算 公 式 为 :G = (t 2 t 1 ) log 2 (log W 2 log W 1 ) 式 中 t 1 和 t 2 为 所 取 对 数 期 两 点 时 间,W 1 和 W 2 为 相 应 时 间 测 得 的 细 胞 含 量 或 OD 值 测 定 微 生 物 的 数 量 有 多 种 不 同

测 定 细 菌 生 长 曲 线 生 92 沈 睿 2912372 同 组 成 员 : 徐 鲁 斌 赵 磊 韦 人 杨 丹 灵 实 验 日 期 :211-5-15 一. 实 验 目 的 1. 了 解 细 菌 生 长 曲 线 特 征, 测 定 细 菌 繁 殖 的 代 时 2. 学 习 液 体 培 养 基 的 配 制 及 注 意 事 项 3. 学 习 液 体 种 子 和 固 体 种 子 的 不 同 接 种 方 法 和 注 意 事 项 4. 了 解 不 同 细 菌, 不 同 接 种 方 法 在 同 一 培 养 基 上 生 长 速 度 的 不 同 5. 利 用 细 菌 悬 液 浑 浊 度 间 接 测 定 细 菌 生 长 二. 实 验 原 理 将 少 量 细 菌 接 种 到 一 定 体 积 的 适 合 的 新 鲜 培 养 基 中, 在 适 宜 的 条 件 下 进 行 培 养, 定 时 测 定 培 养 液 中 的 菌 量, 以 总 菌 量 的 对 数 作 纵 坐 标, 生 长 时 间 作 横 坐 标, 绘 制 的 曲 线 叫 生 长 曲 线 它 反 映 了 单 细 胞 微 生 物 在 一 定 环 境 条 件 下 于 液 体 培 养 时 所 表 现 出 的 群 体 生 长 规 律 依 据 其 生 长 速 率 的 不 同, 一 般 可 把 生 长 曲 线 分 为 调 整 期 对 数 期 平 衡 期 和 死 亡 期 而 代 时 则 是 微 生 物 生 长 过 程 中 衡 量 微 生 物 增 值 速 度 的 一 项 重 要 参 数, 可 从 生 长 曲 线 数 据 计 算 得 出 生 长 曲 线 可 表 示 细 菌 从 开 始 生 长 到 死 亡 的 全 过 程 动 态 不 同 微 生 物 有 不 同 的 生 长 曲 线, 同 一 种 微 生 物 在 不 同 的 培 养 条 件 下, 其 生 长 曲 线 也 不 一 样 因 此, 测 定 微 生 物 的 生 长 曲 线 对 于 了 解 和 掌 握 微 生 物 的 生 长 规 律 是 很 有 帮 助 的 1. 调 整 期 细 菌 接 种 到 新 鲜 培 养 基 而 处 于 一 个 新 的 生 长 环 境, 因 此 在 一 段 时 间 里 并 不 马 上 分 裂, 细 菌 的 数 量 维 持 恒 定, 或 增 加 很 少 此 时 胞 内 的 RNA 蛋 白 质 等 物 质 含 量 有 所 增 加, 相 对 地, 此 时 的 细 胞 体 积 最 大, 说 明 细 菌 并 不 是 处 于 完 全 静 止 的 状 态 2. 对 数 期 细 菌 经 过 前 一 段 的 诱 导 适 应 后 进 入 对 数 生 长 期, 并 以 最 大 的 速 率 生 长 和 分 裂, 导 致 细 菌 数 量 呈 对 数 增 加, 而 且 细 菌 内 各 成 分 按 比 例 有 规 律 地 增 加, 很 明 显 此 时 期 内 的 细 菌 生 长 是 平 衡 生 长 对 数 生 长 期 细 菌 的 代 谢 活 性 酶 活 性 高 而 稳 定, 大 小 比 较 一 致, 生 活 力 强, 因 而 它 广 泛 地 在 生 产 上 用 作 种 子 和 在 科 研 上 作 为 理 想 的 实 验 材 料 3. 平 衡 期 当 细 胞 的 繁 殖 速 度 达 到 最 高 峰 时, 其 细 胞 总 数 就 不 会 再 增 加, 由 于 上 两 阶 段 糖 类 营 养 物 质 的 消 耗, 代 谢 产 物 乙 醇 的 积 累 和 ph 氧 化 还 原 电 势 等 环 境 变 化, 逐 步 不 适 宜 于 细 菌 生 长, 导 致 生 长 速 率 降 低 直 至 零 ( 即 细 菌 分 裂 增 加 的 数 量 等 于 细 菌 死 亡 数 ), 结 束 对 数 生 长 期, 进 入 稳 定 生 长 期 稳 定 生 长 期 的 活 细 菌 数 最 高 并 维 持 稳 定 4. 