1028 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 收 集 小 鼠 血 清, 取 小 鼠 肺 组 织 称 重 后, 左 侧 肺 用 于 组 织 蛋 白 和 mrna 鉴 定 ; 右 肺 置 于 10% 中 性 福

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1027 基 础 医 学 研 究 白 介 素 33 在 百 草 枯 诱 导 小 鼠 急 性 肺 损 伤 中 的 作 用 机 制 研 究 刘 晨 风 1,2, 吴 小 红 2, 曾 扬 2, 高 同 同 2, 于 虹 2, 郭 彦 2, 孙 世 惠 2 1,2, 周 育 森 摘 要 目 的 探 讨 白 介 素 33(IL 33) 在 百 草 枯 (PQ) 染 毒 小 鼠 急 性 肺 损 伤 (ALI) 模 型 中 的 表 达 及 作 用 方 法 25 只 SPF 级 雌 性 BALB/c 小 鼠 平 均 分 为 正 常 对 照 组,PQ 损 伤 6 12 24 48h 组 腹 腔 注 射 PQ(30mg/kg) 建 立 小 鼠 ALI 模 型 并 于 各 时 间 点 处 死 取 材 评 价 肺 组 织 病 理 变 化 和 炎 症 细 胞 浸 润 ; 观 察 血 清 白 介 素 1β(IL 1β) IL 2 IL 6 肿 瘤 坏 死 因 子 α(tnf α) 和 肺 组 织 髓 过 氧 化 物 酶 (MPO) 水 平 变 化 ;RT PCR 免 疫 组 化 和 Westernblot 分 别 检 测 组 织 中 IL 33mRNA 和 蛋 白 表 达 水 平 变 化 分 析 IL 33 与 病 理 损 伤 和 炎 症 指 标 关 联 性 以 明 确 IL 33 在 调 解 内 源 性 细 胞 因 子 及 在 ALI 中 的 作 用 结 果 与 正 常 对 照 组 相 比,PQ 损 伤 后 小 鼠 肺 组 织 弥 漫 性 损 伤 伴 有 严 重 水 肿 及 大 量 炎 症 细 胞 浸 润, 促 炎 细 胞 因 子 IL 1β IL 6 TNF α MPO 明 显 升 高, 抑 炎 细 胞 因 子 IL 2 明 显 下 调 (P<0 05);PQ 损 伤 后 IL 33 在 mrna 和 蛋 白 表 达 水 平 均 显 著 下 调 (P<0 05) 关 联 性 分 析 显 示 IL 33 与 病 理 损 伤 指 标,IL 1β IL 6 TNF α MPO 均 呈 明 显 负 相 关 (P<0 05), 与 IL 2 呈 正 相 关 趋 势, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 结 论 IL 33 在 PQ 诱 导 小 鼠 ALI 中 表 达 水 平 下 降, 提 示 可 能 在 调 解 内 源 性 炎 症 因 子 平 衡 中 发 挥 重 要 作 用, 可 为 临 床 干 预 和 治 疗 ALI 的 新 靶 点 关 键 词 中 图 分 类 号 白 介 素 33; 百 草 枯 ; 急 性 肺 损 伤 ; 炎 症 S482.4;R363.1;R392.7 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1027-06 急 性 肺 损 伤 (acutelunginjury,ali) 发 展 到 严 重 阶 段 称 为 急 性 呼 吸 窘 迫 综 合 征 (acuterespiratorydis tressyndrome,ards), 最 终 因 形 成 全 身 炎 症 反 应 综 合 征 (systemic inflammatory response syndrome, SIRS) 和 多 器 官 功 能 障 碍 综 合 征 (multipleorgandys 2014-02-25 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :81371805); 国 家 重 点 基 础 研 究 发 展 计 划 (973)( 编 号 :2012CB518905) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 北 京 微 生 物 流 行 病 研 究 所, 合 肥 230032 2 北 京 微 生 物 流 行 病 研 究 所 病 原 微 生 物 生 物 安 全 国 家 重 点 实 验 室, 北 京 100071 作 者 简 介 : 刘 晨 风, 男, 硕 士 研 究 生 ; 孙 世 惠, 女, 副 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:sun sh01@163.com; 周 育 森, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:yszhou@ bmi.ac.cn functionsyndrome,mods) 而 导 致 死 亡 [1] 由 于 ALI 的 发 病 机 制 较 为 复 杂, 目 前 尚 不 清 楚 其 中 由 化 学 强 毒 除 草 剂 百 草 枯 (paraquat,pq) 中 毒 所 致 的 ARDS, 已 导 致 数 千 人 中 毒 死 亡, 病 死 率 高 达 70% [2] 白 介 素 33(interleukin 33,IL 33) 是 IL 1 家 族 的 新 成 员, 在 慢 性 炎 症 心 血 管 疾 病 和 变 态 反 应 性 等 疾 病 中 发 挥 重 要 作 用 [3-6] [3,5] 研 究 显 示 IL 33 既 能 作 为 促 炎 因 子 活 化 炎 症, 加 重 组 织 损 伤, 也 可 作 为 染 色 质 相 关 核 因 子 起 转 录 抑 制 作 用, 辅 助 抑 制 前 炎 症 基 因 表 达 [7] 但 目 前 鲜 有 报 道 评 价 IL 33 在 急 性 炎 症 中 的 作 用 为 此, 该 实 验 使 用 PQ 建 立 小 鼠 ALI 模 型, 系 统 研 究 了 IL 33 表 达 与 ALI 小 鼠 的 病 理 和 炎 症 细 胞 因 子 之 间 的 动 态 变 化 关 系, 阐 述 了 IL 33 在 化 学 毒 物 造 成 的 ALI 中 的 重 要 调 节 作 用 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 与 试 剂 PQ 购 自 上 海 先 正 达 有 限 公 司 ; Goatanti mouseil 33 抗 体 购 自 美 国 R&D 公 司 ; 中 性 粒 细 胞 抗 体 购 自 美 国 SantaCruz 公 司 ;Rabbitanti GAPDH 抗 体 Rabbitanti goatigg(hrp 标 记 ) 和 AntirabbitIgG(HRP 标 记 ) 均 购 自 美 国 CelSigna ling 公 司 ;IL 1β IL 2 IL 6 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α (tumornecrosisfactor α,tnf α)elisa 预 包 被 试 剂 盒 均 购 自 北 京 达 科 为 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 髓 过 氧 化 物 酶 (myeloperoxidase,mpo)elisa 试 剂 盒 购 自 荷 兰 Hycultbiotechnology 公 司 ; 总 RNA 提 取 试 剂 盒 购 自 德 国 Qiagen 公 司 ;RNA 反 转 录 cdna 试 剂 盒 购 自 北 京 全 式 金 生 物 技 术 公 司 ; 实 时 荧 光 定 量 PCR (SYBRGreen) 试 剂 盒 购 自 北 京 天 根 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 蛋 白 酶 抑 制 剂 混 合 物 购 自 北 京 普 利 莱 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 其 余 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯, 由 国 药 ( 北 京 ) 化 工 集 团 提 供 1.2 动 物 模 型 建 立 及 分 组 25 只 SPF 级 雌 性 BALB/c 小 鼠,6~8 周 龄, 体 重 (20±1)g, 购 自 军 事 医 学 科 学 院 实 验 动 物 中 心 小 鼠 随 机 平 均 分 为 5 组, 依 次 为 正 常 对 照 组,PQ 注 射 后 6 12 24 48h 取 材 组 (PQ6 12 24 48h) 腹 腔 注 射 PQ(30mg/kg) 建 立 小 鼠 ALI 模 型, 分 别 于 相 应 时 间 段 称 重 后 处 死

1028 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 收 集 小 鼠 血 清, 取 小 鼠 肺 组 织 称 重 后, 左 侧 肺 用 于 组 织 蛋 白 和 mrna 鉴 定 ; 右 肺 置 于 10% 中 性 福 尔 马 林 溶 液, 正 常 对 照 组 作 相 同 处 理 1.3 方 法 1.3.1 肺 组 织 病 理 学 检 测 首 先 评 价 相 对 肺 组 织 重 量 变 化, 计 算 公 式 为 相 对 肺 组 织 重 量 变 化 =[ 小 鼠 肺 组 织 (mg)/ 小 鼠 总 重 量 (g)]; 其 次 对 右 肺 固 定 72h 后, 常 规 梯 度 乙 醇 脱 水 二 甲 苯 透 明, 石 蜡 包 埋, 连 续 切 片, 切 片 厚 度 为 4μm, 苏 木 精 - 伊 红 (HE) 染 色, 光 镜 下 观 察 肺 组 织 病 理 变 化, 使 用 病 理 评 分 方 法 进 行 肺 组 织 损 伤 半 定 量 分 析 [8] 1.3.2 免 疫 组 织 化 学 检 测 使 用 肺 组 织 石 蜡 切 片 进 行 IL 33 和 中 性 粒 细 胞 免 疫 组 织 化 学 检 测, 二 甲 苯 脱 蜡, 梯 度 乙 醇 水 化, 枸 橼 酸 钠 及 微 波 进 行 抗 原 修 复, 晾 至 室 温 后,PBS 洗 3 遍 (5min/ 次, 下 同 ) 后, 加 入 0 3% 过 氧 化 氢 封 闭 内 源 性 过 氧 化 氢 酶,PBS 洗 3 遍 后 进 行 血 清 封 闭, 封 闭 后 分 别 滴 加 兔 抗 IL 33 (1 80) 和 大 鼠 抗 中 性 粒 细 胞 表 面 标 记 (1 50) 抗 体,4 孵 育 过 夜 次 日,PBS 洗 3 遍 后, 分 别 加 入 HRP 标 记 的 抗 山 羊 二 抗 和 抗 大 鼠 二 抗,37 孵 育 40min,PBS 洗 3 遍 后,DAB 显 色, 苏 木 精 衬 染, 盐 酸 酒 精 分 化,PBS 返 蓝, 梯 度 乙 醇 依 次 脱 水, 二 甲 苯 透 明, 中 性 树 胶 封 片 光 镜 下 观 察 棕 黄 色 颗 粒 为 阳 性 结 果 1.3.3 炎 症 细 胞 因 子 检 测 MPO 检 测 使 用 肺 组 织 匀 浆 液, 组 织 匀 浆 液 的 制 备 过 程 参 考 Hycult 说 明 书 ; 收 集 小 鼠 血 液,3500r/min 离 心 20min 后 收 集 血 清 保 存 备 用 炎 症 因 子 IL 1β IL 2 IL 10 TNF α 和 MPO 检 测 及 浓 度 计 算 参 考 试 剂 盒 说 明 书 1.3.4 总 RNA 提 取 逆 转 录 及 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 提 取 小 鼠 肺 组 织 总 RNA 用 于 检 测 小 鼠 肺 组 织 中 IL 33 表 达, 使 用 总 RNA 提 取 试 剂 盒 提 取 RNA, 具 体 操 作 步 骤 参 考 说 明 书 ; 逆 转 录 PCR 使 用 mrna 逆 转 录 cdna 试 剂 盒, 具 体 操 作 方 法 及 反 应 体 系 参 考 说 明 书 ;IL 33PCR 反 应 检 测 使 用 SYBR GreenRealmasterMix, 具 体 反 应 体 系 请 参 考 说 明 书, 以 GAPDH 作 为 持 家 基 因 对 照, 分 析 在 ALI 不 同 时 间 点 IL 33 的 表 达 水 平 变 化 实 时 荧 光 定 量 PCR 引 物 分 别 为 :IL 33 F:GACACATTGAGCATCCAAGG,IL 33 R:AACAGATTGGTCATTGTATGTACTCAG;GAP DH F:CTCTGACTTCAACAGCGACAC, GAPDH R: CGTTGTCATACCAGGAAATGA 反 应 条 件 为 : 预 变 性 :95 2min; 变 性 95 15s, 退 火 55 15s, 延 伸 68 20s,35 次 循 环, 荧 光 实 时 定 量 PCR 使 用 EppendorfrealplexPCR 仪 器 1.3.5 Westernblot 检 测 提 取 小 鼠 肺 组 织 总 蛋 白 用 于 肺 组 织 中 IL 33 和 GAPDH 表 达 检 测 取 30mg 肺 组 织 于 500μlRIPA 中 匀 浆, 并 加 入 5μlPMSF 和 蛋 白 酶 抑 制 剂 混 合 物,0 条 件 下 匀 浆 20min, 匀 浆 后 14000r/min 离 心 15min 处 理, 取 400μl 上 清 液 备 用 Westernblot 实 验 按 常 规 方 法 进 行 抗 IL 33 抗 体 工 作 稀 释 度 为 1 500, 抗 GAPDH 为 1 1000; 二 抗 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 IgG 二 抗 为 1 5000 使 用 软 件 计 算 IL 33 灰 度 值 比 1.4 统 计 学 处 理 采 用 GraphPadPrism5 软 件 进 行 统 计 分 析, 指 标 关 联 分 析 使 用 Stata 软 件, 多 组 均 数 比 较 采 用 方 差 分 析 2 结 果 2.1 PQ 染 毒 后 小 鼠 ALI 观 察 正 常 对 照 组 小 鼠 肺 泡 上 皮 细 胞 形 态 结 构 正 常, 见 图 1A; 相 比 于 正 常 对 照 组,PQ 染 毒 后 可 见 肺 组 织 随 时 间 进 程 损 伤 加 重 染 毒 后 6 12h 仅 主 要 表 现 为 脉 管 周 围 肺 泡 间 隔 轻 度 增 宽, 以 及 少 量 炎 性 细 胞 浸 润, 见 图 1B PQ 染 毒 24h 特 别 是 损 伤 48h 后, 小 鼠 肺 组 织 出 现 弥 漫 性 损 伤 和 明 显 水 肿, 肺 泡 组 织 明 显 塌 陷, 间 隔 增 宽, 肺 泡 上 皮 细 胞 大 量 坏 死, 以 及 伴 有 大 量 的 炎 症 细 胞 浸 润, 见 图 1C D 组 织 病 理 学 分 析 显 示 PQ 染 毒 6h 后 损 伤 评 分 均 明 显 高 于 正 常 对 照 组, 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=75 11,P<0 01), 见 图 1E; 为 了 进 一 步 评 价 肺 组 织 水 肿 情 况, 结 果 显 示 与 正 常 对 照 组 相 比, PQ 损 伤 后 肺 相 对 重 量 增 加, 在 损 伤 24h 后 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=34 75,P<0 01) 见 图 1F 2.2 PQ 染 毒 后 小 鼠 肺 组 织 中 性 粒 细 胞 结 果 显 示, 正 常 对 照 组 没 有 或 极 少 有 中 性 粒 细 胞, 见 图 2A PQ 损 伤 后 中 性 粒 细 胞 逐 渐 增 多, 在 PQ6h 中 性 粒 细 胞 主 要 聚 集 于 气 管 腔 和 血 管 腔 固 有 层 周 围 ( 数 据 未 显 示 ), 但 随 着 损 伤 加 重, 在 PQ12h 后, 中 性 粒 细 胞 通 过 肺 毛 细 血 管 微 循 环 系 统 逐 步 释 放 到 肺 组 织, 见 图 2B 在 PQ 损 伤 24h 和 48h 后, 中 性 粒 细 胞 浸 润 到 肺 间 质 中, 并 在 损 伤 严 重 部 位 呈 弥 散 性 分 布, 见 图 2C D 光 镜 下 观 察 并 统 计 20 倍 镜 下 9 个 视 野 的 中 性 粒 细 胞 平 均 个 数 发 现 中 性 粒 细 胞 随 损 伤 时 间 延 长 逐 步 增 多, 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=134 70,P< 0 01), 见 图 2E 在 PQ 诱 导 的 ALI 中,MPO 的 表 达 明 显 上 调, 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=84 09,P< 0 01), 见 图 2F 2.3 PQ 染 毒 后 小 鼠 炎 症 因 子 紊 乱 与 对 照 组 相

１２９ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ B C D ** 80 % & ' ( ) * + 20 E A ** 60 40 ** 20 0 0 F 6 12!" h 24 48 3 000 MPO( pg / ml ) ** 2 000 ** ** 12!" h 24 1 000 0 0 6 48 图 １ ＰＱ染毒小鼠肺组织各时间点病理变化 ＨＥ ２ Ａ 正常对照组 Ｂ ＰＱ染毒 １ ２ｈ组 Ｃ ＰＱ染毒 ２ ４ｈ组 Ｄ ＰＱ染 图 ２ ＰＱ染毒小鼠后不同时间点中性粒细胞浸润 毒４ ８ｈ组 Ｅ 肺组织病理评分 Ｆ 肺组织相对比重 与正常对照组 及 ＭＰＯ水平变化 Ｉ ＨＣ ２ １ ｈ 比较 Ｐ Ａ 正常对照组 Ｂ ＰＱ染毒 １ ２ｈ组 Ｃ ＰＱ染毒 ２４ｈ组 Ｄ ＰＱ染 毒后 ４８ｈ组 Ｅ 肺组织 ２ 视野下中性粒细胞个数 Ｆ 肺组织匀浆 比 在 ＰＱ损伤６ｈ后 Ｉ Ｌ １β表达水平明显增高 并 液中 ＭＰＯ表达水平变化 与正常对照组 ｈ 比较 Ｐ １ 在损伤后 １２ｈ和 ２４ｈ时达到顶峰 差异均有统计学 意义 Ｆ ５ ５ ７４ Ｐ １ 见图 ３Ａ ＰＱ损伤 ６ｈ 持较高水平 差异均有统计学意义 Ｆ ２８ ９３ Ｐ 后 Ｉ Ｌ ２有上升趋势 但是在 １ ２ｈ后即观察到 Ｉ Ｌ ２ １ 见图 ３Ｃ ＴＮＦ α在 ＰＱ损伤 ６ｈ后同样增高 明显下降 并随时间延长呈下降依赖趋势 在 ４ ８ｈ 明显 并在 ２４ｈ前持续增高并呈现时间依赖趋势 时达到最低值 差异有统计学意义 Ｆ １６ ８８ Ｐ 在 ＰＱ损伤 ４ ８ｈ后 ＴＮＦ α较 ２４ｈ有所降低 但是依 ５ 见图 ３Ｂ Ｉ Ｌ ６在 ＰＱ损伤 ６ｈ即显著增高 并 然明显高于正常对照组 差异有统计学意义 Ｆ 随着损伤时间延长继续增高 在１ ２ ４８ｈ时持续保 ７ ９ Ｐ １ 见图 ３Ｄ

1030 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 2.4 PQ 染 毒 后 小 鼠 肺 组 织 中 IL 33mRNA 水 平 与 正 常 对 照 组 相 比,PQ 损 伤 6h 后 IL 33 表 达 水 平 明 显 降 低 (P<0 05), 并 在 24h 之 内 呈 下 降 趋 势 (P<0 05,F=127 5), 尽 管 PQ 损 伤 48h 时,IL 33 表 达 相 对 于 24h 明 显 增 高, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P <0 01), 但 依 然 低 于 正 常 对 照 组, 见 图 4E 2.5 PQ 染 毒 后 小 鼠 肺 组 织 IL 33 蛋 白 水 平 免 疫 组 化 显 示,IL 33 在 肺 组 织 中 广 泛 表 达, 特 别 集 中 于 肺 泡 上 皮 细 胞 中 Westernblot 法 显 示, 在 PQ 损 伤 后, 能 够 观 察 到 IL 33 蛋 白 表 达 下 调, 并 在 损 伤 24h 前 具 有 时 间 依 赖 趋 势 (F=315 7,P<0 01) 但 是 在 PQ 损 伤 48h 后, 两 种 方 法 均 显 示 IL 33 的 表 达 水 平 有 上 调 趋 势, 推 测 与 IL 33 在 炎 症 反 应 中 的 促 炎 / 抑 炎 双 重 作 用 有 关, 见 图 4(A~D,F) 2.6 IL 33 与 各 项 指 标 关 联 分 析 IL 33 的 水 平 变 化 与 肺 病 理 损 伤 评 分, 肺 组 织 相 对 重 量,IL 1β IL 6 TNF α 以 及 MPO 的 表 达 水 平 变 化 都 呈 负 相 关 联, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05,P<0 01), 尽 管 IL 33 与 IL 2 有 正 相 关 趋 势, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 以 上 结 果 提 示 IL 33 在 PQ 诱 导 的 小 鼠 ALI 中 具 有 重 要 的 作 用, 在 病 理 损 伤 以 及 炎 症 因 子 紊 乱 中,IL 33 可 能 处 于 较 重 要 的 位 置, 在 平 衡 细 胞 因 子 紊 乱 中 可 能 发 挥 着 重 要 的 作 用, 见 表 1 表 1 IL 33mRNA 与 其 他 指 标 关 联 性 分 析 关 联 分 析 R 值 P 值 IL 33mRNA + 肺 组 织 损 伤 评 分 -0.4877 0.020800 IL 33mRNA + 肺 相 对 重 量 -0.5060 0.044500 IL 33mRNA +IL 1β -0.8396 0.000119 IL 33mRNA +IL 2 0.2170 0.193000 IL 33mRNA +IL 6-0.5713 0.012700 IL 33mRNA +TNF α -0.8768 0.000223 IL 33mRNA +MPO -0.5370 0.012500 R 为 关 联 分 析 3 讨 论 引 起 ALI 的 因 素 包 括 SARS MERS 病 毒 以 及 高 图 3 PQ 染 毒 小 鼠 后 血 清 炎 症 因 子 变 化 与 正 常 对 照 组 (0h) 比 较 : P<0.05, P<0.01

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1031 图 4 PQ 染 毒 后 肺 组 织 IL 33 表 达 变 化 IHC 200 A: 正 常 对 照 组 ;B:PQ 染 毒 12h 组 ;C:PQ 染 毒 24h 组 ;D:PQ 染 毒 48h 组 ;E:PQ 染 毒 后 肺 组 织 IL 33mRNA 表 达 变 化 ;F:PQ 染 毒 后 肺 组 织 IL 33 蛋 白 水 平 变 化 ; 与 正 常 对 照 组 (0h) 比 较 : P<0 01; 与 PQ24h 比 较 : ## P<0.01 致 病 性 H5N1 病 毒 [8] 内 毒 素 [9] PQ 等 化 学 毒 质 [10] 及 缺 血 再 灌 注 胃 酸 反 流 等 本 实 验 使 用 PQ 染 毒 小 鼠 建 立 ALI 模 型 用 以 阐 述 ALI 的 致 病 机 制 及 免 疫 反 应 等 结 果 表 明 PQ 染 毒 后 期 小 鼠 肺 组 织 充 血 水 肿, 肺 部 实 质 性 病 变 目 前 仅 有 报 道 [11-12] ALI 与 毒 物 富 集 炎 症 爆 发 氧 化 损 伤 等 因 素 有 关, 但 依 然 缺 乏 详 实 研 究 研 [13] 究 显 示, 中 性 粒 细 胞 积 聚 在 ALI 中 具 有 重 要 作 用 : 一 方 面 堵 塞 肺 毛 细 血 管 引 起 微 循 环 紊 乱 ; 另 一 方 面 中 性 粒 细 胞 释 放 大 量 炎 症 因 子 引 起 组 织 损 伤 本 研 究 显 示 PQ 损 伤 早 期 积 聚 于 气 管 腔 和 血 管 腔 固 有 层, 晚 期 浸 润 到 肺 泡 腔 内 呈 现 弥 漫 性 分 布, 提 示 PQ 染 毒 后 诱 发 机 体 产 生 强 烈 的 炎 症 反 应 进 一 步 检 测 到 PQ 染 毒 后 促 炎 因 子 的 上 调 抑 炎 因 子 的 下 调 等, 这 些 炎 症 因 子 相 互 作 用, 级 联 放 大, 共 同 介 导 炎 症 因 子 风 暴 的 发 生, 这 种 过 激 的 免 疫 反 应 对 组 织 造 成 二 次 损 伤, 促 进 ALI 的 发 展 成 ARDS 及 MODS 而 导 致 机 体 死 亡 Hongetal [14] 发 现 IL 33 与 其 受 体 ST2 的 活 化 参 与 哮 喘 中 Th2 介 导 的 肺 部 免 疫 应 答 及 参 与 过 敏 原 诱 导 的 肥 大 细 胞 激 活, 提 示 IL 33 在 慢 性 炎 症 中 发 挥 促 炎 作 用 另 一 方 面 IL 33 也 可 作 为 高 内 皮 小 静 脉 核 因 子 起 转 录 抑 制 作 用, 辅 助 抑 制 前 炎 症 基 因 表 达, 具 有 抗 炎 作 用 Hazletetal [15] 报 道 IL 33 在 细 菌 感 染 中 通 过 上 调 Th2 类 细 胞 因 子, 抑 制 Th1 类 细 胞 因 子 清 除 细 菌 从 而 对 机 体 起 保 护 作 用, 外 源 性 应 用 重 组 IL 33 可 以 减 轻 感 染 铜 绿 假 单 胞 菌 引 起 的 角 膜 炎 症 Walzletal [16] 研 究 发 现 用 抗 ST2(IL 33 受 体 ) 单 克 隆 抗 体 给 小 鼠 静 脉 注 射 后 会 减 弱 Th2 类 细 胞 因 子 相 关 的 嗜 酸 性 呼 吸 道 炎 症 的 形 成 但 是 目 前 鲜 有 报 道 IL 33 在 急 性 炎 症 中 的 具 体 作 用 和 功 能 评 价 本 文 研 究 显 示,PQ 染 毒 后 小 鼠 肺 组 织 中 IL 33 在 mrna 和 蛋 白 表 达 水 平 明 显 下 调, 提 示 IL 33 在 化 学 毒 物 PQ 诱 导 ALI 中 可 能 发 挥 保 护 作 用, 这 可 能 与 IL 33 转 录 抑 制 调 控 介 导 的 抑 炎 作 用 有 关 而 在 PQ 损 伤 48h 后,IL 33mRNA 和 蛋 白 水 平 呈 现 升 高 趋 势, 提 示 IL 33 在 抑 制 炎 症 和 促 进 炎 症 的 角 色 转 换, 推 测 ALI 模 型 中 IL 33 也 可 能 转 化 为 促 炎 因 子 以 发 挥 作 用 而 关 联 分 析 结 果 显 示,IL 33 与 IL 1β IL 6 TNF α 及 MPO 呈 现 显 著 相 关 性, 提 示 IL 33 在 PQ 诱 导 ALI 中 发 挥 重 要 作 用, 并 且 在 化 学 毒 物 诱 导 急 性 内 源 性 炎 症 细 胞 因 子 的 紊 乱 中,IL 33 可 能 在 早 期 发 挥 核 转 录 抑 制 作 用, 缓 解 了 促 炎 因 子 的 积 聚 和 爆 发, 推 测 IL 33 在 急 性 炎 症 中 早 期 发 挥 重 要 的 调 控 作 用, 提 示 在 机 体 受 到 外 界 急 性 刺 激 后, 有 可 能 通 过 干 预 IL 33 表 达 变 化, 以 达 到 调 控 机 体 自

1032 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 身 炎 症 因 子 紊 乱 作 用 参 考 文 献 [1] WareLB,MathayM A.Theacuterespiratorydistressyndrome [J].NEnglJMed,2000,342(18):1334-49. [2] OnyeamaHP,OehmeFW.Aliteraturereviewofparaquattoxici ty[j].vethumtoxicol,1984,26(6):494-502. [3] ObokiK,OhnoT,KajiwaraN,etal.IL 33andIL 33receptors inhostdefenseanddiseases[j].alergolint,2010,59(2):143-60. [4] XuD,JiangHR,KewinP,etal.IL 33exacerbatesantigenin ducedarthritisbyactivatingmastcels[j].procnatlacadsciu SA,2008,105(31):10913-8. [5] MilerAM.RoleofIL 33ininflammationanddisease[J].JIn flam(lond),2011,8(1):22. [6] SchmitzJ,OwyangA,OldhamE,etal.IL 33,aninterleukin 1 likecytokinethatsignalsviatheil 1receptorrelatedproteinST2 andinducesthelpertype2 asociatedcytokines[j].immunity, 2005,23(5):479-90. [7] CariereV,RouselL,OrtegaN,etal.IL 33,theIL 1 likecyto kineligandforst2receptor,isachromatin asociatednuclear factorinvivo[j].procnatlacadsciusa,2007,104(1): 282-7. [8] SunSH,ZhaoGY,LiuCF,etal.Inhibitionofcomplementac tivationaleviatesacutelunginjuryinducedbyhighlypathogenica vianinfluenzah5n1virusinfection[j].am JRespirCelMol Biol,2013,49(2):221-30. [9] RitirschD,FlierlM A,DayDE,etal.Acutelunginjuryin ducedbylipopolysaccharideisindependentofcomplementactiva tion[j].jimmunol,2008,180(11):7664-72. [10]SunSH,WangHB,ZhaoGY,etal.ComplementInhibitional leviatesparaquat inducedacutelunginjury[j].amjrespircel MolBiol,2011,45(4):834-42. [11] ImaiY,KubaK,NeelyGG,etal.Identificationofoxidative stresandtol likereceptor4signalingasakeypathwayofacute lunginjury[j].cel,2008,133(2):235-49. [12]DolinayT,KimYS,HowrylakJ,etal.Inflammasome regulated cytokinesarecriticalmediatorsofacutelunginjury[j].amjre spircritcaremed,2012,185(11):1225-34. [13] MantovaniA,CasatelaMA,CostantiniC,etal.Neutrophilsin theactivationandregulationofinnateandadaptiveimmunity[j]. NatRevImmunol,2011,11(8):519-31. [14]HongYS,MoonSJ,JooYB,etal.Measurementofinterleukin 33(IL 33)andIL 33receptors(sST2andST2L)inpatientswith rheumatoidarthritis[j].jkoreanmedsci,2011,26(9):1132-9. [15]HazletLD,McClelanSA,BaretRP,etal.IL 33shiftsmac rophagepolarization,promotingresistanceagainstpseudomonas aeruginosakeratitis[j].investophthalmolvissci,2010,51 (3):1524-32. [16]WalzlG,MathewsS,KendalS,etal.InhibitionofT1/ST2dur ingrespiratorysyncytialvirusinfectionpreventsthelperceltype2 (Th2)butnotTh1 drivenimmunopathology[j].jexpmed, 2001,193(7):785-92. Roleofinterleukin 33inparaquat inducedacutelunginjury LiuChenfeng 1,2,WuXiaohong 2,ZengYang 2,etal ( 1 BeijingInstituteofMicrobiologyandEpidemiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230032; 2 StateKey LaboratoryofPathogenandBiosecurity,BeijingInstituteofMicrobiologyandEpidemiology,Beijing 100071) Abstract Objective Toevaluateroleofinterleukin33(IL 33)inparaquat(PQ) inducedacutelunginjury (ALI).Methods 25femaleBALB/cmicewererandomlydividedintofivegroup:controlgroup(injectionwith physiologicalsaline),pq6hgroup[6hafterparaquatpoisoning(30mg/kg)],pq12hgroup,pq24hgroup andpq48hgroup.almicewerekiledatindicatedtimeafterpqpoisoning.thelungtisuewasweightedbythe ratioof(lung/mouse)weight,andlunginjuryandneutrophilinfiltrationwereobservedbyhematoxylin eosinstai ningandimmunohistochemistryrespectively.besides,interleukin 1β(IL 1β),IL 2,IL 6,tumornecrosisfactor α(tnf α)inserumandmyeloperoxidase(mpo)inlungtisueweredeterminedbyrelevantelisakits.further more,theil 33mRNAinlungtisuewasdetectedbyquantitativerealtimePCR,whiletheIL 33proteinwasde tectedusingimmunohistochemistryandwesternblotasay.spearman srankcorelationbetweenil 33andother variablesorseverityoflungimpairmentwereanalyzedsimultaneously.results Thereweremarkedhistologicalle sionsandneutrophilsinfiltrationinlungtisueandasignificantincreaseofil 1β,IL 6,TNF αandmpoinserum afterpqpoisoningatindicatedtime,whilealowerlevelofil 33andIL 2werefoundinserumcomparewithcon trolgroup(p<0 05).TherewasanegativecorelationbetweenIL 33andlungdamagescores,relativelung weight,il 1β,IL 6,TNF αandmpo(p<0 05).NosignificantcorelationwasfoundbetweenIL 33andIL 2. Conclusion OurstudyindicatesthatendogenousIL 33fluctuationplaysacrucialroleinPQ inducedacutelung injury,whichrepresentsapotentialtargetforclinicalinterventionduringpq inducedali. Keywords interleukin33;paraquat;acutelunginjury;inflammation

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1033 利 用 高 通 量 测 序 快 速 检 测 H7N9 禽 流 感 病 毒 及 基 因 组 序 列 分 析 裴 广 倩 1,2, 范 航 2, 安 小 平 2, 王 伟 2, 徐 晓 蒙 2, 史 套 兴 2 2, 童 贻 刚 摘 要 目 的 探 索 用 高 通 量 测 序 技 术 检 测 咽 拭 子 样 本 中 H7N9 禽 流 感 病 毒 的 方 法 方 法 分 别 提 取 编 号 为 106 089 及 0243 份 样 本 RNA, 反 转 录,cDNA 扩 增, 用 IonTorent 进 行 高 通 量 测 序, 对 测 序 结 果 进 行 生 物 信 息 学 分 析 结 果 3 个 咽 拭 子 样 本 的 测 序 结 果 中 均 能 检 测 出 禽 流 感 病 毒, 拼 接 出 的 基 因 组 序 列 可 以 进 行 生 物 信 息 学 分 析 结 论 利 用 高 通 量 测 序 技 术 可 以 快 速 地 检 测 H7N9 禽 流 感 病 毒, 并 可 用 生 物 信 息 学 软 件 拼 接 基 因 组 序 列 及 进 行 序 列 分 析 关 键 词 中 图 分 类 号 高 通 量 测 序 ;H7N9 禽 流 感 病 毒 ; 生 物 信 息 学 分 析 R373.19;Q7 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1033-06 禽 流 感 病 毒 是 一 种 引 起 禽 类 部 分 哺 乳 动 物 及 人 类 传 染 性 疾 病 的 甲 型 流 感 病 毒, 两 个 宿 主 相 同 的 甲 型 流 感 病 毒 之 间 的 8 个 RNA 片 段 经 常 发 生 重 配 [1], 而 且 其 依 赖 于 RNA 的 RNA 聚 合 酶 缺 少 校 对 功 能, 导 致 其 在 复 制 过 程 中 基 因 组 的 高 突 变 率, 这 2 个 特 性 使 得 甲 型 流 感 病 毒 不 断 进 化, 引 起 人 类 感 染, 有 时 发 生 大 爆 发, 感 染 人 的 禽 流 感 病 毒 亚 型 主 要 为 H5N1 [2-3] H9N2 H7N7 在 2013 年 以 前,H7N9 仅 感 染 禽 类, 并 未 发 现 过 感 染 人 的 情 况 [4], 然 而, 自 2013 年 2 月 19 日 开 始, 我 国 的 上 海 安 徽 等 东 南 省 市, 陆 续 新 发 现 了 由 H7N9 禽 流 感 病 毒 引 起 人 感 染 病 例, 患 者 均 出 现 严 重 的 肺 炎 和 急 性 呼 吸 窘 迫 综 合 2014-02-25 接 收 基 金 项 目 : 国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 863 计 划 ( 编 号 :2012AA022 003); 艾 滋 病 和 病 毒 性 肝 炎 等 重 大 传 染 病 防 治 科 技 重 大 专 项 十 二 五 实 施 计 划 ( 编 号 :2013ZX10004 605 2013ZX10004 217 2013ZX10004 607 2011ZX10004 001); 重 大 新 药 创 制 科 技 重 大 专 项 十 二 五 实 施 计 划 ( 编 号 : 2011ZX09401 023); 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : 81072350); 病 原 微 生 物 生 物 安 全 国 家 重 点 实 验 室 开 放 课 题 ( 编 号 :SKLPBS1113) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学, 合 肥 230032 2 军 事 医 学 科 学 院 微 生 物 流 行 病 研 究 所, 病 原 微 生 物 生 物 安 全 国 家 重 点 实 验 室, 北 京 100071 作 者 简 介 : 裴 广 倩, 女, 硕 士 研 究 生 ; 史 套 兴, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:shitaoxing @sina.com 童 贻 刚, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:tong.yi gang@gmail.com 征 (acuterespiratorydistressyndrom,ards) [5-6] H7N9 禽 流 感 病 毒 是 H7 亚 型 与 H9N2 亚 型 基 因 重 配 产 生 的 新 病 毒, 病 毒 的 一 些 关 键 位 点 发 生 改 变 导 致 该 病 毒 感 染 人 类 [7] 随 着 技 术 的 发 展 与 研 究 的 深 入, 高 通 量 测 序 技 术 成 为 快 速 获 得 病 原 体 基 因 组 序 列 的 重 要 手 段 之 一 该 研 究 利 用 美 国 LifeTech nologies 公 司 IonPGM 高 通 量 测 序 仪 检 测 3 个 咽 拭 子 样 本, 获 得 了 基 因 组 序 列 并 进 行 了 生 物 信 息 学 分 析 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 编 号 为 106 089 及 0243 份 样 本 均 来 自 于 鸡 咽 拭 子 :106 号 样 本 进 行 鸡 胚 培 养 ;089 号 样 本 经 过 禽 流 感 病 毒 通 用 引 物 荧 光 定 量 RT PCR 检 测,CT 值 为 16 2;024 号 样 本 经 过 禽 流 感 病 毒 通 用 引 物 荧 光 定 量 RT PCR 检 测,CT 值 为 29 9 1.2 主 要 试 剂 引 物 合 成 于 明 琛 志 远 生 物 技 术 有 限 公 司 ;MagMAX TM ViralRNAIsolationKit 反 转 录 试 剂 盒 SuperScript Ⅲ One StepRT PCRSystem with Platinum TaqDNA Polymerase 均 购 自 于 美 国 In vitrogen 公 司 ;DNAPolymerase2XPCRMasterMix 购 自 于 博 迈 德 公 司 ;PCR 产 物 纯 化 试 剂 盒 购 自 于 德 国 Qiagen 公 司 ;NEBNext FastDNALibraryPrepSetfor IonTorent TM 购 自 于 NewEnglandBiolabs 公 司 ;Ion ShearTM PlusReagentsKit IonOneTouch TM 200Tem platekitv2dl IonPGM TM Sequencing300Kit 及 Ion Torent 测 序 仪 均 购 自 于 美 国 LifeTechnologies 1.3 方 法 1.3.1 引 物 合 成 用 于 流 感 病 毒 的 通 用 反 转 录 引 物 序 列 为 Uni12(M):AGCRAAAGCAGG, 通 用 引 物 [8] 序 列 分 别 为 :MBTuni 12:5 ACGCGTGATCAG CAAAAGCAGG 3 ;MBTuni 13:5 ACGCGTGATCAG TAGAAACAAGG 3 用 于 扩 增 流 感 病 毒 的 8 对 全 [9] 长 引 物 序 列 见 表 1, 为 了 扩 增 低 浓 度 样 本 中 的 H7N9, 以 A/Anhui/1/2013(H7N9) 基 因 组 为 参 考 序 列, 设 计 合 成 35 对 小 片 段 引 物 序 列, 见 表 2 1.3.2 RNA 提 取 按 照 MagMAX TM ViralRNAIso lationkit 说 明 书 操 作 : 取 400μl 咽 拭 子 样 品, 加 入 802μl 裂 解 液 (400μlLysis/BindingSoln.Concen

