 1. DAPI 兩 端 的 NH2 釋 出 一 個 電 子, 使 其 帶 正 電, 鑲 嵌 在 DNA 雙 股 螺 旋 帶 負 電 的 鹼 基 之 間 2. DNA 雙 股 螺 旋 與 DAPI 結 合, 用 以 偵 測 細 胞 核 ( 右 圖 ) 3. 在 螢 光 顯 微 鏡 觀 察 下,DAPI 染 劑 是 用 紫 外 光 波 長 的 光 線 激 發 當 DAPI 與 雙 股 DNA 結 合 時, 最 大 吸 收 波 長 為 358nm, 最 大 發 射 波 長 為 461nm, 其 發 散 光 的 波 長 範 圍 含 蓋 了 藍 色 至 青 綠 色 DAPI 也 可 以 和 RNA 結 合, 但 產 生 的 螢 光 強 度 不 及 與 DNA 結 合 的 結 果, 其 發 散 光 的 波 長 範 圍 約 在 400nm 左 右 下 圖 是 我 們 用 此 方 法 做 出 的 結 果 : 成 功 的 呈 現 出 綠 色 為 肌 動 蛋 白 絲 所 在 位 置, 藍 色 為 細 胞 核 202
實 驗 一 : 細 胞 間 疏 密 程 度 與 細 胞 骨 架 的 關 係 1. 以 下 先 以 六 張 照 片 說 明 疏 密 不 同 的 細 胞 組, 在 電 腦 不 同 的 處 理 下 所 呈 現 的 情 形 ( 倍 率 60X) 較 疏 組 : 細 胞 數 約 2~5 個 較 密 組 : 細 胞 數 約 55~65 個 ( 一 ) 螢 光 下 的 肌 動 蛋 白 絲 ( 綠 色 ) 螢 光 下 的 肌 動 蛋 白 絲 ( 綠 色 ) ( 二 ) 螢 光 下 的 細 胞 核 ( 藍 色 ) 螢 光 下 的 細 胞 核 ( 藍 色 ) ( 三 ) 沒 有 螢 光 的 細 胞 整 體 沒 有 螢 光 的 細 胞 整 體 203
2. 下 表 為 細 胞 疏 密 度 不 同 的 細 胞 組 其 肌 動 蛋 白 絲 所 呈 現 的 情 形 : 較 疏 組 較 密 組 圖 1-1-1 當 細 胞 形 狀 拉 的 較 長 時, 骨 架 沿 著 細 胞 膜 延 伸 圖 1-1-2 肌 動 蛋 白 絲 呈 交 叉 排 列 圖 1-2-1 在 細 胞 較 疏 的 環 境 下 骨 架 較 長 圖 1-2-2 肌 動 蛋 白 絲 分 佈 較 平 均 圖 1-1-3 肌 動 蛋 白 絲 呈 現 幾 乎 互 相 平 行 204 圖 1-2-3 肌 動 蛋 白 絲 分 佈 無 明 顯 方 向 性
3. 下 表 為 細 胞 間 疏 密 之 比 較 : 細 胞 疏 密 度 比 較 項 目 較 疏 組 較 密 組 1. 一 致 性 較 高 ( 見 圖 1-3-1) 骨 架 方 向 的 一 致 性 2. 接 近 平 行 ( 見 圖 1-3-1) 1. 一 致 性 較 低 ( 見 圖 1-1-2) 2. 錯 綜 複 雜 ( 見 圖 1-2-2) 3. 順 著 細 胞 伸 展 的 方 向 ( 見 圖 1-2-1) 3. 沒 有 明 顯 的 伸 展 方 向 ( 見 圖 1-1-2) 1. 較 長 ( 見 圖 1-3-1) 骨 架 長 短 及 粗 細 2. 粗 細 無 明 顯 相 對 關 係 1. 較 短 ( 見 圖 1-3-2) 2. 粗 細 無 明 顯 相 對 關 係 細 胞 形 狀 可 延 展 較 長, 細 胞 形 狀 較 長 伸 展 空 間 有 限, 細 胞 形 狀 較 圓 骨 架 張 力 因 延 展, 骨 架 線 條 拉 的 較 緊 由 細 胞 膜 邊 緣 可 看 出 鬚 狀 的 骨 架, 線 條 拉 的 較 鬆 實 驗 二 : 細 胞 有 絲 分 裂 各 期 型 態 與 細 胞 骨 架 的 關 係 細 胞 週 期 可 分 為 G1 G2 S M 四 期 G1 為 細 胞 生 長 期 S 為 DNA 複 製 期 G2 為 細 胞 分 裂 準 備 期,M 期 為 細 胞 分 裂 期 下 圖 為 細 胞 週 期 的 螢 光 染 色, 綠 色 藍 色 紅 色 依 序 為 紡 綞 絲 (Spindle microtubule) 染 色 體 (Chromosomes) 及 細 胞 骨 架 (cytoskeleton); 其 中 除 第 一 張 圖 為 G2 期, 餘 皆 為 M 期 中 的 各 期 : 205