死 亡 期 营 养 物 质 耗 尽 和 有 毒 代 谢 产 物 的 大 量 积 累, 细 菌 死 亡 速 率 逐 步 增 加 和 活 细 菌 逐 步 减 少, 标 志 进 入 衰 亡 期 该 时 期 细 菌 代 谢 活 性 降 低, 细 菌 衰 老 并 出 现 自 溶 该 时 期 死 亡 的 细 菌 以 对 数 方 式 增 加, 但 在 衰 亡 期 的 后 期, 由 于 部 分 细 菌 产 生 抗 性 也 会 使 细 菌 死 亡 的 速 率 降 低 5. 代 时 从 生 长 曲 线 可 以 计 算 出 细 胞 每 分 裂 一 次 所 需 要 的 时 间, 即 代 时, 以 G 表 示 计

算 公 式 为 :G = (t 2 t 1 ) log 2 (log W 2 log W 1 ) 式 中 t 1 和 t 2 为 所 取 对 数 期 两 点 时 间,W 1 和 W 2 为 相 应 时 间 测 得 的 细 胞 含 量 或 OD 值 测 定 微 生 物 的 数 量 有 多 种 不 同 的 方 法, 如 血 细 胞 计 数 法, 平 板 菌 落 计 数 法, 称 重 法 和 比 浊 法 等 本 实 验 采 用 比 浊 法 测 定, 由 于 细 菌 悬 液 的 浓 度 与 光 密 度 (OD6 值 ) 成 正 比, 因 此 可 利 用 分 光 光 度 计 测 定 菌 液 的 光 密 度 来 推 知 菌 液 的 浓 度, 并 将 所 测 的 OD 值 与 其 对 应 的 培 养 时 间 作 图, 即 可 绘 出 该 菌 在 一 定 条 件 下 的 生 长 曲 线, 此 法 快 捷 简 便 三. 实 验 器 材 1. 取 液 器 (5ul, 1ul 各 一 支 ), 培 养 箱, 摇 床,722s 分 光 光 度 计, 无 菌 1ul 吸 头 8 个, 无 菌 5ul 吸 头 2 个, 比 色 皿 7 个 和 共 用 参 比 杯 1 个, 平 板, 培 养 瓶 等 2. 菌 种 : 大 肠 杆 菌, 金 黄 色 葡 萄 球 菌 3. 培 养 基 (1ml/25ml 三 角 瓶 8 瓶 / 大 组 ) 牛 肉 膏 蛋 白 胨 葡 萄 糖 培 养 基, 配 方 ( 总 量 1mL): 牛 肉 粉 3g; 蛋 白 胨 1g;NaCl 5g; 葡 萄 糖 1(g/L), ph7.5 四. 实 验 步 骤 1. 准 备 菌 种 将 大 肠 杆 菌, 金 黄 色 葡 萄 球 菌 分 别 接 种 到 牛 肉 膏 蛋 白 胨 葡 萄 糖 三 角 瓶 培 养 基 中, 在 37 o C, 摇 床 上 培 养 14-18h, 另 外 准 备 大 肠 杆 菌 平 板 1 块 (37 o C,24h) 2. 接 种 每 3 个 小 组 组 成 一 个 大 组, 每 小 组 负 责 以 下 部 分 实 验 内 容, 按 照 如 下 的 方 法 在 培 养 瓶 中 进 行 接 种 和 培 养 第 一 小 组 : 1-1: 取 1.ml 大 肠 杆 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,37 o C, 1-2: 取 3.ml 大 肠 杆 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,37 o C, 1-3: 取 5.ml 大 肠 杆 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,37 o C, 第 二 小 组 : 2-1: 取 一 个 大 肠 杆 菌 菌 落 接 种 到 1ml 培 养 基,3 o C, 2-2: 取 1.ml 大 肠 杆 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,37 o C,11rpm 2-3: 取 1.ml 大 肠 杆 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,3 