1034 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 1 流 感 病 毒 8 对 全 长 引 物 序 列 引 物 名 称 序 列 (5 3 ) 目 的 长 度 片 段 (bp) PB 2 1 AGCRAAAGCAGGTCAATTATATTCA PB 2 2341 PB 2 2341R AGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAACTA PB 1 1 AGCRAAAGCAGGCAAACCATTTGAATG PB 1 2341 PB 1 2341R AGTAGAAACAAGGCATTTTTTCATGAA PA 1 AGCRAAAGCAGGTACTGATYCGAAATG PA 2233 PA 2233R AGTAGAAACAAGGTACTTTTTTGGACA HA 1 AGCAAAAGCAGGGGAAAATA HA 1778 HA 1778R AGTAGAAACAAGGGTGTTTT NP 1 AGCAAAAGCAGGGTAGATAA NP 1565 NP 1565R AGTAGAAACAAGGGTATTTTT NA 1 AGCAAAAGCAGGAGTGAAAA NA 1413 NA 1413R AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT M 1 AGCAAAAGCAGGTAGATATT M 1027 M 1027R AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT NS 1 AGCAAAAGCAGGGTGACAAA NS 890 NS 890R AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 表 2 35 对 小 片 段 引 物 引 物 名 称 序 列 (5 3 ) 目 的 长 度 片 段 (bp) PB 2 1 F:ATGTCACAGTCTCGCACTCG PB 2 1 403 R:CCCTGCGGCGTATTTTAACC PB 2 2 F:ATGGACCAACGACAAGCACA PB 2 2 550 R:TGGCACATCTCCAAAAGCGA PB 2 3 F:ATTTGACCCAAGGGACCTGC PB 2 3 592 R:GGATTTAGCCGCTGGTTTGC PB 2 4 F:CCGAGGCAATCATAGTGGCA PB 2 4 445 R:TCCGGACCATTGATCTCCCA PB 2 5 F:TCCAGCACTGAGAGAGTGGT PB 2 5 466 R:CGGAACCCCTCACATTCACA PB 2 6 F:GCGTGACGTACTGGGAACAT PB 2 6 457 R:CCGAATCCTTTTGGTCGCTG PB 1 1 F:AAGTGCCAGTGCAAAATGCT PB 1 1 439 R:GCTGTCAGGCCATTCGATCT PB 1 2 F:GCCAGACCTATGACTGGACG PB 1 2 438 R:GGAGGCCAGATTGCTCAAGT PB 1 3 F:TGCTGAAAGAGGCAAGCTGA PB 1 3 424 R:TTCCGCTGGTACTTGTGTCC PB 1 4 F:AACCCCCGGATGTTTCTAGC PB 1 4 600 R:TCCAAAACTGGGCAACTCCA PB 1 5 F:GGACGGACTCCAATCCTCAG PB 1 5 479 R:GGTTTGGCCCTCCATCTGAA PB 1 6 F:GACCAGCAACAGCTCAAATG PB 1 6 439 R:TCGTCCTCAAGAATCCCCCT PB 1 7 F:GGTTTCAGATGGAGGGCCAA PB 1 7 500 R:TTTGCCGTCTGAGCTCTTCA PA 1 F:GTGCGACAGTGCTTCAATCC PA 1 495 R:TGCCCTGCTTTCTTCGTCAA PA 2 F:TTGGAGTGACGAGGAGGGAA PA 2 530 R:GCTCGGGTCCTCAATGCTTA PA 3 F:GTGAACGCCAGAATTGAGCC PA 3 501 R:GTCAGTCAGTTCACACGCCT PA 4 F:GAGAACATGGCACCGGAGAA PA 4 484 R:CCAACCTTGGGTCGGTAAGG PA 5 F:TACAGCAGAGGTGTCCCACT PA 5 582 R:AAGGTTCTGCACACCTTCCC PA 6 F:ATGGAAATGAGACGCTGCCT PA 6 410 续 表 2 引 物 名 称 序 列 (5 3 ) 目 的 长 度 片 段 (bp) R:AGTGCATGTGTGAGGAAGGAG HA 1 F:CTGGGGACAATCACTGGACC HA 1 474 R:AACTTGTGGTCTCGCTCCTG HA 2 F:CAGGAGCGAGACCACAAGTT HA 2 433 R:CCCTGTGCATTCTGGTGTCT HA 3 F:ACACCAGAATGCACAGGGAG HA 3 579 R:GTGCACCGCATGTTTCCATT NP 1 F:AATGGTTAGCGGCATTGGGA NP 1 393 R:CGGGGATCCATTCCAGTACG NP 2 F:GAGGATGCAACTGCTGGTCT NP 2 553 R:GGCTGTTTTGAAGCAGACGG NP 3 F:CCTGCTTGTGTGTACGGACT NP 3 378 R:AGATGCCCTCTGTTGGTTGG NP 4 F:TGGTCCCAAGAGGACAGCTA NP 4 366 R:GGTTCGTTGCCTTTTCGTCC NA 1 F:AGTATCGCGCCCTGATAAGC NA 1 400 R:CCTGTTCGTTCCCCGTAACA NA 2 F:ATGCCCAGTAGTGTTCACCG NA 2 375 R:AGCCAAGTGTTAGCCCCATC NA 3 F:GATGGGGCTAACACTTGGCT NA 3 260 R:TTGCTGGTCCACCACACTTT NA 4 F:GAAGGGGACTGCTATCGAGC NA 4 144 R:CCCATCAGGCCAGTTCCATT M 1 F:TTGCAGGGAAGAACGCAGAT M 1 554 R:CATAGCCTGCACCATTTGCC M 2 F:TGTGCCACTTGTGAGCAGAT M 2 436 R:AGGCCCTCTTTTCAAACCGT M 3 F:AGGCAAATGGTGCAGGCTAT M 3 311 R:CAGCATTCTGCTGTTCCTGC NS 1 F:ACTGTGTCAAGCTTCCAGGT NS 1 464 R:TCGCCTACAATTGCTCCTTCT NS 2 F:TGCCAGCTCCACGCTATCTA NS 2 559 R:TCTCTTGCTCCACTTCAAGC trate,2μlcarierrna,400μl100% Isopropanol), 20μl 磁 珠 混 合 液 (10μlRNABindingBeads,10μl Lysis/BindingEnhancer), 震 荡 4min, 使 其 充 分 裂 解 并 吸 附 核 酸, 放 在 磁 力 架 上, 溶 液 变 澄 清 后 弃 掉 上 清 液, 然 后 加 入 300μlWashSolution1( 加 入 100% 异 丙 醇 ) 洗 涤 2 次,450μlWashSolution2( 加 入 100% 乙 醇 ) 洗 涤 2 次, 风 干 乙 醇 2min, 最 后 用 20μlRNA freewater 洗 脱 1.3.3 逆 转 录 及 cdna 扩 增 取 1μl106 号 样 品 RNA 进 行 一 步 法 扩 增, 加 入 25μl2 ReactionMix, 1μl10μmol/LMBTuni 12,1μl10μmol/LMBTuni 13,2μlSuperScript Ⅲ RT/Platinum TaqMix,20 μlddh 2 O, 混 匀, 放 在 PCR 仪 上, 设 置 程 序 为 :55 30min;94 2min;40 个 循 环 (94 15s;55 30s;68 2min);68 5min

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1035 取 8μl089 号 样 品 RNA, 加 入 1μl10mmol/L dntpmix,1μl10μmol/luni12(m),65 温 育 5 min, 冰 上 放 置 2min, 然 后 加 入 2μl10 RTbufer,4 μl25mmol/l MgCl 2,2μl0 1mol/L DTT,1 μl RNaseOUT(40U/μl),1μlSuperScriptⅢ RT(200 U/μl), 放 在 PCR 仪 上, 设 置 程 序 为 25 10min,50 50min,85 5min, 冰 上 2min, 最 后 加 入 1μl RNaseH,37 放 置 20min,cDNA 合 成, 之 后 用 8 对 全 长 引 物 进 行 PCR 扩 增 089 样 品 的 扩 增 条 件 见 表 3 基 因 表 3 089 样 品 的 扩 增 条 件 PCR 条 件 PB 2 PB 1 PA 94,4min;35 循 环 (94,35s;58,30s;72,7min);72,7min HA NP M NA 94,4min;35 循 环 (94,20s;43,30s;72,7min);72,7min NS 94,4min;35 循 环 (94,20s;58,30s;72,7min);72,7min 取 8μl024 号 样 品 RNA 进 行 反 转 录, 反 转 录 用 35 对 小 片 段 引 物 +8 对 全 长 引 物, 扩 增 时 用 35 对 小 片 段 引 物,PCR 条 件 设 置 为 :94 5min;35 循 环 (94 15s;55 30s;72 2min);72 7min 3 个 样 本 全 部 扩 增 完 后 进 行 电 泳 鉴 定 并 分 别 把 扩 增 产 物 混 合, 用 PCR 纯 化 试 剂 盒 进 行 纯 化 1.3.4 IonTorent 测 序 分 别 取 100ng 纯 化 产 物, 用 IonShear TM PlusReagentsKit 酶 法 打 断 7min, 加 入 1.8 倍 体 积 AMPureXPBeads 纯 化, 末 端 补 平, 两 端 加 接 头, 加 入 1.8 倍 体 积 AMPureXPBeads 纯 化, E Gel 胶 选 择 片 段 ( 约 390bp),PCR 扩 增, 加 入 1 倍 体 积 AMPureXPBeads 纯 化,2100 鉴 定 库 的 片 段 大 小 及 质 量, 文 库 构 建 成 功 以 后, 取 20μl 终 浓 度 为 300ng/L 的 工 作 库 进 行 油 包 水 PCR, 随 后 用 碱 法 将 双 链 DNA 变 单 链, 制 备 模 板, 最 后 将 带 有 模 板 的 微 粒 溶 液 离 心 使 其 进 入 到 318C 芯 片 的 微 孔 中, 上 机 测 序 1.3.5 生 物 信 息 学 分 析 上 机 测 序 后 经 测 序 仪 自 动 运 行 得 到 测 序 结 果, 测 序 原 始 结 果 以 图 片 形 式 保 存, 测 序 服 务 器 将 图 片 形 式 结 果 解 析 为 sf 格 式 的 原 始 文 件 和 fastq 格 式 的 测 序 序 列 数 据 对 fastq 格 式 的 测 序 序 列 进 行 过 滤 低 质 量 序 列 过 短 序 列 以 及 错 误 序 列 等 处 理 选 取 目 前 流 行 的 H7N9 禽 流 感 病 毒 序 列 以 及 部 分 其 他 亚 型 的 禽 流 感 病 毒 序 列 作 为 参 考 序 列, 将 测 序 数 据 使 用 CLCGenomicWorkbench 软 件 比 对 到 参 考 序 列 中, 通 过 覆 盖 参 考 序 列 的 序 列 数 量 比 例 以 及 参 考 序 列 被 覆 盖 的 长 度 判 断 样 品 中 是 否 有 对 应 的 病 毒, 拼 接 基 因 组 序 列, 并 且 分 析 其 进 化, 构 建 系 统 发 育 树 2 结 果 2.1 逆 转 录 后 PCR 扩 增 电 泳 鉴 定 分 别 取 5μl 106 号 样 本 089 号 样 本 的 8 个 全 长 扩 增 产 物 及 024 号 样 本 的 任 意 8 个 小 片 段 扩 增 产 物 进 行 电 泳 鉴 定, 见 图 1~3 106 号 样 本 经 过 凝 胶 电 泳 后 可 观 察 到 明 显 的 8 条 片 段 相 应 大 小 的 条 带,089 号 样 本 M 片 段 没 有 条 带,024 号 样 本 扩 增 出 的 条 带 很 少 图 1 106 号 样 本 片 段 扩 增 1:BM2000DNAMarker;2:PB 2 ;3:PB 1 ;4:PA;5:HA;6:NA;7: NP;8:M;9:NS;10: 阴 性 对 照 - 水 图 2 089 号 样 本 片 段 扩 增 1:PB 2 ;2:PB 1 ;3:PA;4:NS;5:BM2000DNAMarker;6:M ;7: HA;8:NA;9:NP;10: 阴 性 对 照 - 水 图 3 024 号 样 本 片 段 扩 增 1:BM2000DNAMarker;2:PB 2 2;3:PB 1 6;4:PA 3;5:HA 3; 6:NP 2;7:NA 1;8:M 1;9:NS 2;10: 阴 性 对 照 - 水

１３６ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ ２ ２ 文库的 ２１ 鉴定 分别取 １μｌ稀释相应倍 ｂｐ 浓度为 ５２３ ｎｇ Ｌ ８９号样本稀释 ２倍后片 数 ５ ５ｎ ｇ Ｌ 的 ３个样本文库 加入到 ２ １ 芯 段大小为 ３ ８３ｂ ｐ 浓度为 ３６９ｎ ｇ Ｌ ２４号样本稀 片中 对 ＤＮＡ库进行片段大小鉴定及浓度测定 见 释５ 倍后片段大小为 ３６ｂｐ 浓度为 １７２ ｎｇ Ｌ ６号样本稀释 １倍后片段大小为 ３ ６ ６ 图 ４ ６ １ 从图中可以 看 出３个 库 大 小 及 浓 度 都 符 合 上 机 要 图 ４ １６号样本稀释 １ 倍后的鉴定 图 ５ ８９号样本稀释 ２ 倍后的鉴定 图 ６ ２４号样本稀释 ５ 倍后的鉴定

安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １３７ 求 文库构建成功 ２ ３ Ｉ ｏｎｔｏ ｒ ｒ ｎ测序 不同 ＣＴ值的样本用高通 量测序都能检测到禽流感病毒 并且病毒含量低的 样本测序结果中流感病毒对应的序列较少 相比之 下病毒含量较高和培养的样本流感病毒占测序结果 ６号样本测得 ３ ８６１ １ ４条 ｒ ａ ｄｓ 匹 的比例较大 １ 配ｒ ａ ｄｓ数为 ３ ７９１２８ ８ ９号样本测得 １８ １９ ２ ６条 ｒ ａ ｄ ｓ 匹 配 ｒ ａ ｄ ｓ数 为 １ ７４１３ ２ ４号 样 本 测 得 图 ８ ２４号样本的 Ｈ９基因系统发育树 ７ ２６９６条 ｒ ａ ｄ ｓ 匹配 ｒ ａ ｄ ｓ数为 １７ ８１ ２ ４ 生 物 信 息 学 分 析 以 Ａ Ａｎ ｈｕ １ ２ １３ Ｈ７Ｎ９ 基因组为主要参考序列 辅助部分 Ｈ９Ｎ２的 基因组序列 将测序数据使用 ＣＬＣＧ ｎ ｏ ｍ ｃｗｏ ｒ ｋ ｂ ｎ ｃ ｈ软件比对到参考序列中 结果显示 ３个样本 的 ８个片段都可以检测出并且可以判断其类型 １ ６ 号样本为 Ｈ９Ｎ２禽流感病毒 ８ ９样本及 ２ ４样本均 为 Ｈ９Ｎ２与 Ｈ７Ｎ９混合型 其中 １ ６号样本的 ｍａ ｐ 图 ９ ２４号样本的 Ｈ７基因系统发育树 ｐ ｎ ｇ结果如图 ７所示 将 ３个样本的 ＨＡ ＮＡ基因 序列分别经过 Ｂｌ ａ ｓ 选取与之同源性较高的几个毒 株构建系统发育树 分析之间的亲缘关系 其中 ２ ４ ３ 讨论 号样本的 ＨＡ基因进化树如图 ８ ９所示 结果显示 ２４号样本的 Ｈ９基因与选取的几个毒株不在一个 传统的检测流感病毒 获取基因组序列的方法 分支上 亲缘关系较远 而 Ｈ７基因与其他几个毒株 是以基因特异引物扩增 ８个基因片段 进行克隆 选 在一个分支上 亲缘关系较近 择阳性克 隆 进 行 Ｓ ａ ｎｇ ｒ测 序 然 后 进 行 序 列 的 拼 接 构建病毒基因组 该方法操作比较繁琐 费时 费 力 自从 ２５年高通量测序仪问世以来 高通量测 序技术不断的迅速发展 从通量到读长得到了极大 的改善 具有标准化流水作业的文库构建流程 避免 了常规实验中的细菌转化 培养以及单克隆的挑选 等 而且短时间可以获得大量有效的数据 这对于快 速获取病原体的全部遗传信息具有重要意义 Ｉ ｏ ｎ Ｔｏ ｒ ｒ ｎ 高通 量 测 序 技 术 基 于 半 导 体 技 术 具 有 简 单 快速 准确 灵活和低成本等显著优势 是中等规 １ ２ １２年 Ｂｏ ｗｍａ ｎ ａ ｌ 利 模测序项目的最佳选择 ｏ ｎｔｏ ｒ ｒ ｎ高通量测序技术分 析 了 Ｈ３Ｎ２基 因 用Ｉ 组 １ ６号样本经过鸡胚培养 浓度较高 采用一步 法扩增 几乎能获得病毒基因组全长序列 ８９号 样本 浓度相对较低 采用上述方法 很难获得病毒 基因组全长序列 ８个片段中有些片段扩增效率较 高 就会获得很高的覆盖度 而扩增效率低的某些片 段将无法获得理想的结果 所以 对于浓度较低的 样品采用分布扩增法 即反转录后分别用特异性引 图 ７ １ ６号样本 ＣＬＣ的 ｍａｐｐ ｎｇ图 ２４号样本 由 物扩增 ８个片段 对于浓度极低的

1038 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 于 样 本 中 模 板 浓 度 很 低, 并 且 病 毒 核 酸 不 完 整, 用 Uni12(M) 扩 增 只 能 获 得 靠 近 3 端 的 大 量 产 物, 很 难 扩 增 出 片 段 的 全 长 因 此 根 据 H7N9 的 8 个 片 段 设 计 35 对 小 片 段 引 物, 在 反 转 录 过 程 中 加 入 35 对 小 片 段 引 物 和 8 对 全 长 引 物, 使 断 裂 的 vrna, 也 能 被 转 录 成 cdna, 随 后 用 35 对 小 片 段 引 物 进 行 扩 增, PCR 产 物 长 度 主 要 在 400~500bp, 相 对 容 易 得 到 基 因 组 全 长 序 列 高 通 量 测 序 数 据 结 果 验 证 了 这 3 种 方 法 的 可 行 性 综 上 所 述, 本 研 究 建 立 了 用 高 通 量 测 序 技 术 检 测 咽 拭 子 标 本 中 H7N9 禽 流 感 病 毒 的 方 法, 无 论 在 样 本 中 的 病 毒 含 量 高 或 者 低, 都 能 有 充 分 的 数 据 用 于 检 出 并 判 段 其 型 别 相 对 来 说, 高 病 毒 含 量 的 样 本 更 容 易 对 已 知 病 原 体 做 出 检 验 参 考 文 献 [1] LiC,HataM,WatanabeS,etal.Compatibilityamongpolymerase subunitproteinsisarestrictingfactorinreasortmentbetweene quineh7n7andhumanh3n2influenzaviruses[j].jvirol, 2008,82(23):11880-8. [2] PeirisJM,deJongM D,GuanY.Avianinfluenzavirus (H5N1):athreattohumanhealth[J].ClinMicrobiolRev, 2007,20(2):243-67. [3] GambotoA,Barat BoyesSM,deJongMD,etal.Humaninfec tionwithhighlypathogenich5n1influenzavirus[j].thelancet, 2008,371(9622):1464-75. [4] 朱 闻 斐, 高 荣 保, 王 大 燕, 等.H7 亚 型 禽 流 感 病 毒 概 述 [J]. 病 毒 学 报,2013,29(003):245-9. [5] GaoR,CaoB,HuY,etal.Humaninfectionwithanovelavian origininfluenzaa(h7n9)virus[j].nengljmed,2013,368 (20):1888-97. [6] WenYM,KlenkHD.H7N9avianinfluenzavirus searchandre search[j].emergingmicrobes&infections,2013,2(4):e18. [7] KageyamaT,FujisakiS,TakashitaE,etal.Geneticanalysisof novelaviana(h7n9)influenzavirusesisolatedfrompatientsin China,FebruarytoApril2013[J].EuroSurveil,2013,18 (15):20453. [8] ZhouB,DonnelyM E,ScholesDT,etal.Single reactionge nomicamplificationacceleratessequencingandvaccineproduction forclasicalandswineoriginhumaninfluenzaaviruses[j].jvir ol,2009,83(19):10309-13. [9] ChanCH,LinKL,ChanY,etal.Amplificationoftheentire genomeofinfluenzaavirush1n1andh3n2subtypesbyreverse transcriptionpolymerasechainreaction[j].jvirolmethods, 2006,136(1-2):38-43. [10] BowmanAS,SreevatsanS,KilianM L,etal.Molecularevi denceforinterspeciestransmisionofh3n2pm/h3n2vinfluenza AvirusesatanOhioagriculturalfair,July2012[J].Emerging Microbes&Infections,2012,1(10):e33. DetectionofavianinfluenzaA(H7N9)virusbyhigh throughput sequencingandgenomicsequenceanalysis PeiGuangqian 1,2,FanHang 2,AnXiaoping 2,etal ( 1 AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230032; 2 StateKeyLaboratoryofPathogenandBiosecurity, BeijingInstituteofMicrobiologyandEpidemiology,Beijing 100071) Abstract Objective Toexplorethemethodsofhigh throughputsequencingforavianinfluenzaa(h7n9)virus detectionfromthroatswabs.methods RNAwasextractedfromthreethroatswabspecimens,folowedbyreverse transcription,amplificationofthecdna,andthenthecdnaampliconsweresequencedwithiontorent.finaly thesequencingdatawereanalyzedusingbioinformaticssoftware.results AvianinfluenzaA(H7N9)viruscould bedetectedfromthroatswabspecimensbydirectsequencingthecdnaampliconusingnext generationsequencing technique,andthegenomesequencescouldberapidlydetermined.conclusion High throughputsequencingisa powerfultoolfordetectionofavianinfluenzaa(h7n9)virusandthegenomesequencescanbeanalyzedusing bioinformaticssoftware. Keywords high throughputsequencing;avianinfluenzaa(h7n9)virus;bioinformaticsanalysis

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1039 环 氧 化 酶 2 表 达 在 NK/T 细 胞 淋 巴 瘤 化 疗 耐 药 中 的 作 用 及 其 机 制 研 究 王 亚 民, 顾 康 生 摘 要 目 的 探 讨 环 氧 化 酶 2(COX 2) 的 表 达 导 致 NK/T 细 胞 淋 巴 瘤 细 胞 株 化 疗 耐 药 的 可 能 机 制 方 法 MTS 法 检 测 表 阿 霉 素 COX 2 抑 制 剂 塞 来 昔 布 及 Akt 信 号 通 路 抑 制 剂 LY294002 对 NK/T 淋 巴 瘤 细 胞 株 YTS 的 生 长 影 响 Western blot 检 测 表 阿 霉 素 作 用 后 COX 2 的 表 达 情 况, 高 表 达 COX 2 YTS 细 胞 分 成 表 阿 霉 素 组 表 阿 霉 素 联 合 塞 来 昔 布 (20 μmol/l) 组 及 表 阿 霉 素 塞 来 昔 布 (20 μmol/l) 联 合 LY294002(25μmol/L) 组 进 行 比 较,Westernblot 检 测 Akt p Akt Bax Bcl 2 Mcl 1 表 达 情 况,MTS 检 测 细 胞 存 活 率, 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 的 凋 亡 变 化 结 果 表 阿 霉 素 塞 来 昔 布 LY294002 对 YTS 的 生 长 均 具 有 细 胞 毒 作 用, 并 呈 剂 量 依 赖 性 表 阿 霉 素 可 以 诱 导 YTSCOX 2 的 高 表 达, 且 呈 剂 量 依 赖 性 与 未 被 诱 导 细 胞 相 比,COX 2 高 表 达 的 细 胞 株 对 表 阿 霉 素 的 耐 受 性 提 高,Westernblot 结 果 显 示 Bcl 2 Mcl 1 和 p Akt 蛋 白 表 达 升 高,Bax 蛋 白 表 达 降 低 COX 2 高 表 达 YTS 细 胞 分 成 表 阿 霉 素 组 表 阿 霉 素 联 合 塞 来 昔 布 (20 μmol/l) 组 及 表 阿 霉 素 塞 来 昔 布 (20 μmol/l) 联 合 LY294002(25μmol/L) 组 进 行 比 较, 细 胞 存 活 率 依 次 降 低 ; 凋 亡 率 依 次 升 高 ;Bax 表 达 依 次 升 高 ;p Akt Bcl 2 Mcl 1 表 达 依 次 降 低 结 论 表 阿 霉 素 可 诱 导 NK/T 淋 巴 瘤 细 胞 株 YTSCOX 2 表 达, 高 表 达 COX 2 细 胞 株 可 能 通 过 p Akt 信 号 通 路 介 导 细 胞 凋 亡 途 径 提 高 对 表 阿 霉 素 的 耐 受 性 关 键 词 环 氧 化 酶 2; 凋 亡 ;Akt; 表 阿 霉 素 ;NK/T 淋 巴 瘤 细 胞 株 YTS 中 图 分 类 号 R733.4 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1039-06 环 氧 化 酶 2(Cyclooxygenase 2,COX 2) 是 前 列 [1] 腺 素 合 成 过 程 中 的 一 个 重 要 限 速 酶, 研 究 表 明 在 鼻 型 NK/T 细 胞 淋 巴 瘤 患 者 中,COX 2 表 达 可 以 作 为 治 疗 反 应 不 佳 的 预 后 因 子, 提 示 COX 2 在 该 类 型 淋 巴 瘤 肿 瘤 对 化 疗 的 耐 受 性 方 面 发 挥 重 要 作 用 ; 而 化 疗 耐 药 的 一 个 重 要 原 因 是 肿 瘤 对 凋 亡 诱 导 的 耐 受, 其 中 磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶 / 蛋 白 激 酶 B(phosphati dylinositol3 kinase/akt,pi3k/akt) 信 号 通 路 的 激 活 2014-02-25 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 高 校 省 级 自 然 科 学 研 究 项 目 ( 编 号 :KJ2011Z164) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 肿 瘤 科, 合 肥 230022 作 者 简 介 : 王 亚 民, 男, 硕 士 研 究 生 ; 顾 康 生, 男, 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:ks63@ tom.com. 被 认 为 是 肿 瘤 细 胞 抗 凋 亡 的 主 要 机 制 之 一, 影 响 肿 瘤 细 胞 对 化 疗 的 敏 感 性 为 探 讨 NK/T 细 胞 淋 巴 瘤 耐 药 的 机 制, 该 研 究 拟 采 用 化 疗 药 物 表 阿 霉 素 诱 导 NK/T 淋 巴 瘤 细 胞 株 YTS, 获 得 高 表 达 COX 2 细 胞 株 并 进 行 分 组 研 究, 检 测 p Akt Bax Bcl 2 Mcl 1 表 达 和 细 胞 存 活 率 ; 探 讨 p Akt 信 号 通 路 和 细 胞 凋 亡 途 径 在 COX 2 高 表 达 的 NK/T 细 胞 淋 巴 瘤 化 疗 耐 药 中 的 作 用 及 可 能 机 制 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 人 NK/T 淋 巴 瘤 细 胞 株 YTS 由 郑 州 大 学 第 一 附 属 医 院 张 明 智 教 授 馈 赠 ;1640 培 养 基 购 自 赛 默 飞 世 尔 生 物 化 学 制 品 ( 北 京 ) 有 限 公 司 ; 表 阿 霉 素 塞 来 昔 布 购 自 美 国 辉 瑞 公 司 ;LY294002 购 自 美 国 Sigma 公 司 ;COX 2 单 抗 和 Bax Bcl 2 Mcl 1 Akt p Akt 单 抗 购 自 美 国 BioworldTechnology 公 司 ;β ac tin 鼠 / 兔 二 抗 均 购 自 北 京 中 杉 金 桥 公 司 ;Marker 和 发 光 剂 购 自 美 国 ThermoScientific 公 司 ;BCA 蛋 白 定 量 试 剂 盒 购 自 原 平 皓 生 物 技 术 有 限 公 司 1.2 方 法 1.2.1 细 胞 培 养 人 NK/T 淋 巴 瘤 细 胞 株 YTS 接 种 于 含 10% 胎 牛 血 清,1% 非 必 须 氨 基 的 1640 培 养 基 中,37 5% CO 2 饱 和 湿 度 培 养 箱 中 常 规 培 养,3 ~4d 传 代 1.2.2 不 同 剂 量 表 阿 霉 素 对 YTS 细 胞 生 长 的 影 响 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 ( 细 胞 数 为 10 10 4 /ml), 每 孔 90μl 接 种 96 孔 板, 分 别 加 入 含 表 阿 霉 素 (0 3 33 6 66 9 99 1 32 1 67mg/L) 培 养 液, 终 液 量 100μl/ 孔, 并 设 等 量 PBS 孔 调 零 培 养 24h 加 入 MTS20μl, 继 续 培 养 4h, 酶 标 仪 检 测 450nm 波 长 处 的 吸 光 值 (A) 1.2.3 不 同 剂 量 塞 来 昔 布 对 YTS 细 胞 生 长 的 影 响 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 ( 细 胞 数 为 10 10 4 /ml), 每 孔 90μl 接 种 于 96 孔 板 将 含 塞 来 昔 布 (0 20 40 60 80 100μmol/L) 的 培 养 液 加 入 接 种 于 96 孔 板 的 YTS 细 胞 终 液 量 100μl/ 孔, 并 设 等 量 PBS 孔 调 零 培 养 24h 加 入 MTS20μl, 继 续 培 养 4h, 酶 标 仪 检 测 A 值

1040 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1.2.4 不 同 剂 量 LY294002 对 YTS 细 胞 生 长 的 影 响 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 ( 细 胞 数 为 10 10 4 /ml), 每 孔 90μl 接 种 于 96 孔 板 将 含 LY294002(0 25 50 75 100 150μmol/L) 的 培 养 液 加 入 接 种 于 96 孔 板 的 YTS 细 胞 终 液 量 100μl/ 孔, 并 设 等 量 PBS 孔 调 零 培 养 24h 加 入 MTS20μl, 继 续 培 养 4h, 酶 标 仪 检 测 A 值 每 组 设 定 5 个 复 孔, 取 其 平 均 值, 实 验 重 复 3 次 细 胞 存 活 率 =( 实 验 组 A 值 / 对 照 组 A 值 ) 100%, 细 胞 死 亡 率 =1- 细 胞 存 活 率 1.2.5 表 阿 霉 素 对 COX 2 表 达 不 同 的 YTS 细 胞 存 活 率 的 影 响 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 ( 细 胞 数 为 10 10 4 /ml), 每 孔 90μl 接 种 于 96 孔 板 A 组 为 未 处 理 对 照 组,B 组 直 接 加 入 表 阿 霉 素 3 3mg/L10μl 作 用 24h C 组 每 孔 加 入 表 阿 霉 素 0 33mg/L10 μl 预 作 用 3h 后 再 加 入 表 阿 霉 素 3.3mg/L10μl 作 用 24h 设 等 量 PBS 孔 调 零 培 养 24h 加 入 MTS20 μl, 继 续 培 养 4h, 酶 标 仪 检 测 A 值 1.2.6 不 同 干 预 组 作 用 于 高 表 达 COX 2YTS 细 胞 后 细 胞 存 活 率 变 化 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 ( 细 胞 数 为 10 10 4 /ml), 每 孔 90μl 接 种 于 96 孔 板, 每 孔 均 加 入 表 阿 霉 素 0 33mg/L10μl 预 作 用 3h 后 分 组, C 组 每 孔 加 入 表 阿 霉 素 3 3mg/L10μl 作 用 24h,D 组 每 孔 加 入 表 阿 霉 素 3 3mg/L10μl 和 塞 来 昔 布 20μmol/L10μl 作 用 24h,E 组 加 入 表 阿 霉 素 3 3 mg/ml10 μl 和 塞 来 昔 布 20 μmol/l 10 μl 及 LY29400225μmol/L10μl 作 用 24h, 设 等 量 PBS 孔 调 零 培 养 24h, 加 入 MTS20μl, 继 续 培 养 4h, 酶 标 仪 检 测 A 值 1.2.7 流 式 细 胞 术 检 测 凋 亡 率 细 胞 分 组 和 处 理 同 上,A 组 为 对 照 组 作 用 24h 后 收 集 细 胞 先 将 每 孔 上 清 液 吸 取 到 对 应 的 10ml 离 心 管 中, 每 孔 加 1ml 预 冷 PBS 洗 涤 后 同 样 收 集 到 对 应 的 离 心 管 中, 1500r/min 离 心 10min 后 弃 上 清 液 后 同 样 用 预 冷 PBS 离 心 洗 涤 1 次 每 孔 加 750μlPI 溶 液,37 避 光 作 用 20min 以 充 分 消 化 细 胞, 吹 打 后 确 保 将 所 有 细 胞 收 集 到 离 心 管 中, 混 匀 4 避 光 染 色 过 夜 重 悬 收 集 细 胞, 混 匀 后 转 移 到 流 式 管 中, 流 式 细 胞 仪 在 FL3 参 数 即 第 三 荧 光 激 发 波 长 处 对 每 管 细 胞 进 行 DNA 细 胞 周 期 分 析, 并 将 结 果 予 以 保 存 WinM DI2.9 软 件 分 析 亚 二 倍 体 峰 DNA 含 量 所 占 细 胞 周 期 的 百 分 率 即 细 胞 凋 亡 率, 绘 制 量 效 曲 线 图 每 组 实 验 重 复 3 次 1.2.8 表 阿 霉 素 对 YTS 细 胞 COX 2 蛋 白 表 达 的 影 响 分 别 收 集 表 阿 霉 素 (0 0 033 0 165 0 33mg/ L) 作 用 3h 的 细 胞, 冰 上 裂 解 30min,4 离 心, 提 取 蛋 白 以 BCA 方 法 进 行 蛋 白 定 量,120 5min 变 性 处 理, 上 样 后 分 别 行 电 泳 100V30min 后 转 150V, 电 泳 至 溴 酚 蓝 刚 出 现 即 可, 终 止 电 泳 进 行 转 膜 按 预 染 Marker 切 取 相 应 分 子 量 凝 胶, 半 干 转 膜, 电 压 100V, 转 膜 1h, 含 5% 脱 脂 牛 奶 TBST 液 封 闭 2h, 孵 育 COX 2 单 抗 4 过 夜,TBST 清 洗 3 次, 每 次 15min 加 入 辣 根 酶 标 记 的 鼠 或 兔 二 抗 孵 育 1h,TBST 清 洗 后, 于 曝 光 仪 中 涂 上 发 光 剂 曝 光, 并 保 存 图 像 目 的 条 带 用 捷 达 801 专 业 数 码 凝 胶 成 像 与 分 析 系 统 3.3.2 进 行 分 析, 以 目 的 条 带 与 β actina 值 的 比 值 作 为 蛋 白 表 达 相 对 含 量 1.2.9 Westernblot 检 测 不 同 处 理 组 的 p Akt Bax Bcl 2 Mcl 1 蛋 白 表 达 分 别 提 取 A B C D E 组 细 胞 的 蛋 白, 按 照 1.2.8 中 方 法 检 测 Bax Bcl 2 Mcl 1 及 p Akt 蛋 白 表 达 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS19 0 统 计 软 件 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 单 变 量 两 组 资 料 间 的 比 较 采 用 t 检 验, 多 组 资 料 间 的 比 较 用 单 因 素 方 差 分 析 2 结 果 2.1 表 阿 霉 素 对 YTS 细 胞 生 长 的 影 响 不 同 浓 度 的 表 阿 霉 素 对 细 胞 生 长 均 有 抑 制 作 用, 这 种 作 用 呈 剂 量 依 赖 性 见 图 1 图 1 表 阿 霉 素 对 COX 2 表 达 不 同 的 YTS 细 胞 存 活 率 的 影 响 2.2 塞 来 昔 布 对 YTS 细 胞 生 长 的 影 响 不 同 浓 度 的 塞 来 昔 布 对 细 胞 生 长 均 有 抑 制 作 用, 呈 剂 量 依 赖 性 见 表 1 2.3 LY294002 对 YTS 细 胞 生 长 的 影 响 不 同 浓 度 的 LY294002 对 细 胞 生 长 均 有 抑 制 作 用, 呈 剂 量 依 赖 性 见 表 1

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1041 表 1 不 同 浓 度 塞 来 昔 布 和 LY294002 对 YTS 细 胞 生 长 的 影 响 (n=3, x±s) 珋 浓 度 (μmol/l) A 450 YTS 存 活 率 (%) P 1 值 P 2 值 塞 来 昔 布 0 0.89±0.01 100 20 0.82±0.07 92.28±1.77 0.003000 40 0.72±0.09 80.20±1.89 0.000200 0.00880 60 0.61±0.19 68.21±1.39 0.000100 0.00059 80 0.54±0.14 60.73±1.22 0.000008 0.00879 100 0.45±0.09 50.38±1.06 0.000001 0.00277 LY294002 0 0.89±0.01 100 25 0.81±0.02 90.49±1.65 0.00139 50 0.70±0.03 78.94±3.24 0.00090 0.0088 75 0.62±0.01 69.04±1.54 0.00003 0.0034 100 0.54±0.01 60.65±1.15 0.00001 0.0021 150 0.43±0.01 48.97±0.07 0.00001 0.0004 率 明 显 降 低 C 组 与 表 阿 霉 素 联 合 塞 来 昔 布 (D 组 ) 及 表 阿 霉 素 塞 来 昔 布 联 合 LY294002(E 组 ) 相 比 较, 细 胞 凋 亡 率 依 次 增 高, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P <0 05) 见 表 2 图 3 表 2 不 同 处 理 组 接 受 表 阿 霉 素 作 用 24h 后 YTS 细 胞 凋 亡 的 变 化 (n=3, x±s) 珋 组 别 YTS 细 胞 凋 亡 率 (%) P 1 值 A 0.48±0.02 B 64.8 ±1.12 0.0000001 C 28.32±0.69 0.0000001 D 38.22±0.92 0.0001900 E 49.50±1.29 0.0005400 P 1 : 与 前 一 浓 度 组 比 较 P 1 : 与 未 加 药 组 比 较 ;P 2 : 与 前 一 浓 度 组 比 较 2.4 表 阿 霉 素 对 COX 2 表 达 不 同 的 YTS 细 胞 存 活 率 的 影 响 检 测 结 果 显 示 : 高 表 达 COX 2 细 胞 株 与 未 诱 导 细 胞 株 相 比, 在 接 受 相 同 剂 量 的 表 阿 霉 素 作 用 后, 细 胞 存 活 率 明 显 增 加, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P=0 00032,P<0 05) 见 图 1 2.5 不 同 干 预 组 作 用 于 高 表 达 COX 2YTS 细 胞 后 细 胞 存 活 率 变 化 检 测 结 果 显 示 :COX 2 高 表 达 YTS 细 胞 分 别 加 入 单 药 表 阿 霉 素, 表 阿 霉 素 联 合 塞 来 者 布, 及 表 阿 霉 素 塞 来 者 布 联 合 LY294002,3 组 进 行 比 较, 细 胞 株 存 活 率 逐 渐 降 低, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P=0 00023,P<0 05) 见 图 2 图 3 不 同 处 理 组 细 胞 凋 亡 率 变 化 A: 空 白 对 照 组 ;B:YTS 细 胞 直 接 加 入 表 阿 霉 素 作 用 24h 组 ;C: 高 表 达 COX 2YTS 细 胞 加 入 表 阿 霉 素 作 用 24h 组 ;D: 高 表 达 COX 2 YTS 细 胞 加 入 表 阿 霉 素 和 塞 来 昔 布 作 用 24h 组 ;E: 高 表 达 COX 2 YTS 细 胞 加 入 表 阿 霉 素 和 塞 来 昔 布 及 LY294002 作 用 24h 组 图 2 不 同 干 预 组 作 用 于 高 表 达 COX 2YTS 细 胞 后 细 胞 存 活 率 变 化 2.6 不 同 处 理 组 的 细 胞 凋 亡 率 变 化 检 测 结 果 显 示 : 与 B 组 未 诱 导 细 胞 株 相 比, 在 接 受 相 同 剂 量 的 表 阿 霉 素 作 用 后,C 组 COX 2 高 表 达 细 胞 株 的 凋 亡 2.7 表 阿 霉 素 对 YTS 细 胞 COX 2 表 达 的 影 响 Westernblot 结 果 显 示 :YTS 细 胞 COX 2 有 一 定 表 达, 随 着 表 阿 霉 素 (0 0 033 0 165 0 33mg/L) 作 用 剂 量 的 增 加,COX 2 的 表 达 呈 增 高 趋 势 见 图 4 2.8 不 同 处 理 组 的 p Akt Bax Bcl 2 Mcl 1 蛋 白 表 达 Westernblot 结 果 显 示 : 与 B 组 未 诱 导 细 胞