M 期 為 本 實 驗 所 觀 察 的 時 期, 即 細 胞 真 正 進 行 有 絲 分 裂 的 時 期 下 為 不 同 分 裂 時 間 點 的 實 驗 照 片 : 圖 3-1 上 圖 皆 為 尚 未 進 行 分 裂 的 兩 顆 細 胞, 可 看 出 細 胞 核 內 沒 有 點 狀 的 螢 光 物 質 下 面 十 張 照 片 從 剛 開 始 進 行 分 裂 到 分 裂 結 束, 可 大 致 描 述 M 期 的 分 裂 情 形 兩 張 為 一 組 ( 左 為 有 染 色 時, 右 為 原 本 之 細 胞, 可 對 照 比 較 各 階 段 細 胞 的 肌 動 蛋 白 絲 與 細 胞 核 的 變 化 ): 1. 圖 3-2-1 分 裂 時 細 胞 核 出 現 被 綠 色 螢 光 標 記 的 物 質 圖 3-2-2 可 清 楚 看 到 兩 個 細 胞 核 206
2. 圖 3-3-1 骨 架 模 糊 無 清 楚 線 條 圖 3-3-2 可 清 楚 看 到 兩 個 細 胞 核 相 連 3. 圖 3-4-1 質 內 骨 架 模 糊 散 亂 圖 3-4-2 核 尚 有 部 分 連 接 207
4. 圖 3-6-1 兩 顆 細 胞 逐 漸 成 形 並 分 離 圖 3-5-2 核 已 完 全 分 開 5. 圖 3-7-1 細 胞 分 裂 末 期, 核 中 已 無 綠 色 點 狀 螢 光 出 現 圖 3-7-2 細 胞 核 已 完 全 分 開 208
捌 討 論 在 實 驗 一, 我 們 觀 察 細 胞 在 疏 密 環 境 不 同 時 細 胞 的 形 態 與 骨 架 的 關 係, 但 是 細 胞 是 如 何 感 受 到 與 其 他 細 胞 之 間 疏 密 度 的 不 同 呢? 我 們 認 為, 細 胞 是 因 為 受 其 他 細 胞 擠 壓 所 致, 所 以 在 細 胞 與 細 胞 間 較 疏 鬆 時, 細 胞 因 為 可 以 盡 量 延 伸, 平 貼 於 培 養 皿 上, 故 整 體 形 狀 較 長, 肌 動 蛋 白 絲 也 拉 的 較 長, 同 時 也 較 緊 繃, 彼 此 呈 現 平 行 之 關 係 而 細 胞 在 較 緊 密 的 環 境 下, 因 為 無 空 間 可 伸 展, 所 以 骨 架 較 短, 且 拉 的 較 鬆, 骨 架 有 交 錯 排 列 的 情 形 驗 證 細 胞 形 狀 的 伸 縮 與 肌 動 蛋 白 絲 的 控 制 有 密 切 關 係 在 實 驗 二, 我 們 觀 察 細 胞 在 M 期 的 分 裂 情 形 與 骨 架 變 化 之 關 係 實 驗 結 果 發 現, 在 細 胞 分 裂 時, 原 本 線 條 清 楚 的 骨 架 此 時 變 得 模 糊, 在 細 胞 膜 邊 緣 呈 現 散 亂 的 分 布, 此 外, 細 胞 核 中 出 現 點 狀 的 螢 光, 到 了 分 裂 完 成 時, 核 中 的 點 狀 螢 光 消 失, 而 骨 架 也 重 新 出 現 就 一 般 認 知 而 言, 骨 架 的 位 置 是 在 細 胞 核 至 胞 膜 之 間, 與 肌 動 蛋 白 絲 特 異 性 結 合 的 抗 體 不 應 該 會 偵 測 到 其 他 物 質, 為 此 奇 特 現 象, 我 們 做 了 以 下 天 馬 行 空 的 推 測, 探 討 核 中 物 質 的 出 現 原 因 : 1. 