o C, 第 三 小 组 : 3-1: 取 1.ml 金 黄 色 葡 萄 球 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,37 o C, 3-2: 取 1.ml 金 黄 色 葡 萄 球 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,3 o C, 3-3: 取 1.ml 金 黄 色 葡 萄 球 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,37 o C,11rpm 3. 取 样 在 培 养 过 程 中, 隔 一 小 时 ( 或 半 小 时 ) 取 样 一 次.,3 个 小 组 分 别 进 行 实 验, 最 终 汇 总 实 验 结 果 全 班 同 时 取 样, 同 时 开 始 振 荡, 取 样 期 间 时 间 不 算 4. 测 量 取 5μl 培 养 液 到 2μl 蒸 馏 水 中, 以 蒸 馏 水 为 对 照, 测 OD6; 注 意 固 定 参 比 杯, 不 要 调 动 波 长 旋 钮 ; 固 定 一 台 分 光 光 度 计 ; 零 小 时 也 要 测, 把 结 果 填 入 表 格 中 ( 也 可 测 OD42,OD62 等, 本 组 选 用 OD6)

五. 实 验 结 果 与 讨 论 1. 培 养 菌 液 吸 光 度 数 据 及 处 理 开 始 取 样 时 间 9:36 1:36 11:35 12:1 12:45 13:25 14: 15:5 16:1 17:1 18:15 19:2 结 束 取 样 时 间 9:41 1:5 11:43 12:12 12:49 13:31 14:5 15:1 16:14 17:12 18:25 19:29 1-1.4.24.83.92 25 14 36 27 67 3 26 6 1-2.46.61 2 48 65 9 69 19 75.3.335.38 1-3.58 24 93.375 2 17 31 64.31.364.48.436 2-1.1 -.9 -....5.26.74 14 4 48 69 OD6 2-2.7.29.78 5 11 25 37 2 5 93 94 98 2-3.13.17.58.93 27 45 6 89 87 34 45 73 3-1.5.45.76.7 3 22 15 3 68.35.41.422 3-2.45.16.71.25.5.59.74 5 61 1 1 14 3-3.74.12.45.49.73.91 41 37 69 91 31 53 表 1 菌 液 吸 光 度 原 始 数 据 发 酵 时 间 (h) 1 2 2.5 3 3.5 4 5 6 7 8 9 1-1..2.79.88 21 1 32 23 63 99 22 56 1-2..15.74 2 19 13 23 73 29 54 89.334 1-3..66 35.317 62 9 73 6 52.36.35.378 2-1......4.25.73 13 39 47 68 OD6 2-2..22.71.98 4 18 3 45 48 86 87 91 2-3..4.45.8 14 32 47 76 74 21 32 6 3-1..4.71.65.98 17 1 98 63.345.396.417 3-2...26..5.14.29.6 16 6 65 69 3-3......17.67.63.95 17 7 79 表 2 菌 液 吸 光 度 处 理 后 ( 扣 去 初 始 吸 光 度 ) 数 据 ( 背 景 为 浅 蓝 色 的 数 据 原 为 负 数, 是 数 据 较 小 时 分 光 光 度 计 不 准 确 所 致, 所 以 在 计 算 中 作 为. 考 虑 ) 2. 绘 制 生 长 曲 线 (OD-t) 根 据 处 理 后 得 到 的 表 2 数 据 分 组 分 条 件 绘 制 生 长 曲 线 图, 并 作 拟 合, 使 用 的 作 图 软 件 为 origin8. 和 Excel27 具 体 曲 线 图 和 分 析 见 下 1) 1-1 组 : 取 1.ml 大 肠 杆 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,37 o C, 图 1 小 组 1-1 的 OD-t 图