1042 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 图 4 不 同 剂 量 表 阿 霉 素 对 YTS 细 胞 作 用 3h 后 COX 2 蛋 白 表 达 的 影 响 1: 空 白 对 照 组 ;2: 表 阿 霉 素 0.033mg/L 组 ;3: 表 阿 霉 素 0.165 mg/l 组 ;4: 表 阿 霉 素 0.33mg/L 组 ; 与 空 白 对 照 组 比 较 : P< 0 01; 与 前 一 浓 度 组 比 较 : # P<0 05 株 相 比,C 组 COX 2 高 表 达 YTS 细 胞 株 在 接 受 表 阿 霉 素 作 用 24h 后,Bcl 2 Mcl 1 和 p Akt 蛋 白 表 达 增 强,Bax 蛋 白 表 达 减 弱 C D E3 组 干 预 组 相 比 较, Bax 蛋 白 表 达 依 次 增 强 ;p Akt Bcl 2 Mcl 1 蛋 白 表 达 依 次 减 弱 见 图 5 3 讨 论 正 常 情 况 下,COX 2 在 绝 大 部 分 组 织 细 胞 中 不 表 达, 细 胞 因 子 某 些 药 物 等 多 种 刺 激 因 子 可 以 诱 导 [2] 其 高 表 达 研 究 显 示 抗 肿 瘤 药 物 可 诱 导 肿 瘤 细 胞 表 达 COX 2 Guetal [3] 研 究 结 果 表 明, 紫 杉 醇 可 诱 导 胃 腺 癌 细 胞 株 SGC 7901 的 COX 2 高 表 达 研 [1] 究 表 明, 在 鼻 型 NK/T 细 胞 淋 巴 瘤 患 者 中,COX 2 表 达 可 以 作 为 治 疗 反 应 不 佳 的 预 后 因 子, 提 示 COX 2 在 该 类 型 淋 巴 瘤 肿 瘤 对 化 疗 的 耐 受 性 方 面 发 挥 重 要 作 用 对 凋 亡 诱 导 的 耐 受 是 肿 瘤 化 疗 耐 药 的 一 个 重 要 原 因 ; 引 起 细 胞 信 号 凋 亡 通 路 和 凋 亡 相 关 分 子 的 变 化 均 会 导 致 细 胞 凋 亡 耐 受, 多 种 对 细 胞 凋 亡 起 促 进 或 抑 制 作 用 的 基 因 参 与 其 中, 其 中 Bcl 2 家 族 较 受 关 注 Bcl 2 和 Bax Mcl 1 都 属 于 Bcl 2 家 族,Bcl 2,Mcl 1 编 码 蛋 白 抑 制 凋 亡,Bax 编 码 蛋 白 促 进 凋 亡 Chenetal [4] 在 肺 癌 细 胞 中 发 现,COX 2 可 能 通 过 Akt Mcl 1 从 而 介 导 细 胞 对 凋 亡 的 耐 受 图 5 不 同 处 理 组 Bax Bcl 2 Mcl 1 p Akt 表 达 变 化 1:A 组 ;2:B 组 ;3:C 组 ;4:D 组 ;5:E 组 ; 与 B 组 比 较 : P< 0 01; 与 前 一 浓 度 组 比 较 : # P<0.05 PI3K/Akt 信 号 通 路 的 激 活 被 认 为 是 肿 瘤 细 胞 抗 凋 亡 的 主 要 机 制 之 一, 影 响 肿 瘤 细 胞 对 化 疗 的 敏 感 性 在 胃 癌 细 胞 与 化 疗 药 物 依 托 泊 苷 和 阿 霉 素 化 疗 耐 药 研 究 中 显 示 :PI3K/Akt 信 号 通 路 发 挥 重 要 作 用, 用 PI3K 抑 制 剂 阻 断 PI3K/Akt 信 号 通 路 后, 可 减 弱 胃 癌 细 胞 对 两 种 化 疗 药 物 的 抵 抗 [5] [6-7] 研 究 显 示 许 多 肿 瘤 细 胞 的 凋 亡 可 能 是 通 过 p Akt 信 号 通 路 介 导 发 生 Hiletal [8] 发 现, 在 胰 腺 癌 细 胞 中,COX [9] 2 高 表 达 可 以 使 p Akt 活 化 增 强 也 有 文 献 报 道 COX 2 的 抑 制 剂 塞 来 昔 布 可 以 抑 制 Akt 的 磷 酸 化 本 研 究 中, 用 表 阿 霉 素 刺 激 YTS 细 胞 诱 导

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1043 COX 2 高 表 达, 获 得 高 表 达 COX 2 细 胞 株 预 实 验 中 发 现, 表 阿 霉 素 浓 度 为 0 33mg/L 作 用 3h 后, COX 2 表 达 最 高, 故 每 次 选 取 这 一 浓 度 来 诱 导 COX 2 高 表 达 塞 来 昔 布 和 LY294002 对 细 胞 生 长 呈 剂 量 毒 性, 本 研 究 中 选 取 作 用 细 胞 24h 后 无 明 显 细 胞 毒 性 的 浓 度 塞 来 昔 布 选 取 浓 度 为 20μmol/L, LY294002 选 取 浓 度 为 25μmol/L 在 本 研 究 中,COX 2 高 表 达 细 胞 与 未 诱 导 细 胞 相 比, 在 接 受 相 同 浓 度 表 阿 霉 素 作 用 后, 对 表 阿 霉 素 的 耐 受 性 提 高 Westernblot 检 测 显 示,COX 2 高 表 达 细 胞 p Akt 活 化 表 达 升 高,Bcl 2 Mcl 1 抗 凋 亡 蛋 白 表 达 升 高,Bax 促 凋 亡 蛋 白 表 达 降 低, 提 示 高 表 达 COX 2 细 胞 可 能 通 过 p Akt 信 号 通 路 介 导 细 胞 凋 亡 途 径 提 高 对 表 阿 霉 素 的 耐 受 性 为 进 一 步 研 究 高 表 达 COX 2 细 胞 可 能 通 过 p Akt 信 号 通 路 介 导 细 胞 凋 亡 途 径 提 高 对 表 阿 霉 素 的 耐 受 性 的 假 设, 本 研 究 将 COX 2 高 表 达 细 胞 分 成 3 组, 分 别 加 入 表 阿 霉 素 单 药 表 阿 霉 素 联 合 塞 来 昔 布 (20μmol/L) 两 药 及 表 阿 霉 素 塞 来 昔 布 (20μmol/ L) 联 合 LY294002(25μmol/L),3 组 结 果 比 较 显 示, COX 2 的 抑 制 剂 塞 来 昔 布 可 以 抑 制 p Akt 的 表 达, [9] 这 与 有 关 文 献 提 出 COX 2 的 抑 制 剂 塞 来 昔 布 可 以 抑 制 Akt 的 磷 酸 化 说 法 一 致 随 着 p Akt 表 达 的 逐 渐 降 低, 细 胞 存 活 率 不 断 降 低, 凋 亡 率 逐 渐 增 加 Bax 表 达 逐 渐 增 高 ;Bcl 2 Mcl 1 表 达 逐 渐 降 低 这 与 Linetal [10] 在 其 他 肿 瘤 细 胞 中 发 现 COX 2 可 能 通 过 p Akt 信 号 通 路 上 调 Mcl 1 的 表 达 而 提 高 肿 瘤 细 胞 存 活 率 的 结 果 是 相 似 的 综 上 所 述,NK/T 淋 巴 瘤 细 胞 株 YTS 可 被 表 阿 霉 素 诱 导 获 得 COX 2 高 表 达 高 表 达 COX 2 细 胞 可 能 通 过 p Akt 信 号 通 路 介 导 细 胞 凋 亡 途 径 提 高 对 表 阿 霉 素 的 耐 受 性 p Akt 可 作 为 新 的 提 高 化 疗 效 果 靶 点 进 行 进 一 步 探 索 和 研 究 参 考 文 献 [1] ShimSJ,YangW I,ShinE,etal.Clinicalsignificanceofcy clooxygenase 2expresioninextranodalnaturalkiler(NK)/T cel lymphoma,nasaltype[j].intjradiatoncolbiolphys,2007,67 (1):31-8. [2] EicheleK,RamerR,HinzB.Decisiveroleofcyclooxygenase 2 andlipocalin typeprostaglandindsynthaseinchemothempeuties inducedapoptosisofhumancervicalcarcinomacels[j].onco gene,2008,27(21):3032-44. [3] GuKS,ChenY.Mechanism ofp glycoproteinexpresioninthe SGC7901humangastricadenocarcinomacellineinducedbycy clooxygenase 2[J].AsianPacJCancerPrev,2012,13(5):2379-83. [4] ChenW,BaiL,WangX,etal.AcquiredactivationoftheAkt/cy clooxygenase 2/Mcl 1pathwayrenderslungcancercelsresistant toapoptosis[j].molharmacol,2010,77(3):416-23. [5] RodriguezD,Rojas RiveraD,HetzC.Integratingstressignalsat theendoplasmicreticulum:thebcl 2proteinfamilyrheostat[J]. BiochimBiophysActa,2011,1813(4):564-74. [6] JiaSS,XiGP,ZhangM,etal.IductionofapoptosisbyD limo neneismediatedbyinactivationofaktinls174thumancolon cancercels[j].oncolrep,2013,29(1):349-54. [7] LiuQ,DongHW,SunW G,etal.Apoptosisinitiationofbionone insgc 7901gastriccarcinomacancercelsviaaPI3K AKTpath way[j].archtoxicol,2013,87(3):481-90. [8] HilR,LiY,TranLM,etal.CelintrinsicroleofCOX 2in pancreaticcancerdevelopment[j].molcancerther,2012,11 (10):2127-37. [9] AgarwalS,AchariC,PraveenD,etal.Inhibitionof12 LOXand COX 2reducestheproliferationofhumanepidermoidcarcinoma cels(a431)bymodulatingtheerk andpi3k Aktsignaling pathways[j].expdermatol,2009,18(11):939-46. [10]LinM T,LeeRC,YangPC,etal.Cyclooxygenase 2inducing Mcl 1 dependentsurvivalmechanisminhumanlungadenocarcino macl1.0cels.involvementofphosphatidylinositol3 kinase/akt pathway[j].jbiolchem,2001,276(52):48997-900. Experimentalstudyofcyclooxygenase 2expresioninNK/Tcellymphoma intheroleofchemotherapydrugresistanceanditsmechanism WangYamin,GuKangsheng (DeptofOncology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022) Abstract Objective Toinvestigatethepotentialmechanismofchemotherapydrugresistanceinducedbycycloox ygenase 2(COX 2)inNK/Tcellymphoma.Methods Theefectsofepirubicinandcelecoxib,aCOX 2selec tiveinhibitor,andly294002,theaktpathwayinhibitorontheviabilityofnk/tcelwasasesedbymtsasay. TheefectofepirubicinonregulatingtheCOX 2expresionwasdetectedbyWesternblot.Thesignificanceof

1044 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 褪 黑 素 对 ICSI 周 期 中 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 结 果 的 影 响 高 明 1, 郝 燕 1, 陈 大 蔚 1,2, 纪 冬 梅 1, 陈 蓓 丽 1, 邹 薇 薇 1, 章 志 国 1,2 1,2, 曹 云 霞 摘 要 目 的 探 讨 褪 黑 素 的 应 用 对 卵 胞 浆 内 单 精 子 注 射 (ICSI) 周 期 中 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 (IVM) 受 精 和 胚 胎 发 育 的 影 响 方 法 收 集 的 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 随 机 置 于 含 褪 黑 素 和 不 含 褪 黑 素 的 IVM 培 养 液 中 进 行 IVM 培 养, 记 录 和 分 析 未 成 熟 卵 IVM 以 及 所 获 胚 胎 的 发 育 情 况 结 果 用 含 褪 黑 素 IVM 培 养 液 培 养 的 未 成 熟 卵 母 细 胞 为 褪 黑 素 组 (n=94),ivm 培 养 成 熟 78 枚,ICSI 后 受 精 60 枚, 培 养 后 卵 裂 59 枚, 发 育 至 囊 胚 26 枚, 其 14 枚 为 优 质 囊 胚, 而 非 褪 黑 素 组 (n=73),ivm 培 养 成 熟 60 枚,ICSI 后 受 精 44 枚, 培 养 后 卵 裂 42 枚, 随 后 11 枚 发 育 至 囊 胚, 仅 1 枚 优 质 囊 胚 两 组 间 成 熟 率 受 精 率 卵 裂 率 及 囊 胚 率 差 异 无 统 计 学 意 义 (P >0 05), 但 褪 黑 素 组 的 优 质 囊 胚 率 明 显 高 于 非 褪 黑 素 组 (53 8% vs9 1%), 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05,χ 2 = 6 42) 结 论 褪 黑 素 的 应 用 改 善 了 IVM 效 果, 使 人 未 成 熟 2014-03-20 接 收 基 金 项 目 : 国 家 重 大 研 究 计 划 ( 编 号 :2012CB944704); 国 家 自 然 青 年 科 学 基 金 培 育 计 划 ( 编 号 :2012KJ06) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 生 殖 医 学 中 心, 合 肥 230022 2 安 徽 省 生 命 资 源 保 存 与 人 工 器 官 工 程 技 术 研 究 中 心, 合 肥 230022 作 者 简 介 : 高 明, 男, 硕 士 研 究 生 ; 曹 云 霞, 女, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:caoyunx ia6@126.com 章 志 国, 男, 副 研 究 员, 责 任 作 者,E mail: zg_100@gmail. com 卵 母 细 胞 在 IVM ICSI 及 胚 胎 培 养 后 发 育 更 多 的 优 质 囊 胚 关 键 词 中 图 分 类 号 褪 黑 素 ; 未 成 熟 卵 母 细 胞 ; 体 外 成 熟 ; 发 育 R321;R329 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1044-04 1983 年,Veecketal [1] 首 次 报 道 了 利 用 体 外 成 熟 (invitromaturation,ivm) 培 养 获 得 成 熟 卵 母 细 胞 并 生 育 一 正 常 婴 儿 目 前 IVM 已 成 为 辅 助 生 殖 领 [2-3] 域 的 一 项 重 要 技 术, 但 大 量 研 究 结 果 显 示, 未 成 熟 卵 母 细 胞 经 IVM 体 外 受 精 和 胚 胎 体 外 培 养 很 少 能 发 育 至 囊 胚 阶 段 为 了 改 善 IVM 结 果, 研 究 人 员 不 断 对 IVM 过 程 各 个 环 节 进 行 改 进 2013 年,Kim etal [4] 将 褪 黑 素 引 入 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 IVM 培 养 体 系, 在 IVM 培 养 液 中 添 加 10μmol/L 褪 黑 素 获 得 了 60% 的 临 床 妊 娠 率, 显 著 高 于 其 他 报 道 的 IVM 妊 [4] 娠 率 研 究 表 明 卵 泡 液 中 含 有 一 定 浓 度 的 褪 黑 素, 在 卵 母 细 胞 的 生 长 和 成 熟 过 程 中 有 重 要 的 作 用 该 研 究 中 添 加 5~10μmol/L 褪 黑 素 的 IVM 培 养 液 培 养 卵 胞 浆 内 单 精 子 注 射 (intracytoplasmicspermin jection,icsi) 周 期 中 获 得 的 未 成 熟 卵 母 细 胞, 探 讨 褪 黑 素 的 应 用 能 否 改 善 ICSI 周 期 未 成 熟 卵 母 细 胞 及 所 获 胚 胎 的 发 育, 为 IVM 方 案 的 优 化 和 临 床 应 用 提 供 依 据 chemotherapydrugresistanceincellinesytsthatoverexprescox 2wasanalyzedamongdiferentgroupstreated withepirubicinalone,andwithcelecoxib(20μmol/l)orcombinedwithly294002(25μmol/l).further,wede tectedtheactivationofakt,p Akt,Bax,Bcl 2,Mcl 1bymeansofWesternblot,meanwhile,flowcytometrywas usedtoevaluatecelapoptosisrate.results Itwasshownthatepirubicin,celecoxibandLY294002wereinpos sesionofcytotoxicefectonytscellineactivityinadose dependentmanner.whenthedoseofepirubicinin creased,theexpresionofcox 2showedarisingtrendinYTScelline.Comparedwithcontrolcel,COX 2 over expresingcelsweremoretoleranttoepirubicin,andexpresedhigherexpresionofp Akt,Bcl 2,Mcl 1andles Bax.Over exprescox 2wasanalyzedamongdiferentgroupstreatedwithepirubicinalone,andwithcelecoxib(20 μmol/l)orcombinedwithly294002(25μmol/l).celsurvivalratedecreasedandcelapoptosisrateincreased succesively.atthesametime,expresionofbaxup regulatedandexpresionofbcl 2,Mcl 1,p Aktreduced succesively.conclusion EpirubicinhasacumulativeefectonCOX 2expresioninductioninNK/Tlymphoma cellinesyts.over exprescox 2cellinesmayincreasetoleranceofepirubicinthroughtheapoptosispathway mediatedbyp Aktsignaling. Keywords COX 2;apoptosis;Akt;epirubincin;NK/TlymphomacellineYTS

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1045 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 1.1.1 卵 母 细 胞 和 精 子 来 源 未 成 熟 卵 母 细 胞 来 自 于 在 本 中 心 就 诊 的 不 孕 症 患 者, 经 超 促 排 卵 行 IC SI 治 疗 且 剥 除 颗 粒 细 胞 后 镜 下 观 察 确 定 为 未 成 熟 卵 母 细 胞 授 精 所 用 精 子 来 自 供 卵 患 者 丈 夫 1.1.2 试 剂 褪 黑 素 透 明 质 酸 酶 雌 激 素 磷 酸 盐 缓 冲 液 无 水 乙 醇 丙 酮 酸 钠 双 抗 TCM199(Sigma, 美 国 );COOK 胚 胎 培 养 液 CultureOil(COOK, 澳 大 利 亚 );PVP(IrvineScientific, 美 国 ); 重 组 促 卵 泡 激 素 ( 雪 兰 诺, 瑞 士 ); 人 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 ( 丽 珠, 中 国 ); 供 卵 者 自 体 血 清 1.1.3 主 要 器 材 显 微 操 作 1006 皿 中 心 井 3037 培 养 皿 (Falcon, 美 国 ); 巴 斯 德 吸 管 (Hilgenbeng, 德 国 ); 显 微 固 定 针 显 微 注 射 针 (J.Y.LAB, 加 拿 大 ); 细 胞 培 养 皿 (Nunc, 美 国 ) 1.1.4 主 要 仪 器 设 备 体 视 显 微 镜 (Nikon, 日 本 ); 倒 置 显 微 镜 及 显 微 操 作 仪 (Olympus, 日 本 ); 超 声 及 穿 刺 取 卵 系 统 (Toshiba, 日 本 ); 常 规 培 养 箱 (SANYO, 日 本 ); 三 气 培 养 箱 (Galaxy, 英 国 ) 1.1.5 IVM 培 养 液 IVM 培 养 液 准 备 :80% TCM199 +2.2g/L 丙 酮 酸 钠 +75IU/L 促 卵 泡 激 素 (foliclestimulatinghormone,fsh)+500iu/l 人 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 (humanchorionicgonadotropin, HCG) +800μg/L 雌 激 素 +5~10μmol/L 褪 黑 素 +6g/L 双 抗 +20% 自 体 血 清, 平 衡 过 夜 备 用 1.2 方 法 1.2.1 卵 母 细 胞 的 获 取 及 分 组 就 诊 于 本 中 心 年 龄 35 岁 以 下 的 不 孕 症 患 者, 予 以 常 规 方 案 降 调 节, 促 性 腺 激 素 促 排 卵, 至 卵 泡 直 径 达 到 成 熟 标 准 后, 肌 内 注 射 HCG,34~36h 内 超 声 引 导 经 阴 道 穿 刺 取 卵 ICSI 前 将 卵 丘 复 合 物 置 于 含 80U/ml 透 明 质 酸 酶 0.2ml 的 3037 皿 中 间 孔, 拆 除 卵 母 细 胞 周 围 的 大 部 分 颗 粒 细 胞, 经 倒 置 显 微 镜 观 察 卵 母 细 胞 的 成 熟 程 度, 未 成 熟 卵 母 细 胞 (GV 期 或 MI 期 ) 供 本 研 究 使 用 本 研 究 共 获 得 未 成 熟 卵 母 细 胞 167 枚 (GV 期 117 枚 和 MI 期 50 枚 ), 褪 黑 素 组 94 枚 在 含 5~ 10μmol/L 褪 黑 素 的 IVM 培 养 液 培 养 (GV 期 78 枚 和 MI16 枚 ), 非 褪 黑 素 组 73 枚 在 不 含 褪 黑 素 的 IVM 培 养 液 培 养 (GV 期 39 枚 和 MI 期 34 枚 ) 1.2.2 IVM 培 养 将 未 成 熟 卵 母 细 胞 移 入 IVM 培 养 液, 三 气 培 养 箱 培 养 24h, 培 养 成 熟 的 卵 母 细 胞 进 行 ICSI 授 精 1.2.3 ICSI 和 胚 胎 培 养 通 过 IVM 培 养 成 熟 后 的 卵 母 细 胞 常 规 进 行 ICSI: 利 用 负 压 将 处 理 后 的 精 子 自 尾 部 开 始 吸 入 显 微 注 射 针 内, 调 整 卵 母 细 胞 至 第 一 极 体 位 于 6 点 或 12 点 处 显 微 固 定 针 固 定, 携 带 精 子 的 显 微 注 射 针 自 正 中 3 点 位 置 垂 直 穿 越 透 明 带 和 卵 母 细 胞 胞 浆 膜, 确 认 卵 母 细 胞 膜 破 裂 后, 将 精 子 注 入 卵 细 胞 浆 内 以 完 成 授 精 过 程 ICSI 后 常 规 进 行 分 裂 期 胚 胎 培 养 和 囊 胚 培 养, 并 记 录 胚 胎 发 育 情 况 1.2.4 分 裂 期 胚 胎 及 囊 胚 评 分 标 准 分 裂 期 胚 胎 根 据 形 态 学 分 为 4 级 :Ⅰ 级 胚 胎, 细 胞 大 小 均 匀, 形 态 规 则, 碎 片 <10%;Ⅱ 级 胚 胎, 细 胞 大 小 比 较 均 匀, 胞 质 可 有 颗 粒 现 象, 碎 片 占 卵 胞 浆 体 积 的 10% ~20%;Ⅲ 级 胚 胎, 细 胞 大 小 明 显 不 均, 碎 片 占 卵 胞 浆 体 积 的 21% ~50%;Ⅳ 级 胚 胎, 细 胞 严 重 大 小 不 均, 碎 片 占 卵 胞 浆 体 积 50% 以 上 Ⅰ 和 Ⅱ 级 胚 胎 为 优 质 胚 胎 囊 胚 评 分 及 囊 胚 扩 张 度 评 分 依 据 Gardner 评 分 法 [5] :A 型 内 细 胞 团 (innercelmas,icm) 由 许 多 紧 密 包 裹 的 细 胞 组 成,B 型 ICM 由 包 裹 不 紧 密 细 胞 组 成 A 型 滋 养 层 由 很 多 形 态 均 一 细 胞 形 成 连 续 的 上 皮,B 型 滋 养 层 由 较 少 细 胞 形 成 疏 松 的 上 皮 由 A 型 或 B 型 ICM 和 滋 养 层 组 成 的 囊 胚 称 为 优 质 囊 胚 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS18 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 百 分 率 表 示, 对 结 果 进 行 χ 2 检 验 及 Fisher s 精 确 检 验 2 结 果 2.1 两 组 未 成 熟 卵 母 细 胞 的 IVM 褪 黑 素 组 : 未 成 熟 卵 母 细 胞 94 枚,IVM 培 养 成 熟 78 枚, 受 精 60 枚, 卵 裂 59 枚, 囊 胚 26 枚, 其 中 获 得 14 枚 优 质 囊 胚 ; 非 褪 黑 素 组 : 未 成 熟 卵 母 细 胞 73 枚,IVM 培 养 成 熟 60 枚, 受 精 44 枚, 卵 裂 42 枚, 囊 胚 11 枚, 其 中 1 枚 优 质 囊 胚 两 组 间 比 较 : 成 熟 率 受 精 率 卵 裂 率 及 囊 胚 率 差 异 无 统 计 学 意 义, 但 褪 黑 素 组 的 优 质 囊 胚 率 明 显 高 于 非 褪 黑 素 组 (53.8% vs9 1%), 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05,χ 2 =6 42), 见 表 1 未 成 熟 卵 母 细 胞 和 IVM 后 成 熟 卵 母 细 胞 见 图 1 2.2 两 组 GV 期 及 MI 期 未 成 熟 卵 母 细 胞 的 IVM 褪 黑 素 组 和 非 褪 黑 素 组 均 含 有 GV 期 和 MI 期 未 成 熟 卵 母 细 胞, 两 组 GV 期 和 MI 期 未 成 熟 卵 母 细 胞 发 育 情 况, 成 熟 率 卵 裂 率 囊 胚 率 和 优 质 囊 胚 率 比

1046 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 较, 差 异 无 统 计 学 意 义, 见 表 2 2.3 GV 期 与 MI 期 未 成 熟 卵 母 细 胞 的 IVM 褪 黑 素 组 和 非 褪 黑 素 组 共 有 GV 期 未 成 熟 卵 母 细 胞 117 枚,MI 期 卵 母 细 胞 50 枚,GV 期 和 MI 期 未 成 熟 卵 母 细 胞 发 育 情 况, 成 熟 率 卵 裂 率 囊 胚 率 和 优 质 囊 胚 率 比 较, 差 异 无 统 计 学 意 义, 见 表 3 2.4 囊 胚 情 况 本 研 究 共 获 得 囊 胚 37 枚, 其 中 优 质 囊 胚 15 枚,14 枚 发 育 自 褪 黑 素 组, 另 1 枚 发 育 自 非 褪 黑 素 组 见 图 2 图 1 未 成 熟 卵 母 细 胞 和 IVM 后 成 熟 卵 母 细 胞 代 表 图 200 A:GV 期 卵 母 细 胞 ;B:MI 期 卵 母 细 胞 ;C: 体 外 成 熟 的 MI 期 卵 母 细 胞 图 2 优 质 囊 胚 的 代 表 图 500 A:4AB;B:4BA;C:4AA;D:4AA 表 1 褪 黑 素 组 与 非 褪 黑 素 组 未 成 熟 卵 母 细 胞 发 育 比 较 项 目 褪 黑 素 组 非 褪 黑 素 组 所 获 卵 母 细 胞 数 目 (n) 94 73 IVM 成 熟 率 (%) 78/94(83.0) 60/73(82.2) 受 精 率 (%) 60/78(76.9) 44/60(73.3) 卵 裂 率 (%) 59/60(98.3) 42/44(95.4) 囊 胚 率 (%) 26/59(44.1) 11/42(26.1) 优 质 囊 胚 率 (%) 14/26(53.8) 1/11(9.1) 与 褪 黑 素 组 比 较 : P<0 05 表 2 褪 黑 素 组 与 非 褪 黑 素 组 GV 期 及 MI 期 未 成 熟 卵 发 育 比 较 项 目 褪 黑 素 组 非 褪 黑 素 组 GV MI GV MI 所 获 卵 母 细 胞 数 目 (n) 78 16 39 34 IVM 成 熟 率 (%) 63/78(80.8) 15/16(93.8) 29/39(74.4) 31/34(91.2) 受 精 率 (%) 48/63(76.2) 12/15(80.0) 21/29(72.4) 23/31(74.2) 卵 裂 率 (%) 47/48(97.9)12/12(100.0) 20/21(95.2) 22/23(95.7) 囊 胚 率 (%) 22/47(46.8) 4/12(33.3) 7/20(35.0) 4/22(18.2) 优 质 囊 胚 率 (%) 12/22(54.5) 2/4(50.0) 0/7(0.00) 1/4(25.0) 表 3 GV 期 及 MI 期 未 成 熟 卵 母 细 胞 发 育 比 较 项 目 GV MI 所 获 卵 母 细 胞 数 目 (n) 117 50 IVM 成 熟 率 (%) 92/117(78.6) 46/50(92.0) 受 精 率 (%) 69/92(75.0) 35/46(76.1) 卵 裂 率 (%) 67/69(97.1) 34/35(97.1) 囊 胚 率 (%) 29/67(43.3) 8/34(23.5) 优 质 囊 胚 率 (%) 12/29(41.4) 3/8(37.5) 3 讨 论 [6] 研 究 表 明 氧 化 应 激 对 卵 母 细 胞 成 熟 起 着 抑 制 作 用, 在 体 内 生 长 的 卵 母 细 胞, 会 受 到 体 内 抗 氧 化 物 质, 如 超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxidedismutase, SOD) 和 谷 胱 甘 肽 (glutathione,gsh) 的 保 护 而 免 于 损 伤 褪 黑 素 作 为 体 内 调 节 生 理 节 律 周 期 的 内 源 性 物 质, 能 够 对 抗 氧 化 应 激, 卵 泡 液 中 一 定 浓 度 的 褪 黑 素 直 接 保 护 着 卵 母 细 胞 在 生 长 发 育 过 程 中 免 受 氧 化 应 激 的 损 伤, 卵 泡 液 中 褪 黑 素 的 存 在 影 响 到 卵 母 细 胞 的 质 量 和 其 后 续 的 发 育 潜 能 [7-8] 本 研 究 中 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 在 含 褪 黑 素 的 IVM 培 养 液 中 行 IVM, 体 外 受 精 及 胚 胎 培 养, 褪 黑 素 组 成 熟 率 受 精 率 卵 裂 率 囊 胚 率 及 优 质 囊 胚 率 均 高 于 非 褪 黑 素 组, 其 中 优 质 囊 胚 率 方 面, 组 间 差 异 有 统 计 学 意 义 本 研 究 显 示 褪 黑 素 应 用 于 IVM 培 养 液 能 改 善 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 的 IVM 结 果, 提 高 优 质 囊 胚 形 成 研 究 中 GV 期 和 MI 期 卵 母 细 胞 被 分 开, 同 一 发 育 阶 段 的 卵 母 细 胞 行 共 同 培 养 MI 期 卵 母 细 胞 的 成 熟 率 高 于 GV 期 卵 母 细 胞 ; 受 精 率 与 卵 裂 率 方 面, 两 者 相 当 ; 囊 胚 及 优 质 胚 胎 率 方 面,GV 期 卵 母

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1047 细 胞 显 著 高 于 MI 期 卵 母 细 胞, 但 各 指 标 的 组 间 差 异 均 无 统 计 学 意 义 但 本 研 究 样 本 量 有 限, 今 后 仍 需 扩 大 样 本 量, 并 对 褪 黑 素 促 进 人 胚 胎 发 育 的 机 制 及 所 获 胚 胎 的 安 全 性 进 行 研 究 本 研 究 结 果 表 明 IVM 培 养 液 中 低 浓 度 的 褪 黑 素 因 其 自 由 基 清 除 作 用 对 卵 母 细 胞 的 成 熟 和 胚 胎 的 发 育 有 促 进 效 应 ;ICSI 周 期 中 所 获 得 的 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 具 有 很 高 的 利 用 价 值 ICSI 周 期 中 的 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 后 可 以 捐 赠 给 卵 子 库 或 用 于 研 究, 也 可 应 用 于 患 者 自 身, 提 高 累 积 妊 娠 率 [2-3,9] 本 研 究 中 通 过 褪 黑 素 的 应 用 使 体 内 成 熟 失 败 人 卵 母 细 胞 在 IVM ICSI 及 胚 胎 培 养 后 获 得 更 多 的 优 质 囊 胚, 为 IVM 的 优 化 提 供 依 据, 也 为 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 再 利 用 的 研 究 提 供 有 益 的 借 鉴 参 考 文 献 [1] VeeckLL,WorthamJW Jr,WitmyerJ,etal.Maturationand fertilizationofmorphologicalyimmaturehumanoocytesinapro gramofinvitrofertilization[j].fertilsteril,1983,39(5):594-602. [2] LiuY,CaoYX,ZhangZG,etal.Artificialoocyteactivation andhumanfailed maturedoocytevitrificationfolowedbyinvitro maturation[j].zygote,2013,21(1):71-6. [3] ZhangZG,LiuY,XingQ,etal.Cryopreservationofhuman failed maturedoocytesfolowedbyinvitromaturation:vitrification issuperiortotheslowfreezingmethod[j].reprodbiolendocri nol,2011,9:156. [4] KimM K,ParkEA,KimHJ,etal.Doessupplementationofin vitroculturemediumwithmelatoninimproveivfoutcomeinpcos [J].ReprodBiomedOnline,2013,26(1):22-9. [5] GardnerDK,SchoolcraftW B.Cultureandtransferofhuman blastocysts[j].curopinobstetgynecol,1999,11(3):307-11. [6] CombelesCM,CuptaS,AgarwalA.Couldoxidativestresinflu encetheinvitromaturationofoocytes?[j].reprodbiomedon line,2009,18(6):864-80. [7] TamuraH,TakasakiA,TaketaniT,etal.Melatoninasafree radicalscavengerintheovarianfolicle[j].endocrj,2013,60 (1):1-13. [8] TamuraH,TakasakiA,TaketaniT,etal.Theroleofmelatonin asanantioxidantinthefolicle[j].jovarianres,2012,5:5. [9] 魏 兆 莲, 周 平, 曹 云 霞, 等. 未 成 熟 卵 体 外 培 养 成 熟 治 疗 难 治 性 多 囊 卵 巢 综 合 征 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2004,39(5):405-6. EfectofmelatoninappliedtoIVM medium onivm outcome ofhumanimmatureoocytesretrievedfrom ICSIcycles GaoMing 1,HaoYan 1,ChenDawei 1,2,etal ( 1 ReproductiveMedicineCenter,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022; 2 AnhuiProvincialEngineringTechnologyResearchCenterofBiopreservationandArtificialOrgans,Hefei 230022) Abstract Objective Tostudytheefectofmelatoninappliedtoinvitromaturation(IVM)mediumonIVM,ferti lizationandembryonicdevelopmentinhumanimmatureoocytescolectedfromintracytoplasmicsperminjection(ic SI)cycles.Methods AlofthehumanimmatureoocyteswererandomlyplacedintoIVM medium supplemented withandwithoutmelatoninforivm.results Theoocytescultureinthemedium withmelatoninbelongedtothe groupmelatonin(n=94),inwhich94immatureoocyteswerecolected.inthegroupmelatonin78matured,60 fertilized,59cleaved,andfinaly26developedtoblastocysts,ofwhich,14werehigh qualityblastocysts.inthe groupnon melatonin(n=73),60matured,44fertilizedand42cleaved.afterafurthercultureforblastocyst,11 blastocystswereachievedandonly1high qualityblastocyst.nosignificantdiferencewasfoundinivm,fertiliza tion,cleavageandblastocystratesbetweengroups.butthehigh qualityblastocystrateinthegroupmelatoninwas higherthanthatinthegroupnon melatonin(53.8% vs9.1%),therewasasignificantdiferencebetweengroups (P<0 05,χ 2 =6 42).Conclusion IVM mediumsupplementedwithmelatoninisappliedtoivm humanimma tureoocytesretrievedfromicsicyclesandcanachievetheformationofmorehigh qualityblastocysts. Keywords melatonin;humanimmatureoocyte;invitromaturation;development

1048 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) Bcl 2 在 紫 杉 醇 耐 药 胃 腺 癌 细 胞 中 的 表 达 及 意 义 张 丽, 胡 汪 来, 王 家 钰, 张 旭 东, 张 林 杰 摘 要 目 的 探 讨 凋 亡 抑 制 蛋 白 Bcl 2 在 紫 杉 醇 (TAX) 耐 药 胃 腺 癌 细 胞 中 的 作 用 方 法 采 用 药 物 浓 度 梯 度 递 增 持 续 作 用 法 建 立 耐 TAXSGC 7901 细 胞 株,PI 单 染 法 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 率 差 异,MTT 比 色 法 检 测 细 胞 生 存 率 变 化, Westernblot 检 测 TAX 处 理 后 SGC 7901 普 通 细 胞 株 及 耐 药 细 胞 株 Bcl 2 mcl 1 Bax Bcl xl 蛋 白 表 达, 半 定 量 PCR 检 测 Bcl 2mRNA 水 平 变 化, 流 式 细 胞 术 检 测 Bcl 2 基 因 沉 默 后 的 凋 亡 率 变 化,MTT 检 测 细 胞 生 存 率 结 果 TAX 诱 导 胃 腺 癌 细 胞 凋 亡 具 有 时 间 和 剂 量 相 关 性, 耐 药 胃 腺 癌 细 胞 株 对 TAX 诱 导 的 凋 亡 不 敏 感,TAX 处 理 后 Westernblot 检 测 到 耐 药 细 胞 株 中 Bcl 2 表 达 上 调, 亲 本 细 胞 株 Bcl 2 则 表 达 下 调, 半 定 量 PCR 检 测 耐 药 胃 腺 癌 细 胞 株 中 Bcl 2mRNA 水 平 亦 上 调 在 耐 药 胃 癌 细 胞 株 中 沉 默 Bcl 2 后,Bcl 2 蛋 白 水 平 下 调, 细 胞 凋 亡 率 明 显 上 升, 细 胞 生 存 率 显 著 下 降 结 论 Bcl 2 的 表 达 上 调 可 能 是 胃 腺 癌 细 胞 对 TAX 耐 药 的 重 要 机 制 关 键 词 中 图 分 类 号 胃 肿 瘤 ; 紫 杉 醇 ; 细 胞 凋 亡 ; 肿 瘤 耐 药 ;Bcl 2 R735.2;R392.12 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1048-05 胃 癌 是 我 国 常 见 的 恶 性 肿 瘤, 化 疗 是 胃 癌 患 者 治 疗 的 主 要 手 段 之 一 紫 杉 醇 (paclitaxel,tax) 作 为 胃 癌 化 疗 的 一 线 药 物, 因 其 在 临 床 初 始 化 疗 缓 解 后 常 产 生 耐 药 性, 严 重 影 响 患 者 治 疗 效 果 [1] 近 年 [2] 来 通 过 建 立 TAX 耐 药 的 肿 瘤 细 胞 株 探 讨 TAX 耐 [3] 药 机 制 的 研 究 表 明 :P 糖 蛋 白 微 管 β 亚 基 和 α 亚 基 表 达 的 改 变, 以 及 凋 亡 途 径 中 相 关 分 子 的 表 达 异 常 均 与 TAX 耐 药 性 有 关 Bcl 2 家 族 中 的 抗 凋 亡 蛋 白 在 TAX 等 化 疗 药 物 耐 药 的 肿 瘤 细 胞 中 发 挥 重 要 作 用 该 研 究 旨 在 探 讨 Bcl 2 蛋 白 在 TAX 耐 药 的 胃 腺 癌 细 胞 中 的 作 用, 了 解 胃 腺 癌 细 胞 耐 药 的 分 子 机 制, 以 期 寻 找 克 服 肿 瘤 细 胞 耐 药 的 有 效 途 径 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 SGC 7901 胃 腺 癌 细 胞 株 购 自 中 国 科 学 2014-03-20 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 高 等 学 校 省 级 自 然 科 学 研 究 项 目 ( 编 号 : KJ2011A167) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 免 疫 学 教 研 室, 合 肥 230032 作 者 简 介 : 张 丽, 女, 硕 士 研 究 生 ; 张 林 杰, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:zlj33@ ahmu.edu.cn 院 上 海 细 胞 库 ;RPMI 1640 培 养 基 胰 酶 小 牛 血 清 Opti MEM 购 自 美 国 Gibco 公 司 ; 小 鼠 抗 人 Bcl 2 Bax mcl 1 Bcl xl 单 抗 购 自 美 国 CST 公 司 ; 小 鼠 抗 人 β actin 单 抗 及 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 羊 抗 小 鼠 IgG 抗 体 购 自 北 京 中 杉 金 桥 公 司 ;Bcl 2 小 干 扰 RNA 购 自 上 海 吉 玛 公 司 ; 脂 质 体 Lipofectamine2000 购 自 美 国 Invitrogen 公 司 ;TAX 购 自 美 国 百 时 美 施 贵 宝 公 司 ;β actin 及 Bcl 2 引 物 由 上 海 生 工 生 物 公 司 合 成 1.2 细 胞 培 养 及 药 物 处 理 SGC 7901 胃 癌 细 胞 系 在 含 10% 小 牛 血 清 1% 双 抗 的 RPMI 1640 培 养 基, 37 5%CO 2 饱 和 湿 度 下 培 养 TAX 溶 于 DMSO 配 成 1mmol/L 储 存 液,-20 保 存, 使 用 前 稀 释 成 所 需 浓 度 细 胞 传 代 后 24h,PBS 洗 涤 2 次, 未 处 理 组 更 换 新 鲜 培 养 液, 药 物 组 加 入 TAX, 不 同 时 间 收 集 备 用 1.3 耐 药 细 胞 系 的 建 立 选 取 对 数 生 长 期 的 SGC 7901 细 胞,TAX 作 用 浓 度 从 0 03μmol/L 开 始,48h 后 弃 去 培 养 液, 加 入 新 鲜 培 养 液 继 续 培 养, 观 察 没 有 明 显 死 亡 细 胞 后, 选 择 对 数 生 长 期 的 细 胞 传 代, 并 增 加 25% ~50%TAX 药 物 浓 度, 反 复 传 代 并 使 之 稳 定, 直 至 该 细 胞 株 能 在 0 3μmol/L 的 TAX 浓 度 下 长 期 培 养 生 长, 命 名 为 SGC 7901/TAX 1.4 PI 单 染 法 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 率 将 处 于 对 数 生 长 期 的 SGC 7901 与 SGC 7901/TAX 细 胞 接 种 于 24 孔 板 培 养 过 夜, 选 择 不 同 剂 量 的 TAX 及 不 同 时 间 点 分 别 作 用 于 上 述 两 种 细 胞 收 集 24 孔 板 中 上 清 液, 各 孔 再 用 PBS 洗 涤 1 遍,1200r/min 离 心 10min, 弃 上 清 液, 每 孔 加 入 750μlPI 染 液,37 避 光, 作 用 20min 后 收 集 细 胞 4 避 光 过 夜 次 日 上 流 式 仪 检 测 每 组 实 验 重 复 3 次, 结 果 用 WinMDI2.9 软 件 分 析, 具 有 G1 期 DNA 含 量 的 细 胞 比 例 即 细 胞 凋 亡 率 1.5 MTT 比 色 法 检 测 细 胞 生 存 率 将 处 于 对 数 生 长 期 的 SGC 7901 与 SGC 7901/TAX 细 胞 接 种 于 96 孔 板,37 5%CO 2 温 箱 培 养 3d, 分 别 加 TAX 作 用 不 同 时 间 及 浓 度 每 孔 加 MTT 溶 液 20μl, 继 续 孵 育 4h, 终 止 培 养, 小 心 吸 弃 孔 内 培 养 上 清 液, 每 孔 加 150μlDMSO, 振 荡 10min, 使 结 晶 物 充 分 溶 解 选 择 490nm 波 长, 在 酶 联 免 疫 检 测 仪 上 测 定 各 孔 吸 光