分 裂 時 細 胞 的 不 穩 定, 使 核 內 某 種 物 質 也 一 併 被 激 發, 表 現 出 螢 光 2. 分 裂 時, 核 膜 的 通 透 性 大 量 增 加, 少 部 份 接 在 二 抗 上 的 螢 光 團 破 碎 並 經 由 沒 有 專 一 性 的 孔 道 進 入 核 內 3. 分 裂 時 細 胞 的 不 穩 定, 使 因 變 化 而 散 亂 的 骨 架, 帶 著 一 級 抗 體 二 級 抗 體 及 螢 光 團 一 併 進 入 核 內 4. 就 我 們 拍 出 的 照 片 而 言, 取 樣 了 五 十 幾 盤 細 胞, 卻 很 難 找 到 剛 好 分 裂 到 一 半 的 細 胞, 可 見 細 胞 的 分 裂 速 度 非 常 快, 所 以 我 們 的 實 驗 結 果 照 片 才 會 多 偏 重 在 快 要 分 裂 及 剛 分 裂 完 這 部 份 5. 核 內 可 能 存 在 肌 動 蛋 白 絲, 在 分 裂 時 為 了 維 持 形 狀 的 穩 定 性, 會 從 原 本 的 游 離 奘 聚 合 成 明 顯 的 骨 架, 以 便 控 制 細 胞 核 的 分 裂, 所 以 才 有 M 期 出 現 被 螢 光 標 記 的 物 質 玖 結 論 1. 細 胞 與 細 胞 間 密 度 越 低, 其 肌 動 蛋 白 絲 越 長 方 向 性 越 一 致, 鮮 少 交 錯, 且 明 顯 地 順 著 細 胞 伸 展 方 向, 密 度 越 高 則 反 之 2. 細 胞 在 分 裂 時 的 肌 動 蛋 白 絲, 較 分 裂 前 更 為 密 集, 直 到 分 裂 後 才 又 出 現 和 原 來 一 樣 明 顯 的 絲 狀 3. 一 般 在 生 長 期 之 細 胞, 核 內 不 會 有 綠 色 螢 光 ( 對 肌 動 蛋 白 絲 有 高 度 專 一 性 ), 但 在 細 胞 分 裂 時, 核 內 出 現 被 標 記 螢 光 之 物 質, 且 持 續 至 兩 個 細 胞 核 完 全 分 離 拾 感 想 與 未 來 展 望 這 次 能 夠 完 成 這 項 研 究 首 先 特 別 感 謝 師 長 及 學 姊 學 長 們, 在 這 一 年 多 來, 不 論 是 實 驗 操 作 上 的 指 導, 或 是 理 論 的 基 本 概 念 解 說, 對 我 們 來 說 都 是 很 大 的 收 穫 與 難 得 的 經 驗 再 者, 也 要 感 謝 有 這 次 專 題 研 究 的 機 會, 從 一 開 始 的 靈 感 激 發 蒐 集 資 料, 到 開 始 著 手 進 行 研 究, 這 中 間 的 過 程 是 我 們 最 珍 惜 的, 不 僅 學 到 了 許 多 學 術 上 的 知 識, 也 學 會 如 何 對 一 件 事 思 考 209
提 出 問 題 與 想 法 更 學 會 與 他 人 溝 通 交 換 彼 此 意 見, 相 信 在 不 久 後 的 將 來, 在 接 觸 學 問 的 研 究 身 處 群 體 生 活 勇 於 提 出 自 己 的 想 法 和 接 納 他 人 的 意 見 皆 有 相 當 大 的 幫 助 此 外, 也 要 感 謝 自 然 科 教 師 長 期 以 來 的 指 教 與 陪 伴, 在 我 們 遇 到 困 難 時, 恰 如 其 分 地 給 予 懇 切 的 建 議, 並 和 我 們 討 論 實 驗 的 內 容, 提 醒 我 們 一 些 需 要 改 進 的 地 方 當 然 還 有 傳 授 親 身 經 驗 的 學 姊 不 時 為 我 們 打 氣 的 學 妹 及 互 相 鼓 勵 一 同 奮 鬥 的 同 學 們 這 次 的 實 驗 是 暫 時 告 一 段 落, 未 來 我 們 希 望 能 朝 以 下 幾 點 進 一 步 發 展 : 1. 