从 图 中 可 以 观 察 到 调 整 期 (-1 小 时 ), 但 是 之 后 的 增 长 不 太 符 合 对 数 期 的 增 长 模 式, 而 且 在 培 养 的 整 个 时 间 段 内 没 有 出 现 平 衡 期, 因 为 在 这 个 环 境 下 培 养 9 个 小 时 还 不 足 以 使 细 菌 消 耗 的 营 养 物 质 和 积 累 的 代 谢 产 物 达 到 平 衡 期 的 标 准 因 为 平 衡 期 尚 未 出 现, 死 亡 期 必 然 还 没 有 经 历 当 然, 在 比 浊 法 的 使 用 过 程 中, 确 实 不 易 观 察 到 死 亡 期, 因 为 分 光 光 度 计 所 测 的 是 总 菌 体 含 量, 而 不 是 活 菌 含 量 2) 1-2 组 : 取 3.ml 大 肠 杆 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,37 o C, 图 2 小 组 1-2 的 OD-t 图 从 上 图 可 以 看 出 -1 小 时 的 调 整 期, 而 类 似 对 数 期 的 2-9 小 时 增 速 不 大, 平 衡 期 没 有 出 现 3) 1-3 组 : 取 5.ml 大 肠 杆 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,37 o C, 图 3 小 组 1-3 的 OD-t 图 上 图 中, 调 整 期 大 约 出 现 在 -.5 小 时 段, 由 于 第 四 个 数 据 点 异 常 地 大, 可 能 是 该 小 组 未 将 样 品 混 匀 就 进 行 了 测 定, 导 致 图 中 显 示 的 对 数 期 也 不 同 寻 常, 平 衡 期 从 趋 势 看 即 将 来 到 比 起 1-1,1-2 组, 平 衡 期 显 得 更 近 是 因 为 初 始 加 入 的 菌 液 有 5ml, 消 耗 营 养 物 质 和 产 生 代 谢 产 物 的 速 度 更 快 4) 2-1 组 : 取 一 个 大 肠 杆 菌 菌 落 接 种 到 1ml 培 养 基,3 o C, 从 图 中 能 明 显 地 看 到 调 整 期 (-4 小 时 ), 对 数 期 (4-7 小 时 ) 及 之 后 的 平 衡 期 相 比 第 一 大 组, 这 小 组 由 于 初 始 加 入 的 是 平 板 上 的 菌 落 而 非 菌 液, 所 以

图 4 小 组 2-1 的 OD-t 图 需 要 更 长 的 时 间 来 调 整 适 应 培 养 基 的 环 境, 故 调 整 期 较 长 另 一 方 面, 对 数 期 的 斜 率 较 之 前 大 组 小, 说 明 生 长 较 为 缓 慢 5) 2-2 组 : 取 1.ml 大 肠 杆 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,37 o C,11rpm 图 5 小 组 2-2 的 OD-t 图 从 拟 合 曲 线 中 可 以 看 到 调 整 期 相 当 短, 几 乎 在 接 种 后 就 马 上 能 适 应 培 养 的 环 境 了 而 对 数 期 (1-6 小 时 ) 增 长 比 较 缓 慢, 之 后 的 平 衡 期 能 被 观 察 到 6) 2-3 组 : 取 1.ml 大 肠 杆 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,3 o C, 图 6 小 组 2-3 的 OD-t 图