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1049 值, 记 录 结 果, 以 时 间 为 横 坐 标, 吸 光 值 为 纵 坐 标 绘 制 细 胞 生 长 曲 线 1.6 Westernblot 收 集 细 胞, 预 冷 PBS 洗 涤 2 遍, 加 入 细 胞 裂 解 液, 冰 上 孵 育 30min,4 12000r/ min, 离 心 30min, 吸 取 上 清 液, 即 细 胞 总 蛋 白 用 BCA 法 测 定 蛋 白 浓 度 将 已 定 量 好 的 细 胞 总 蛋 白 与 2 蛋 白 电 泳 上 样 缓 冲 液 等 量 混 合, 沸 水 煮 3~5 min 备 用 20μg 总 蛋 白 经 SDS PAGE 电 泳, 转 移 至 硝 酸 纤 维 素 膜 上, 转 膜 后 用 5% 脱 脂 牛 奶 /TBST 封 闭 2h, 依 次 加 入 一 抗 (β actin 小 鼠 抗 人 Bax Bcl xl Bcl 2 mcl 1)1 1000 稀 释, 室 温 孵 育 2h,TBST 洗 3 次, 每 次 15min, 分 别 加 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 羊 抗 小 鼠 二 抗 (1 10000 稀 释 ) 室 温 孵 育 1h,TBST 洗 3 次, 每 次 15min 用 ECL 试 剂 盒 进 行 显 影 曝 光, 拍 摄 图 像 保 存 1.7 RT PCR 用 TRIzol 法 提 取 TAX 作 用 不 同 时 间 的 SGC 7901/TAX 细 胞 的 总 RNA, 并 进 行 质 量 鉴 定 按 照 逆 转 录 试 剂 盒 说 明, 冰 上 操 作 将 不 同 时 间 点 的 RNA 逆 转 录 成 cdna 再 以 逆 转 录 出 的 cdna 为 模 板 建 立 反 应 体 系 (25μl) β actin 引 物 序 列 : 正 义 链 5 GACCTGACTGACTACCTCATGAAGAT 3, 反 义 链 5 GTCACACTTCATGATGGAGTTGAAGG 3 Bcl 2 引 物 序 列 : 正 义 链 5 TTCGCCGAGTCCAGGC 3, 反 义 链 5 TCACTTGTGGCCCAGATAGC 3 反 应 的 变 性, 退 火, 延 伸 条 件 为 94 5min;94 30s, 60 45s,72 1min, 共 35 个 循 环 ;72 10min PCR 产 物 在 1 5% 琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 泳 1.8 基 因 沉 默 根 据 Bcl 2 基 因 信 息, 分 别 设 计 3 条 针 对 Bcl 2 的 靶 序 列 SiRNA1:5 CATCGCCCT GTGGATGACT 3,SiRNA2:5 GACTCTGCTCAGTIT GGCC 3 ;SiRNA3:5 GTGAAGTCAACATGCCTGC 3 取 对 数 生 长 期 的 SGC 7901/TAX, 以 24 孔 板 为 例, 细 胞 密 度 为 1 10 5, 接 种 于 24 孔 板, 用 含 10% 小 牛 血 清 的 无 抗 生 素 的 RPMI 1640 培 养 24h 将 SiRNA 与 Opti MEM( 转 染 专 用 培 养 基 ),Lipo fectamine2000 与 Opti MEM 分 别 混 匀 后, 再 混 合 两 种 悬 液, 室 温 作 用 20min 将 SiRNA 脂 质 体 复 合 物 加 入 培 养 孔 中, 转 染 后 6h, 吸 弃 含 SiRNA 脂 质 体 复 合 物 的 培 养 液, 换 为 含 10% 小 牛 血 清 无 抗 生 素 的 RPMI 1640 培 养, 设 空 白 阴 性 对 照 组 1.9 统 计 学 处 理 采 用 SPSS16 0 统 计 软 件 分 析 数 据 以 x±s 珋 表 示, 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析 2 结 果 2.1 SGC 7901/TAX 与 SGC 7901 细 胞 形 态 比 较 显 微 镜 下 观 察 SGC 7901 细 胞 呈 圆 形, 大 小 均 一, 形 态 规 则, 折 光 率 高, 呈 铺 路 石 状 ;SGC 7901/TAX 细 胞 变 形, 部 分 细 胞 体 积 增 大, 大 小 不 均 一, 形 态 不 规 则, 可 见 瘤 巨 细 胞 和 凹 陷, 折 光 率 减 弱 见 图 1 图 1 光 镜 下 SGC 7901 与 SGC 7901/TAX 细 胞 形 态 SP 100 A:SGC 7901;B:SGC 7901/TAX 2.2 TAX 诱 导 SGC 7901/TAX 与 SGC 7901 凋 亡 率 比 较 用 不 同 浓 度 (0 1 0 2 0 3μmol/L)TAX 诱 导 SGC 7901/TAX 与 SGC 7901 细 胞 36h, 两 株 细 胞 的 凋 亡 率 分 别 为 (2 11±1 02)% (7 23± 0 71)% (8 13±1 33)% 和 (3 64±0 82)% (19 62±1 04)% (33 72±0 93)%, 在 0 2μmol/ L 时 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 同 时 选 用 0 3μmol/LTAX 作 用 6 12 36h 凋 亡 率 分 别 为 亲 本 株 (4 03±0 81)% (7 23±1 40)% (33 7± 0 97)%, 耐 药 株 (1 23 ±1 01)% (3 60 ± 0 73)% (33 72±1 34)%, 在 6h 以 后 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 以 上 表 明 耐 药 株 细 胞 较 亲 本 株 细 胞 对 TAX 诱 导 的 凋 亡 明 显 耐 受 2.3 TAX 对 SGC 7901/TAX 与 SGC 7901 的 增 殖 抑 制 作 用 比 较 分 别 采 用 不 同 浓 度 的 TAX(0 1 0 2 0 3μmol/L) 作 用 于 SGC 7901/TAX 与 SGC 7901 细 胞 36h 后,MTT 法 检 测 细 胞 存 活 率 分 别 为 (96 43±2 52)% (91 97±2 90)% (89 11± 3 52)% 和 (88 54±0 93)% (83 31±2 07)% (69 56±3 20)%, 在 TAX0 1μmol/L 时 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 同 时, 采 用 0 3μmol/LTAX 作 用 两 株 细 胞 6 12 36h 后,MTT 检 测 存 活 率 耐 药 株 为 (95 17±1 84)% (89 34±2 61)% (84 33 ±3 12)%, 亲 本 细 胞 株 为 (93 42±2 31)% (80 77±3 74)% (69 12±1 93)%,12h 后 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 以 上 表 明 TAX 对 耐 药 株 细 胞 的 增 殖 抑 制 作 用 较 亲 本 株 细 胞 明 显 减 弱 2.4 TAX 作 用 于 SGC 7901 和 SGC 7901/TAX 后

1050 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 对 Bcl 2 家 族 蛋 白 表 达 的 影 响 检 测 Bcl 2 蛋 白 家 族 Bcl 2 mcl 1 Bcl xl Bax 在 两 株 细 胞 中 表 达 的 变 化 情 况, 结 果 显 示 Bcl 2 在 亲 本 细 胞 株 中 表 达 下 调, 与 0h 蛋 白 表 达 量 比 较, 在 6h 后 开 始 降 低, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05), 见 图 2; 同 时 Bcl 2 在 TAX 耐 药 细 胞 株 中 表 达 明 显 上 调, 与 0h 蛋 白 表 达 量 比 较, 在 6h 后 开 始 升 高, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P< 0 05), 见 图 3 Bcl 2 在 两 株 细 胞 中 的 表 达 差 异 说 明 抗 凋 亡 蛋 白 Bcl 2 变 化 可 能 在 TAX 耐 药 机 制 中 起 重 要 作 用 图 3 TAX(0 3μmol/L) 诱 导 SGC 7901/TAX 细 胞 Bcl 2 家 族 蛋 白 的 变 化 与 同 种 蛋 白 0h 比 较 : P<0 05 图 2 TAX(0 3μmol/L) 诱 导 SGC 7901 细 胞 Bcl 2 家 族 蛋 白 的 变 化 与 同 种 蛋 白 0h 比 较 : P<0 05 图 4 TAX(0 3μmol/L) 诱 导 胃 腺 癌 细 胞 耐 药 株 SGC 7901/TAXBcl 2mRNA 的 表 达 M:MarkerDL2000 2.5 TAX 诱 导 耐 药 细 胞 株 SGC 7901/TAX 中 Bcl 2mRNA 表 达 水 平 变 化 在 明 确 了 TAX 作 用 于 胃 腺 癌 细 胞 耐 药 株 SGC 7901/TAX 后 Bcl 2 的 蛋 白 水 平 是 上 调 的, 进 一 步 探 讨 mrna 水 平 的 变 化 TAX 处 理 胃 腺 癌 耐 药 细 胞 株 SGC 7901/TAX 后, 提 取 作 用 不 同 时 间 点 的 mrna, 采 用 特 异 性 引 物 通 过 RT PCR 反 应 检 测 Bcl 2mRNA 水 平 也 是 上 调 的, 见 图 4, 与 蛋 白 水 平 变 化 一 致, 说 明 Bcl 2 的 变 化 受 到 转 录 水 平 上 的 调 控 2.6 TAX 作 用 于 沉 默 Bcl 2 的 耐 药 细 胞 株 SGC 7901/TAX 后 凋 亡 率 变 化 情 况 由 于 Bcl 2 在 耐 药 细 胞 株 中 表 达 上 调, 于 是 在 耐 药 细 胞 株 SGC 7901/ TAX 中 沉 默 Bcl 2 基 因,Westernblot 鉴 定 Bcl 2 蛋 白 表 达 可 见 转 染 小 干 扰 RNA 后,Bcl 2 的 蛋 白 表 达 显 著 下 调, 见 图 5, 说 明 沉 默 基 因 有 效 转 染 24h 后 加 TAX 作 用 36h, 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 率 示 3 条 小 干 扰 RNA 分 别 为 (14 32±0 92)% (18 53± 1 06)% (29 16±0 47)%, 较 空 白 对 照 (7 20± 0 32)% 和 阴 性 对 照 (8 41±0 65)% 明 显 提 高, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05), 见 图 6, 同 时 MTT 比 色 法 检 测 示 转 染 3 条 小 干 扰 RNA 后 细 胞 存 活 率 分 别 为 (79 82±1 34)% (76 11±3 42)% (66 72± 1 53)%, 与 空 白 对 照 (89 12±1 97)% 和 阴 性 对 照 (88 15±2 64)% 相 比 显 著 下 降, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 3 讨 论 TAX 是 从 紫 杉 树 皮 中 分 离 得 到 的 抗 癌 药 物, 其

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1051 图 5 Westernblot 检 测 沉 默 Bcl 2 基 因 后 Bcl 2 的 表 达 变 化 1: 空 白 对 照 组 ;2: 阴 性 对 照 组 ;3:Bcl 2 SiRNA1 组 ;4:Bcl 2 SiR NA2 组 ;5:Bcl 2 SiRNA3 组 ; 与 空 白 对 照 组 比 较 : P<0 05 [4] 作 用 机 制 主 要 是 促 进 微 管 双 聚 体 装 配 成 微 管, 抑 制 微 管 的 解 聚, 从 而 影 响 细 胞 的 正 常 分 裂, 使 细 胞 阻 滞 于 G2/M 期 同 时 TAX 与 微 管 蛋 白 结 合 十 分 稳 定, 可 抑 制 细 胞 内 外 某 些 调 控 因 素 对 微 管 系 统 的 作 用, 可 诱 导 细 胞 最 终 以 凋 亡 方 式 死 亡 临 床 应 用 于 治 疗 多 种 肿 瘤 如 胃 癌 食 道 癌 肺 癌 乳 腺 癌 卵 巢 癌 等 但 是, 与 其 他 化 疗 药 物 一 样 TAX 也 面 临 着 肿 瘤 细 胞 的 耐 药 性 问 题 肿 瘤 耐 药 的 机 制 非 常 复 杂 [5], 主 要 可 分 为 4 种 : 1 降 低 药 物 活 性 或 提 高 细 胞 解 毒 能 力 ;2 通 过 转 运 蛋 白 降 低 细 胞 内 或 区 域 内 的 药 物 浓 度 ;3 改 变 药 物 作 用 靶 点 或 提 高 细 胞 对 破 坏 靶 点 的 修 复 能 力 ;4 提 高 细 胞 抗 凋 亡 能 力 这 种 耐 药 可 为 原 发 性 也 可 为 继 发 性, 并 已 成 为 肿 瘤 化 疗 的 一 大 障 碍 本 实 验 采 用 药 物 浓 度 梯 度 递 增 持 续 作 用 法 建 立 了 耐 TAX 的 胃 腺 癌 细 胞 株 SGC 7901/TAX, 光 镜 下 观 察 SGC 7901 细 胞 呈 圆 形 或 椭 圆 形, 大 小 均 一, 形 态 规 则, 边 界 清 晰, 核 大,SGC 7901/TAX 耐 药 细 胞 形 态 不 规 则, 大 小 不 一, 细 胞 体 积 稍 增 大, 边 界 不 清 楚, 细 胞 核 不 规 则, 可 见 较 大 的 凹 陷 和 巨 细 胞 流 式 细 胞 术 检 测 TAX 诱 导 的 两 株 细 胞 随 着 药 物 作 用 浓 度 的 增 加 及 时 间 的 延 长 凋 亡 率 增 加, 并 且 耐 药 细 胞 株 较 亲 本 细 胞 对 TAX 诱 导 的 凋 亡 明 显 耐 受 同 时, MTT 实 验 显 示 TAX 诱 导 后 耐 药 细 胞 株 的 生 存 率 比 亲 本 细 胞 明 显 提 高, 这 些 都 显 示 建 立 了 TAX 耐 药 细 胞 株 SGC 7901/TAX 模 型 成 功 之 后,TAX 分 别 作 用 于 两 株 细 胞,Westernblot 检 测 了 与 凋 亡 密 切 相 关 的 Bcl 2 家 族 相 关 蛋 白 的 表 达 情 况, 结 果 显 示 Bcl 2 在 SGC 7901 细 胞 株 中 蛋 白 表 达 水 平 下 调, 而 在 SGC 7901/TAX 耐 药 细 胞 株 中 的 蛋 白 表 达 却 是 上 调 这 提 示 Bcl 2 作 为 抗 凋 亡 Bcl 2 家 族 中 的 重 要 一 员, 其 在 TAX 诱 导 的 耐 药 胃 腺 癌 细 胞 凋 亡 中 起 抑 制 作 用 为 了 进 一 步 证 实 Bcl 2 在 TAX 耐 药 中 的 作 用, 在 Bcl 2 高 表 达 的 耐 药 细 胞 SGC 7901/TAX 中 沉 默 Bcl 2 基 因 后,TAX 再 作 用 此 沉 默 Bcl 2 基 因 的 耐 药 细 胞 株, 流 式 结 果 显 示 细 胞 凋 亡 率 较 沉 默 基 因 前 明 显 升 高,MTT 也 提 示 沉 默 Bcl 2 基 因 后 耐 药 细 胞 株 生 存 率 较 沉 默 基 因 前 明 显 减 少 由 此 进 一 步 表 明 SGC 7901/TAX 对 TAX 耐 药 与 TAX 诱 导 Bcl 2 的 表 达 增 加 有 关 Bcl 2 基 因 家 族 是 线 粒 体 凋 亡 途 径 中 的 重 要 凋 亡 调 节 蛋 白 [6], 分 为 两 类, 一 类 为 抗 凋 亡 成 员 位 于 内 质 网 线 粒 体 膜 和 核 膜 等 处, 包 括 Bcl 2 Bcl xl mcl 1 均 含 有 3~4 个 BH 结 构 域 ; 另 一 类 为 促 凋 亡 成 员 : 正 常 时 存 在 于 胞 质 或 者 细 胞 骨 架 中, 包 括 Bim Bid Bax Bad 等 Bcl 2 蛋 白 最 早 在 人 类 滤 泡 样 的 B 细 胞 淋 巴 瘤 中 由 染 色 体 [t(14:18)(q32:q21)] 易 位 的 断 裂 点 克 隆 发 现 [7], 已 知 Bcl 2 主 要 通 过 阻 止 凋 亡 而 促 进 细 图 6 沉 默 Bcl 2 基 因 后,TAX 诱 导 SGC 7901/TAX 的 凋 亡 率 A: 空 白 对 照 组 ;B: 阴 性 对 照 组 ;C:Bcl 2 SiRNA1 组 ;D:Bcl 2 SiRNA2 组 ;E:Bcl 2 SiRNA3 组

1052 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 胞 存 活 Bcl 2 定 位 于 细 胞 核 膜 内 质 网 和 线 粒 体 外 膜 上 Bcl 2 通 过 BH3 结 构 域 与 同 家 族 的 促 凋 亡 分 [8] 子 如 Bax 形 成 异 源 二 聚 体, 有 研 究 显 示 当 肿 瘤 细 胞 受 到 凋 亡 诱 导 因 子 的 刺 激 后 是 否 存 活 取 决 于 Bcl 2/Bax 的 比 率, 当 Bax 增 加 时, 形 成 Bax/Bax 同 二 聚 体, 加 速 细 胞 凋 亡, 当 Bcl 2 表 达 增 加 时, 形 成 Bcl 2/ Bax 异 二 聚 体, 抑 制 Bax/Bax 同 二 聚 体 诱 导 的 凋 亡, 但 这 些 复 合 物 凋 亡 调 节 的 具 体 机 制 尚 不 清 楚 研 [9] 究 显 示 将 Bcl 2 转 染 到 乳 腺 癌 细 胞 中, 转 染 Bcl 2 的 细 胞 在 相 同 化 疗 药 物 的 作 用 下 凋 亡 率 明 显 减 低 了 Konoplevaetal [10] 将 Bcl 2 反 义 寡 核 苷 酸 导 入 白 血 病 细 胞 中, 抑 制 其 Bcl 2 表 达, 发 现 转 染 后 细 胞 的 凋 亡 率 明 显 减 低, 并 且 对 多 种 化 疗 药 物 的 敏 感 性 升 高 Hanetal [11] 将 Bcl 2 的 小 干 扰 RNA 转 染 入 耐 TAX 的 肺 癌 细 胞 后, 细 胞 凋 亡 率 较 转 染 前 明 显 提 高 了 这 都 与 该 实 验 结 果 相 符 合 因 此, 对 反 义 Bcl 2 寡 核 苷 酸 或 其 反 义 表 达 质 粒 的 体 内 外 抗 肿 瘤 作 用 研 究 有 重 要 意 义, 可 能 成 为 未 来 逆 转 肿 瘤 耐 药 治 疗 的 新 靶 点 新 思 路 参 考 文 献 [2] ChenH,LandenCN,LiY,etal.Epigalocatechingalateand sulforaphanecombinationtreatmentinduceapoptosisinpaclitaxel resistantovariancancercelsthroughhtertandbcl 2down regu lation[j].expcelres,2013,319(5):697-706. [4] FangW S,LiangXT.Recentprogresinstructureactivityrela tionshipandmechanisticstudiesoftaxolanalogues[j].minirev MedChem,2005,5(1):1-12. [5] LoHW,Ali OsmanF.Geneticpolymorphismandfunctionofglu tathiones transferasesintumordrugresistance[j].curopin Pharmacol,2007,7(4):367-74. [6] ThomasS,QuinnBA,DasSK,etal.TargetingtheBcl 2family forcancertherapy[j].expertopinthertargets,2013,17(1): 61-75. [7] ZinkelS,GrosA,YangE.Bcl 2familyinDNAdamageandcel cyclecontrol[j].celdeathdifer,2006,13(8):1351-9. [9] AggarwalH,LubanaPS,JainDK,etal.EstimationofBcl 2 proteinincarcinomaofthebreastanditsclinicalcorelationinlo calyadvancedbreastcancer[j].jcancerresther,2007,3 (4):207-10. [10]KonoplevaM,TariAM,EstrovZ,etal.LiposomalBcl 2anti senseoligonueleotidesenhanceproliferation,sensitizeacutemye loidleukemiatocytosine arabinoside,andinduceapoptosisinde pendentofotherantiapoptoticproteins[j].blood,2000,95 (12):3929-38. [1] GaletiE,MagnaniM,RenzuliM L,etal.Paclitaxelanddo cetaxelresistance:molecularmechanismsanddevelopmentofnew generationtaxanes[j].chem MedChem,2007,2(7):920-42. [3] ZhouJ,ZhaoW Y,MaX,etal.Theanticancereficacyofpacli taxelliposomesmodifiedwithmitochondrialtargetingconjugatein resistantlungcancer[j].biomaterials,2013,34(14):3626-38. [8] HansenPJ,FearJM.Cheatingdeathatthedawnoflife:devel opmentalcontrolofapoptoticrepresioninthepreimplantationem bryo[j].biochembiophysrescommun,2011,413(2):155-8. [11]HanZX,WangHM,JiangG,etal.Overcomingpaclitaxelre sistanceinlungcancercelsviadualinhibitionofstathminand bcl 2[J].CancerBiotherRadiopharm,2013,28(5):398-405. TheroleofBcl 2inpaclitaxel resistantgastricadenocarcinomacels ZhangLi,HuWanglai,WangJiayu,etal (DeptofImmunology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230032) Abstract Objective ToinvestigatetheroleofBcl 2inpaclitaxel resistantgastricadenocarcinomacels.methods Thepaclitaxel resistantcellinesgc 7901/TAXwasestablishedbyincreasingdrugconcentrationgradientand continuinginduction.thediferenceofapoptosisratewasmeasuredbyflowcytometryusingpropidiumiodidestai ning.mttcolorimetricdetectedcelsurvivalrate.theproteinexpresionlevelsofbcl 2,mcl 1,Bax,Bcl xlwere detectedbywesternblot.theexpresionofbcl 2mRNAlevelintheresistantcellinewasmonitoredbyRT PCR. SilencingofgeneBcl 2expresionwasaccomplishedbysmalinterferingRNAtechniques.Results Paclitaxel in ducedapoptosisingastricadenocarcinomacelswasinatimeanddose dependentmanner.drug resistantgastric adenocarcinomacellinewasnotsensitivetopaclitaxelinducedapoptosis.theup regulationofbcl 2proteinlevel wasobviousinthedrug resistantcelline,andbcl 2mRNAlevelwasalsofoundtobeupregulatedbysemi quan titativepcr.inhibitingbcl 2expresionbySiRNAinresistantgastricadenocarcinomacellineincreasedthecel apoptosis.conclusion Bcl 2upregulationplaysanimportantroleingastricadenocarcinomacelsresistanttopa clitaxelinducedapoptosis. Keywords gastricadenocarcinoma;paclitaxel;celapoptosis;tumordrug resistance;bcl 2

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1053 细 胞 自 噬 在 褪 黑 素 诱 导 的 肝 癌 细 胞 株 HepG2 死 亡 中 的 作 用 范 文 洁, 贾 振 亚, 曹 静, 徐 癑, 范 璐 璐, 孙 国 平 摘 要 目 的 研 究 褪 黑 素 (MT) 对 人 肝 癌 HepG2 细 胞 自 噬 功 能 的 影 响, 并 初 步 探 讨 自 噬 在 MT 诱 导 细 胞 死 亡 中 的 作 用 方 法 体 外 培 养 肝 癌 细 胞 株 HepG2, 用 不 同 浓 度 的 MT (10-7 10-5 10-3 mol/l) 作 用 于 HepG2 细 胞,Westernblot 法 检 测 HepG2 细 胞 自 噬 相 关 蛋 白 LC3(LC3 Ⅰ /LC3 Ⅱ) 的 表 达, 并 用 单 丹 磺 酰 尸 胺 (MDC) 染 色 在 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 下 观 察 HepG2 细 胞 内 自 噬 体 形 成 情 况 ; 在 给 予 MT 的 同 时 使 用 3 甲 基 腺 嘌 呤 (3 MA) 或 氯 喹 (CQ) 对 细 胞 自 噬 进 行 抑 制, 利 用 MTT 和 Westernblot 法 分 别 测 定 HepG2 细 胞 的 细 胞 活 力 和 LC3 蛋 白 的 表 达 变 化 结 果 MT 作 用 后 可 诱 导 HepG2 细 胞 内 自 噬 小 体 形 成, 自 噬 相 关 蛋 白 LC3 Ⅱ 表 达 增 多 且 呈 剂 量 依 赖 关 系 MT 作 用 后,HepG2 细 胞 生 长 受 到 抑 制, 加 入 3 MA 或 CQ 抑 制 自 噬 后, 细 胞 生 长 受 抑 现 象 更 加 显 著 MT+3 MA 组 LC3 Ⅱ /β actin 比 值 较 MT 单 药 组 明 显 减 小,MT +CQ 组 则 比 值 增 大 结 论 MT 可 激 活 肝 癌 细 胞 HepG2 保 护 性 自 噬 反 应, 通 过 3 MA 或 CQ 阻 断 MT 诱 导 的 自 噬 通 路 可 显 著 增 强 MT 对 HepG2 细 胞 的 生 长 抑 制 作 用, 提 示 自 噬 可 能 是 肝 癌 细 胞 HepG2 逃 避 MT 肿 瘤 杀 伤 作 用 的 一 种 有 效 机 制 关 键 词 肝 癌 ; 自 噬 ; 褪 黑 素 ; 细 胞 增 殖 中 图 分 类 号 R735.7 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1053-04 褪 黑 素 (melatonin,mt) 是 一 种 主 要 由 松 果 腺 合 成 并 分 泌 的 吲 哚 类 化 合 物, 具 有 调 节 生 理 节 奏 抗 氧 化 抗 炎 免 疫 调 节 等 多 种 功 能 [1] [2] 研 究 表 明 MT 还 具 有 抗 肿 瘤 和 化 学 预 防 作 用, 动 物 实 验 及 临 床 试 [3] 验 均 表 明,MT 能 有 效 抑 制 肝 癌 乳 腺 癌 肺 癌 前 列 腺 癌 等 多 种 肿 瘤 增 殖 自 噬 是 细 胞 面 对 饥 饿 等 环 境 压 力 下 的 一 种 生 存 机 制, 目 前 对 于 MT 与 自 噬 的 [4-5] 关 系 尚 不 明 确 多 数 研 究 表 明 MT 可 抑 制 自 噬 通 路 且 这 种 作 用 常 与 其 抗 氧 化 活 性 直 接 相 关 ; 但 Liuetal [6] 则 发 现 在 小 鼠 肝 癌 H22 细 胞 中,MT 可 通 过 减 少 mtor 和 Akt 信 号 蛋 白 表 达 从 而 诱 发 自 噬 过 2014-03-20 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :81071986 81272739) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 肿 瘤 内 科, 合 肥 230022 作 者 简 介 : 范 文 洁, 女, 硕 士 研 究 生 ; 孙 国 平, 男, 教 授, 主 任 医 师, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:sunguoping@ahmu.edu.cn 程 但 是 在 人 类 肝 癌 细 胞 中,MT 是 否 在 细 胞 自 噬 诱 导 的 肿 瘤 抑 制 机 制 或 细 胞 保 护 机 制 中 发 挥 作 用 尚 不 明 确 因 此, 该 研 究 旨 在 明 确 MT 在 肝 癌 治 疗 中 能 否 诱 导 自 噬 产 生, 并 对 自 噬 在 MT 杀 伤 肿 瘤 细 胞 中 的 作 用 进 行 初 步 探 讨 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 1.1.1 细 胞 株 HepG2 肝 癌 细 胞 株 购 自 中 国 科 学 院 上 海 生 命 科 学 院 细 胞 库, 培 养 于 含 10% 胎 牛 血 清 DMEM 培 养 液 中, 置 于 37 5% CO 2 饱 和 湿 度 培 养 箱 中 培 养, 隔 天 换 液, 融 合 度 达 80% 时 传 代 1.1.2 主 要 试 剂 MT LC3 兔 抗 多 克 隆 抗 体 3 甲 基 腺 嘌 呤 (3 methyladenine,3 MA) 氯 喹 (chloro quine,cq) 单 丹 磺 酰 尸 胺 (monodansylcadaverin, MDC) 染 料 均 购 自 美 国 Sigma 公 司 ;β actin 鼠 抗 多 克 隆 抗 体 山 羊 抗 兔 二 抗 山 羊 抗 小 鼠 二 抗 购 自 北 京 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 1.2 方 法 1.2.1 Westernblot 法 检 测 细 胞 自 噬 相 关 蛋 白 LC3 的 表 达 取 对 数 生 长 期 的 HepG2 细 胞, 用 0 1% 胰 蛋 白 酶 消 化 以 每 孔 2 5 10 5 个 细 胞 密 度 接 种 于 6 孔 板 中, 培 养 24h 待 细 胞 贴 壁 后 进 行 药 物 干 预 选 用 不 同 浓 度 梯 度 的 MT 溶 液 (10-7 10-5 10-3 mol/ L, 生 理 浓 度 约 10-9 mol/l) 作 用 于 HepG2 细 胞, 以 只 加 培 养 液 的 HepG2 细 胞 为 对 照 组 24h 后 收 集 细 胞, 冷 PBS 洗 2 次, 每 孔 加 蛋 白 裂 解 液 150μl, 冰 上 裂 解 30min, 然 后 4 12000r/min 离 心 15 min, 取 上 清 液,BCA 法 定 量, 取 20μg 蛋 白 进 行 Westernblot 实 验 :12 5%SDS PAGE 电 泳, 转 膜,5% 脱 脂 奶 粉 封 闭 2h,4 一 抗 孵 育 过 夜, 加 入 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 二 抗, 最 后 加 入 电 化 学 发 光 试 剂 ( 美 国 Pierce 公 司 ), 采 用 ImageQuant TM LAS 4000 型 发 光 成 像 系 统 显 像 1.2.2 MDC 染 色 法 观 察 自 噬 体 的 形 成 细 胞 发 生 自 噬 形 成 的 自 噬 体 为 酸 性, 故 弱 碱 性 的 荧 光 染 料 MDC 被 细 胞 吸 收 后 可 选 择 性 的 浓 聚 于 自 噬 体, 可 用 于 显 示 自 噬 体 的 形 成 及 自 噬 体 的 数 量 [7] 将 预 先 消 毒 的 盖 玻 片 (24mm 24mm) 放 置 于 培 养 皿 内,

1054 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 接 种 对 数 生 长 期 的 HepG2 细 胞 于 盖 玻 片 上 制 成 细 胞 爬 片, 待 细 胞 贴 壁 后 进 行 药 物 干 预 实 验 分 为 空 白 组 雷 帕 霉 素 (1μg/ml) 组 ( 阳 性 对 照 ) MT 组 (10-5 mol/l),24h 后 用 0.05mmol/LMDC 于 37 避 光 孵 育 30min 后, 取 出 爬 片 置 于 载 玻 片 上, 立 即 在 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 下 进 行 观 察 1.2.3 MTT 法 检 测 自 噬 抑 制 剂 对 MT 抗 肿 瘤 作 用 的 影 响 调 整 细 胞 密 度 为 2.5 10 4 /ml, 接 种 于 96 孔 板, 每 孔 200μl, 待 细 胞 贴 壁 后 分 别 加 入 自 噬 抑 制 剂 3 MA(2mmol/L) 和 CQ(5μg/ml) 预 处 理 细 胞 1 h, 然 后 加 入 不 同 质 量 浓 度 的 MT(0 10-7 10-5 10-3 mol/l) 共 同 培 养 24h 后, 进 行 MTT 法 检 测 实 验 分 为 MT 单 药 组 MT+3 MA 联 合 用 药 组 MT+CQ 联 合 用 药 组, 以 只 加 培 养 液 的 孔 为 空 白 组 每 组 设 3 个 复 孔, 加 药 后 培 养 24h, 每 孔 加 入 MTT 溶 液 (5 g/l)20μl,37 继 续 孵 育 4h 后 吸 出 各 孔 培 养 液, 每 孔 加 入 DMSO150μl, 用 酶 标 仪 在 490nm 波 长 下 测 定 各 孔 吸 光 度 (opticaldensity,od) 值, 并 计 算 细 胞 存 活 率 存 活 率 (%)=(OD 实 验 组 -OD 空 白 组 )/ (OD 对 照 组 -OD 空 白 组 ) 100% 1.2.4 自 噬 抑 制 剂 对 LC 3 蛋 白 表 达 的 影 响 HepG2 细 胞 贴 壁 生 长 后, 加 入 药 物 处 理, 实 验 分 为 : MT(0 10-5 mol/l) 单 药 组 MT(0 10-5 mol/l)+3 MA(2mmol/L) 联 合 用 药 组,MT(0 10-5 mol/l)+ CQ(5μg/ml) 联 合 用 药 组, 作 用 24h 后 收 集 细 胞 至 1 5ml 离 心 管 中, 行 Westernblot 检 测, 检 测 方 法 同 1.2.1 1.3 统 计 学 处 理 应 用 SPSS13 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 组 间 比 较 采 用 t 检 验, 多 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析 图 1 Westernblot 检 测 不 同 浓 度 MT 对 HepG2 细 胞 中 自 噬 相 关 蛋 白 LC3(LC3 Ⅰ 和 LC3 Ⅱ) 表 达 的 影 响 1: 空 白 组 ;2:MT10-7 mol/l 组 ;3:MT10-5 mol/l 组 ;4:MT 10-3 mol/l 组 ; 与 空 白 组 比 较 : P<0.05 与 雷 帕 霉 素 处 理 结 果 相 似, 见 图 2 形 态 学 上 出 现 自 噬 体 的 增 多 是 证 实 自 噬 发 生 的 最 基 本 的 条 件, 因 此 上 述 结 果 提 示,MT 确 实 可 以 诱 导 HepG2 细 胞 自 噬 的 产 生 2 结 果 2.1 MT 对 HepG2 细 胞 自 噬 功 能 的 影 响 2.1.1 自 噬 相 关 蛋 白 LC3 的 表 达 水 平 Western blot 检 测 显 示, 与 对 照 组 比 较, 经 不 同 浓 度 MT (10-7 10-5 10-3 mol/l) 处 理 24h 后,HepG2 细 胞 LC3 Ⅱ 蛋 白 表 达 量 均 明 显 增 高,LC3 Ⅱ /β actin 吸 光 度 比 值 随 MT 浓 度 增 加 呈 现 出 递 增 趋 势 (F= 80 336,P<0 05), 见 图 1, 提 示 MT 可 诱 导 HepG2 细 胞 自 噬 体 形 成, 并 呈 现 出 剂 量 依 赖 关 系 2.1.2 MDC 荧 光 染 色 检 测 自 噬 水 平 改 变 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 下 观 察 结 果 显 示, 与 对 照 组 比 较, 经 MT (10-5 mol/l) 处 理 后 有 大 量 绿 色 荧 光 小 点 即 自 噬 小 体 散 在 分 布 于 细 胞 膜 附 近, 且 数 量 明 显 多 于 对 照 组, 图 2 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 检 测 MT 处 理 后 HepG2 细 胞 内 自 噬 发 生 增 多 600 A: 空 白 组 ;B: 雷 帕 霉 素 组 ; C:MT10-5 mol/l 组 2.2 抑 制 细 胞 自 噬 能 增 强 MT 对 HepG2 细 胞 的 生 长 抑 制 MTT 检 测 结 果 显 示, 与 对 照 组 相 比,MT (10-7 10-5 和 10-3 mol/l) 单 药 处 理 HepG2 细 胞 24h 后 的 细 胞 活 力 均 被 抑 制 (F =49 271,P <

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1055 0 05), 加 入 自 噬 抑 制 剂 3 MA(2mmol/L 预 处 理 1 h) 或 CQ(5μg/ml 预 处 理 1h) 后, 联 合 用 药 组 的 细 胞 存 活 率 均 较 MT 单 药 组 明 显 下 降 (F=39 682,F =68 794,P<0 05), 见 图 3 LC3 -Ⅱ /β-actin 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1 2 3 4 5 6 LC3-Ⅰ LC3-Ⅱ β-actin * * * 1 2 3 4 5 6 图 3 自 噬 抑 制 剂 3 MA 或 CQ 与 MT 联 合 作 用 对 HepG2 细 胞 存 活 率 的 影 响 与 空 白 组 比 较 : P<0 05; 与 MT 组 比 较 : P<0.05 2.3 抑 制 自 噬 后 自 噬 相 关 蛋 白 LC3 的 表 达 水 平 检 测 10-5 mol/lmt 治 疗 组 HepG2 细 胞 LC3 Ⅱ 表 达 量 高 于 对 照 组, 而 2mmol/L3 MA 和 10-5 mol/lmt 联 合 干 预 后 HepG2 细 胞 LC3 Ⅱ 表 达 量 低 于 MT 单 药 组, 而 经 过 10-5 mol/lmt 和 5μg/mlCQ 联 合 干 预 后 LC3 Ⅱ 表 达 量 高 于 MT 单 药 组, 见 图 4 以 上 结 果 提 示,3 MA 可 抑 制 HepG2 细 胞 自 噬 体 的 形 成, CQ 则 可 在 溶 酶 体 水 平 阻 断 HepG2 细 胞 自 噬 体 的 降 解, 这 也 从 另 一 个 方 面 显 示 MT 作 用 下 HepG2 细 胞 自 噬 体 增 多 的 现 象 的 确 是 自 噬 机 制 被 激 活 的 结 果, 而 非 自 噬 降 解 通 路 被 抑 制 所 造 成 的 假 象 3 讨 论 自 噬 是 广 泛 存 在 于 真 核 细 胞 中 的 一 种 生 命 现 象, 是 一 种 高 度 保 守 的 细 胞 行 为, 与 细 胞 的 生 长 增 [8] 殖 及 肿 瘤 的 发 生 过 程 关 系 密 切 研 究 表 明 自 噬 在 肿 瘤 中 具 有 双 重 作 用, 既 可 以 作 为 一 种 防 御 机 制 来 抵 御 环 境 变 化 对 细 胞 造 成 的 损 伤, 同 时 亦 可 作 为 一 种 Ⅱ 型 细 胞 死 亡 程 序 诱 导 细 胞 主 动 性 死 亡, 因 此 不 同 条 件 下 自 噬 在 肿 瘤 中 的 作 用 主 要 取 决 于 细 胞 状 态 以 及 所 处 的 具 体 环 境 LC3 是 哺 乳 动 物 细 胞 中 酵 母 ATG8 基 因 的 同 源 物, 现 已 作 为 自 噬 的 特 异 性 标 志 蛋 白 [9], 自 噬 发 生 时 LC3 由 胞 质 型 ( 即 LC3 Ⅰ) 转 位 到 自 噬 体 膜 (LC3 Ⅱ) 增 加, 因 此 LC3 Ⅰ 向 LC3 Ⅱ 的 转 变 代 表 图 4 抑 制 自 噬 后 自 噬 相 关 蛋 白 LC3(LC3 Ⅰ /LC3 Ⅱ) 的 表 达 水 平 1: 空 白 组 ;2:MT(10-5 mol/l) 组 ;3:3 MA(2mmol/L) 组 ;4: MT(10-5 mol/l)+3 MA(2mmol/L) 组 ;5:CQ(5μg/ml) 组 ;6:MT (10-5 mol/l)+cq(5μg/ml) 组 ; 与 空 白 组 比 较 : P<0 05; 与 MT (10-5 mol/l) 组 比 较 : Δ P<0 05 了 自 噬 的 诱 导, 但 LC3 Ⅰ 相 对 不 稳 定, 易 受 环 境 及 实 验 条 件 等 多 种 因 素 的 影 响, 且 对 抗 体 的 亲 和 力 要 低 于 LC3 Ⅱ, 因 此 多 数 研 究 将 LC3 Ⅱ 作 为 自 噬 检 测 指 标 [10-11] 本 研 究 采 用 Westernblot 检 测 显 示, 经 MT 处 理 后,HepG2 细 胞 的 LC3 Ⅱ /β actin 的 比 值 明 显 增 高, 且 呈 剂 量 依 赖 关 系, 表 明 MT 可 诱 导 HepG2 细 胞 自 噬 发 生 3 MA 是 一 种 核 苷 派 生 物, 能 促 进 溶 酶 体 碱 化, 导 致 自 噬 体 不 能 与 溶 酶 体 融 合 而 抑 制 自 噬 小 体 的 形 成 [12] CQ 则 作 为 一 种 溶 酶 体 抑 制 剂, 可 在 自 噬 性 降 解 通 路 的 下 游 溶 酶 体 水 平 来 抑 制 自 噬 [13] 本 研 究 显 示 将 二 者 分 别 加 入 HepG2 细 胞 均 可 抑 制 MT 引 起 的 自 噬 反 应, 且 可 使 MT 刺 激 后 的 HepG2 细 胞 存 活 率 较 MT 单 独 作 用 明 显 下 降, 提 示 抑 制 自 噬 可 能 会 提 高 肝 癌 细 胞 HepG2 对 MT 的 敏 感 性 由 此 推 测 抗 癌 药 物 治 疗 过 程 中 诱 导 产 生 的 自 噬 体 可 能 是 肝 癌 细 胞 逃 避 化 疗 药 物 环 境 从 而 逃 避 死 亡 的 一 种 有 效 机 制 ; 在 化 疗 过 程 中 加 用 自 噬 抑 制 剂 以 抑 制 自 噬 反 应 可 降 低 肿 瘤 细 胞 对 受 损 细 胞 器 的 清 除 能 力, 从 而 增 加 肿 瘤 细 胞 死 亡 率, 增 强 化 疗 疗 效 但 关 于 自 噬 在 MT 杀 伤 肝 癌 细 胞 中 所 起 的 具 体 作 用 及 分 子 机 制 尚 有 待 进 一 步 研 究 阐 明 参 考 文 献 [1] ReiterRJ,ParedesSD,ManchesterLC,etal.Reducingoxida tive/nitrosativestres:anewly discoveredgenreformelatonin[j]. CritRevBiochemMolBiol,2009,44(4):175-200. [2] LenoirV,deJonage CanonicoM B,PerinM H,etal.Preventive