進 一 步 研 究 同 是 細 胞 骨 架 的 中 間 絲 微 質 管 與 細 胞 型 態 的 關 係, 如 此 一 來, 掌 握 到 三 種 骨 架 的 形 態, 可 再 做 疊 合 或 是 分 開 分 析 比 較, 得 到 細 胞 骨 架 與 型 態 更 進 一 步 的 相 對 關 係 2. 生 物 界 存 在 各 種 形 狀 的 細 胞, 例 如 : 長 條 分 節 的 肌 肉 細 胞 扁 平 的 表 皮 細 胞 神 經 細 胞 雙 凹 圓 盤 狀 的 紅 血 球 細 胞 柱 狀 細 胞.. 除 了 部 分 原 因 是 為 了 適 應 環 境 及 發 揮 其 功 能 外, 細 胞 的 形 狀 想 必 也 跟 細 胞 骨 架 有 密 切 關 聯, 更 深 入 針 對 各 種 不 同 形 狀 的 細 胞, 以 相 同 的 免 疫 螢 光 染 色 方 法, 探 討 與 其 骨 架 的 關 係, 並 比 較 之 3. 利 用 縱 向 切 片, 在 電 腦 上 組 合 成 一 個 立 體 結 構 的 細 胞, 藉 以 研 究 細 胞 在 分 裂 時 期 與 其 骨 架 的 變 化, 細 胞 如 何 利 用 骨 架 的 變 化 維 持 穩 定 性 及 進 行 分 裂, 立 體 結 構 比 平 面 更 為 精 準 可 信 4. 以 特 定 的 無 毒 螢 光 染 劑, 擴 散 通 過 細 胞 膜, 再 利 用 細 胞 之 粒 線 體 激 發 螢 光, 即 可 在 螢 光 顯 微 鏡 下 觀 察 立 體 動 態 的 細 胞 分 裂 情 形 與 骨 架 的 運 動 關 係 5. 以 破 壞 骨 架, 來 摧 毀 細 胞, 在 藥 學 上 已 運 用 廣 泛 ( 如 Vincristine), 除 了 病 變 的 細 胞 外, 能 否 也 應 用 在 病 毒 上, 值 得 研 究 6. 應 激 纖 維 (Stress Fiber) 由 肌 動 蛋 白 絲 構 成, 目 的 在 於 與 細 胞 膜 接 合, 穩 定 聚 焦 接 觸 點 ( 下 圖 之 紅 點 ), 以 便 細 胞 黏 貼 在 物 體 表 面 可 做 免 疫 螢 光 染 色 進 一 步 觀 察 該 點 7. 利 用 同 步 化 使 所 有 培 養 皿 上 的 細 胞 週 期 同 時 進 行, 假 定 共 10 盤 細 胞, 培 養 在 培 養 皿 上 後, 每 兩 小 時 拿 出 一 盤 培 養 皿 做 免 疫 螢 光 染 色, 便 可 更 精 確 的 鎖 定 分 裂 週 期, 拍 到 細 胞 核 與 細 胞 核 分 裂 到 一 半 的 照 片, 也 能 一 次 做 更 大 量 的 取 樣, 以 利 比 較 210
拾 參 考 資 料 及 其 他 一 書 籍 : 1. Campbell 李 家 維 等 編 譯 (2001) 生 物 學 偉 明 圖 書 出 版 2. 林 榮 培 楊 揚 輝 螢 光 顯 微 鏡 檢 查 法 行 政 院 農 業 委 員 會 家 畜 試 驗 所 3. 魏 保 生 主 編 細 胞 和 分 子 生 物 學 科 學 出 版 社 二 網 頁 : 1. 螢 光 顯 微 鏡 下 的 細 胞 http://www.hellouk.org/forum/lofiversion/index.php/t106906.html National Institute for Medical Research 2. 維 基 百 科 www.wikipedia.org 3. http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/biologypages/c/cellcycle.html 211