细 菌 在 这 个 培 养 环 境 下 也 很 快 进 入 对 数 期 (-9 小 时 ), 而 平 衡 期 没 有 出 现 7) 3-1 组 : 取 1.ml 金 黄 色 葡 萄 球 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,37 o C, 图 7 小 组 3-1 的 OD-t 图 调 整 期 (-3 小 时 ), 对 数 期 (3-8 小 时 ), 平 衡 期 (9 小 时 后 ) 8) 3-2 组 : 取 1.ml 金 黄 色 葡 萄 球 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,3 o C, 图 8 小 组 3-2 的 OD-t 图 调 整 期 (-4 小 时 ), 对 数 期 (4-8 小 时 ), 品 衡 期 (9 小 时 后 ) 9) 3-3 组 : 取 1.ml 金 黄 色 葡 萄 球 菌 菌 液 接 种 到 1ml 培 养 基,37 o C,11rpm 图 9 小 组 3-3 的 OD-t 图 调 整 期 (-4 小 时 ), 对 数 期 (4-9 小 时 ), 根 据 趋 势 推 测 平 衡 期 就 在 9 小 时

OD6 OD6 后 1) 初 始 浓 度 对 细 菌 生 长 的 影 响.4.35.3 5.5 2 4 6 8 1 1ml,37 度, 3ml,37 度, 5ml,37 度, 图 1 不 同 初 始 浓 度 组 的 大 肠 杆 菌 菌 液 OD-t 图 相 同 温 度 和 摇 床 转 速 下, 接 种 后 初 始 浓 度 越 高, 调 整 期 越 短, 而 从 图 中 较 难 观 察 出 对 数 期 长 短 比 较 和 增 速 比 较, 相 差 不 大, 但 从 理 论 上 可 以 推 断, 初 始 浓 度 较 高 组 的 对 数 期 持 续 时 间 应 该 较 短, 因 为 含 菌 量 大, 单 位 时 间 内 消 耗 营 养 物 质 就 会 更 多, 产 生 代 谢 产 物 也 会 更 多 从 总 体 上 来 说, 初 始 浓 度 越 高 的 组 每 时 刻 的 含 菌 量 都 相 应 更 高 11) 接 种 类 型 对 细 菌 生 长 的 影 响.3 5.5 菌 落,3 度, 1ml,3 度, 2 4 6 8 1 -.5 图 11 不 同 接 种 类 型 组 的 大 肠 杆 菌 菌 液 OD-t 图 从 实 验 结 果 可 以 看 出, 液 体 种 子 的 调 整 期 明 显 短 于 固 体 种 子, 可 能 是 因 为 液 体 种 子 接 种 至 培 养 基 前 后 培 养 环 境 差 异 较 小, 而 固 体 种 子 前 后 环 境 差 异 大, 所 以 需 要 更 长 时 间 适 应 菌 落 接 种 的 对 数 期 较 短 代 时 较 小, 可 能 是 因 为 但 菌 落 中 细 菌 对 营 养 等 需 求 一 致, 在 调 整 后, 能 迅 速 生 长 繁 殖 12) 温 度 对 细 菌 生 长 的 影 响 在 相 同 初 始 浓 度 和 摇 床 转 速 下 观 察 温 度 对 细 菌 生 长 的 影 响 从 图 12 可 以 看 到, 调 整 期 温 度 较 高 组 菌 含 量 较 多, 而 到 了 对 数 期, 反 而 温 度 较 低 组 菌 含 量 更 多, 但 总 体 上 两 者 相 差 不 大 由 图 13 则 可 以 发 现, 温 度 造 成 菌 含 量 差 异 非 常 明 显, 温 度 较 高 组 的 菌 含 量 明 显 高 于 温 度 较 低 组 查 阅 资 料 后 可 知 两 种 菌 的 最 适 生 长 温 度 都 是 37 度, 金 葡 组 的 结 果 很 符 合, 而 大 肠 杆 菌 组 出 现 了 偏 差 导 致 偏

OD6 OD6 OD6.3 5.5 1ml,37 度, 1ml,3 度, -.5 2 4 6 8 1 图 12 不 同 温 度 组 的 大 肠 杆 菌 菌 液 OD-t 图.45.4.35.3 5.5 2 4 6 8 1 1ml,37 度, 1ml,3 度, 图 13 不 同 温 度 组 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 菌 液 OD-t 图 差 的 原 因 可 能 是 一 开 始 接 种 时 取 量 出 现 了 偏 差,3 度 组 接 种 量 多 于 37 度 组, 或 者 是 测 量 吸 光 度 时 每 次 混 得 都 不 够 匀, 造 成 数 值 不 稳 定 13) 摇 床 转 速 对 细 菌 生 长 的 影 响.3 5.5 1ml,37 度, 1ml,37 度, 11rpm 2 4 6 8 1 图 14 不 同 摇 床 转 速 的 大 肠 杆 菌 菌 液 OD-t 图