1056 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) andcurativeefectofmelatoninonmammarycarcinogenesisin ducedbydimethylbenz[a]anthraceneinthefemalesprague Daw leyrat[j].breastcancerres,2005,7(4):r470-6. [3] Leja SzpakA,JaworekJ,PierzchalskiP,etal.Melatonininduces pro apoptoticsignalingpathwayinhumanpancreaticcarcinoma cels(panc 1)[J].JPinealRes,2010,49(3):248-55. [4] NopparatC,PorterJE,EbadiM,etal.Themechanism forthe neuroprotectiveefectofmelatoninagainstmethamphetamine in ducedautophagy[j].jpinealres,2010,49(4):382-9. [5] KohPO.Melatoninpreventsischemicbraininjurythroughactiva tionofthemtor/p70s6kinasesignalingpathway[j].neurosci Let,2008,444(1):74-8. [6] LiuC,JiaZ,ZhangX,etal.Involvementofmelatonininautoph agy mediatedmousehepatomah22celsurvival[j].intimmuno pharmacol,2012,12(2):394-401. [7] BiederbickA,KernH F,Els serh P.Monodansylcadaverine (MDC)isaspecificinvivomarkerforautophagicvacuoles[J]. EurJCelBiol,1995,66(1):3-14. [8] YuYX,GuZL,QinZH,etal.Theroleofautophagyinpharma cologicalactionsofanticancerdrugs[j].chinpharmacolbul, 2006,22(2):137-41. [9] SlobodkinM R,ElazarZ.TheAtg8family:multifunctionalubiq uitin likekeyregulatorsofautophagy[j].esaysbiochem,2013, 55:51-64. [10] RubinszteinDC,CuervoAM,RavikumarB,etal.Insearchofan autophagomometer [J].Autophagy,2009,5(5):585-9. [11] KlionskyDJ,AbdalaFC,AbeliovichH,etal.Guidelinesforthe useandinterpretationofasaysformonitoringautophagyinhigher eukaryotes[j].autophagy,2008,4(2):151-75. [12]WuY,WangX,GuoH,etal.Synthesisandscreeningof3 MAde rivativesforautophagyinhibitors[j].autophagy,2013,9(4):595-603. [13]EggerME,HuangJS,YinW.Inhibitionofautophagywithchloro quineisefectiveinmelanoma[j].jsurgres,2013,184(1): 274-81. Theroleofautophagyinhumanhepatocarcinomacel linehepg2inducedbymelatonin FanWenjie,JiaZhenya,CaoJing,etal (DeptofMedicalOncology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022) Abstract Objective ToinvestigatethechangeinfunctionofautophagyinhepatocarcinomacellineHepG2in ducedbymelatonin(mt),andtoexploretheroleofautophagyinmt inducedceldeath.methods Hepatocarci nomacancercellinehepg2wastreatedwithdiferentconcentrationsofmt(10-7,10-5,10-3 mol/l).theex presionofautophagy relatedproteinlc3(lc3 Ⅰ /LC3 Ⅱ)duringMT inducedceldeathwasanalysedbywestern blotasay,autophgosomesandautolysosomesinhepg2celsweredetectedbymonodansylcadaverin(mdc)staining underlaserscanningconfocalmicroscope(lscm).theviabilityofhepg2celswasexaminedbymttasayafter treatedeitherwithdiferentconcentrationsofmtaloneorincombinationwiththeautophagyinhibitor3 methylade nine(3 MA)orchloroquine(CQ).TheexpresionofLC3inMT treatedhepg2celswasanalysedbywesternblot asaybeforeandafter3 MAorCQtreatment.Results WesternblotasaydemonstratedthatMTcoulddose de pendentlyincreasedlc3 Ⅱ expresion,andtheformationofautophagosomesinhepg2celsaftermttreatment couldbeobservedunderlscm.comparedwiththecontrolgroup,mttreatmentsignificantlyinhibitedcelgrowth whichwasfurtherenhancedbycombineduseofautolysosomeinhibitor3 MAorCQ,theratioofLC3 Ⅱ /β actin wasdecreasedmarkedlyafter3 MAtreatment,whileafterCQtreatment,theratioofLC3 Ⅱ /β actinwasincreased markedly.conclusion MTcanenhancethefunctionofautophagyinHepG2celsandinduceanincreasedforma tionofautophagosomes.theautolysosomeinhibitor3 MAorCQcansignificantlyenhancetheefectofMT induced proliferativeinhibitioninhepg2celsbyblockingmt inducedautophagypathway,indicatingautophagyislikelyto beamechanismforhepg2celstoavoidmt inducedceldeath. Keywords liverneoplasms;autophagy;melatonin;celproliferation

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1057 PPARα 激 活 可 改 善 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 的 大 鼠 肝 损 伤 王 莉, 宋 育 林, 何 雪 摘 要 目 的 观 察 过 氧 化 物 酶 体 增 殖 物 激 活 受 体 α (PPARα) 激 动 剂 (WY14643) 对 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 肝 损 伤 及 其 脂 质 过 氧 化 PPARαmRNA 胆 盐 输 出 泵 (Bsep)mR NA 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α(tnf α)mrna 表 达 的 影 响 方 法 48 只 SD 雄 性 大 鼠 随 机 分 为 3 组, 每 组 16 只 正 常 对 照 组 : 等 量 溶 剂 空 腹 灌 胃 处 理 ; 模 型 组 : 异 烟 肼 + 利 福 平 各 50mg/ (kg d) 空 腹 灌 胃 处 理 ;WY14643 干 预 组 : 异 烟 肼 + 利 福 平 处 理 同 模 型 组, 同 时 腹 腔 内 注 射 WY146431mg/(kg d) 正 常 对 照 组 和 模 型 组 也 同 时 腹 腔 内 注 射 等 量 溶 剂 于 实 验 2 周 和 4 周 分 批 处 死 大 鼠, 检 测 大 鼠 血 清 肝 生 化 指 标 肝 组 织 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 丙 二 醛 (MDA), 观 察 其 肝 脏 病 理 学 改 变, 并 采 用 RT PCR 法 检 测 PPARα Bsep TNF αmrna 的 表 达 结 果 1 与 正 常 对 照 组 比 较, 模 型 组 血 清 总 胆 汁 酸 (TBA) 总 胆 红 素 (TBIL) 直 接 胆 红 素 (DBIL) 碱 性 磷 酸 酶 (ALP) 升 高, 肝 组 织 MDA 升 高, 肝 组 织 SOD 减 少 (P< 0 05); 肝 组 织 病 理 见 肝 细 胞 变 性 坏 死 及 炎 细 胞 浸 润 ; 肝 PPARα BsepmRNA 表 达 明 显 降 低,TNF αmrna 表 达 明 显 升 高 (P<0 01) 2 与 模 型 组 比 较,WY14643 干 预 组 肝 组 织 SOD 增 加,MDA 降 低 (P<0 05), 肝 脏 病 理 学 改 善, 肝 PPARα BsepmRNA 表 达 明 显 升 高,TNF αmrna 表 达 明 显 降 低 (P<0 01) 与 2 周 模 型 组 比 较,WY14643 干 预 组 血 清 TBA TBIL DBIL 降 低 (P<0 05), 与 4 周 模 型 组 比 较, WY14643 干 预 组 血 清 TBA 降 低 (P<0 05) 结 论 PPARα 激 活 可 通 过 抗 氧 化 调 节 PPARα Bsep 和 TNF αmrna 表 达, 改 善 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 的 大 鼠 肝 损 伤 关 键 词 TNF α; 大 鼠 PPARα 激 动 剂 ; 肝 损 伤 ; 异 烟 肼 ; 利 福 平 ;Bsep; 中 图 分 类 号 R575.1 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1057-05 [1] 前 期 研 究 显 示, 利 福 平 合 用 异 烟 肼 可 致 大 鼠 发 生 肝 脂 肪 变 性 炎 细 胞 浸 润 及 胆 汁 淤 积 肝 脂 肪 变 性 胆 汁 淤 积 分 别 与 脂 质 代 谢 紊 乱 胆 盐 输 出 泵 2014-04-02 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :1208085MH155) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 消 化 内 科, 安 徽 省 消 化 疾 病 重 点 实 验 室, 合 肥 230022 作 者 简 介 : 王 莉, 女, 硕 士 研 究 生 ; 宋 育 林, 男, 副 教 授, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:ylsongcn@163.com (bilesaltexportpump,bsep) 的 表 达 量 变 化 及 功 能 缺 失 之 间 关 系 密 切, 而 Bsep 受 肿 瘤 坏 死 因 子 α(tumor necrosisfactoralpha,tnf α) 的 影 响 [2] 脂 质 代 谢 Bsep TNF α 均 为 过 氧 化 物 酶 体 增 殖 物 激 活 受 体 α (peroxisomeproliferator activatedreceptorα,pparα) 的 作 用 靶 点,PPARα 是 核 激 素 受 体 家 族 中 一 员, 其 与 维 甲 酸 X 受 体 相 互 作 用 而 诱 导 一 系 列 基 因 表 达, 其 中 包 括 脂 肪 酸 运 输 线 粒 体 脂 肪 酸 氧 化 分 解 代 谢 和 炎 症 反 应 等 相 关 基 因 [3], 还 参 与 调 解 胆 汁 酸 的 代 谢 [4] PPARα 在 利 福 平 合 用 异 烟 肼 致 大 鼠 肝 损 伤 中 的 作 用 尚 不 清 楚, 该 研 究 将 探 讨 PPARα 激 动 剂 (WY14643) 对 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 肝 损 伤 的 作 用 及 其 部 分 作 用 机 制 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 1.1.1 实 验 动 物 健 康 成 年 SD 大 鼠,SPF 级,48 只, 雄 性,6 周 龄, 体 重 150~180g, 由 安 徽 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心 提 供 1.1.2 药 物 及 试 剂 WY14643 购 自 美 国 Santa CruzBiotechnology 公 司 ( 批 号 C0912); 异 烟 肼 购 自 上 海 信 谊 药 厂 有 限 公 司 ( 批 号 130101); 利 福 平 购 自 上 海 延 安 药 业 有 限 公 司 ( 批 号 120103); 大 鼠 血 清 生 化 检 测 试 剂 购 自 瑞 士 Roche 公 司 ; 蛋 白 测 定 试 剂 盒 丙 二 醛 (malondialdehyde,mda) 和 超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxidedismutase,sod) 测 定 试 剂 盒 均 由 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所 生 产 ;TRIzol RT PCR 的 试 剂 盒 DNA Marker Taq 酶 等 均 为 生 工 生 物 工 程 ( 上 海 ) 股 份 有 限 公 司 所 生 产 1.1.3 仪 器 和 设 备 瑞 士 RocheModularDPP 全 自 动 生 化 分 析 仪 ;SartoriusBS110S 型 电 子 分 析 天 平 ; PCR 反 应 扩 增 仪 (2720 美 国 ABI 公 司 ); 凝 胶 成 像 系 统 (FR 980A 上 海 复 日 科 技 有 限 公 司 ) 1.2 方 法 1.2.1 药 物 制 备 异 烟 肼 和 利 福 平 分 别 制 成 浓 度 为 30g/L 的 灌 胃 液, 异 烟 肼 直 接 溶 于 无 菌 生 理 盐 水, 利 福 平 溶 于 0.5% 羧 甲 基 纤 维 素 钠 制 备 的 混 悬 液, 此 混 悬 液 由 羧 甲 基 纤 维 素 钠 直 接 与 水 混 合 制 备

1058 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 而 成 [1] 1.2.2 造 模 及 分 组 按 照 参 考 文 献 将 大 鼠 适 应 性 喂 养 1 周 后 随 机 分 为 正 常 对 照 组 模 型 组 WY14643 干 预 组, 每 组 16 只 正 常 对 照 组 模 型 组 WY14643 干 预 组 分 别 给 予 0.9% 氯 化 钠 注 射 液 10ml/(kg d) 异 烟 肼 50mg/(kg d)+ 利 福 平 50 mg/(kg d) 异 烟 肼 50mg/(kg d)+ 利 福 平 50 mg/(kg d), 每 日 1 次 定 时 空 腹 灌 胃 WY14643 干 预 组 给 予 每 日 1 次 腹 腔 注 射 WY146431mg/(kg d), 其 余 两 组 每 日 1 次 腹 腔 注 射 等 量 溶 剂 连 续 用 药 14d 后, 随 机 处 死 正 常 对 照 组 模 型 组 WY14643 干 预 组 各 8 只 大 鼠, 其 余 大 鼠 继 续 上 述 处 理 至 第 28 天 1.2.3 标 本 采 集 大 鼠 处 死 前 隔 夜 禁 食 禁 水 12h 处 死 前 称 量 大 鼠 体 重, 水 合 氯 醛 腹 腔 麻 醉, 腹 主 动 脉 取 血, 留 取 血 清 标 本,-20 冻 存 待 测 ; 摘 取 大 鼠 肝 脏 并 称 肝 脏 湿 重, 各 组 切 取 肝 左 叶 相 同 部 位 肝 组 织, 10% 福 尔 马 林 缓 冲 液 固 定, 用 于 观 察 肝 脏 病 理 变 化, 并 留 取 适 量 肝 组 织 于 冻 存 管, 液 氮 中 储 存, 待 肝 组 织 匀 浆 制 备 及 总 RNA 提 取 1.2.4 观 察 指 标 及 测 定 方 法 1.2.4.1 一 般 情 况 实 验 期 间 每 3d 称 大 鼠 体 重 1 次, 并 观 察 其 生 长 情 况 精 神 状 态 生 活 习 性 变 化 毛 色 大 小 便 食 欲 对 外 界 刺 激 的 反 应 情 况 1.2.4.2 血 清 生 化 指 标 全 自 动 生 化 分 析 仪 检 测 各 组 大 鼠 血 清 总 胆 汁 酸 (totalbiliaryacid,tba) 总 胆 红 素 (totalbilirubin,tbil) 直 接 胆 红 素 (direct bilirubin,dbil) 谷 草 转 氨 酶 (aspartatetransami nase,ast) 谷 丙 转 氨 酶 (alaninetraminitransperase, ALT) 碱 性 磷 酸 酶 (alkalinephosphatase,alp) 1.2.4.3 肝 组 织 匀 浆 SOD MDA 的 测 定 采 用 考 马 斯 亮 蓝 法 测 定 肝 组 织 蛋 白 浓 度, 采 用 羟 胺 法 测 定 SOD 活 力, 采 用 硫 代 巴 比 妥 酸 法 测 定 MDA 含 量 具 体 实 验 步 骤 参 考 说 明 书 进 行 1.2.4.4 肝 脏 病 理 组 织 学 检 查 10% 福 尔 马 林 缓 冲 液 固 定 的 肝 脏 组 织, 常 规 脱 水, 石 蜡 包 埋 切 片 HE 染 色 在 光 学 显 微 镜 下 观 察 肝 组 织 病 理 学 改 变 1.2.4.5 大 鼠 肝 组 织 PPARα Bsep TNF αmrna 的 测 定 取 50~100mg 组 织 液 氮 研 磨 至 粉 末 状, 置 1.5ml 离 心 管 中, 加 入 1mlTRIzol 充 分 匀 浆, 氯 仿 提 取, 异 丙 醇 沉 淀, 加 入 适 量 的 无 Rnase 水 溶 解, 电 泳 检 测 RNA 结 果, 将 总 RNA 反 转 录 成 cdna 后 进 行 扩 增 PCR 反 应 条 件 如 下 :95 预 变 性 3min,94 变 性 30s,56 退 火 30s,72 延 伸 90s, 共 35 个 循 环 循 环 结 束, 最 后 72 延 伸 8min, 降 至 4 结 束 反 应, 引 物 由 上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司 合 成, 引 物 序 列 :β actin: 上 游 5 CGTAAAGACCTCTATGC CAACA 3, 下 游 5 CGGACTCATCGTACTCCTGCT 3 ;PPARα: 上 游 5 AGGCTATCCCAGGCTTTGC 3, 下 游 5 GCGTCTGACTCGGTCTTCTTG 3 ;TNF α: 上 游 5 GTCGTAGCAAACCACCAAGC 3, 下 游 5 TCA CAGAGCAATGACTCCAAAG 3 ;Bsep: 上 游 5 GCA CAGTTGCTGGGATTGG 3, 下 游 5 TTGGCATAGCT CGGAGTATAAGA 3 将 5μl 的 PCR 产 物 在 2% 琼 脂 糖 凝 胶 中 电 泳 后 再 用 凝 胶 成 像 系 统 摄 影 比 较 目 的 基 因 与 β actin 条 带 的 灰 度 值, 分 析 目 的 基 因 的 表 达 水 平 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS16 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示 多 组 间 定 量 资 料 比 较 采 用 方 差 分 析, 组 内 两 两 比 较 采 用 SNK 和 LSD 检 验 2 结 果 2.1 一 般 情 况 正 常 对 照 组 大 鼠 精 神 状 态 食 欲 较 好, 毛 色 光 泽 尚 可, 无 黄 染, 对 外 界 刺 激 反 应 较 灵 敏 模 型 组 大 鼠 精 神 状 态 较 差, 对 外 界 刺 激 反 应 迟 钝, 食 欲 减 退, 毛 色 无 光 泽, 脚 掌 及 尾 部 呈 明 显 橘 红 色, 小 便 及 大 便 颜 色 呈 橘 红 色 WY14643 干 预 组 大 鼠 精 神 状 态 稍 差, 但 较 模 型 组 佳, 食 欲 稍 减 退, 毛 色 光 泽 稍 差, 脚 掌 及 尾 部 呈 橘 红 色, 小 便 及 大 便 颜 色 呈 橘 红 染, 但 颜 色 较 模 型 组 清 亮 2.2 血 清 生 化 指 标 变 化 方 差 分 析 结 果 显 示 2 周 TBA TBIL DBIL ALP ALT AST 水 平 及 4 周 TBA TBIL DBIL ALP ALT AST 水 平 F 值 分 别 为 50 869 31 097 67 18 30 632 3 831 5 262; 12 141 46 768 31 914 17 769 0 697 0 067 与 正 常 对 照 组 比 较, 模 型 组 大 鼠 血 清 TBA TBIL DBIL ALP 明 显 升 高 (P<0 05),ALT AST 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 与 2 周 模 型 组 比 较,2 周 WY14643 干 预 组 大 鼠 血 清 TBA TBIL DBIL 明 显 降 低, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 (P<0 05),ALT AST ALP 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05); 与 4 周 模 型 组 比 较,4 周 WY14643 干 预 组 大 鼠 血 清 TBA 明 显 降 低 (P<0 05),TBIL DBIL 降 低, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05),ALT AST ALP 差 异 无 统 计 学 意 义 (P >0 05) 见 表 1

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1059 表 1 大 鼠 血 清 生 化 指 标 变 化 (n=8, x±s) 珋 项 目 2 周 4 周 正 常 对 照 组 模 型 组 WY14643 干 预 组 正 常 对 照 组 模 型 组 WY14643 干 预 组 TBA(μmol/L) 27.45±2.94 79.6±15.65 66.94±9.79 # 21.46±3.66 42.50±12.25 30.33±7.56 # TBIL(μmol/L) 1.60±0.65 4.56±0.90 3.50±0.71 # 0.98±0.08 3.56±0.63 2.88±0.86 DBIL(μmol/L) 0.63±0.38 3.60±0.49 2.40±0.65 ## 0.21±0.15 2.31±0.61 1.79±0.71 ALT(U/L) 28.13±4.26 31.25±4.80 34.37±4.47 41.00±3.42 46.50±12.42 40.13±15.66 AST(U/L) 131.13±8.87 138.00±39.99 134.13±7.26 136.25±19.23 141.00±34.04 137.3±26.02 ALP(U/L) 158.63±12.25 204.1±12.19 196.50±12.91 84.00±9.41 118.25±18.72 120.0±10.84 与 正 常 对 照 组 比 较 : P<0.01; 与 模 型 组 比 较 : # P<0.05, ## P<0.01 表 2 大 鼠 肝 组 织 内 MDA 含 量 SOD 活 性 变 化 (n=8, x±s) 珋 项 目 2 周 4 周 正 常 对 照 组 模 型 组 WY14643 干 预 组 正 常 对 照 组 模 型 组 WY14643 干 预 组 MDA(nmol/mgprot) 1.65±0.28 2.10±0.34 1.73±0.27 # 1.65±0.30 2.17±0.44 1.78±0.35 # SOD(U/mgprot) 94.93±9.27 71.09±11.50 84.57±10.71 # 92.63±12.59 68.50±13.85 83.98±9.38 # 与 正 常 对 照 组 比 较 : P<0.05, P<0 01; 与 模 型 组 比 较 : # P<0.05 2.3 肝 组 织 MDA 含 量 及 SOD 活 性 变 化 方 差 分 析 结 果 显 示 2 周 MDA SOD 及 4 周 MDA SOD 的 F 值 分 别 为 5 229 10 306;4 301 8 128 与 正 常 对 照 组 比 较, 模 型 组 第 2 周 和 第 4 周 肝 组 织 内 MDA 升 高,SOD 降 低, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05); 与 模 型 组 比 较,WY14643 干 预 组 第 2 周 和 第 4 周 肝 组 织 内 MDA 降 低,SOD 升 高, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P< 0 05) 见 表 2 2.4 肝 脏 形 态 学 变 化 正 常 对 照 组 大 鼠 肝 脏 外 观 色 泽 暗 红, 被 膜 平 滑, 边 缘 锐 利, 切 面 光 整 ; 模 型 组 大 鼠 肝 脏 颜 色 偏 黄, 肝 脏 明 显 肿 大, 被 膜 紧 张, 边 缘 较 钝, 切 面 油 腻 ;WY14643 干 预 组 大 鼠 肝 脏 外 观 接 近 正 常, 颜 色 为 暗 红 稍 偏 黄, 肝 脏 无 明 显 肿 大, 被 膜 较 平 滑, 边 缘 较 锐 利, 切 面 较 光 整 光 镜 下, 正 常 对 照 组 大 鼠 肝 脏 肝 小 叶 结 构 完 整, 见 图 1A; 模 型 组 可 见 肝 细 胞 不 同 程 度 的 空 泡 变 性 脂 肪 变 性 较 明 显, 见 图 1B; 部 分 小 叶 内 可 见 炎 细 胞 浸 润 及 点 状 坏 死, 汇 管 区 炎 症 明 显,4 周 模 型 组 以 肝 细 胞 变 性 坏 死 及 炎 性 细 胞 浸 润 为 主, 见 图 1C;WY14643 干 预 组 大 鼠 肝 细 胞 变 性 坏 死 脂 肪 变 性 及 炎 细 胞 浸 润 与 模 型 组 比 较 均 有 所 减 轻, 见 图 1D 2.5 大 鼠 肝 组 织 PPARα Bsep TNF αmrna 表 达 方 差 分 析 结 果 显 示 2 周 及 4 周 PPARα Bsep TNF αmrna 表 达 水 平 存 在 统 计 学 差 异,F 值 分 别 为 83 841 133 653 41 557;78 29 88 672 68 61 与 正 常 对 照 组 比 较, 模 型 组 PPARα 及 BsepmRNA 表 达 明 显 降 低 (P<0 01) TNF αmrna 表 达 明 显 增 强 (P<0 01); 与 模 型 组 比 较,WY14643 干 预 组 图 1 各 组 大 鼠 肝 脏 病 理 学 改 变 HE 400 A: 正 常 对 照 组 ;B:2 周 模 型 组 ;C:4 周 模 型 组 ;D:4 周 WY14643 组 PPARα 及 BsepmRNA 表 达 明 显 增 强 (P<0 01) TNF αmrna 明 显 降 低 (P<0 01), 见 图 2 3 讨 论 本 实 验 结 果 显 示,SD 大 鼠 给 予 喂 养 异 烟 肼 和 利 福 平 后 表 现 出 肝 细 胞 坏 死 脂 肪 变 性 及 炎 性 细 胞 浸 润, 同 时 伴 有 血 清 TBA TBIL DBIL ALP 升 高 表 明 利 福 平 合 用 异 烟 肼 致 肝 损 伤 的 SD 大 鼠 模 型 建 立 成 功 PPARα 主 要 在 肝 细 胞 表 达, 可 通 过 调 控 相 关 基 因 表 达, 纠 正 肝 脏 脂 质 代 谢 紊 乱, 减 轻 氧 化 应 激 反 应, 抑 制 炎 症 因 子 产 生 和 释 放, 减 轻 或 阻 止 肝 组 织 损 伤 [3], 同 时 参 与 胆 汁 酸 的 合 成 转 运 及 代 谢 [4] 本 研 究 结 果 显 示, 利 福 平 合 用 异 烟 肼 致 肝 损 伤 的 同 时

1060 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 图 2 各 组 大 鼠 肝 细 胞 中 PPARα Bsep TNF αmrna 的 表 达 M:Marker;1:2 周 正 常 对 照 组 ;2:2 周 模 型 组 ;3:2 周 WY14643 干 预 组 ;4:4 周 正 常 对 照 组 ;5:4 周 模 型 组 ;6:4 周 WY14643 干 预 组 ; 与 正 常 对 照 组 比 较 : P<0.01; 与 模 型 组 比 较 : ## P<0.01 伴 有 PPARαmRNA 表 达 下 调, 而 经 过 WY14643 治 疗 激 活 PPARα 之 后, 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 的 肝 损 伤 减 轻, 主 要 表 现 为 肝 细 胞 坏 死 及 炎 症 减 轻, 脂 肪 变 性 明 显 减 轻, 同 时 血 清 TBA TBIL DBIL ALP 降 低 这 些 结 果 表 明,PPARαmRNA 表 达 下 调 在 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 的 肝 损 伤 发 病 机 制 中 起 着 重 要 的 作 用, 激 活 PPARα 可 改 善 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 的 肝 损 伤 本 研 究 结 果 显 示 : 与 正 常 对 照 组 比 较, 模 型 组 肝 组 织 匀 浆 MDA 含 量 升 高 SOD 含 量 降 低, 与 前 期 研 [1] 究 结 果 一 致 而 给 予 WY14643 治 疗 后 肝 组 织 匀 浆 MDA 含 量 明 显 降 低 SOD 含 量 明 显 升 高, 提 示 WY14643 可 通 过 降 低 肝 组 织 的 氧 化 应 激 作 用 而 减 轻 肝 组 织 损 伤 Bsep 功 能 抑 制 是 药 物 性 肝 损 伤 的 机 制 之 一 [5] Bsep 是 一 种 ATP 结 合 盒 转 运 体, 由 ABCB11 基 因 编 码, 是 肝 细 胞 的 毛 细 胆 管 膜 上 的 胆 汁 酸 外 排 的 主 要 转 运 体, 当 Bsep 功 能 受 损, 使 胆 汁 酸 排 出 障 碍, 从 而 导 致 胆 汁 淤 积 [6-7] [8] 文 献 报 道, 利 福 平 致 肝 内 胆 汁 淤 积 的 机 制 可 能 与 其 导 致 肝 内 胆 汁 酸 转 运 体 Bsep 和 Mrp2 定 位 改 变 有 关 本 研 究 结 果 表 明, 利 福 平 合 用 异 烟 肼 可 致 大 鼠 肝 脏 BsepmRNA 表 达 下 降 Kolouchovaetal [9] 指 出, 普 伐 他 汀 通 过 增 加 BsepmRNA 的 表 达 而 减 少 胆 汁 淤 积 动 物 的 胆 汁 酸 的 血 浆 浓 度, 同 时 可 引 起 PPARαmRNA 表 达 上 调 本 实 验 WY14643 激 活 PPARα 后,BsepmRNA 的 表 达 明 显 增 加, 表 明 WY14643 可 能 通 过 促 进 Bsep mrna 的 表 达 而 改 善 肝 内 胆 汁 淤 积 WY14643 促 进 BsepmRNA 表 达 的 机 制 尚 不 清 楚 Chenetal [10] 发 现 促 炎 因 子 TNF α IL 6 等 的 表 达 可 减 少 肝 组 织 BsepmRNA 的 表 达 本 研 究 结 果 显 示 模 型 组 TNF αmrna 较 正 常 对 照 组 明 显 升 高, 而 BsepmRNA 表 达 明 显 下 降, 而 给 予 WY14643 治 疗 后,TNF α mrna 表 达 明 显 降 低, 同 时 Bsep mrna 表 达 升 高, 提 示 TNF α 在 这 一 过 程 中 可 能 起 到 至 关 重 要 的 作 用 TNF α 是 一 个 重 要 的 促 炎 因 子 和 免 疫 调 节 因 子,TNF α 可 促 进 T 细 胞 产 生 各 种 炎 症 因 子, 从 而 促 进 炎 症 反 应 的 发 生,TNF α 一 方 面 具 有 直 接 的 细 胞 毒 作 用, 引 起 肝 细 胞 坏 死, 另 一 方 面 又 可 引 起 微 循 环 障 碍 导 致 肝 细 胞 坏 死, 同 时, 还 与 其 他 炎 性 因 子 如 IL 6 相 互 激 发, 引 起 级 联 放 大 反 应, 进 一 步 加 重 肝 损 伤 [11] 本 研 究 显 示 给 予 WY14643 处 理 后, 肝 脏 TNF αmrna 的 表 达 明 显 减 少, 提 示 WY14643 可 通 过 降 低 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 引 起 的 炎 性 因 子 的 产 生, 改 善 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 的 肝 损 伤 综 上 所 述,WY14643 可 减 轻 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 的 肝 损 伤, 机 制 可 能 是 WY14643 激 活 肝 细 胞 PPARα 而 降 低 肝 组 织 氧 化 应 激 上 调 BsepmRNA 表 达 下 调 TNF αmrna 的 表 达 而 起 作 用, 但 其 确 切 通 路 尚 有 待 进 一 步 深 入 研 究 参 考 文 献 [1] 杨 慧 媛, 宋 育 林, 许 建 明, 等. 异 烟 肼 利 福 平 合 用 致 大 鼠 肝 损 伤 的 实 验 模 型 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2008,43(2):185-9. [2] 白 阳, 冯 义 朝.BSEP 的 调 控 及 其 突 变 与 胆 汁 淤 积 性 肝 病 的 关 系 [J]. 医 学 信 息,2013,26(2):326-7. [3] KongL,RenW,LiW,etal.Activationofperoxisomeproliferator activatedreceptoralphaamelioratesethanolinducedsteatohepatitis inmice[j].lipidshealthdis,2011,10:246. [4] ZolnerG,WagnerM,TraunerM.Nuclearreceptorsasdrugtargets incholestasisanddrug inducedhepatotoxicity[j].pharmacolt her,2010,126(3):228-43. [5] KisE,IojaE,RajnaiZ,etal.BSEPinhibition:invitroscreensto asescholestaticpotentialofdrugs[j].toxicolinvitro,2012,26 (8):1294-9. [6] ZhangY,LiF,PatersonAD,etal.Abcbldeficiencyinduces cholestasiscoupledtoimpaired fatyacidoxidationinmice[j].j

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1061 BiolChem,2012,287(29):24784-94. [7] YoshikadoT,TakadaT,YamamotoT,etal.Itraconazole induced cholestasis:involvementoftheinhibitionofbilecanalicularphos pholipidtranslocatormdr3/abcb4[j].molpharmacol,2011,79 (2):241-50. [8] 曹 云 海, 陈 熙, 张 程, 等. 利 福 平 对 小 鼠 肝 细 胞 胆 汁 酸 转 运 体 Bsep 和 Mrp2 表 达 与 定 位 的 影 响 [J]. 中 国 药 理 学 通 报, 2010,26(12):1581-6. [9] KolouchovaG,BrcakovaE,HirsovaP,etal.Pravastatinmodulates liverbileacidandcholesterolhomeostasisinratswithchroniccho lestasis[j].jgastroenterolhepatol,2011,26(10):1544-51. [10]ChenY,SongX,ValanejadL,etal.Bilesaltexportpumpisdys regulatedwithalteredfarnesoidx receptorisoform expresionin patientswithhepatocelularcarcinoma[j].hepatology,2013,57 (4):1530-41. [11] 曾 明, 王 金 萍, 丁 媛 媛, 等. 可 舒 胶 囊 对 酒 精 性 肝 损 伤 大 鼠 血 清 中 NF κb 和 TNF α 的 影 响 [J]. 东 南 国 防 医 药,2013,15 (1):21-3. Activationofperoxisomeproliferatoractivatedreceptoralphaameliorates IsoniazidandRifampininducedliverinjuryinrats WangLi,SongYulin,HeXue (DeptofGastroenterology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity, KeyLaboratoryofDigestiveDiseaseofAnhuiProvince,Hefei 230022) Abstract Objective Toobservetheefectsofperoxisomeproliferator activatedreceptorα(pparα)agonist (WY14643)onIsoniazidandRifampininducedliverinjuryinrats,andexploreitsinfluenceonthelipidperoxida tionandtheexpresionofpparαmrna,bilesaltexportpump(bsep)mrna,tumornecrosisfactoralpha(tnf α)mrna.methods 48maleSDratswererandomlydividedinto3groups,16ratsforeachgroup.Normalcontrol groupwasgivenequivalentsolventoncedaily.modelgroupwasgivenintragastricadministrationofisoniazid50mg/ (kg d) +Rifampin50mg/(kg d).wy14643groupwasgivenisoniazid50mg/(kg d) +Rifampin50mg/ (kg d)byintragastricadministrationandwy146431mg/(kg d)byintraperitonealinjection.theothertwo groupsreceiveddailyintraperitonealinjectionoftheequivalentsolvent.everygroupwassacrificedrespectivelyon day14and28.theserumbiochemicalindexofliver,thehepatictisuesuperoxidedismutase(sod),malondial dehyde(mda)weremeasured.thepathologicalchangesinliverwereobserved.theexpresionofpparα,bsep, TNF αmrnawasdetectedbyrt PCR.Results 1 Comparedwithnormalcontrolgroup,serumtotalbiliaryacid (TBA),totalbilirubin(TBIL),directbilirubin(DBIL),alkalinephosphatase(ALP)inmodelgroupweresignifi cantlyelevated(p<0 05);SODwassignificantlyreduced(P<0 05),MDAwassignificantlyelevated(P< 0 05);hepatocytenecrosis,fatychange,inflammatorycelinfiltrationinratliverofmodelgroupwereobserved; theexpresionofpparα,bsepmrnawassignificantlyreduced(p<0 01),TNF αmrnaexpresionwassignif icantlyelevated(p<0 01).2 Comparedwithmodelgroup,SODwassignificantlyelevated(P<0 05).Hepatic tisuemdawassignificantlyreduced(p<0 05)inWY14643group,theliverhistologicalhadimproved.Theex presionofpparα,bsepmrnawassignificantlyelevated(p<0 01),TNF αmrnaexpresionwassignificantly reduced(p<0 01).Comparedwithmodelgroupofweek2,serum TBA,TBIL,DBILreducedinWY14643 group(p<0 05).Comparedwithmodelgroupofweek4,serum TBAreducedinWY14643group(P<0 05). Conclusion ActivationofPPARαamelioratedIsoniazidandRifampininducedliverinjurythroughantioxidanion andmodulationoftheexpresionofpparα,bsepandtnf αmrna. Keywords PPARαagonist;liverinjury;Isoniazid;Rifampin;Bsep;TNF α;rat

1062 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 抑 制 p70s6k 对 HSC T6 增 殖 活 化 的 作 用 研 究 占 书 箱 1,2, 黄 成 1,2, 马 陶 陶 1,2, 陈 培 杰 1,2 1,2, 李 俊 摘 要 目 的 研 究 抑 制 核 糖 体 40S 小 亚 基 S6 蛋 白 激 酶 (p70s6k) 的 表 达 对 大 鼠 肝 星 状 细 胞 株 (HSC T6) 增 殖 活 化 的 影 响 方 法 建 立 CCl 4 诱 导 大 鼠 肝 纤 维 化 模 型, 观 察 磷 酸 化 p70s6k 在 纤 维 化 肝 组 织 中 的 表 达 变 化 ; 利 用 雷 帕 霉 素 抑 制 p70s6k 蛋 白 表 达, 及 靶 向 p70s6k 基 因 的 sirna 预 处 理 HSC T6, 再 添 加 重 组 小 鼠 血 小 板 衍 生 生 长 因 子 (PDGF BB) 诱 导, 观 察 HSC T6 的 增 殖 活 化 情 况 ; 利 用 Westernblot RT PCR 检 测 p70s6k P p70s6k α SMA ColagenI 的 蛋 白 和 基 因 表 达 水 平 结 果 CCl 4 诱 导 大 鼠 肝 纤 维 化 模 型 组 磷 酸 化 p70s6k 蛋 白 明 显 升 高 ; 雷 帕 霉 素 预 处 理 HSC T6, 明 显 降 低 了 p70s6k 的 磷 酸 化 水 平, 并 抑 制 了 PDGF BB 诱 导 的 细 胞 增 殖 及 α SMA ColagenI 的 表 达 ;sirna 转 染 HSC T6, 在 基 因 和 蛋 白 水 平 抑 制 了 p70s6k 的 表 达, 同 时 减 少 了 PDGF BB 诱 导 的 α SMA ColagenI P p70s6k 的 表 达 结 论 用 sir NA 和 雷 帕 霉 素 阻 断 p70s6k 的 表 达, 在 一 定 程 度 上 可 以 抑 制 HSC T6 的 增 殖 和 活 化, 为 肝 纤 维 化 的 防 治 研 究 提 供 新 的 思 路 和 靶 点 关 键 词 化 中 图 分 类 号 肝 星 状 细 胞 株 ;p70s6k;sirna; 雷 帕 霉 素 ; 肝 纤 维 R322.47;R329.25;R575.202.2 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1062-06 肝 纤 维 化 是 各 种 病 因 所 致 慢 性 肝 损 伤 后, 实 质 细 胞 再 生 间 质 细 胞 活 化 增 生 和 细 胞 外 基 质 (extra celularmatrix,ecm) 沉 积 的 肝 组 织 修 复 重 建 的 过 程, 是 慢 性 肝 病 共 有 的 病 理 过 程 [1] 在 肝 纤 维 化 的 发 生 发 展 过 程 中, 肝 星 状 细 胞 (hepaticstelatecels, HSC) 的 活 化 和 增 殖 起 关 键 作 用, 活 化 的 HSC 是 过 度 沉 积 的 ECM 的 主 要 来 源 细 胞 [2] 因 此, 深 入 研 究 HSC 活 化 增 殖 的 机 制, 寻 找 抑 制 HSC 活 化 增 殖 的 方 法, 已 受 到 国 内 外 学 者 广 泛 的 关 注 核 糖 体 40S 小 亚 基 S6 蛋 白 激 酶 (p70s6k) 是 哺 乳 动 物 雷 帕 霉 素 靶 2014-03-20 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :81072686 81202978); 安 徽 省 高 等 学 校 省 级 自 然 科 学 研 究 项 目 ( 编 号 :KJ2010A162); 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 重 点 项 目 ( 编 号 :KJ2012A156) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 药 学 院, 合 肥 230032 2 安 徽 医 科 大 学 肝 病 研 究 所, 合 肥 230032 作 者 简 介 : 占 书 箱, 男, 硕 士 研 究 生 ; 李 俊, 男, 博 士, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail: lijun@ahmu.edu.cn 蛋 白 (mammaliantargetofrapamycin,mtor) 的 下 游 [3] 底 物, 研 究 显 示,p70S6K 在 细 胞 增 殖 生 长 中 起 到 [4] 重 要 的 调 控 作 用 该 实 验 室 前 期 研 究 表 明, 在 血 小 板 衍 生 生 长 因 子 (plateletderivedgrowthfactor, PDGF) 诱 导 HSC T6 增 殖 活 化 中,p70S6K 的 磷 酸 化 水 平 明 显 增 加, 表 明 p70s6k 可 能 参 与 HSC 的 增 殖 活 化 现 利 用 雷 帕 霉 素 抑 制 p70s6k 的 表 达, 并 通 过 靶 向 p70s6k 的 sirna 抑 制 p70s6k 的 活 化, 探 讨 p70s6k 在 HSC 增 殖 活 化 中 的 作 用 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 动 物 雄 性 SD 大 鼠 30 只,6~8 周 龄, 体 重 180~220g, 清 洁 级, 购 于 安 徽 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心 1.2 细 胞 株 HSC T6 购 自 中 国 科 学 院 上 海 细 胞 库, 为 永 生 化 大 鼠 HSC 1.3 主 要 材 料 与 试 剂 重 组 小 鼠 血 小 板 衍 生 生 长 因 子 (PDGF BB) 购 于 英 国 PEPROTECH 公 司 ; 靶 向 p70s6krnai 试 剂 盒 购 于 上 海 吉 玛 公 司 ;Lipo fectamine TM 2000 购 于 美 国 Invitrogen 公 司 ; 雷 帕 霉 素 购 于 Aladdin 公 司 ;RabbitmAbanti P p70s6kinase (T389) 购 于 美 国 CelSignaling 公 司 ;MousemAban ti α SMA 购 于 武 汉 博 士 德 生 物 工 程 有 限 公 司 ; 四 甲 基 偶 氮 唑 蓝 (MTT) 购 于 美 国 Amresco 公 司 ; 逆 转 录 试 剂 盒 购 于 日 本 TaKaRa 公 司 ;PCR 试 剂 盒 购 于 Fermentas 公 司 ; 引 物 由 上 海 生 工 公 司 设 计 合 成 ;Op timem DMEM 培 养 液 TRIzolReagentRNA 提 取 试 剂 购 于 美 国 InvitrogenLifeTechnologies 公 司 ; 胎 牛 血 清 购 于 杭 州 四 季 青 生 物 工 程 材 料 有 限 公 司 ;DM SO 购 于 美 国 Sigma 公 司 1.4 主 要 仪 器 NAPCO 6100 型 细 胞 培 养 箱, 美 国 SHELLAB;SW CJ IF 型 超 净 工 作 台, 江 苏 苏 净 集 团 苏 州 安 泰 空 气 技 术 有 限 公 司 ;PCR 扩 增 仪, 德 国 Eppedorf 公 司 ;Westernblot 设 备, 美 国 Biorad 公 司 ; Sigam3 16K 高 速 离 心 机, 美 国 Sigma 公 司 ; 冷 冻 离 心 机 TGL 18R, 珠 海 黑 马 医 学 仪 器 有 限 公 司 ; 酶 标 仪 MK3, 荷 兰 雷 勃 公 司 ; 荧 光 倒 置 显 微 镜, 日 本 Olym pus 公 司 1.5 方 法

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1063 1.5.1 大 鼠 肝 纤 维 模 型 的 建 立 用 CCl 4 诱 导 大 鼠 肝 纤 维 化, 具 体 方 法 参 见 文 献 [5] 1.5.2 HE 和 Mason 染 色 取 大 鼠 肝 脏 右 叶 相 同 位 置 组 织,10% 甲 醛 溶 液 固 定, 石 蜡 包 埋, 切 片,HE 和 Mason 染 色, 光 镜 下 观 察 染 色 结 果 并 拍 照, 分 析 和 评 价 CCl 4 诱 导 大 鼠 肝 损 伤 和 纤 维 化 程 度 1.5.3 HSC T6 细 胞 培 养 和 传 代 HSC T6 细 胞 使 用 含 有 10% 胎 牛 血 清 及 100kU/L 青 霉 素 和 100 mg/l 链 霉 素 的 高 糖 培 养 基, 置 于 37 5%CO 2 培 养 箱 中 培 养 当 细 胞 生 长 融 合 达 到 约 80% 时, 用 0 25% 胰 蛋 白 酶 消 化 传 代 或 按 所 需 浓 度 接 种 培 养 瓶 培 养 板 1.5.4 MTT 检 测 细 胞 增 殖 HSC T6 细 胞 生 长 80% 融 合,0.25% 胰 蛋 白 酶 消 化, 完 全 培 养 基 重 悬, 台 盼 蓝 法 细 胞 计 数, 每 孔 4 10 3 个 细 胞 接 种 于 96 孔 板 待 细 胞 贴 壁 后, 加 入 雷 帕 霉 素, 使 其 终 浓 度 依 次 为 0 0 2 20 50ng/ml [6], 同 时 加 入 等 体 积 溶 媒 DMSO 作 为 对 照, 每 组 6 个 复 孔, 每 孔 均 为 200μl 体 系 置 于 37 5%CO 2 培 养 箱 中 培 养 2h 后, 除 正 常 对 照 孔 外, 再 均 加 入 终 浓 度 为 10ng/ml [4,7] 的 PDGF [7], 放 回 培 养 箱, 继 续 培 养 24h 或 48h 时 间 到 后, 每 孔 加 20μl5mg/mlMTT,37 继 续 培 养 4 h 终 止 培 养,5ml 注 射 器 小 心 吸 尽 各 孔 中 液 体, 加 入 150μlDMSO, 立 即 用 酶 标 仪 于 490nm 波 长 处 检 测 吸 光 度 值 1.6 转 染 1.6.1 靶 向 p70s6k 的 sirna 设 计 与 合 成 上 海 吉 玛 公 司 根 据 p70s6k 全 基 因 序 列 设 计 3 个 sirna 序 列 如 下 :R1:sense 5 GGAAUAUUCUGGAG GAAGUTT 3,antisense5 ACUUCCUCCAGAAUAUU CCTT 3 ;R2:sense5 GGGAUAUUCAUGGAAGAUA TT 3,antisense5 UAUCUUCCAUGAAUAUCCCTT 3 ;R3:sense5 GGCUCCAUCUGUACUUGAATT 3, antisense5 UUCAAGUACAGAUGGAGCCTT 3 另 外,siRNA 阴 性 对 照 序 列 为 :sense5 UUCUC CGAACGUGUCACGUTT 3,antisense 5 ACGUGA CACGUUCGGAGAATT 3 1.6.2 实 验 分 组 1 空 白 对 照 组, 以 等 体 积 的 Op timem 培 养 液 代 替 转 染 液, 作 为 转 染 前 p70s6k 的 水 平 ;2 阴 性 对 照 组, 用 转 染 scramble RNA 的 细 胞 观 察 p70s6k 表 达 的 变 化 ;3 p70s6k sirna 组 (R1 R2 R3), 转 染 靶 向 p70s6k 的 sirna, 特 异 性 干 扰 目 的 基 因 p70s6k 的 表 达 1.6.3 转 染 HSC T6 细 胞 生 长 融 合 约 80% 时, 用 OptiMEM 培 养 液 分 别 稀 释 Lipofectamine TM 2000 和 sirna 至 所 需 浓 度, 室 温 静 置 5min 将 稀 释 后 的 sirna 与 Lipofectamine TM 2000 小 心 吹 打 混 匀, 室 温 再 静 置 20min 以 形 成 稳 定 的 sirna 脂 质 体 复 合 物 随 后 弃 去 旧 培 养 液, 将 上 述 含 有 复 合 物 的 培 养 液 加 入 待 转 染 细 胞,6h 后 更 换 完 全 培 养 基 DMEM, 并 加 入 PDGF, 使 其 终 浓 度 为 10ng/ml, 继 续 作 用 24h 1.6.4 RT PCR 检 测 p70s6k α SMA ColagenⅠ mrna 水 平 收 集 经 雷 帕 霉 素 或 sirna 作 用 过 的 细 胞, 应 用 TRIzol 试 剂 盒 提 取 细 胞 的 总 RNA, 通 过 分 光 光 度 法 测 定 RNA 溶 液 的 吸 光 度 来 测 定 RNA 的 含 量 和 纯 度 (OD 260 /OD 280 >1 8) 采 用 TaKaRa 逆 转 录 试 剂 盒 得 到 cdna, 按 表 1 中 所 列 条 件 进 行 相 应 基 因 的 PCR 反 应 琼 脂 糖 凝 胶 80V 电 泳 PCR 产 物 30min, 图 像 分 析 仪 采 集 图 像, 光 密 度 扫 描, 以 GAP DH 为 基 准 分 析, 即 以 目 的 基 因 与 GAPDH 的 灰 度 比 值 表 示 目 的 基 因 的 相 对 表 达 水 平, 实 验 重 复 3 次 表 1 RT PCR 引 物 序 列 退 火 温 度 及 产 物 大 小 基 因 引 物 序 列 退 火 温 度 产 物 大 小 ( ) (bp) ColagenI F:5 TACAGCACGCTTGTGGATG 3 52 256 R:5 TTGAGTTTGGGTTGTTGGTC 3 α SMA F:5 TGGCCACTGCTGCTTCCTCTTCTT 3 58 422 R:5 GGGGCCAGCTTCGTCATACTCCT 3 p70s6k F:5 GAAATCTTGATGATGAGAAGCGGC 3 54 169 R:5 CTTGTGTGAGGTAGGGAGGCA 3 GAPDH F:5 CAAGGTGATCCATGACAACTTTG 3 58 496 R:5 GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG 3 1.7 Westernblot 检 测 P p70s6k p70s6k α SMA 蛋 白 表 达 收 集 经 雷 帕 霉 素 或 sirna 作 用 过 的 细 胞, 加 蛋 白 裂 解 液 RAPI( 含 PMSF), 冰 上 摇 晃 裂 解 30min 4,12000r/min 离 心 30min, 取 上 清 液 用 BCA 法 对 蛋 白 样 品 定 量 后, 加 入 上 样 缓 冲 液,100 加 热 10min 使 蛋 白 变 性 每 孔 加 20μl 或 30μl 总 蛋 白, 进 行 SDS PAGE 电 泳, 采 用 湿 转 法 将 胶 上 蛋 白 转 移 至 PVDF 膜 上, 膜 在 室 温 下 用 5% 脱 脂 奶 粉 (TBST 配 制 ) 封 闭 3h, 膜 用 TBST 清 洗 后, 用 待 检 测 蛋 白 的 一 抗 孵 育,4 次 日, 膜 用 TBST 清 洗 后, 用 与 一 抗 种 属 相 匹 配 的 的 二 抗 室 温 孵 育 2 h,ecl 发 光 试 剂 盒 显 影, 以 β actin 为 内 参,ImageJ 软 件 分 析 条 带 的 灰 度 值 1.8 统 计 学 处 理 采 用 SPSS13.0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 用 One WayANOVA 检 验 各 组 间 差 异 的 显 著 性

1064 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 2 结 果 2.1 磷 酸 化 p70s6k 在 CCl 4 诱 导 的 大 鼠 肝 纤 维 化 组 织 中 的 蛋 白 表 达 HE 染 色 和 Mason 染 色 结 果 ( 图 1) 显 示, 正 常 组 肝 组 织 结 构 完 整, 肝 细 胞 排 列 整 齐, 无 变 性, 而 模 型 组 肝 组 织 可 见 大 量 胶 原 纤 维 沉 积 并 伴 有 脂 肪 空 泡, 纤 维 间 隔 粗 大, 形 成 假 小 叶, 表 明 CCl 4 成 功 诱 导 了 大 鼠 肝 纤 维 化 模 型 Westernblot 结 果 表 明, 与 正 常 组 比 较, 模 型 组 α SMA 磷 酸 化 p70s6k 蛋 白 明 显 升 高, 差 异 有 统 计 学 意 义 (F= 13 115,F=13 787;P<0 05) 见 图 2 图 1 CCl 4 诱 导 大 鼠 肝 纤 维 化 模 型 200 A:HE 染 色 ;B:Mason 染 色 ;1: 正 常 组 ;2: 模 型 组 2.2 雷 帕 霉 素 对 PDGF 诱 导 的 HSC 增 殖 活 化 的 影 响 MTT 结 果 ( 图 3A) 显 示, 雷 帕 霉 素 在 3 种 浓 度 下 (2 20 50ng/ml), 均 能 够 明 显 抑 制 PDGF 诱 导 的 HSC 增 殖, 与 模 型 组 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 (F= 61 056,F=46 151;P<0 05,P<0 01);RT PCR 结 果 ( 图 3B) 显 示, 雷 帕 霉 素 减 少 了 PDGF 诱 导 的 α SMA 和 ColagenI 基 因 表 达, 与 模 型 组 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=134 489,F=15 941;P<0 05,P< 0 01);Westernblot 结 果 ( 图 3C) 显 示, 雷 帕 霉 素 明 显 地 抑 制 了 p70s6k 的 磷 酸 化, 减 少 了 α SMA 的 蛋 白 表 达 水 平, 与 模 型 组 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 (F= 54 659,F=36 382;P<0 05,P<0 01) 2.3 p70s6k sirna 抑 制 p70s6k 基 因 和 蛋 白 的 表 达 HSC 转 染 p70s6k sirna 后, 分 别 通 过 RT PCR 和 Westernblot 检 测 p70s6k 在 基 因 和 蛋 白 水 平 的 表 达, 两 项 检 测 结 果 均 显 示 (F=38 747;F= 17 35),R1 R2 R3 组 p70s6k 的 基 因 和 蛋 白 表 达 量 均 有 不 同 程 度 的 下 降, 且 与 模 型 组 阴 性 对 照 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (F=38 747,F=17 35;P< 0 05,P<0 01), 提 示 p70s6k sirna 能 够 明 显 抑 制 p70s6k 基 因 和 蛋 白 的 表 达, 脂 质 体 转 染 p70s6k sirna 是 有 效 的 阴 性 对 照 组 与 正 常 组 比 较 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 见 图 4 2.4 p70s6k sirna 作 用 对 PDGF 诱 导 的 HSC 活 化 的 影 响 PCR 结 果 表 明, 转 染 p70s6k sirna(1 2 3)HSC 细 胞 后,PDGF 诱 导 的 α SMA 和 Colagen I 的 基 因 水 平 被 明 显 抑 制, 与 模 型 组 相 比 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=95 668,F=27 91;P<0 05,P< 0 01), 阴 性 对 照 组 与 模 型 组 差 异 无 统 计 学 意 义 (P >0 05)( 图 5A) Westernblot 结 果 表 明, 转 染 p70s6k sirna(1 2 3)HSC 细 胞 后,PDGF 诱 导 的 α SMA 和 磷 酸 化 p70s6k 的 蛋 白 水 平 被 明 显 抑 制, 与 模 型 组 相 比 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=50 659,F= 30 652;P<0 01), 阴 性 对 照 组 与 模 型 组 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 见 图 5B 3 讨 论 图 2 Westernblot 检 测 P p70s6k 在 大 鼠 肝 纤 维 化 组 织 中 的 表 达 与 正 常 组 比 较 : # P<0 05 p70s6k 是 一 种 核 糖 体 蛋 白 激 酶, 在 各 种 组 织 中 广 泛 存 在, 参 与 细 胞 信 号 转 导 ; 作 为 mtor 的 下 游 作 用 靶 点,p70S6K 活 化 可 促 进 5 TOPmRNA 的 翻 译, 促 进 细 胞 生 长 和 增 殖 [8] [9-10] 研 究 表 明, 在 癌 症 等 疾 病 中,p70S6K 活 化 水 平 明 显 升 高, 抑 制 其 表 达 可 明 显 抑 制 肿 瘤 细 胞 的 增 殖 [6,11-13] 肝 纤 维 化 是 一 种 以 HSC 活 化 增 殖 介 导 ECM 过 度 沉 积 为 主 要

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1065 A bp 100 250 500 750 1 000 2 000 100 250 500 750 1 000 2 000 M 1 2 3 4 5 6 p70s6k 169 bp GAPDH 496 bp 0.8 0.6 0.4 0.2 * ## # # 0.0 1 2 3 4 5 6 B 1 2 3 4 5 6 ku p70s6k 70 β-actin 42 1.5 1.0 0.5 * ## ## # 0.0 1 2 3 4 5 6 图 4 p70s6k sirna 对 PDGF 诱 导 的 HSC T6 的 p70s6k 基 因 和 蛋 白 表 达 的 作 用 A:RT PCR 检 测 p70s6k mrna 表 达 ;B:Westernblot 检 测 p70s6k 蛋 白 表 达 ;M:Marker;1: 正 常 组 ;2: 模 型 组 ;3:PDGF+ Scram ble sirna;4:pdgf+p70s6k sirna1, 即 R1 组 ;5:PDGF+p70S6K sirna2, 即 R2 组 ;6:PDGF+p70S6K sirna3, 即 R3 组 ; 与 正 常 组 比 较 : P<0 05; 与 模 型 组 比 较 : # P<0 05, ## P<0 01 图 3 雷 帕 霉 素 对 PDGF 诱 导 的 HSC T6 增 殖 活 化 的 影 响 A:MTT 检 测 HSC T6 增 殖 ;B:RT PCR 检 测 α SMA 和 ColagenI mrna 表 达 ;C:Westernblot 检 测 α SMA 和 P p70s6k 蛋 白 表 达 ;M: Marker;1: 正 常 组 ;2: 模 型 组 ;3:PDGF+2ng/ml 雷 帕 霉 素 ;4:PDGF+ 20ng/ml 雷 帕 霉 素 ;5:PDGF+50ng/ml 雷 帕 霉 素 ;6:PDGF+DMSO; 与 正 常 组 比 较 : P<0 05; 与 模 型 组 比 较 : ## P<0 01, # P<0 05 特 点 的 疾 病, 鉴 于 p70s6k 在 细 胞 增 殖 中 的 重 要 作 用, 首 先 建 立 了 大 鼠 肝 纤 维 化 模 型, 发 现 肝 纤 维 化 组 织 中 P p70s6k 明 显 增 加, 表 明 p70s6k 可 能 参 与 了 肝 纤 维 化 的 过 程 正 常 情 况 下 HSC 在 肝 组 织 中 处 于 静 止 状 态, 数 目 较 少, 占 肝 脏 细 胞 总 数 的 5% ~8%, 当 肝 脏 受 到 炎 症 或 机 械 刺 激 等 损 伤 时,HSC 被 激 活, 其 表 型 由 静 止 型 转 变 为 激 活 型, 激 活 型 HSC 即 为 肌 成 纤 维 细 胞 (myofibroblasts,mfb), 能 够 产 生 大 量 ECM 在 肝 内 沉 积 因 此,HSC 活 化 是 肝 纤 维 化 发 生 发 展 的 关 键 环 节, 如 何 抑 制 HSC 增 殖 活 化, 以 减 缓 肝 纤 维 化 的 疾 病 进 程, 是 肝 纤 维 化 研 究 的 重 点 本 实 验 室 前 [4] 期 研 究 显 示, 在 PDGF 诱 导 活 化 的 HSC 中 p70s6k 磷 酸 化 水 平 表 达 明 显 升 高, 与 本 实 验 在 大 鼠

1066 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 用 3 种 p70s6k sirna 转 染 HSC 靶 向 抑 制 p70s6k, 结 果 显 示,3 种 小 RNA 干 扰 片 段 均 能 够 在 基 因 和 蛋 白 水 平 抑 制 p70s6k 的 表 达, 进 一 步 研 究 显 示, p70s6k sirna 明 显 降 低 了 p70s6k 磷 酸 化 水 平, 并 显 著 抑 制 PDGF 诱 导 的 HSC 中 α SMA 蛋 白 和 基 因 的 表 达 以 及 ColagenI 的 基 因 表 达 ( 注 :p70s6k sir NA1 不 能 抑 制 ColagenI 的 基 因 表 达 ) 综 上 所 述, 降 低 p70s6k 的 活 性 可 以 抑 制 HSC 的 增 殖 活 化, 抑 制 胶 原 的 分 泌, 提 示 p70s6k 有 可 能 作 为 肝 纤 维 化 预 防 治 疗 研 究 的 靶 点 参 考 文 献 图 5 p70s6k sirna 对 PDGF 诱 导 的 HSC T6 活 化 的 影 响 A:RT PCR 检 测 α SMA ColagenⅠ mrna 表 达 ;B:Westernblot 检 测 α SMA P p70s6k 蛋 白 表 达 ;M:Marker;1: 正 常 组 ;2: 模 型 组 ; 3:PDGF+Scramble sirna;4:pdgf+p70s6k sirna1, 即 R1 组 ;5: PDGF+p70S6K sirna2, 即 R2 组 ;6:PDGF+p70S6K sirna3, 即 R3 组 ; 与 正 常 组 比 较 : P<0 05; 与 模 型 组 比 较 : # P<0 05, ## P<0 01 肝 纤 维 化 组 织 中 检 测 到 p70s6k 磷 酸 化 水 平 升 高 的 结 果 一 致, 表 明 p70s6k 可 能 参 与 了 HSC 的 活 化 增 殖 为 进 一 步 明 确 其 在 HSC 中 的 作 用, 本 实 验 利 用 雷 帕 霉 素 抑 制 其 表 达 并 通 过 靶 向 干 扰 p70s6k, 观 察 其 对 HSC 增 殖 及 α SMA 和 ColagenI 表 达 的 影 响 结 果 显 示,3 种 剂 量 的 雷 帕 霉 素 (2 20 50ng/ ml) 分 别 作 用 HSC24h 或 48h, 均 能 够 明 显 抑 制 PDGF 诱 导 的 HSC 增 殖, 进 一 步 研 究 显 示, 雷 帕 霉 素 不 仅 降 低 p70s6k 磷 酸 化 水 平, 并 明 显 抑 制 α SMA 蛋 白 和 基 因 的 表 达 以 及 ColagenI 的 基 因 表 达 利 [1] 贾 丽 莎, 黄 成, 张 磊, 等. 脂 质 体 转 染 TRPM7siRNA 对 肝 星 状 细 胞 增 殖 的 影 响 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2011,46(11): 1117 20. [2] Hernandez GeaV,FriedmanSL.Pathogenesisofliverfibrosis [J].AnnuRevPathol,2011,6:425-56. [3] ZhengY,ColinsSL,LutzMA,etal.Aroleformammaliantar getofrapamycininregulatingtcelactivationversusanergy[j].j Immunol,2007,178(4):2163-70. [4] FangL,ZhanS,HuangC,etal.TRPM7channelregulates PDGF BB inducedproliferationofhepaticstelatecelsviapi3k anderkpathways[j].toxicolapplpharmacol,2013,272(3): 713-25. [5] 张 磊, 李 俊, 朱 鹏 里, 等. 四 氯 化 碳 诱 导 大 鼠 肝 纤 维 化 进 展 期 和 恢 复 期 模 型 的 建 立 [J]. 中 国 药 理 学 通 报,2011,27 (12):1757-60. [6] VelagapudiC,BhandariBS,Abboud WernerS,etal.Thetu berin/mtorpathwaypromotesapoptosisoftubularepithelialcels indiabetes[j].jamsocnephrol,2011,22(2):262-73. [7] TaoH,HuangC,YangJJ,etal.MeCP2controlstheexpresion ofrasal1inthehepaticfibrosisinrats[j].toxicology,2011, 290(2-3):327-33. [8] BuckM,ChojkierM A.RibosomalS 6kinase mediatedsignalto C/EBP betaiscriticalforthedevelopmentofliverfibrosis[j]. PLoSOne,2007,2(12):e1372. [9] ZhanHX,CongL,ZhaoYP,etal.ActivatedmTOR/P70S6K signalingpathwayisinvolvedininsulinomatumorigenesis[j].j SurgOncol,2012,106(8):972-80. [10] LealP,GarciaP,SandovalA,etal.AKT/mTOR substrate P70S6Kisfrequentlyphosphorylatedingalbladdercancertisue andcellines[j].oncotargetsther,2013,6:1373-84. [11]NawrothR,StelwagenF,SchulzW A,etal.S6K1and4E BP1 areindependentregulatedandcontrolcelulargrowthinbladder cancer[j].plosone,2011,6(11):e27509. [12] YuSY,LiuL,LiP,etal.RapamycininhibitsthemTOR/ p70s6kpathwayandatenuatescardiacfibrosisinadriamycin in duceddilatedcardiomyopathy[j].thoraccardiovascsurg,2013, 61(3):223-8. [13] ChuuCP,LinHP,CiaccioM F,etal.Cafeicacidphenethyl estersuppresestheproliferationofhumanprostatecancercels throughinhibitionofp70s6k andaktsignalingnetworks[j]. CancerPrevRes(Phila),2012,5(5):788-97.

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1067 携 带 Aβ37 42 肽 段 的 重 组 乙 肝 病 毒 表 面 抗 原 病 毒 样 颗 粒 的 制 备 蒋 桂 云 1, 陈 念 华 2, 付 远 辉 3, 焦 月 盈 3, 徐 青 3 1,3, 何 金 生 摘 要 目 的 采 用 杆 状 病 毒 表 达 系 统 制 备 携 带 Aβ37 42 肽 段 的 重 组 乙 肝 病 毒 表 面 抗 原 (HBsAg) 病 毒 样 颗 粒 (VLPs) 方 法 将 Aβ42 分 子 的 C 末 端 6 个 氨 基 酸 进 行 3 个 串 联 后, 插 入 到 HBsAg 的 113aa 与 114aa 之 间, 利 用 Bac to Bac 杆 状 病 毒 表 达 系 统, 构 建 表 达 HBsAgAβ37 42 的 重 组 杆 状 病 毒 载 体, 转 染 Sf9 细 胞,Westernblot 鉴 定 目 的 蛋 白 表 达 情 况, 用 氯 化 铯 (CsCl) 密 度 梯 度 超 速 离 心 纯 化, 电 镜 观 察 VLPs 的 形 态 结 果 制 备 并 纯 化 出 HBsAgVLPs 和 携 带 Aβ37 42 肽 段 的 HBsAgVLPs(HBsAgAβ37 42VLPs) 结 论 制 备 携 带 Aβ 抗 原 表 位 的 重 组 HBsAg 作 为 一 种 阿 尔 茨 海 默 病 (AD) 疫 2014-02-25 接 收 基 金 项 目 : 中 央 高 校 基 本 科 研 业 务 费 ( 编 号 :2012JBZ003) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 免 疫 学 教 研 室, 合 肥 230032 2 烟 台 市 第 二 中 学, 烟 台 264000 3 北 京 交 通 大 学 生 命 科 学 与 生 物 工 程 研 究 院, 北 京 100044 作 者 简 介 : 蒋 桂 云, 女, 硕 士 研 究 生 ; 何 金 生, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:jshhe@ bjtu.edu.cn 苗 具 有 一 定 的 可 行 性, 值 得 进 一 步 探 讨 关 键 词 阿 尔 茨 海 默 病 ; 乙 肝 病 毒 表 面 抗 原 ; 杆 状 病 毒 表 达 系 统 ; 病 毒 样 颗 粒 中 图 分 类 号 R741.16;Q78 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1067-05 阿 尔 茨 海 默 病 (Alzheimer sdisease,ad) 是 以 渐 进 性 记 忆 力 减 退 为 主 要 临 床 症 状 的 疾 病 到 目 前 为 止, 世 界 AD 患 者 将 近 3700 万 [1-2] 近 年 来, 以 Aβ42 为 靶 向 的 治 疗 性 AD 疫 苗 引 起 广 泛 关 注, 制 约 AD 疫 苗 研 制 的 因 素 : 首 先 是 Aβ42 为 AD 患 者 的 自 [3] 身 抗 原, 存 在 免 疫 耐 受 问 题 既 往 研 究 表 明 高 密 度 多 价 结 构 的 病 毒 样 颗 粒 (virus likeparticles, VLPs) 一 类 的 抗 原 能 够 诱 导 机 体 产 生 高 滴 度 的 抗 体 反 应, 强 大 的 抗 体 应 答 能 够 突 破 免 疫 耐 受 其 次, 研 [4] 究 人 员 采 用 Aβ42C 末 端 的 6 个 氨 基 酸 免 疫 动 物, 能 够 获 得 识 别 Aβ42, 不 识 别 Aβ40 的 抗 体, 避 免 了 干 扰 Aβ40 的 正 常 功 能 另 外, 作 为 Aβ 治 疗 性 疫 Thestudyontheefectofsilencingp70S6K onthe proliferationandactivationofhsc T6 ZhanShuxiang 1,2,HuangCheng 1,2,MaTaotao 1,2,etal ( 1 SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230032; 2 InstituteforLiverDiseases ofanhuimedicaluniversity,hefei 230032) Abstract Objective Toinvestigatetheefectofsuppresingp70S6K(ribosomalproteinS6kinase)expresionon theproliferationandactivationofhepaticstelatecelstrain(hsc T6)invitro.Methods CCl 4 inducedliverfi brosismodelinratsandthenthephosphorylatedp70s6k(p p70s6k)levelwasdeterminedinfibroticlivertisue. AfterpretreatedwithRapamycinorsiRNAtargetingp70S6K,HSC T6wasstimulatedwithPDGFandthenthepro liferationandactivationofitwereobserved.westernblotandrt PCRwereusedtodetecttheproteinandmRNA expresionofp70s6k,p p70s6k,α SMAandColagenI.Results TheP p70s6klevelobviouslyincreasedinrat fibroticlivertisue.therapamycinpretreatmentsignificantlydecreasedthep p70s6klevelandinhibitedpdgf mediatedproliferationandtheexpresionofα SMA,ColagenIinHSC T6.p70S6K sirnadown regulatedtheex presionofp70s6kinmrnaandproteinlevelandmeanwhiledecreasedtheexpresionofα SMA,ColagenⅠ and P p70s6kinducedbypdgfinhsc.conclusion Blockingp70S6KexpresionbyRapamycinandp70S6K sir NAcansupprestheactivationandproliferationofHSCtoacertainextent,maybeprovidingnewideasandtargets forthepreventionandtreatmentofliverfibrosis. Keywords HSC T6;p70S6K;smalinterferingRNA;Rapamycin;hepaticfibrosis

1068 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 苗 主 要 免 疫 对 象 的 老 年 人, 存 在 免 疫 衰 老 现 象 [5] 招 募 童 年 时 期 的 记 忆 性 T 淋 巴 细 胞, 是 突 破 免 疫 衰 老 的 一 种 方 法 [6] 本 实 验 将 Aβ42 分 子 的 C 末 端 6 个 氨 基 酸 进 行 3 个 串 联 后, 插 入 到 乙 肝 病 毒 表 面 抗 原 (hepatitisbvirussurfaceantigen,hbsag) 的 113 aa 与 114aa 之 间, 制 备 融 合 有 Aβ37 42 肽 段 的 HB sagvlps(hbsagaβ37 42VLPs), 为 提 高 Aβ42 分 子 的 C 末 端 作 为 疫 苗 抗 原 的 免 疫 原 性 提 供 研 究 基 础 1 材 料 与 方 法 1.1 细 胞 株 载 体 和 感 受 态 杆 状 病 毒 表 达 系 统 ( 包 括 E.coli 菌 株 DH10Bac 质 粒 pfastbac1) 和 草 地 贪 夜 蛾 细 胞 (Sf9) 购 自 美 国 Invitrogen 公 司 ; 载 体 pmd18 T 购 自 日 本 TaKaRa 公 司 ; 菌 株 E.coliDH5α 为 本 室 保 存 1.2 主 要 试 剂 引 物 合 成 及 DNA 测 序 由 华 大 基 因 完 成 ;Aβ37 42 肽 段 的 HBsAg 基 因 (HBsAgAβ37 42) 由 上 海 生 工 合 成 ; 质 粒 小 量 提 取 及 胶 回 收 试 剂 盒 购 自 美 国 Promega 公 司 ;T4DNA 连 接 酶 ExTaq 聚 合 酶 及 DNA Marker 购 自 日 本 TaKaRa 公 司 ; SF900 培 养 基 购 自 美 国 Gibco 公 司 ; 胎 牛 血 清 (fetal bovineserum,fbs) 购 自 美 国 Hyclone 公 司 ; 核 酸 内 切 酶 及 预 染 蛋 白 Marker 购 自 美 国 NEB 公 司 ;Cel fectin Reagent 购 自 美 国 Invitrogen 公 司 RIPA 裂 解 液 购 自 碧 云 天 公 司 ;HBsAg 抗 体 阳 性 人 血 清 为 本 室 保 存 ; 鼠 特 异 性 HBsAg 免 疫 血 清 为 本 实 验 室 制 备 ; 兔 抗 Aβ37 42 抗 体 购 自 美 国 Abcam 公 司 ; 兔 抗 人 山 羊 抗 小 鼠 及 山 羊 抗 兔 HRP 标 记 二 抗 购 自 北 京 中 杉 金 桥 公 司 ; 硝 酸 纤 维 素 膜 购 自 英 国 Amersham 公 司 ;BCA 蛋 白 定 量 试 剂 盒 和 ECL 化 学 发 光 试 剂 盒 购 自 美 国 Pierce 公 司 ; 细 胞 培 养 用 耗 材 购 自 美 国 Corning 公 司 1.3 质 粒 pmd18 T HBsAg 的 构 建 分 别 设 计 引 物 F1: 5 GATATCATGGAGAACATCGCATCAG GACTC 3 R1:5 TGGTCCGGTGCTGGTGGTTGAT GATCCTGGAATTAGAGGAC 3 ;F2:5 GTCCTCTA ATTCCAGGATCATCAACCACCAGCACCGGACC 3 和 R2:5 CTCGAGTCAAATGTATACCCAAAGAC 3 ( 下 划 线 处 分 别 为 EcoR V 和 XhoⅠ 酶 切 位 点 ), 以 puc57 HBsAgAβ37 42 为 模 板, 扩 增 HBsAg 基 因, 连 接 至 pmd18 T 载 体 测 序 获 得 质 粒 pmd18 T HBsAg, 并 测 序 1.4 质 粒 pfastbac1 HBsAgAβ37 42 及 pfast Bac1 HBsAg 的 构 建 分 别 以 EcoRⅠ 和 XhoⅠ 双 酶 切 puc57 HBsAgAβ37 42 和 pfastbac1, 回 收 片 段 和 载 体, 连 接, 挑 选 重 组 子, 摇 菌, 提 取 质 粒 pfastbac1 HBsAgAβ37 42; 分 别 以 EcoRⅤ 和 XhoⅠ 双 酶 切 测 序 正 确 的 质 粒 pmd18t HBsAg 和 pmtv5 HisA 回 收 片 段 和 载 体 连 接, 挑 选 重 组 子, 摇 菌, 提 取 质 粒 pmtv5 HisA HBsAg; 分 别 以 EcoRⅠ 和 XhoⅠ 双 酶 切 pmtv5 HisA HBsAg 和 pfastbac1, 回 收 片 段 和 载 体 连 接, 挑 选 重 组 子, 摇 菌, 提 取 质 粒 pfastbac1 HB sag 1.5 重 组 杆 状 病 毒 DNA rbacmid HBsAgAβ37 42 和 rbacmid HBsAg 的 获 得 分 别 取 pfastbac1 HBsAgAβ37 42 和 pfastbac1 HBsAg 转 化 DH10Bac 使 之 发 生 转 座, 经 蓝 白 斑 筛 选, 挑 选 白 色 单 菌 落, 扩 大 培 养 并 提 取 重 组 杆 状 病 毒 DNA 分 子 rbacmid HBsAgAβ37 42 和 rbacmid HBsAg PCR 方 法 鉴 定 后, 以 Celfectine reagent 分 别 转 染 rbacmid HBsAgAβ37 42 和 rbacmid HBsAg 至 Sf9 细 胞, 于 28 培 养 72h, 待 出 现 细 胞 病 变 效 应 (cytopathicefect, CPE) 后, 离 心 收 获 培 养 上 清 液, 即 为 第 1 代 毒 种, 命 名 为 rbac HBsAgAβ37 42 和 rbac HBsAg 1.6 蛋 白 的 表 达 与 鉴 定 待 Sf9 细 胞 生 长 汇 合 度 为 90% 时, 按 感 染 复 数 (multiplicityofinfection, MOI)=5 分 别 接 种 P3 代 rbac HBsAgAβ37 42 和 rbac HBsAg,72h 收 获 细 胞, 裂 解 细 胞, 进 行 SDS PAGE 电 泳, 转 膜, 封 闭, 用 抗 HBsAg 阳 性 人 血 清 或 兔 抗 Aβ37 42 抗 体 4 过 夜 孵 育, 洗 膜 3 次 后, 用 HRP 羊 抗 人 或 羊 抗 兔 为 二 抗 进 行 Westernblot 检 测 1.7 HBsAgAβ37 42 和 HBsAgVLPs 的 纯 化 待 Sf9 细 胞 生 长 汇 合 度 为 90% 时, 将 培 养 液 换 成 无 血 清 培 养 液, 按 MOI=5 分 别 接 种 P3 代 rbac HBsAgAβ37 42 和 rbac HBsAg,72h 收 获 细 胞, 超 声 裂 解, 收 集 上 清 液 采 用 氯 化 铯 (CsCl) 密 度 梯 度 离 心 (1.1~1 4g/cm 3 ), 收 集 VLPs, 进 行 Westernblot 检 测 和 电 镜 观 察 1.8 BCA 法 测 定 样 品 中 蛋 白 浓 度 按 照 BCA 法 蛋 白 定 量 试 剂 盒 说 明, 采 用 酶 标 96 孔 板 的 方 法, 测 定 纯 化 后 蛋 白 的 浓 度 1.9 SDS PAGE 检 测 蛋 白 的 纯 度 使 用 12% 聚 丙 烯 酰 胺 进 行 SDS PAGE, 考 马 斯 亮 蓝 染 色 1~2h, 然 后 脱 色 1~2h, 观 察 结 果 1.10 透 射 电 镜 观 察 VLPs 形 态 纯 化 后 VLPs 少

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1069 许, 磷 钨 酸 负 染 后 在 透 射 电 子 显 微 镜 ( 荷 兰 Philips 公 司,EM410) 下 观 察 VLPs 形 态 2 结 果 2.1 质 粒 pmd18t HBsAg 的 构 建 及 鉴 定 质 粒 pmd18t HBsAg 经 EcoRⅤ 和 XhoⅠ 双 酶 切 鉴 定, 产 生 一 条 2692bp 和 一 条 693bp 条 带, 与 预 期 条 带 大 小 一 致, 见 图 1, 并 通 过 测 序, 序 列 也 与 标 准 序 列 一 致 图 3 rbacmid HBsAgAβ37 42 和 rbacmid HBsAgPCR 鉴 定 结 果 1: 质 粒 rbacmid HBsAgAβ37 42;2:DL15000Marker;3: 质 粒 rbacmid HBsAg 图 1 质 粒 pmd18t HBsAg 的 酶 切 鉴 定 1: 质 粒 pmd18 T HBsAg;2:DL2000Marker;3:DL15000Marker 2.4 HBsAgAβ37 42VLPs 和 HBsAgVLPs 纯 化 及 鉴 定 分 别 用 P3 代 的 重 组 杆 状 病 毒 rbac HBsAgAβ37 42 和 rbac HBsAg 感 染 Sf9 细 胞 72h 后, 收 获 细 胞 裂 解, 并 将 细 胞 裂 解 液 进 行 CsCl 密 度 梯 度 超 速 离 心 后, 分 离 出 目 的 条 带 层 ( 约 1 19g/cm 3 ), 分 别 用 HBsAg 抗 体 阳 性 人 血 清 ( 或 鼠 特 异 性 HBsAg 免 疫 血 清 ) 和 兔 抗 Aβ37 42 抗 体 作 为 一 抗, 进 行 Westernblot 鉴 定, 可 见 目 的 条 带 HBsAg 约 25ku 和 HBsAgAβ37 42 约 27ku, 见 图 4 5 2.2 pfastbac1 HBsAgAβ37 42 及 pfastbac1 HB sag 质 粒 的 构 建 及 鉴 定 质 粒 pfastbac1 HBsAgAβ37 42 及 pfastbac1 HBsAg 经 EcoRⅠ Xho Ⅰ 双 酶 切 后 分 别 应 产 生 4775 747bp 和 4775 693 bp 的 条 带, 与 预 期 条 带 相 符, 见 图 2, 酶 切 鉴 定 正 确 图 4 Westernblot 分 析 HBsAg 蛋 白 的 表 达 1:Sf9 细 胞 感 染 rbac HBsAgAβ37 42;2:Sf9 细 胞 感 染 rbac HB sag;3:sf9 细 胞 图 5 Westernblot 分 析 Aβ37 42 肽 段 的 表 达 1:Sf9 细 胞 感 染 rbac HBsAgAβ37 42;2:Sf9 细 胞 感 染 rbac HBsAg 图 2 质 粒 pfastbac1 HBsAgAβ37 42 和 pfastbac1 HBsAg 的 酶 切 鉴 定 1:DL15000Marker;2:DL2000 Marker;3: 质 粒 pfastbac1 HBsAgAβ37 42;4: 质 粒 pfastbac1 HBsAg 2.3 重 组 杆 状 病 毒 DNA 的 获 得 及 PCR 鉴 定 转 座 后, 获 得 表 达 HBsAgAβ37 42 和 HBsAg 的 重 组 杆 状 病 毒 载 体 rbacmid HBsAgAβ37 42 和 rbacmid HB sag, 经 PCR 扩 增 出 的 片 段 大 小 和 预 期 相 符, 见 图 3 2.5 纯 化 后 蛋 白 浓 度 的 测 定 BCA 法 蛋 白 定 量 结 果 显 示,CsCl 密 度 梯 度 离 心 纯 化 所 得 HBsAgAβ37 42 蛋 白 浓 度 为 3 492mg/ml,HBsAg 蛋 白 浓 度 为 3 589mg/ml 2.6 纯 化 后 蛋 白 纯 度 的 检 测 使 用 CsCl 密 度 梯 度 离 心 纯 化 蛋 白, 通 过 SDS PAGE 考 马 斯 亮 蓝 染 色 检 测 纯 化 后 的 蛋 白, 见 图 6, 可 见 纯 化 后 样 品 在 泳 道 上 有 25ku 左 右 的 条 带