OD6 OD6.45.4.35.3 5.5 -.5 2 4 6 8 1 1ml,37 度, 1ml,37 度,11rpm 图 15 不 同 摇 床 转 速 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 菌 液 OD-t 图 摇 床 转 速 的 增 加 表 示 溶 氧 度 的 提 高, 意 味 着 供 氧 更 充 足, 对 于 兼 性 厌 氧 ( 如 大 肠 杆 菌 ) 和 需 氧 细 菌 ( 如 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ) 来 说, 能 提 供 更 好 的 生 长 环 境 所 以 在 图 14 和 图 15 中 可 以 看 到 在 初 始 浓 度 和 培 养 温 度 相 同 的 情 况 下, 摇 床 转 速 越 大, 生 长 更 旺 盛, 调 整 期 也 更 短 14) 不 同 菌 种 对 细 菌 生 长 的 影 响.45.4.35.3 5.5 -.5 2 4 6 8 1 大,1ml,37 度, 大,1ml,37 度, 11rpm 大,1ml,3 度, 金,1ml,37 度, 金,1ml,3 度, 金,1ml,37 度, 11rpm 3. 代 时 计 算 图 16 相 同 培 养 条 件 下 大 肠 杆 菌 和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 生 长 曲 线 对 比 图 ( 大 表 示 接 种 大 肠 杆 菌, 金 表 示 接 种 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ) 在 图 16 中 分 别 对 比 三 组 相 同 的 情 况, 除 了 1ml,37 度, 组, 其 他 两 组 中 大 肠 杆 菌 的 生 气 长 情 况 更 好, 调 整 期 更 短, 对 数 期 也 短, 意 味 着 代 时 较 短, 生 长 繁 殖 速 度 快 而 1ml,37 度, 组 的 结 果 产 生 主 要 是 由 于 改 组 中 接 种 大 肠 杆 菌 的 组 出 现 了 一 些 问 题, 把 这 组 大 肠 杆 菌 和 1ml,3 度, 组 的 大 肠 杆 菌 比 较 也 相 差 无 几, 而 这 与 大 肠 杆 菌 在 37 度 时 生 长 最 佳 也 是 矛 盾 的 根 据 表 2 中 所 得 的 OD 数 据, 和 所 绘 制 的 细 菌 生 长 曲 线 (OD-t), 可 计 算 每 组 细 菌 生 长 的 代 时 G 计 算 时 选 取 每 组 生 长 曲 线 对 数 期 内 的 两 组 数 据, 带 入 代 时 的 计 算 公 式 :G = (t 2 t 1 ) log 2 (log W 2 log W 1 ), 式 中 t 1 和 t 2 为 所 取 对 数 期 两 点 时 间,W1 和 W2 为 相 应 时

间 测 得 的 细 胞 含 量 或 OD 值 具 体 计 算 结 果 如 下 表 所 示 : 组 别 1-1 1-2 1-3 2-1 2-2 2-3 3-1 3-2 3-3 t1(h) N/A 4 N/A 4 3 3.5 5 4 5 W1 N/A 23 N/A.25 4 32 98.29.63 t2(h) N/A 6 N/A 5 4 7 6 5 6 W2 N/A 29 N/A.73 3 21 63.6.95 代 时 G (h) N/A 2.23 N/A.65 3.11 4.71 2.44.95 1.69 表 3 各 组 代 时 计 算 表 (N/A 表 示 由 于 数 据 的 波 动 太 大, 无 可 用 于 计 算 的 数 据 ) 4. ph 值 对 照 组 :6.7 组 号 7-1 小 组 7-2 小 组 7-3 小 组 -1 7.5 7 未 测 -2 7.7 7.2 未 测 -3 7.7 7 未 测 表 4 培 养 结 束 后 测 得 的 ph 表 经 过 培 养 后, 大 肠 杆 菌 作 为 产 酸 的 菌 种,pH 相 比 于 对 照 组 应 该 有 所 下 降, 但 是 实 验 结 果 却 比 对 照 组 ph 值 大 可 能 原 因 是 大 肠 杆 菌 先 利 用 糖, 分 解 产 酸 会 使 ph 下 降, 但 随 后 继 续 繁 殖 或 杂 菌 的 生 长, 促 使 蛋 白 胨 的 分 解, 产 生 了 代 谢 产 物 又 呈 现 碱 性, 因 此 会 表 现 出 ph 增 大 现 象 六. 实 验 思 考 1. 计 算 出 大 肠 杆 菌 和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 在 牛 肉 膏 蛋 白 胨 葡 萄 糖 培 养 基 中 对 数 生 长 期 中 的 代 时 (min)( 繁 殖 一 代 的 时 间 ), 为 什 么 比 理 论 时 间 长 好 多? 答 : 大 肠 杆 菌 由 实 验 计 算 得 到 的 代 时 为.65 小 时 即 39 分 钟, 理 论 值 为 17 分 钟 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 得 到 代 时 为.95 小 时 即 57 分 钟, 理 论 值 为 27-3 分 钟 造 成 实 验 测 得 代 时 比 理 论 值 长 的 原 因 可 能 有 以 下 几 点 : 1) 细 菌 不 断 消 耗 营 养 物 质, 产 生 代 谢 产 物, 影 响 了 细 菌 生 长, 增 加 代 时 2) 培 养 过 程 中 通 风 不 好, 摇 床 速 度 也 不 一 定 是 最 佳, 溶 氧 度 不 够, 影 响 细 菌 生 长, 增 加 代 时 3) 培 养 基 中 没 有 酸 碱 缓 冲 液, 所 以 ph 改 变 较 大, 影 响 细 菌 生 长, 增 加 代 时 4) 取 出 培 养 瓶 测 OD 值 时 有 一 定 的 时 间 脱 离 了 培 养 环 境, 造 成 温 度 和 溶 氧 情 况 的 改 变 2. 为 什 么 可 用 比 浊 法 来 表 示 细 菌 的 相 对 生 长 状 况? 答 : 因 为 菌 液 中 菌 体 的 总 浓 度 ( 包 括 活 菌 和 死 菌 ) 和 其 浑 浊 度 成 正 比 用 分 光 光 度 计 可 测 定 菌 液 的 吸 光 度 来 表 示 菌 液 的 浑 浊 度, 从 而 得 出 菌 体 总 浓 度 作 OD-t 图, 可 得 菌 液 中 菌 体 总 含 量 随 时 间 变 化 的 关 系 曲 线, 即 生 长 曲 线, 从 而 反 应 细 菌 的 生 长 状 况 但 是, 吸 光 度 指 示 的 是 菌 液 中 菌 体 总 含 量, 而 非 活 菌 量, 所 以 在 生 长 曲 线 中 没 有 明 显 的 死 亡 期 3. 生 长 曲 线 中 为 什 么 会 有 稳 定 期 和 衰 退 期? 答 : 实 验 中 细 菌 的 培 养 环 境 是 封 闭 式 的, 中 途 也 没 有 补 料, 所 以 随 着 营 养 物 质 的 消 耗 代 谢 产 物 的 积 累 和 ph 等 环 境 因 素 的 变 化, 培 养 基 会 变 得 不 再 适 于 细 菌 生 长 繁 殖 从 而 导 致 细 菌 量 的 净 增 长 率 接 近 于 零 ( 单 位 时 间 内 细 菌 二 分 裂 增 加 的 细 胞 数 接 近 于 细 菌 死 亡 的 细 胞 数 量 ), 标 志 细 菌 生 长 进 入 稳 定 期 ( 活 菌 数 量 恒 定 ) 之 后, 随 着 营 养 物 质 的 耗 尽 和 有 毒 代 谢 产 物 的 大 量 积 累, 以 及 ph 等 条 件 的 进 一 步 恶 化,