1070 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 图 6 SDS PAGE 电 泳 检 测 纯 化 后 蛋 白 1:Marker;2: 纯 化 的 HBsAgAβ37 42;3: 纯 化 HBsAg;4: 未 纯 化 HBsAgAβ37 42;5: 未 纯 化 HBsAg 2.7 HBsAgAβ37 42VLPs 和 HBsAgVLPs 电 镜 观 察 取 CsCl 密 度 梯 度 超 速 离 心 后 的 HBsAgAβ37 42VLPs 和 HBsAgVLPs 进 行 2 倍 稀 释 后 负 染, 透 射 电 镜 观 察, 见 约 22nm 的 VLPs, 见 图 7 图 7 VLPs 透 射 电 镜 观 察 结 果 (1% 磷 钨 酸,pH6.8 负 染,TECNAI 12000) A: 纯 化 的 HBsAgAβ37 42VLPs;B: 纯 化 的 HBsAgVLPs 3 讨 论 HBsAg 是 半 糖 基 化 的 蛋 白, 由 226 个 氨 基 酸 组 成, 在 内 质 网 合 成 并 在 腔 膜 上 形 成 约 22nm 的 VLPs, 每 个 VLP 由 100~150 个 多 肽 组 成, 其 构 型 复 杂, 外 部 含 有 一 个 能 高 效 产 生 免 疫 原 性 的 区 域, 这 个 区 域 曾 被 多 个 团 队 引 用 并 已 成 为 携 带 外 源 表 位 的 一 个 平 台, 插 入 外 源 性 基 因 序 列 或 表 位 并 不 影 响 颗 粒 的 形 成 和 它 的 免 疫 原 性 [7-9] Smithetal [10] 首 先 报 道 以 首 蓿 尺 蠖 核 型 多 角 体 病 毒 (autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvi rus,acnpv) 转 移 载 体 表 达 β 干 扰 素 以 来, 包 括 HBV 在 内 的 许 多 外 源 基 因 都 已 在 杆 状 病 毒 载 体 表 达 系 统 中 得 到 高 水 平 表 达 选 用 杆 状 病 毒 表 达 系 统 来 表 达 HBsAg 及 HBsAgAβ37 42 具 有 以 下 优 势 :1 蛋 白 表 达 量 高 且 不 影 响 杆 状 病 毒 DNA 的 复 制 和 子 代 病 毒 的 形 成 ;2 表 达 产 物 具 有 生 物 活 性 ;3 对 人 畜 无 害, 其 生 产 相 当 安 全 [11-12] 本 实 验 获 得 表 达 HBsAg 和 HBsAgAβ37 42 的 重 组 杆 状 病 毒, 在 昆 虫 细 胞 中 合 成 并 组 装 成 VLPs, 但 是 不 能 有 效 地 分 泌 出 来, 这 与 Lanfordetal [13] 报 道 的 在 杆 状 病 毒 表 达 系 统 中 表 达 的 HBsAg 蛋 白 主 要 集 中 在 细 胞 内 相 符 合, 但 在 哺 乳 动 物 细 胞, 如 中 国 仓 鼠 卵 巢 细 胞 (Chinesehamsterovary,CHO) 细 胞 中 HBsAg 的 表 达 是 可 以 分 泌 的, 这 可 能 是 由 于 在 杆 状 病 毒 表 达 系 统 中 HBsAg 蛋 白 表 达 量 高, 且 形 成 的 VLPs 多 本 实 验 利 用 Westernblot 鉴 定 HBsAg 蛋 白 表 达 时, 可 见 图 中 有 两 条 带, 分 析 可 能 是 部 分 蛋 白 糖 基 化 的 结 果, 于 是 产 生 了 非 糖 基 化 25ku 和 糖 基 化 29ku 左 右 的 两 条 带, 进 一 步 鉴 定 发 现 感 染 后 72h 蛋 白 表 达 量 相 对 较 高 在 鉴 定 Aβ37 42 短 肽 时, 起 初 在 加 样 孔 附 近 检 测 到 条 带, 在 其 正 确 分 子 量 对 应 的 位 置 (27ku) 却 没 有 特 异 性 条 带 出 现, 由 此 推 测 加 样 孔 附 近 的 条 带 可 能 是 蛋 白 发 生 了 聚 集 形 成 了 多 聚 体 所 导 致 为 了 避 免 此 类 现 象 的 发 生, 将 处 理 蛋 白 的 温 度 从 100 5min 改 为 50 12min, 结 果 检 测 到 目 的 蛋 白 分 子 量 大 小 的 条 带 在 分 析 影 响 此 实 验 的 各 种 因 素 中, 除 了 蛋 白 鉴 定 时 的 处 理 温 度 外, 以 下 几 个 方 面 也 值 得 关 注 : 首 先 转 染 时 质 粒 的 量 要 足 够 ; 另 外 在 以 超 速 离 心 纯 化 VLPs 时, 垫 层 上 加 入 样 品 时, 应 注 意 样 品 的 浓 度, 如 果 浓 度 过 高, 会 导 致 离 心 后 分 层 不 明 显 且 分 不 开, 影 响 样 品 的 纯 度 通 过 本 实 验, 制 备 出 了 携 带 Aβ37 42 肽 段 的 重 组 HBsAgVLPs, 在 后 续 的 实 验 中 将 主 要 从 免 疫 效 果 的 评 价 和 体 内 功 能 实 验 进 行 研 究 总 之,HBsAg Aβ37 42VLPs 的 获 得, 为 后 续 动 物 实 验 提 高 Aβ42 分 子 的 C 末 端 作 为 疫 苗 抗 原 的 免 疫 原 性 以 及 提 高 老 年 人 对 疫 苗 的 反 应 性 等 奠 定 了 研 究 基 础 参 考 文 献 [1] FengG,WangW,QianY,etal.Anti Aβantibodiesinducedby Aβ HBcvirus likeparticlespreventaβ aggregationandprotect PC12celsagainsttoxicityofAβ1 40[J].JNeurosciMethods, 2013,218(1):48-54. [2] FuHJ,LiuB,FrostJL,etal.Amyloid βimmunotherapyfor

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1071 Alzheimer sdisease[j].cnsneuroldisorddrugtargets,2010, 9(2):197-206. [3] ChackerianB.Virus likeparticlebasedvaccinesforalzheimer disease[j].humvaccin,2010,6(11):926-30. [4] AxelsenTV,HolmA,ChristiansenG,etal.Identificationofthe shortestaβ peptidegeneratinghighlyspecificantibodiesagainst thec terminalendofamyloid β42[j].vaccine,2011,29(17): 3260-9. [5] MadeoJ,FrieriM.Alzheimer sdiseaseandimmunotherapy[j]. AgingDis,2013,4(4):210-20. [6] OlkhanudPB,MughalM,AyukawaK,etal.DNAimmunization withhbsag basedparticlesexpresingabcelepitopeofamyloid beta peptideatenuatesdiseaseprogresionandprolongssurvivalin amousemodelofalzheimer sdisease[j].vaccine,2012,30 (9):1650-8. [7] VietheerPT,BooI,DrummerH E,etal.Immunizationswith chimerichepatitisbvirus likeparticles(vlps)toinducepoten tialanti hepatitisc virus(hcv) neutralizingantibodies[j]. AntivirTher,2007,12(4):477-87. [8] WooW P,DoanT,HerdKA,etal.HepatitisBsurfaceantigen vectordeliversprotectivecytotoxict lymphocyteresponsestodis ease relevantforeignepitopes[j].jvirol,2006,80(8):3975-84. [9] KotiwM,JohnsonM,PandeyM,etal.Immunologicalresponseto parentalvaccinationwithrecombinanthepatitisbvirussurfacean tigen virus like particles expresing Helicobacter pylorikata epitopesinamurineh.pylorichalengemode[j].clinvaccine Immunol,2012,19(2):268-76. [10] SmithGE,SummersM D,FraserM.etal.Productionofhuman betainterferonininsectcelsinfectedwithabaculovirusexpresion vector[j].molcelbiol,1983,3(12):2156-65. [11]WangX,GaoL,DengF,etal.High levelproductionofafunc tionalrecombinanthepatitisbviruspolymeraseininsectcelswith abaculovirusexpresionsystem[j].jhuazhongunivscitechn ologmedsci,2007,27(3):269-73. [12] 苗 季, 从 旭, 谭 文 杰, 等. 利 用 穿 梭 质 粒 快 速 构 建 乙 型 肝 炎 病 毒 表 面 抗 原 (HBsAg) 基 因 的 重 组 杆 状 病 毒 [J]. 中 华 实 验 和 临 床 病 毒 学 杂 志,1998,12(3):245-8. [13] LanfordRE,LuckowV,KennedyRC,etal.Expresionand characterizationofhepatitisbvirussurfaceantigenpolypeptidesin insectcelswithabaculovirusexpresionsystem[j].jvirol, 1989,63(4):1549-57. PreparationofarecombinanthepatitisBvirussurface antigenvirus likeparticlesexpresingaβ37 42 JiangGuiyun 1,ChenNianhua 2,FuYuanhui 3,etal ( 1 DeptofImmunology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230032; 2 YantaiNo.2MiddleSchool, Yantai 264000; 3 ColegeofLifeSciencesandBioenginering,BeijingJiaotongUniversity,Beijing 100044) Abstract Objective TopreparearecombinanthepatitisBvirussurfaceantigen(HBsAg)virus likeparticles (VLPs)whichcariedthepeptidesofAβ37 42byusingbaculovirusexpresionsystem.Methods Forconstructed anexpresinghbsagaβ37 42recombinantbacmid,theencodingsequenceofsixaminoacidshortpeptidefromthe carboxyterminusofaβ42peptideintriplicatewereinsertedintohbsagbetween113aaand114aa.whenthere combinantbacmidcontainedthegeneofinterestwasconfirmed,itwastransfectedtosf9celsforproducingrecom binantbaculovirusandamplifyingthebaculoviralstock.therecombinantproteinwasidentifiedbywesternblot. ThepaternsoftheVLPswereobservedbytransmisionelectronmicroscopyaftertherecombinantproteinwaspuri fiedbyusingcscldensitygradientcentrifugation.results HBsAgVLPsandHBsAgVLPsexpresingAβ37 42 (HBsAgAβ37 42VLPs)weresuccesfulyconstructedandpurified.Conclusion TheexpresionofAβantigen epitopebyhbsagvlpsissuccesfulandtheresultisapplicableforfurtherinvivoinvestigationasacandidatevac cineofalzheimer sdisease(ad). Keywords Alzheimer sdisease;hepatitisbvirussurfaceantigen;baculouvirusexpresionsystem;virus like particles

1072 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 小 鼠 海 马 CA1 和 CA3 神 经 元 基 本 电 生 理 特 性 的 比 较 分 析 张 玉 松 1, 祝 延 1,2, 郭 呈 斌 1, 解 敏 1, 王 烈 成 1 3, 张 晨 摘 要 目 的 制 备 急 性 小 鼠 海 马 脑 片, 观 察 并 分 析 海 马 脑 片 CA1 和 CA3 神 经 元 的 电 生 理 特 性 方 法 将 急 性 制 备 的 小 鼠 海 马 脑 片, 应 用 红 外 微 分 干 涉 相 差 技 术 结 合 电 荷 耦 合 成 像 系 统 和 脑 片 膜 片 钳 技 术, 对 小 鼠 海 马 CA1 和 CA3 神 经 元 结 构 特 点 和 电 生 理 特 性 进 行 观 察 和 检 测 结 果 海 马 CA1 和 CA3 神 经 元 立 体 结 构 清 晰, 胞 体 突 起 明 显, 细 胞 死 亡 少 且 容 易 封 接 海 马 CA1 和 CA3 神 经 元 自 发 放 电 电 流 和 动 作 电 位 的 幅 度 频 率, 静 息 膜 电 位 和 峰 峰 间 距, 二 者 之 间 差 异 均 无 统 计 学 意 义 ; 去 极 化 脉 冲 电 压 与 钠 和 钾 离 子 通 道 电 流 密 度, 步 阶 脉 冲 电 流 与 动 作 电 位 发 放 数 二 者 之 间 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 结 论 海 马 CA1 和 CA3 神 经 元 的 一 些 基 本 电 生 理 特 性 存 在 异 同, 这 结 果 为 记 忆 和 神 经 疾 病 等 研 究 提 供 一 定 的 理 论 基 础 关 键 词 膜 片 钳 技 术 ; 小 鼠 ; 脑 片 ; 海 马 神 经 元 ; 电 生 理 中 图 分 类 号 R338.8 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1072-05 海 马 是 大 脑 中 被 广 泛 研 究 的 热 点 脑 区 之 一, 海 马 CA1 和 CA3 神 经 元 是 实 验 研 究 中 常 用 的 两 类 神 经 元 且 均 匀 的 位 于 清 晰 易 见 的 细 胞 带 上, 与 一 些 生 理 行 为 学 和 神 经 系 统 疾 病 研 究 相 关 联 [1-2] CA1 神 经 元 具 有 明 显 的 海 马 信 号 输 出 环 路, 在 长 时 程 记 忆 和 相 对 空 间 任 务 及 行 为 学 上 有 重 要 作 用 CA3 神 经 元 位 于 大 脑 颞 叶 海 马 里, 被 各 种 抑 制 性 神 经 元 所 调 节,CA3 神 经 元 从 齿 状 回 神 经 元 接 收 信 息 与 CA1 神 经 元 有 雪 佛 侧 枝 相 连 接, 也 被 应 用 于 记 忆 方 面 的 研 究 另 外,CA1 和 CA3 神 经 元 异 常 放 电 亦 与 癫 痫 等 神 经 系 统 疾 病 有 关 该 实 验 制 作 急 性 海 马 脑 片, 比 较 分 析 CA1 和 CA3 神 经 元 基 本 电 生 理 特 性, 为 记 忆 和 神 经 疾 病 等 研 究 提 供 一 定 的 理 论 基 础 2014-03-20 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :81071075); 安 徽 医 科 大 学 校 科 研 基 金 ( 编 号 :2013xkj002) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 基 础 医 学 院 生 理 学 教 研 室, 合 肥 230032 2 蚌 埠 医 学 院 生 理 学 教 研 室, 蚌 埠 233000 3 北 京 大 学 生 命 科 学 学 院 神 经 疾 病 与 神 经 网 络 实 验 室, 北 京 100871 作 者 简 介 : 张 玉 松, 男, 硕 士 研 究 生 ; 祝 延, 男, 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:zhuyan @ah.edu.cn 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 动 物 C57/BL6 型 小 鼠 10 只, 出 生 约 14 d, 体 重 约 30g, 清 洁 级, 由 北 京 维 通 利 华 公 司 提 供, 雌 雄 不 限 1.2 仪 器 与 试 剂 1.2.1 主 要 仪 器 LeicaVT1200 型 振 动 切 片 机 (LeicaBiosystemsNuslochGmbH, 德 国 ); 电 极 拉 制 仪 (P 98, 美 国 ); 膜 片 钳 系 统 (HEKA, 德 国 ); 相 差 红 外 微 分 干 涉 显 微 镜 (Olympus, 日 本 ) 1.2.2 主 要 试 剂 实 验 试 剂 均 购 自 美 国 Sigma 公 司 解 剖 液 (mmol/l):sucrose213 Glucose10 KCl 3 NaH 2 PO 4 1 CaCl 2 0.5 MgCl 2 5 NaHCO 3 26, 用 NaOH 或 HCl 调 ph 至 7.30~7.40, 渗 透 压 约 为 310 mosm 人 工 脑 脊 液 (mmol/l):glucose10 NaCl 125 KCl5 NaH 2 PO 4 1.2 CaCl 2 2.6 MgCl 2 1.3 NaHCO 3 26, 调 ph 至 7.30~7.40 电 极 内 液 (mmol/l):kcl145 NaCl5 HEPES10 EGTA 5 MgATP4 Na 2 GTP0.3, 调 ph 值 至 7.30~7.40, 渗 透 压 约 为 310mOsm 1.3 制 备 小 鼠 海 马 脑 片 取 约 14d 的 小 鼠, 用 1% 戊 巴 比 妥 钠 腹 腔 注 射 麻 醉 [3] 麻 醉 昏 迷 后 迅 速 移 除 大 脑, 固 定 头 部 用 手 术 剪 刀 分 别 沿 着 颅 骨 中 线 和 颅 底 两 侧 方 向 剪 开 头 颅 骨, 同 时 不 断 地 用 约 0 解 剖 液 冲 洗 大 脑 ( 解 剖 液 预 先 充 含 95% O 2 +5% CO 2 混 合 气 体 30min), 然 后 把 整 个 大 脑 置 于 有 约 0 解 剖 液 的 圆 盘 中, 用 手 术 刀 和 弯 镊 子 剔 除 嗅 球 小 脑, 沿 颅 中 线 分 开 两 大 脑 半 球 并 除 去 海 马 周 围 白 纸 和 皮 质, 修 整 脑 块 后 在 底 座 上 点 少 量 α 氰 基 丙 烯 酸 乙 酯 胶 水 以 便 海 马 组 织 牢 固 站 立, 迅 速 将 底 座 放 在 盛 有 约 0 解 剖 液 的 切 片 机 槽 里 并 不 断 充 以 混 合 气 体, 沿 矢 状 位 切 成 400μm 厚 的 脑 片, 把 脑 片 放 在 盛 有 人 工 脑 脊 液 ( 预 先 充 混 合 气 体 30min) 的 玻 璃 杯 中 室 温 下 孵 育 1~2h 后 备 用 [4] 1.4 固 定 及 灌 流 脑 片 应 用 盖 网 固 定 法, 即 铂 金 丝 制 作 U 型 框 架 周 围 绕 以 尼 龙 线 绳 并 胶 粘 固 定 把 U 型 网 框 架 轻 放 于 脑 片 上, 用 蠕 动 泵 向 脑 片 恒 速 灌 流 混 合 气 体 饱 和 的 人 工 脑 脊 液, 流 速 1~2ml/min, 使 脑 片 浸 泡 在 液 面 下 2mm [5]

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1073 1.5 神 经 元 形 态 学 观 察 及 电 生 理 记 录 应 用 红 外 显 微 镜 结 合 电 荷 耦 合 摄 像 系 统 观 察 脑 片 CA1 与 CA3 神 经 元 结 构 特 点 电 压 钳 下, 钳 制 电 位 在 -60 mv, 记 录 神 经 元 自 发 放 电 电 流, 给 予 步 阶 脉 冲 刺 激 记 录 不 同 离 子 通 道 电 流 并 作 电 流 电 压 曲 线 ; 电 流 钳 下, 记 录 海 马 神 经 元 的 静 息 膜 电 位 值 和 动 作 电 位 变 化 情 况 这 些 获 得 的 信 号 通 过 放 大 器 放 大 后 输 出, 应 用 IGOR 软 件 分 析 作 图 1.6 统 计 学 处 理 采 用 GraphpadPrism5.0 软 件 进 行 统 计 分 析 数 据 以 x±s 珋 表 示, 两 组 间 比 较 采 用 t 检 验, 多 组 间 比 较 用 方 差 分 析 (Two WayANOVA) 2 结 果 2.1 脑 片 神 经 元 的 选 择 和 形 态 学 观 察 10 倍 镜 下 沿 着 脑 片 锥 体 细 胞 线 找 到 海 马 CA1 与 CA3 区 域, 然 后 换 成 40 倍 镜 观 察 细 胞, 通 过 红 外 微 分 干 涉 显 微 镜 结 合 电 荷 耦 合 摄 像 系 统 可 以 看 到 CA1 与 CA3 神 经 元 立 体 结 构 清 晰, 胞 体 与 突 起 明 显, 胞 体 呈 锥 形 或 椭 圆 形, 死 亡 细 胞 少,CA1 神 经 元 胞 体 相 对 CA3 神 经 元 胞 体 较 小, 选 择 这 两 个 区 域 的 神 经 元 进 行 膜 片 钳 电 生 理 记 录, 高 阻 封 接 顺 利, 见 图 1 ms, 可 以 记 录 到 全 细 胞 跨 膜 总 电 流 变 化 图 形, 外 向 电 流 为 钾 离 子 通 道 电 流, 内 向 电 流 为 钠 离 子 通 道 电 流, 见 图 3 以 去 极 化 电 压 为 横 轴, 以 神 经 元 在 该 刺 激 电 压 时 产 生 的 离 子 电 流 幅 值 为 纵 轴 绘 制 出 离 子 通 道 的 电 流 电 压 (I V) 曲 线, 用 电 流 密 度 代 替 电 流 幅 值 ( 电 流 密 度 = 离 子 电 流 幅 值 / 膜 电 容, 单 位 为 PA/ PF) 计 算 [6] 从 图 4 可 知,CA1 与 CA3 神 经 元 钾 离 子 通 道 激 活 电 压 约 在 -50mV, 随 着 去 极 化 脉 冲 电 压 的 增 加, 电 流 密 度 也 随 着 增 加,CA1 与 CA3 神 经 元 钾 离 子 通 道 电 流 密 度 二 者 之 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (F=4 41,P=0 05), 给 予 不 同 去 极 化 脉 冲 电 压 与 钾 离 子 通 道 电 流 密 度 二 者 之 间 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05);CA1 与 CA3 神 经 元 钠 离 子 通 道 电 流 密 度 约 在 -50mV 激 活 去 极 化,-40mV 后 逐 渐 变 小, 二 者 之 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (F=3 04,P=0 09), 给 予 不 同 去 极 化 脉 冲 电 压 与 钠 离 子 通 道 电 流 密 度 二 者 之 间 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 图 1 红 外 干 涉 显 微 镜 下 观 察 海 马 脑 片 神 经 元 形 态 结 构 特 点 40 A:CA1 神 经 元 ;B:CA3 神 经 元 图 2 海 马 脑 片 CA1 与 CA3 神 经 元 自 发 性 突 触 后 电 流 和 电 流 的 幅 度 及 频 率 A:CA1 神 经 元 自 发 性 突 触 后 电 流 ;B:CA3 神 经 元 自 发 性 突 触 后 电 流 2.2 全 细 胞 膜 片 钳 记 录 2.2.1 电 压 钳 模 式 钳 制 电 位 在 -60mV, 记 录 海 马 CA1 神 经 元 的 自 发 性 突 触 后 电 流 和 CA3 神 经 元 的 自 发 性 突 触 后 电 流, 见 图 2 分 析 其 电 流 的 幅 度 和 频 率,CA1 和 CA3 神 经 元 突 触 后 电 流 幅 度 和 频 率 分 别 为 [(531 10±88 03)PA,n=9],[(305 00± 90 03)PA,n=6] 和 [(0 74±0 15)Hz,n=9], [(1 08±0 12)Hz,n=6], 二 者 之 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (t=1 72,P=0 10;t=1 60,P=0 13) 钳 制 电 位 置 于 -60mV, 从 -60mV 开 始 给 予 20mV 步 阶 脉 冲 去 极 化 刺 激 至 80mV, 每 个 刺 激 时 间 为 200 图 3 在 同 一 神 经 元 上 给 予 不 同 步 阶 脉 冲 刺 激 所 记 录 的 电 流 变 化 左 上 图 : 全 细 胞 电 压 钳 记 录 结 果 ; 右 下 图 : 脉 冲 刺 激 方 波

1074 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 无 统 计 学 意 义 (F=3 57,P=0 06), 见 图 6C 图 5 海 马 脑 片 CA1 与 CA3 神 经 元 的 动 作 电 位 记 录 及 其 幅 度 和 频 率 A:CA1 神 经 元 动 作 电 位 发 放 ;B:CA3 神 经 元 动 作 电 位 发 放 图 4 海 马 脑 片 CA1 和 CA3 神 经 元 钾 离 子 和 钠 离 子 通 道 电 流 的 I-V 曲 线 A: 钾 离 子 通 道 电 流 的 I-V 曲 线 ;B: 钠 离 子 通 道 电 流 的 I-V 曲 线 2.2.2 电 流 钳 模 式 全 细 胞 电 流 钳 模 式 下 记 录 海 马 脑 片 CA1 与 CA3 神 经 元 的 动 作 电 位 放 电 情 况 见 图 5 分 析 CA1 与 CA3 神 经 元 的 动 作 电 位 幅 度 和 频 率, 结 果 显 示 CA1 与 CA3 神 经 元 动 作 电 位 的 幅 度 和 频 率 分 别 为 [(93 19±4 08) mv,n=12], [(101 10±4 42)mV,n=10] 和 [(0 96±0 33) Hz,n=12],[(0 95±0 34)Hz,n=10], 二 者 之 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (t=1 30,P =0 20;t=0 02,P =0 97) 海 马 CA1 与 CA3 神 经 元 静 息 膜 电 位 分 别 为 [(-60 07±0 43)mV,n=12],[(-60 44± 1 39)mV,n=10]; 海 马 CA1 与 CA3 神 经 元 动 作 电 位 峰 峰 间 距 分 别 为 [(4601 00±1785 00)ms,n= 12)],[(3884 00±1654 00)ms,n=10], 二 者 之 间 差 异 均 无 统 计 学 意 义 (t=0 27,P =0 78;t= 0 29,P=0 77) 钳 制 电 位 置 于 -60mV, 以 50PA 步 阶 脉 冲 电 流 从 -650PA 至 50PA, 可 记 录 到 海 马 CA1 与 CA3 神 经 元 动 作 电 位 发 放, 见 图 6A B 取 步 阶 脉 冲 电 流 从 -300PA 到 -50PA 的 动 作 电 位 发 放 数 作 统 计, 结 果 显 示 步 阶 脉 冲 电 流 与 动 作 电 位 发 放 数 二 者 之 间 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05), 海 马 CA1 与 CA3 神 经 元 动 作 电 位 发 放 数 二 者 之 间 差 异 图 6 诱 发 海 马 脑 片 CA1 与 CA3 神 经 元 动 作 电 位 及 其 发 放 数 A:CA1 神 经 元 动 作 电 位 及 其 发 放 ;B:CA3 神 经 元 动 作 电 位 及 其 发 放 ;C: 动 作 电 位 发 放 数 统 计 结 果 (CA1:n=19;CA3:n=13) 3 讨 论 细 胞 培 养 或 急 性 分 离 的 细 胞 可 以 用 于 多 项 实 验 技 术 的 研 究, 却 难 以 运 用 于 膜 片 钳 记 录 研 究 所 需 电

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1075 流, 且 对 神 经 细 胞 离 子 通 道 有 不 同 程 度 的 损 伤, 过 程 复 杂 [7] 离 体 海 马 脑 片 具 有 有 序 排 列 的 神 经 元 和 神 经 纤 维 完 整 的 神 经 解 剖 通 路 定 位 明 显 的 胞 体 突 起 稳 定 的 离 子 通 道 性 质 等 特 点, 易 于 进 行 电 生 理 记 录 操 作, 已 成 为 研 究 神 经 系 统 突 触 可 塑 性 和 神 经 系 统 疾 病 的 良 好 标 本 [8] [9] 研 究 显 示, 离 子 通 道 广 泛 存 在 于 神 经 系 统 中, 与 神 经 系 统 疾 病 ( 如 脑 缺 血 脊 髓 缺 血 癫 痫 及 抑 郁 等 ) 密 切 相 关, 且 有 些 离 子 通 道 在 脑 缺 血 和 癫 痫 的 治 疗 中 发 挥 重 要 的 保 护 作 用 ; 同 时 离 子 通 道 受 体 也 是 一 些 药 物 作 用 的 靶 点 急 性 离 体 脑 片 培 养 是 近 年 发 展 起 来 的 一 种 器 官 培 养 方 法, 相 比 于 传 统 的 体 外 培 养 的 神 经 元, 离 体 脑 片 既 保 留 了 细 胞 的 组 织 结 构, 还 保 留 了 细 胞 与 细 胞 的 内 在 联 系 [10] 更 重 要 的 是, 脑 片 培 养 可 以 模 拟 在 体 生 理 环 境 排 除 了 实 验 中 ph 值 温 度 离 子 浓 度 等 不 利 因 素 的 影 响, 为 研 究 离 子 通 道 的 生 理 特 性 和 药 理 特 性 等 提 供 了 理 想 的 模 型 需 求 [11] 本 实 验 结 果 显 示, 海 马 脑 片 能 够 清 晰 的 观 察 CA1 与 CA3 神 经 元 的 结 构 特 征 和 电 生 理 特 性 结 构 上,CA1 与 CA3 神 经 元 立 体 结 构 清 晰, 树 突 胞 体 明 显 ; 与 CA3 神 经 元 相 比,CA1 神 经 元 顶 树 突 较 长, 树 突 分 支 较 多 形 成 一 个 树 突 树, 胞 体 直 径 较 小 ; 这 些 结 构 特 征 在 急 性 培 养 的 神 经 元 很 难 观 察 到 另 外, CA1 神 经 元 与 CA3 神 经 元 结 构 上 的 异 同 源 于 单 个 神 经 元 内 部 特 性 还 是 区 域 环 路 因 素, 目 前 还 未 完 全 清 楚 [12] 从 本 实 验 结 果 显 示,CA1 与 CA3 神 经 元 自 发 突 触 后 电 流 的 幅 度 达 几 百 甚 至 上 千 PA, 发 放 频 率 约 在 1.0Hz CA1 与 CA3 神 经 元 静 息 膜 电 位 值 均 约 在 -60mV, 未 注 射 去 极 化 电 流 时, 动 作 电 位 的 幅 度 大 约 100mV, 发 放 频 率 在 1~10Hz; 在 给 予 注 射 去 极 化 电 流 时, 动 作 电 位 的 阈 电 位 约 在 -50mV, [13] 这 些 电 生 理 特 性 与 以 往 的 文 献 报 道 相 一 致 钾 离 子 电 流 对 调 节 神 经 元 的 兴 奋 性 至 关 重 要,CA1 与 CA3 神 经 元 钾 离 子 通 道 表 达 特 性 的 不 同 也 许 能 够 解 释 其 放 电 形 式 的 不 同, 这 也 帮 助 理 解 为 什 么 CA1 神 经 元 参 与 癫 痫 样 放 电 事 件 的 发 生 比 CA3 神 经 元 多 综 上 所 述, 制 备 急 性 离 体 海 马 脑 片 能 够 模 拟 在 体 环 境 使 离 子 通 道 性 质 保 持 稳 定,CA1 与 CA3 神 经 元 结 构 及 电 生 理 特 性 的 异 同, 决 定 了 具 有 类 似 而 又 不 同 的 功 能, 为 进 一 步 研 究 与 CA1 和 CA3 神 经 元 相 关 的 神 经 系 统 疾 病 等 提 供 了 理 论 基 础 参 考 文 献 [1] 林 毅 勇, 邵 福 源, 孙 刚, 等. 急 性 缺 氧 对 大 鼠 海 马 神 经 元 N 甲 基 D 天 门 冬 氨 酸 诱 发 电 流 的 影 响 [J]. 中 国 临 床 康 复, 2004,8(4):634-6. [2] NewrzelaD,PahlavanPS,KrugerC,etal.Thefunctiongenome ofca1andca3neuronsundernativeconditionsandinresponse toischemia[j].bmcgenomic,2007,8:370. [3] 杨 李 果, 曾 庆 文, 张 旭 亮, 等.NR1 基 因 敲 除 对 小 鼠 前 额 叶 脑 区 LTP 的 影 响 [J]. 华 东 师 范 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ),2012,47 (1):47-53. [4] MohajeraniMH,SivakumaranS,ZacchiP,etal.Corelatednet workactivityenhancessynapticeficacyviabdnfandtheerk pathwayatimmatureca1 CA3connectionsinthehippocampus [J].PNAS,2007,104(32):13176-81. [5] 雷 革 胜, 万 业 宏, 王 玉 英, 等. 应 用 红 外 可 视 脑 片 膜 片 钳 技 术 研 究 大 鼠 海 马 CA1 神 经 元 电 生 理 特 性 [J]. 第 四 军 医 大 学 学 报, 2004,25(13):1153-6. [6] 张 晓 芸, 王 越, 张 健, 等. 蝎 毒 耐 热 蛋 白 对 大 鼠 海 马 神 经 元 钠 通 道 的 抑 制 作 用 [J]. 生 理 学 报,2007,59(2):278-84. [7] KayAR,KrupaDJ.Acuteisolationofneuronsfromthemature mammaliancentralnervoussystem[j].curprotocneurosci, 2001:Chapter6. [8] 刘 振 伟, 李 立 君, 刘 传 缋. 海 马 脑 片 盲 法 膜 片 钳 全 细 胞 记 录 技 术 [J]. 生 理 学 报,2001,53(5):405-8. [9] 孙 晖, 李 国 超, 谢 敏, 等.P2 受 体 介 导 对 大 鼠 三 叉 神 经 节 神 经 元 电 压 门 控 性 钙 离 子 通 道 的 作 用 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2013,48(3):207-10. [10] 杨 丽 君, 崔 红, 杨 爱 军, 等. 大 鼠 全 脑 脑 片 培 养 及 缺 氧 缺 糖 模 型 的 建 立 [J]. 实 验 动 物 与 比 较 医 学,2009,29(5):283-5. [11] 黄 文 先, 彭 碧 文, 何 小 华. 脑 片 模 型 在 癫 痫 实 验 中 的 应 用 [J]. 武 汉 大 学 学 报 ( 医 学 版 ),2012,33(3):449-52. [12]MizusekiK,RoyerS,DibaK,etal.Activitydynamicsandbe havioralcorelatesofca3andca1hippocampalpyramidalneu rons[j].hippocampus,2012,22(8):1659-80. [13] AndersenP,MorisR,AmaralD,etal.TheHippocampusBook [M].NewYork:OxfordUniversityPres,2007:139-60. Comparativeanalysisofbasicelectrophysiologicalcharacteristics ofhippocampalca1andca3neuronsinmice ZhangYusong 1,ZhuYan 1,2,GuoChengbin 1,etal ( 1 DeptofPhysiology,ColegeofBasicMedicine,AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230032; 2 DeptofPhysiology,BengbuMedicalColege,Bengbu 233000) Abstract Objective Acutemousehippocampalsliceswerepreparedforpatchclamprecordinginordertoobserve

1076 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 兔 MSCs 对 韧 带 移 植 物 骨 道 内 愈 合 影 响 的 光 镜 观 察 刘 靖, 徐 斌, 徐 洪 港, 王 瑞, 涂 俊 摘 要 目 的 探 讨 兔 自 体 外 周 血 间 充 质 干 细 胞 (MSCs) 对 韧 带 移 植 物 在 骨 道 内 愈 合 的 影 响 方 法 8 只 新 西 兰 白 兔 随 机 均 分 为 实 验 组 和 对 照 组 粒 细 胞 刺 激 因 子 动 员 各 组 兔 后, 抽 取 外 周 血 分 离 纯 化 培 养 干 细 胞 实 验 组 移 植 入 MSCs 和 生 物 蛋 白 胶 混 合 物 ; 对 照 组 移 植 入 生 物 蛋 白 胶 分 别 于 2 4 8 12 周 4 个 时 间 点 每 组 各 处 死 1 只 兔 行 形 态 学 观 察, 术 后 4 个 时 间 点 对 两 组 标 本 进 行 高 倍 镜 下 成 纤 维 细 胞 计 数, 采 用 单 向 方 差 分 析 及 SNK 法 检 验, 比 较 韧 带 重 建 术 后 移 植 肌 腱 与 骨 道 愈 合 情 况 结 果 术 后 8 周 实 验 组 移 植 肌 腱 与 骨 道 界 面 连 接 紧 密, 出 现 Sharpey 纤 维 及 软 骨 移 行 带, 术 后 12 周 对 照 组 出 现 Sharpey 纤 维, 但 连 接 组 织 中 胶 原 排 列 紊 乱 实 验 组 与 对 照 组 在 4 个 时 间 点 高 倍 镜 下 成 纤 维 细 胞 计 数 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 结 论 MSCs 能 促 进 韧 带 重 建 术 后 移 植 肌 腱 在 骨 道 内 愈 合 关 键 词 间 充 质 干 细 胞 ; 膝 关 节 ; 韧 带 ; 移 植 物 ; 愈 合 中 图 分 类 号 R686 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1076-04 随 着 国 民 健 身 意 识 不 断 加 强, 交 叉 韧 带 损 伤 越 来 越 多 见 交 叉 韧 带 是 膝 关 节 重 要 的 静 力 稳 定 结 构, 损 伤 后 难 以 自 愈 且 治 疗 难 度 较 大, 如 不 及 时 治 疗 或 治 疗 不 当, 随 之 出 现 膝 关 节 不 稳, 关 节 其 他 韧 带 松 2014-04-18 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :1208085MH157) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 骨 科 四 病 区, 合 肥 230022 作 者 简 介 : 刘 靖, 男, 硕 士 研 究 生 ; 徐 斌, 男, 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail: youchen100@126.com 弛, 半 月 板 损 伤, 关 节 软 骨 退 变 等 并 发 症, 导 致 膝 关 节 退 变 及 骨 性 关 节 病 的 早 期 发 生 [1-3] 目 前 主 要 手 术 方 式 为 膝 关 节 镜 下 自 体 软 组 织 移 植 物 ( 绳 肌 半 腱 肌 股 薄 肌 等 ) 前 交 叉 韧 带 重 建 术 随 着 微 创 [4] 技 术 的 不 断 发 展, 该 手 术 方 式 日 益 成 熟, 但 文 献 报 道, 其 失 败 率 仍 为 0 7% ~10 0%, 骨 道 内 愈 合 不 良 是 导 致 失 败 的 重 要 原 因 之 一 目 前, 关 于 移 植 肌 腱 在 骨 道 内 愈 合 的 研 究 愈 来 愈 多, 包 括 物 理 干 扰 生 理 机 械 刺 激 骨 替 代 材 料 填 充 骨 膜 移 植 物 生 长 因 子 和 基 因 治 疗 组 织 工 程 技 术 及 干 细 胞 移 植 等 [5] 随 着 组 织 工 程 技 术 的 日 益 成 熟, 间 充 质 干 细 胞 (mes enchymalstem cels,mscs) 促 进 骨 道 内 愈 合 的 研 究 尤 为 突 出 1 材 料 与 方 法 1.1 MSCs 的 分 离 培 养 及 鉴 定 粒 细 胞 刺 激 因 子 动 员 后, 抽 取 兔 外 周 血 5ml, 采 用 密 度 梯 度 离 心 法 分 离 细 胞 接 种 到 5ml 完 全 培 养 基 中,37 5%CO 2 恒 温 箱 中 培 养,48~72h 后, 首 次 换 液, 以 后 每 72h 换 液 1 次, 观 察 细 胞 形 态 及 生 长 情 况, 待 细 胞 呈 涡 旋 状 生 长 并 达 90% 时 进 行 传 代 培 养 取 第 3 代 生 长 旺 盛 细 胞 行 MSCs 表 面 抗 原 CD11b CD34 CD29 CD90 检 测 1.2 动 物 模 型 的 建 立 及 分 组 8 只 兔 随 机 均 分 为 实 验 组 和 对 照 组 麻 醉 消 毒 铺 巾 后 取 出 趾 长 屈 肌 腱, 将 肌 腱 对 折, 对 折 后 其 直 径 为 (2 5±0 3)mm, thebasicelectrophysiologicalpropertiesofhippocampalca1andca3neurons.methods Thestructureproperties andbasicelectrophysiologicalpropertiesofmousehippocampalsliceswereobservedandrecordedbyinfrareddifer entialinterferencecontrasttechniqueandpatchclamp,respectively.results Thehippocampalslicestructurewas observedclearlywithhealthyglosandfewdeadneurons,andthehippocampalneuronsweresealedeasilywith patchclamptechnique.thespontaneousdischargecurentandactionpotentialbetweenca1andca3neuronsdid notshowsignificantdiferencesinamplitude,frequency,interspike intervalsandrestingmembranepotentials.the curentdensityofsodium andpotasium ionwheninjectingpulsestimulationsandtheactionpotentialnumbers wheninjectingstepcurentsshowedsignificantdiferencesinca1andca3neurons(p<0 05).Conclusion SomebasicelectrophysiologicalpropertiesofhippocampalCA1andCA3neuronsprovidecertaintheoreticalbasisfor memoryandnervediseasesresearch. Keywords patchclamp;mouse;brainslices;hippocampalneurons;electrophysiology