细 菌 死 亡 的 速 率 逐 步 增 加, 活 细 菌 逐 渐 减 少, 生 长 进 入 衰 退 期 ( 活 菌 数 量 下 降 ) 4. 什 么 条 件 下 接 种 为 宜? 液 体 种 子 比 固 体 种 子 有 什 么 优 越 性? 答 : 最 适 宜 的 接 种 环 境 是 和 原 生 长 环 境 相 似 的 培 养 环 境 这 样 细 菌 不 需 要 很 长 时 间 调 节 就 能 适 应 新 环 境 最 适 宜 的 接 种 菌 种 应 该 是 处 在 生 长 曲 线 的 对 数 期 的 菌 液 此 时 细 菌 已 度 过 调 整 期, 生 长 繁 殖 最 旺 盛, 生 命 力 最 强 大, 各 种 分 解 和 合 成 代 谢 反 应 都 被 充 分 激 活, 对 环 境 有 最 强 的 适 应 能 力 液 体 种 子 与 固 体 种 子 相 比, 更 易 于 扩 散 分 布 到 培 养 基 中, 而 且 前 后 培 养 环 境 也 很 相 似, 细 菌 不 需 要 经 过 太 长 的 调 整 期 而 固 体 种 子 会 有 一 部 分 粘 附 在 接 种 环 上, 即 使 是 进 入 培 养 基 的 细 菌 也 不 易 扩 散, 前 后 环 境 改 变 较 大, 需 要 一 段 较 长 时 间 适 应 5. 根 据 实 验 结 果, 谈 谈 在 工 业 上 如 何 缩 短 发 酵 时 间? 答 : 从 实 验 结 果 来 看, 接 种 量 温 度 摇 床 速 度 ( 溶 氧 度 ) 接 种 类 型 ( 固 体 种 子 或 液 体 种 子 ) 等 条 件 对 细 菌 的 生 长 情 况 都 有 较 大 影 响 所 以 在 工 业 上 也 应 该 依 据 类 似 的 原 则, 采 取 液 体 接 种 的 方 式, 将 已 经 在 与 发 酵 培 养 基 相 同 条 件 下 培 养 好 的 菌 液 ( 接 种 量 适 当 大 ) 接 种 至 发 酵 体 系 中, 同 时 保 证 培 养 基 内 溶 氧 量 充 足, 温 度 也 始 终 保 持 在 发 酵 菌 种 的 最 适 温 度, 同 时 保 证 营 养 的 充 足 供 应 和 ph 等 环 境 条 件 的 稳 定, 从 而 缩 短 发 酵 时 间 6. 有 人 觉 得 摇 瓶 发 酵 和 发 酵 罐 发 酵 测 量 的 生 长 曲 线 一 样, 需 要 取 消 一 次 实 验, 你 认 为 一 样 吗? 试 比 较 摇 瓶 发 酵 和 发 酵 罐 发 酵 测 量 的 生 长 曲 线 的 异 同 点? 答 : 两 者 有 一 定 的 区 别, 所 以 不 应 取 消 相 同 点 是, 都 在 制 定 温 度 和 接 种 量 下 培 养, 前 者 的 摇 床 用 摇 床 来 保 持 一 定 溶 氧 度, 后 者 用 搅 拌 器 保 持 一 定 溶 氧 度 不 同 点 是 : 1) 摇 瓶 发 酵 在 测 定 OD 值 时 细 菌 会 脱 离 培 养 环 境, 造 成 中 断, 温 度 溶 氧 量 等 都 会 受 到 影 响, 而 发 酵 罐 不 会, 取 液 的 同 时 依 旧 在 培 养 中, 过 程 连 续 2) 摇 瓶 虽 然 用 摇 床 控 制 溶 氧 度, 但 实 际 上 很 难 保 持 一 个 恰 当 的 度, 而 发 酵 罐 则 可 以 通 过 搅 拌 通 气 来 控 制 3) 发 酵 罐 可 以 全 过 程 追 踪 ph, 并 进 行 相 应 调 节, 以 维 持 酸 碱 环 境 适 合 细 菌 生 长 七. 致 谢 感 谢 陈 老 师 和 所 有 助 教 的 及 时 的 答 疑 解 惑, 给 了 我 们 实 验 很 大 的 帮 助 这 次 实 验 靠 全 组 同 学 通 力 合 作 才 得 以 完 成, 谢 谢 伙 伴 们 八. 参 考 资 料 1. 微 生 物 学 实 验 指 导, 清 华 大 学 出 版 社, 陈 金 春 陈 国 强 主 编,25 年 8 月 2. http://www.kepu.net.cn/gb/lives/microbe/microbe_life/2311786.html