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1077 长 度 为 (6 2±0 3)mm, 对 折 肌 腱 两 游 离 端 用 无 菌 1 0 缝 线 缝 合, 折 叠 处 用 0 25mm 钢 丝 穿 过 后 备 用 再 从 髌 旁 内 侧 入 路, 以 髌 骨 为 中 心, 作 长 约 2 5cm 的 切 口, 依 次 切 开 皮 肤, 筋 膜, 关 节 囊 及 内 侧 支 持 带, 将 髌 骨 外 翻 脱 位, 切 除 脂 肪 垫, 显 露 前 交 叉 韧 带 切 除 前 交 叉 韧 带 (anteriorcruciateligament,acl) 股 骨 及 胫 骨 上 下 止 点 并 作 标 记, 用 与 肌 腱 直 径 相 匹 配 的 手 摇 钻 (2.5mm 克 氏 针 ) 于 标 记 处 分 别 钻 取 胫 骨 及 股 骨 隧 道, 将 移 植 物 通 过 两 端 的 牵 引 钢 丝 及 缝 线 引 入 骨 隧 道, 在 股 骨 隧 道 终 点 外 侧 以 1.0mm 克 氏 针 从 外 向 内 钻 两 个 间 隔 0.3cm 单 皮 质 骨 道, 将 钢 丝 两 端 穿 过 骨 道 后 固 定 于 股 骨 内 侧, 再 用 1.0mm 克 氏 针 在 胫 骨 结 节 稍 偏 下 的 皮 质 骨 上 钻 孔, 将 缝 线 穿 孔 而 过 后 屈 膝 30 拉 紧 韧 带 固 定 反 复 冲 洗 股 骨 道 内 残 留 的 血 迹, 在 股 骨 隧 道 外 口 附 近, 按 照 分 组 设 计 注 入 胶 体 ( 实 验 组 移 植 入 MSCs 和 生 物 蛋 白 胶 混 合 物, 对 照 组 移 植 入 生 物 蛋 白 胶 ), 逐 层 缝 合 切 口 屈 膝 30 位 石 膏 固 定 术 肢, 术 后 预 防 感 染 1.3 标 本 处 理 及 组 织 学 观 察 分 别 于 术 后 2 4 8 12 周 各 组 处 死 1 只 兔, 解 剖 膝 关 节 并 于 膝 关 节 上 下 各 2.0cm 离 断 完 整 保 留 膝 关 节 标 本 固 定 脱 钙 后 制 成 石 蜡 切 片,HE 染 色 后 行 形 态 学 观 察 1.4 统 计 学 处 理 采 用 SPSS13 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 比 较 ACL 重 建 术 后 4 个 时 间 点 高 倍 镜 下 腱 - 骨 界 面 成 纤 维 细 胞 计 数 2 结 果 2.1 MSCs 的 生 物 学 特 性 原 代 细 胞 在 开 始 培 养 时 没 有 贴 壁, 散 在 分 布 于 培 养 瓶 瓶 底, 细 胞 呈 圆 形, 没 有 突 起, 胞 体 透 亮, 折 光 性 好, 核 呈 卵 圆 性 随 着 培 养 时 间 的 延 长, 细 胞 慢 慢 开 始 贴 壁, 少 部 分 呈 集 落 生 长, 细 胞 有 少 量 突 起, 胞 质 内 颗 粒 增 多, 折 光 性 差, 核 较 大 且 不 清 楚, 呈 扁 圆 形 培 养 48~72h 后, 贴 壁 细 胞 两 端 伸 出 伪 足, 绝 大 部 分 呈 形 态 均 一 的 短 梭 形 首 次 换 液 后 细 胞 贴 壁 及 增 生 速 度 加 快, 后 可 见 明 显 集 落 形 成, 细 胞 克 隆 样 生 长, 细 胞 形 态 均 一, 呈 长 梭 形, 融 合 排 列 成 漩 涡 状 待 培 养 11~14d 细 胞 已 基 本 贴 满 瓶 底 就 可 以 传 代 了, 胰 酶 消 化 的 细 胞 呈 圆 形 且 胞 体 透 亮, 折 光 性 好, 传 代 接 种 后 细 胞 贴 壁 及 克 隆 样 增 生 更 加 迅 速, 形 态 更 加 均 一, 均 呈 成 纤 维 长 梭 形 外 观 2.2 组 织 标 本 观 察 2.2.1 膝 关 节 标 本 大 体 观 察 每 组 分 别 于 术 后 2 4 8 12 周 处 死 1 只 兔, 兔 膝 关 节 切 口 愈 合 良 好, 无 感 染, 有 明 显 关 节 腔 积 液, 滑 膜 大 量 增 生, 软 骨 无 明 显 损 伤 移 植 肌 腱 结 构 完 整, 色 泽 较 正 常 肌 腱 暗 淡, 呈 淡 红 色, 张 力 可, 无 松 弛, 无 坏 死 及 断 裂, 移 植 肌 腱 两 端 与 骨 隧 道 愈 合 良 好 2 周 时 股 骨 隧 道 外 口 间 隙 仍 可 见 少 量 胶 体,4 周 时 股 骨 隧 道 外 口 间 隙 无 胶 体, 股 骨 隧 道 内 口 可 见 少 量 瘢 痕 组 织 及 骨 组 织,8 周 时 股 骨 隧 道 外 口 出 现 少 量 骨 样 组 织, 内 口 出 现 大 量 瘢 痕 组 织,12 周 时 骨 道 外 口 可 见 较 多 骨 样 组 织, 移 植 肌 腱 与 隧 道 壁 粘 连 2.2.2 石 蜡 切 片 HE 染 色 1 术 后 2 周 : 对 照 组 : 骨 道 内 界 面 区 连 接 疏 松, 间 隙 清 晰 可 辩 界 面 区 可 见 由 少 量 血 管, 成 纤 维 细 胞 和 炎 性 细 胞 组 成 的 新 生 肉 芽 组 织 ( 图 1A2); 实 验 组 : 界 面 区 结 合 亦 不 紧 密, 填 充 组 织 仍 为 血 管, 成 纤 维 细 胞 和 炎 性 细 胞 组 成, 但 出 现 排 列 不 规 整 且 不 成 熟 的 类 软 骨 细 胞 ( 图 1A1) 2 术 后 4 周 : 对 照 组 : 界 面 区 连 接 相 对 较 紧 密, 填 充 组 织 血 管 含 量 少, 成 纤 维 细 胞 和 炎 性 细 胞 增 多, 并 出 现 稀 疏 不 成 熟 类 软 骨 细 胞 ( 图 1B2); 实 验 组 : 界 面 区 连 接 紧 密, 已 无 明 显 界 限, 可 见 炎 性 细 胞 和 成 纤 维 细 胞 及 排 列 不 规 整 类 软 骨 细 胞, 新 生 骨 质 向 肌 腱 长 入, 已 出 现 软 骨 化 骨 过 程 ( 图 1B1) 3 术 后 8 周 : 对 照 组 : 界 面 区 连 接 紧 密, 炎 性 细 胞 减 少, 成 纤 维 细 胞 增 生, 胶 原 纤 维 合 成 增 多, 排 列 方 向 不 规 整 ( 图 1C2); 实 验 组 : 界 面 区 连 接 紧 密, 类 软 骨 细 胞 逐 渐 成 熟, 排 列 较 规 整, 胶 原 纤 维 大 量 合 成, 出 现 与 骨 隧 道 轴 向 垂 直 的 Sharpey 纤 维 及 软 骨 移 行 带 ( 图 1C1) 4 术 后 12 周 : 对 照 组 : 界 面 区 出 现 Sharpey 纤 维, 但 连 接 组 织 中 胶 原 排 列 紊 乱 ( 图 1D2); 实 验 组 : 界 面 区 可 见 到 大 量 排 列 有 序 的 Sharpey 纤 维 及 规 整 排 列 的 类 软 骨 细 胞 ( 图 1D1) 2.3 腱 骨 界 面 成 纤 维 细 胞 计 数 术 后 4 个 时 间 点 对 两 组 标 本 进 行 腱 - 骨 界 面 高 倍 镜 下 (HE 染 色 ) 成 纤 维 细 胞 计 数, 见 表 1, 每 个 标 本 取 3 个 高 倍 镜 视 野, 每 组 4 个 时 间 点 各 12 个 高 倍 镜 视 野 方 差 分 析 结 果 显 示 两 组 在 4 个 时 间 点 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=30 91,P<0 05) 3 讨 论 3.1 界 面 愈 合 的 止 点 结 构 特 点 及 组 织 学 转 归 移 植 物 在 关 节 腔 里 经 历 了 缺 血 坏 死 再 血 管 化 细 胞 增 殖 和 塑 形 韧 带 化 等 过 程 移 植 物 在 骨 道 内 愈 合 分 为 两 种 方 式, 即 直 接 止 点 和 间 接 止 点 [6] 直 接 止 点, 类 似 于 正 常 交 叉 韧 带 的 过 渡 形 式, 其 特 征 性 结 构 是 移 行 的 纤 维 软 骨 带, 从 韧 带 向 止 点 分 别 是 韧 带 纤

１７８ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ A1 B1 C1 D1 A2 B2 C2 D2 图 １ 术后 ４个时间点腱 骨界面区 ＨＥ １ １ 实验组 ２ 对照组 Ａ ２周 Ｂ ４周 Ｃ ８周 Ｄ １ ２周 组别 实验 对照 表 １ 术后两组标本 ＨＥ染色界面区成纤维细胞计数 于外源基因的转染及表达调控等特点使其成为理想 珋±ｓ 的比较 ｎ ８ 个 ｘ 的组织工程种子细胞而用于骨道内肌腱移植物愈合 时间 ２周 ４周 ８周 １２周 １２ ５８±１ ６５ １５ ３５±２ １２ １８ ６２±３ ４６ １４ ６８±２ ５２ ３ ４９±１ ５６ ５ ６５±１ ５８ ７ ３２±１ ２８ ４ ９５±１ ６８ 研究中 Ｌ ｍ ａ ｌ １８ 使用 绳肌自体移植物行兔 ｓ被植入生物蛋白胶 双侧 ＡＣＬ重建 实验组 ｂｍｃｓ 对照组中则为空白纤维蛋白胶 结果显示 ｂｍｃｓ ｓ改 善了愈合过程并促进了生物性能的提高 本实验考 与对照组比较 Ｐ ５ 虑到 ＭＳＣｓ是多种间充质细胞的前体细胞 在体内 维软骨 钙化软骨及骨 在钙化软骨和纤维软骨之间 ７ ８ 或体外特定的诱导条件下 可分化为脂肪 骨 软骨 其止点的特有的四层移行结 肌肉 肌腱 韧带 神经 肝 心肌 内皮等多种组织细 构决定了其传递 缓冲应力 降低负荷 还在移植物 胞 理论上可以促进骨 肌腱结合部多种细胞的增 有 潮线 相隔 的生长塑形中的重要作用 ９ １ １ 间接止点其特点 生 从而促进界面愈合 为肌腱与骨组织间形成的穿透性的胶原纤维 走向 参考文献 通常与骨隧道轴向垂直 这种胶原纤维为 Ｓｈａ ｒ ｐ ｙ 样纤维 是肌腱与骨形成连接的一个重要标志 理 想的韧带重建愈合止点应为直接止点 而交叉韧带 重建术后愈合多为间接愈合 但众多学者观点不一 １ ２ Ｒｏ ｄ ｏ ａ ｌ 在狗趾长伸肌的上止点移植到胫骨近 １ Ｐｒ ｏ ｃ ｈ ｏ ｐｄｊ Ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗｓ ｒ ｏ ｍａ ｌｃ ｌ ｌａ ｓｓ ｍｃ ｌ ｌ ｓｆ ｏ ｒｎ ｏ ｎ ｈ ｍａ ｏ ｐ ｃ ｓ ｓ ｕ Ｊ Ｓｃ ｎ ｃ １ ９ ９ ７ ２ ７ ６ ５ ３ ９ ７ １ ４ ２ Ｐ ｎ ｇ Ｍ Ｆ Ｍａ ｃ ｋａ ｙａｍ Ｂ ｋｓｃ ａ ｌ Ｍｕｌ ｌ ｎ ａ ｇ ｐ ｏ ｎ ａ ｌ ｏ ｆａ ｄｕ ｌ ｈ ｕｍａ ｎｍ ｓ ｎｃ ｈ ｙ ｍａ ｌｓ ｍｃ ｌ ｌ ｓ Ｊ Ｓｃ ｎ ｃ １９ ９ ９ ２８ ４ ５ ４ １ １ １ ４ ３ ７ 端的骨隧道研究中 发现愈合界面为间接止点 而 ３ Ｄａ ｖ ｓｐｙ Ｆｒ ａ ｚ ｒｃｒ Ｓ ｈａ ｐ ｒ ｏｊｒ ａ ｌ Ａｇ ｒ ａ ｌ ａ ｄｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｓ ｎ １ ３ Ｐａ ｎｎ ａ ｌ 在兔自体骨 髌腱 骨重建兔 ＡＣＬ中 ｆ ｆ ｃ ｓｏ ｆ ｎ ｓ ｕ ｌ ｎｌ ｋ ｇ ｒ ｏ ｗ ｈｆ ａ ｃ ｏ ｒｏ ｎｈ ｕｍａ ｎｏ ｓ ｏ ｂ ｌ ａ ｓ ｌ ｋ ｃ ｌ ｌ ｓ Ｊ Ｂ ｏ ｃ ｈ ｍｊ １９ ９ ７ ３ ２ ４ ３ ７ ５ ３ ６ 发现愈合界面为直接接止点 ３ ２ ＭＳＣｓ对骨道内移植肌腱愈合的影响 近年 来 国内外学者 １４ １５ 发现多种因素可促进界面区愈 合 陈鸿辉 等 １４ 发现低强度超声及功能性电刺激 可使骨 软骨等多种细胞增生 从而促进纤维软骨带 １ ５ 重建及新骨形成 Ｐａ ｎ ａ ｌ 发现带有 ＢＭＰ的注 射用磷酸钙对兔 ＡＣＬ重建后骨道内肌腱移植物愈 合有促进作用 国外研究者 １６ １７ 发现软骨可能增 ４ 王俊良 ＢＭＰ ２和 ＨＧＦ基因修饰的自体 ＭＳ Ｃｓ促进腱骨愈合 的研究 Ｄ 中国人民解放军军医进修学院 ２ １ ２ ５ 蒋略韬 李永刚 关于促进前交叉韧带重建术后腱骨愈合的研 现代医学 ２ １ ３ ４ １ ８ ５８ ４ ９ 究进展 Ｊ ６ Ｆｒ ｄｍａ ｎｋｂ Ｄ Ａｍａ ｏｍ Ｊ Ｎ ｄ ｆ ｆｄｄ ａ ｌ Ａｒ ｈ ｒ ｏ ｓ ｃ ｏ ｐ ｃａ ｎ ａａ ｎａ ｌ ｙ ｓ ｓｃ ｏ ｍｐ ａ ｒ ｎ ｇ ｒ ｏ ｒｃ ｒ ｕｃ ａ ｌ ｇ ａ ｍ ｎ ｒ ｃ ｏ ｎ ｓ ｒ ｕｃ ｏ ｎ ａｍ ｐａ ｌ ｌ ａ ｒ ｎ ｄｏ ｎａ ｎ ｄｈａ ｍｓ ｒ ｎ ｇ ｎ ｄｏ ｎａ ｕ ｏ ｇ ｒ ａ ｆ ｓ Ｊ Ａｍ ＪＳ ｐ ｏ ｒ ｓ Ｍ ｄ ２ ３ ３ １ １ ２ １ １ ７ Ｄｏ ｂｓ ｏ ｎｋｒ Ｒ ａ ｄ ｎ ｇｌ Ｈａ ｂ ｒ ｙｍ ａ ｌ Ｃ ｎ ｒ ｆ ｕ ｇ ａ ｌ ｓ ｏ ｌ ａ ｏ ｎｏ ｆ 强骨 肌腱结合部移行区的再生 ＭＳＣｓ因具有强 ｂｏ ｎ ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗｆ ｒ ｏ ｍｂｏ ｎ ａ ｎ ｍｐｒ ｏ ｖ ｄｍ ｈ ｏ ｄｆ ｏ ｒ ｈ ｒ ｃ ｏ ｖ ｒ ｙａ ｎ ｄ 大的增殖能力 多向分化潜能 取材方便 损伤小 便 ｑｕ ａ ｎ ａ ｏ ｎｏ ｆｂ ｏ ｎ ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗｏ ｓ ｏ ｇ ｎ ｏ ｒｃ ｌ ｌ ｓｆ ｒ ｏ ｍｒ ａ ｂ ａ ａ ｎ ｄ

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1079 femurae[j].calciftisueint,1999,65(5):411-3. [8] ColterDC,ClasR,DicirolaroCM,etal.Rapidexpansionof recyclingstemcelsinculturesofplastic adherentcelsfrom hu manbonemarow[j].procnatlacadsciusa,2000,97(7): 3213-8. [9] BolnoPB,MorganD,WechslerA.Chemokineinducedmigration ofhumanmesenchymalstemcels:astrategyfordirectingcardiac repair[j].cardiothoracicsurgeryi,2004,199(3s):s33. [10] JagerM,WildA,FusM,etal.Advantagesofbiomatricesinchon drogenesisofpluripotentmesenchymalstem cels[j].zorthop IhreGrenzgeb,2002,140(6):681-9. [11] 李 景 红, 杜 江, 黄 金 中. 软 骨 组 织 工 程 种 子 细 胞 来 源 的 最 新 研 究 进 展 [J]. 中 国 临 床 康 复,2003,7(23):3240-1. [12] RodeoSA,ArnoczkySP,TorzililiPA.Tendon healinginabone tunnel.abiomechanicalandhistologicalstudyinthedog[j].j BoneJointSurgAm,1993,75(12):1795-803. [13] PanniAS,MilanoG,LucaniaL,etal.Grafthealingafteranterior cruciateligamentreconstructioninrabbits[j].clinorthop,1997, 343(10):203-12. [14] 陈 鸿 辉, 杨 小 红, 王 文, 等. 物 理 疗 法 促 进 髌 骨 - 髌 腱 结 合 部 损 伤 早 期 恢 复 的 实 验 研 究 [J]. 中 华 物 理 医 学 与 康 复 杂 志, 2006,28(5):291-4. [15]PanW,WeiY,ZhouL,etal.Comparativeinvivostudyofinject ablebiomaterialscombinedwithbmpforenhancingtendongraft osteointegrationforanteriorcruciateligamentreconstruction[j].j OrthopRes,2011,29(7):1015-21. [16] WongMW,QinL,LeeKM,etal.Healingofbonetendonjunction inabonetrough:agoatpartialpatelectomymodel[j].clinor thoprelatres,2003,8(413):291-302. [17]WongMW,QinL.Engineeredalogeneicchondrocytepeletforre constructionoffibrocartilagezoneatbonetendonjunctionaprelim inaryhistologicalobservation[j].jbiomedmaterresbapplbio mater,2004,70(2):362-7. [18]LimJK,HuiJ,LiL,etal.Enhancementoftendongraftosteointe grationusingmesenchymalstemcelsinababbitmodelofanterior cruciateligamentreconstruction[j].arthroscopy,2004,20(9): 899-910. ThemorphologyofefectsofMSCsforhealingofthe graftofligamentinthebonetunnel LiuJing,XuBin,XuHonggang,etal (DeptofOrthopaedicsSurgery,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022) Abstract Objective Toinvestigatewhetherautogenousperipheralbloodmesenchymalstem celsgelcouldpro motethehealingofthegraftofligamentinthebonetunnel.methods 8NewZealandwhiterabbitswererandomly dividedintoexperimentalandcontrolgroup.aftermobilizeingwithgranulocytecolony stimulating,autogenouspe ripheralbloodmesenchymalstemcelswereisolatedandculturedinvitro.fortheexperimentalgroup,autogenous peripheralbloodmesenchymalstemcelsgelwasinjectedintothethefemurroadtipclearanceoftheaclrecon structionmodel;forthecontrolgroup,onlyfibringluewaswereinjectedinto.respectively,in2ndweek,4thweek, 8thweek,12thweek,onerabbitofeachgroupwassacrificedformorphologyandthenumberoffibroblastswas countedattendon boneinterfacewithhestainingunderhighmagnificationmicroscopetoinvestigatewhetherautog enousperipheralbloodmesenchymalstemcelsgelcouldpromotethehealingoftendon boneinterfaceafterligament reconstruction.results Fortheexperimentalgroup,in8thweek,tendon boneinterfaceconnectionwastight,the interfacialregionshowedalargeorderlyarangementofsharpeyfibersandchondrocyte likecels,forthecontrol group,in12thweek,sharpeyfiberscouldbefound,butthecolagenfiberwasdisorder.thenumberoffibroblasts wascountedattendon boneinterface,weadoptedone wayanovaandsnktesttoanalyzethenumberoffibro blasts,thediferencebetweenexperimentalandcontrolgroupwasconsideredsignificant(p<0 05).Conclusion Autogenousperipheralbloodmesenchymalstemcelsgelcanpromotethehealingoftendon boneinterfaceafterliga mentreconstruction. Keywords mesenchymalstemcels;knee;ligament;graft;healing

1080 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 高 三 尖 杉 酯 碱 对 急 性 单 核 细 胞 白 血 病 SHI 1 细 胞 株 诱 导 凋 亡 机 制 的 研 究 赵 雨 辰, 杨 明 珍 摘 要 目 的 研 究 高 三 尖 杉 酯 碱 (HHT) 作 用 于 急 性 单 核 细 胞 白 血 病 (AML M5)SHI 1 细 胞 株 的 机 制, 是 否 可 抑 制 SHI 1 细 胞 的 增 殖 诱 导 细 胞 凋 亡 ; 了 解 HHT 对 AML M5SHI 1 细 胞 膜 电 位 的 影 响, 即 其 诱 导 的 细 胞 凋 亡 是 否 通 过 线 粒 体 介 导 的 细 胞 凋 亡 途 径 实 现 方 法 将 不 同 浓 度 (5 10 50 100 500μg/L) 的 HHT 作 用 SHI 1 细 胞, 瑞 氏 染 色 观 察 细 胞 镜 下 形 态 学 改 变 流 式 细 胞 术 AnnexinV FITC/PI 法 检 测 细 胞 凋 亡 CCK 8 法 测 细 胞 增 殖 抑 制 作 用 线 粒 体 膜 电 位 试 剂 盒 ( 线 粒 体 染 料 JC 1 活 细 胞 染 色 ) 检 测 线 粒 体 跨 膜 膜 电 位 (Δψm) 变 化 结 果 HHT 能 有 效 抑 制 SHI 1 细 胞 的 增 殖 诱 导 其 凋 亡, 随 着 药 物 浓 度 的 增 高, 细 胞 凋 亡 率 增 殖 抑 制 率 明 显 增 加 (P<0 05) 流 式 细 胞 仪 线 粒 体 膜 电 位 结 果 表 明,HHT 作 用 后 存 在 明 显 荧 光 变 化, 细 胞 线 粒 体 膜 电 位 下 降, 并 呈 浓 度 相 关 性 结 论 HHT 可 抑 制 AML M5SHI 1 细 胞 株 的 增 殖 诱 导 其 凋 亡, 其 诱 导 细 胞 凋 亡 可 能 是 通 过 线 粒 体 介 导 的 细 胞 凋 亡 途 径 实 现 关 键 词 高 三 尖 杉 酯 碱 ;SHI 1 细 胞 ; 急 性 单 核 细 胞 白 血 病 ; 细 胞 增 殖 ; 细 胞 凋 亡 中 图 分 类 号 R733.71;R979.1+9;R329.2+5 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1080-05 急 性 髓 系 白 血 病 (acutemyeloidleukemia,aml) 是 血 液 系 统 的 克 隆 性 恶 性 疾 病, 急 性 单 核 细 胞 白 血 病 (acutemonocyticleukemia,aml M5) 是 AML 中 预 后 较 差 的 亚 型 复 发 难 治 低 增 生 及 老 年 AML M5 患 者 并 发 症 多 缓 解 率 低 对 化 疗 耐 受 差 或 不 敏 感, 是 血 液 科 治 疗 的 重 点 及 难 点 [1] 高 三 尖 杉 酯 碱 (ho moharingtonine,hht) 是 从 我 国 海 南 植 物 粗 榧 中 提 取 出 的 生 物 碱, 是 我 国 在 世 界 上 首 先 用 于 治 疗 急 性 非 淋 巴 细 胞 白 血 病 (acutenon lymphocyticleukemia, ANLL) 的 药 物, 并 获 得 显 著 疗 效 [2], 早 在 上 世 纪 70 年 代 已 用 于 AML 等 的 治 疗, 临 床 上 常 用 于 治 疗 难 治 [1] 复 发 白 血 病, 研 究 表 明 其 作 用 机 制 与 诱 导 多 种 细 2014-02-25 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 高 等 学 校 省 级 自 然 科 学 研 究 重 点 项 目 ( 编 号 : KJ2011A164) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 血 液 内 科, 合 肥 230022 作 者 简 介 : 赵 雨 辰, 女, 硕 士 研 究 生 ; 杨 明 珍, 男, 教 授, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:yangmz89@163.com [3] 胞 凋 亡 抑 制 DNA 合 成 等 有 关 体 外 实 验 显 示, HHT 对 AML M5SHI 1 细 胞 系 有 明 显 促 凋 亡 作 用 常 规 剂 量 或 浓 度 时, 可 抑 制 真 核 细 胞 蛋 白 质 合 成, 肿 瘤 细 胞 分 裂 指 数 减 少, 瘤 组 织 核 酸 含 量 下 降 [4] 前 [5] 期 体 外 实 验 结 果 显 示,HHT 能 够 抑 制 白 血 病 NB4 细 胞 的 增 殖, 诱 导 凋 亡 该 实 验 拟 对 HHT 促 SHI 1 细 胞 凋 亡 作 用 机 制 作 一 探 讨, 为 HHT 治 疗 难 治 复 发 急 性 白 血 病 提 供 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 1.1.1 细 胞 株 SHI 1 细 胞 为 AML M5 细 胞 株, 由 苏 州 大 学 医 学 院 第 一 附 属 医 院 血 液 科 实 验 室 惠 赠 1.1.2 主 要 试 剂 HHT 购 自 杭 州 民 生 药 业 集 团 有 限 公 司 ; 胎 牛 血 清 购 自 杭 州 四 季 青 公 司 ;RPMI1640 培 养 液 购 自 美 国 Gibco 公 司 ;AnnexinV FITC/PI 试 剂 盒 购 自 南 京 凯 基 生 物 科 技 发 展 有 限 公 司 ;CCK 8 试 剂 盒 线 粒 体 膜 电 位 试 剂 盒 ( 线 粒 体 染 料 JC 1 活 细 胞 染 色 ) 均 购 自 上 海 贝 博 公 司 1.2 方 法 1.2.1 细 胞 培 养 AML M5SHI 1 细 胞 置 于 含 青 霉 素 (100U/ml) 和 链 霉 素 (100g/ml) 及 15% 胎 牛 血 清 的 RPMI1640 培 养 液 中, 于 37 5%CO 2 饱 和 湿 度 培 养 箱 中 培 养,2~3d 传 代 1 次, 细 胞 接 种 后, 每 日 计 数 细 胞 数, 连 续 观 察 7~10d, 在 对 数 坐 标 纸 上 绘 制 细 胞 生 长 曲 线 当 细 胞 形 态 逐 渐 浑 圆, 透 亮, 大 小 均 一, 排 列 整 齐, 确 定 曲 线 基 本 呈 水 平 的 部 分 即 为 指 数 生 长 期 取 处 于 指 数 生 长 期 细 胞 进 行 实 验 1.2.2 瑞 氏 染 色 细 胞 形 态 学 观 察 取 对 数 生 长 期 的 SHI 1 细 胞, 将 浓 度 为 500μg/L 的 HHT 加 入 培 养 体 系, 置 37 5%CO 2 饱 和 湿 度 培 养 箱 培 养 20 h, 普 通 光 镜 下 观 察 对 比 正 常 细 胞 与 药 物 处 理 后 细 胞 形 态 学 变 化 无 菌 操 作 下 收 集 药 物 处 理 后 的 细 胞 ( 密 度 约 为 1 10 6 个 /ml),1000r/min, 离 心 2min, 弃 净 上 清 液, 加 入 约 10μl 胎 牛 血 清, 涂 片, 常 规 瑞 氏 染 色 后 光 镜 下 观 察 细 胞 形 态 学 改 变 并 摄 片 1.2.3 AnnexinV FITC/PI 流 式 细 胞 仪 分 析 取 对 数 生 长 期 SHI 1 细 胞 进 行 实 验 调 整 细 胞 至 适 宜 浓

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1081 度 ( 约 为 5 10 5 /ml) 后, 分 别 用 5 10 50 100 500 μg/lhht 处 理 SHI 1 细 胞, 以 相 同 条 件 下 不 加 药 物 为 对 照 组, 接 种 于 6 孔 板 内, 置 于 37 5%CO 2 饱 和 湿 度 孵 箱 孵 育,20h 后 收 集 细 胞 (1 10 6 /L),PBS 洗 2 次, 加 490μl 结 合 缓 冲 液, 混 匀 后 加 5μlAn nexin V FITC 和 5μlPI 液, 避 光 孵 育 15min, 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 情 况 1.2.4 CCK 8 法 检 测 增 殖 能 力 取 对 数 生 长 期 的 SHI 1 细 胞, 浓 度 调 整 为 5 10 5 /ml, 用 5 10 50 100 500μg/L 不 同 浓 度 HHT 作 用 于 细 胞, 设 对 照 组 ( 不 加 药 ) 和 空 白 对 照 组 ( 只 加 培 养 液, 无 细 胞 ), 每 组 另 设 3 个 复 组, 用 CCK 8 法 ( 具 体 操 作 参 照 试 剂 盒 说 明 书 ) 测 出 相 应 450nm 处 吸 光 度 (A 450 ) 值 实 验 重 复 3 次, 取 平 均 值, 根 据 公 式 : 细 胞 活 力 (%) =A( 加 药 )-A( 空 白 )/A( 对 照 )-A( 空 白 ) 100%, 计 算 细 胞 活 力 1.2.5 线 粒 体 跨 膜 电 位 (Δψm) 检 测 用 100μg/L HHT( 此 浓 度 接 近 24hIC 50 值 ) 及 500μg/L 处 理 SHI 1 细 胞, 无 菌 操 作 下 收 集 药 物 处 理 前 后 细 胞 ( 密 度 约 为 1 10 6 个 /ml), 细 胞 用 JC 1 液 37 孵 育 15 min, 依 照 线 粒 体 膜 电 位 试 剂 盒 说 明 书 步 骤 测 线 粒 体 跨 膜 电 位, 上 流 式 细 胞 仪 用 PI 和 FITC 荧 光 通 道 检 测 1.3 统 计 学 处 理 采 用 GraphPadPrism5 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 两 组 间 比 较 用 非 配 对 t 检 验 进 行 结 果 分 析 2 结 果 2.1 HHT 处 理 前 后 瑞 氏 染 色 细 胞 形 态 学 观 察 光 镜 下 未 经 药 物 作 用 的 SHI 1 细 胞 生 长 状 态 良 好, 呈 中 等 大 小, 排 列 整 齐, 细 胞 呈 圆 型, 胞 质 透 明, 核 圆, 规 则, 胞 质 量 中 等 至 丰 富, 染 灰 蓝 色, 部 分 细 胞 胞 质 中 可 见 少 量 淡 紫 红 色 颗 粒, 细 胞 密 度 较 大 而 经 HHT 作 用 后 的 细 胞 形 态 出 现 不 规 则 胞 质 皱 缩 核 浓 缩 染 色 体 凝 集, 细 胞 破 裂, 细 胞 密 度 明 显 减 少 见 图 1 图 1 药 物 处 理 前 后 细 胞 形 态 学 改 变 瑞 氏 染 色 1000 A: 未 经 药 物 处 理 ;B:500μg/LHHT 处 理 2.2 HHT 对 SHI 1 细 胞 凋 亡 的 影 响 Annexin V FITC/PI 法 实 验 结 果 示 : 浓 度 为 5~500μg/L 的 HHT 处 理 SHI 1 细 胞 20h 后, 与 不 加 药 对 照 组 相 比, 药 物 处 理 后 的 SHI 1 细 胞 凋 亡 率 明 显 升 高, 当 HHT 药 物 浓 度 5 10 50 100 500μg/L 时, 统 计 得 细 胞 凋 亡 率 (%) 分 别 为 :(9 12±0 780) (11 23± 0 956) (14 60±0 867) (30 29±1 335) (42 61± 1 393)[ 不 加 药 对 照 组 细 胞 凋 亡 率 (4 11±0 863)], 且 随 药 物 浓 度 的 升 高, 细 胞 凋 亡 率 增 加, 表 现 为 一 定 的 剂 量 依 懒 性 (P<0 05) 见 表 1 图 2 图 2 不 同 浓 度 HHT 作 用 SHI 1 细 胞 20h 凋 亡 情 况 A: 不 加 药 对 照 组 ;B:HHT5μg/L 组 ;C:HHT10μg/L 组 ;D:HHT50μg/L 组 ;E:HHT100μg/L 组 ;F:HHT500μg/L 组

1082 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 2.3 HHT 对 SHI 1 细 胞 的 增 殖 抑 制 当 HHT 药 物 浓 度 分 别 为 5 10 50 100 500μg/L 时, 酶 标 仪 测 得 450nm 处 平 均 吸 光 值 分 别 为 :0 484 0 478 0 468 0 366 0 327, 空 白 对 照 组 平 均 吸 光 值 为 0 312, 不 加 药 对 照 组 平 均 吸 光 值 为 0 817, 根 据 公 式 计 算 细 胞 活 力 (%) 分 别 为 :(34 18±0 662), (32 92±0 991),(30 90 ±0 633),(10 10 ± 0 654),(2 87±0 550)[ 不 加 药 对 照 组 细 胞 活 力 为 (57 52±0 680)] 提 示 药 物 作 用 后 细 胞 活 力 下 降, 且 在 药 物 浓 度 为 100μg/L(IC 50 值 ) 及 更 高 浓 度 时 开 始 出 现 明 显 下 降 见 表 1 图 3 图 3 不 同 浓 度 (5~500μg/L)HHT 作 用 20h 后 细 胞 活 力 表 1 不 同 浓 度 HHT 作 用 SHI 1 细 胞 20h 的 凋 亡 率 和 增 殖 抑 制 (%, x±s) 珋 组 别 凋 亡 率 (n=5) 增 殖 抑 制 ( 细 胞 活 力,n=6) 不 加 药 对 照 4.11±0.863 57.52±0.680 HHT 处 理 (μg/l) 5 9.12±0.780 34.18±0.662 10 11.23±0.956 32.92±0.991 50 14.60±0.867 30.90±0.633 100 30.29±1.335 10.10±0.654 500 42.61±1.393 2.87±0.550 与 不 加 药 对 照 组 比 较 : P<0.05 2.4 HHT 作 用 细 胞 后 线 粒 体 膜 电 位 变 化 流 式 细 胞 仪 结 果 示,HHT 药 物 作 用 后 出 现 明 显 荧 光 变 化, 细 胞 线 粒 体 膜 电 位 下 降 当 HHT 浓 度 为 100 500 μg/l 时, 线 粒 体 膜 电 位 降 低, 早 期 细 胞 凋 亡 率 分 别 为 18 12% 及 30 77%, 较 不 加 药 对 照 组 细 胞 ( 凋 亡 率 0 73%) 明 显 升 高 细 胞 凋 亡 的 百 分 率, 即 An nexin VFITC/PI 阳 性 和 线 粒 体 膜 电 位 下 降 的 细 胞 百 分 率 是 相 近 的, 提 示 HHT 诱 导 细 胞 凋 亡 可 能 与 线 粒 体 膜 电 位 下 降 有 关 见 图 4 3 讨 论 AML 是 造 血 干 祖 细 胞 的 恶 性 克 隆 性 疾 病, 发 病 时 骨 髓 中 异 常 的 原 始 及 幼 稚 细 胞 ( 白 血 病 细 胞 ) 大 量 增 殖, 抑 制 正 常 造 血, 并 广 泛 浸 润 肝 脏 脾 脏 淋 巴 结 细 胞 增 殖 失 控 分 化 障 碍 和 凋 亡 受 阻 是 白 血 病 细 胞 的 基 本 特 征, 诱 导 分 化 和 凋 亡 疗 法 已 成 为 白 血 病 的 两 个 治 疗 策 略 [5] 细 胞 凋 亡 是 细 胞 的 一 种 生 理 性 死 亡 过 程, 凋 亡 的 发 生 是 通 过 一 系 列 复 杂 的 信 号 传 导 通 路 和 基 因 的 调 控 多 种 刺 激 因 素 共 同 作 用 的, 多 种 抗 肿 瘤 药 物 都 能 诱 导 细 胞 的 凋 亡 [1] 线 粒 体 是 细 胞 凋 亡 调 控 网 络 中 重 要 的 细 胞 器, 是 早 期 细 胞 凋 亡 的 标 志 [6] 大 多 数 凋 亡 信 号 通 过 诱 导 线 粒 体 膜 通 透 性 转 运 通 道 (mitochondrialpermeability transitionpore,mpt) 的 开 放 或 线 粒 体 肿 胀 导 致 线 粒 体 膜 电 位 下 降, 允 许 线 粒 体 呼 吸 链 蛋 白 细 胞 素 C 凋 亡 诱 导 因 子 (apoptosis inducingfactor,aif) 从 线 粒 体 释 放 到 胞 质 [7] HHT 能 够 抑 制 G 1 和 G 2 蛋 白 的 合 成, 诱 导 细 胞 分 化, 促 进 细 胞 凋 亡 [8] 刘 佳 宁 等 [9] [10] 任 艳 玲 等 研 究 发 现,HHT 的 作 用 机 制 与 诱 导 多 种 细 胞 凋 亡 抑 制 DNA 合 成 等 有 关 亦 有 [11] 实 验 显 示,HHT 单 药 即 可 以 一 种 剂 量 依 赖 的 方 式 抑 制 THP 1 细 胞 及 Kasumi 细 胞 的 生 长, 诱 导 上 述 细 胞 的 凋 亡 HHT 能 够 显 著 下 调 PI3K 基 因 的 表 图 4 JC 1 活 细 胞 染 色 线 粒 体 膜 电 位 A: 不 加 药 对 照 组 ;B:HHT100μg/L 组 ;C:HHT500μg/L 组

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1083 [12-14] 达 研 究 显 示, 许 多 BCL 2 家 族 成 员 和 AKT 及 JAK/STAT 信 号 通 路 在 HHT 介 导 的 抗 白 血 病 细 [3] 胞 过 程 中 起 着 一 定 的 作 用 苏 州 大 学 陈 苏 宁 等 通 过 对 1 例 AML M5b 患 者 的 骨 髓 细 胞 进 行 体 外 传 代 培 养, 建 立 了 国 内 第 1 个 人 单 核 细 胞 白 血 病 细 胞 系, 该 细 胞 倍 增 时 间 约 为 36h, 以 t(6;l1)(q27; q23) MLL AF6 融 合 基 因 及 del(17)(p11) 和 p53 基 因 异 常 为 主 要 特 征, 命 名 为 SHI 1 本 实 验 研 究 显 示,HHT 在 5~500μg/L 范 围 内 可 有 效 抑 制 AML M5 细 胞 株 SHI 1 细 胞 的 增 殖,5μg/L 的 HHT 即 可 特 异 诱 导 SHI 1 细 胞 凋 亡 随 着 药 物 浓 度 的 增 加, 细 胞 早 期 凋 亡 率 相 应 增 高, 细 胞 活 力 明 显 下 降, 呈 现 较 好 的 剂 量 效 应 关 系 细 胞 凋 亡 形 态 在 电 镜 下 表 现 为 细 胞 核 皱 缩, 核 染 色 质 浓 缩 呈 块 状 边 聚 于 核 膜 下, 核 仁 消 失 而 在 细 胞 凋 亡 的 过 程 中, 亦 检 测 出 线 粒 体 膜 电 位 的 平 行 下 降, 表 明 SHI 1 细 胞 的 凋 亡 和 增 殖 抑 制 与 线 粒 体 膜 电 位 有 关 以 上 实 验 结 果 初 步 表 明,HHT 诱 导 的 细 胞 凋 亡 很 可 能 是 通 过 线 粒 体 介 导 的 细 胞 凋 亡 途 径 实 现 的, 线 粒 体 介 导 的 细 胞 凋 亡 途 径 可 能 是 HHT 诱 导 AML M5SHI 1 细 胞 凋 亡 的 机 制 之 一 该 结 果 为 HHT 治 疗 难 治 复 发 急 性 白 血 病 提 供 了 一 定 的 理 论 依 据, 此 后 的 相 关 信 号 通 路 及 基 因 水 平 的 研 究 尚 需 进 一 步 实 验 探 讨 参 考 文 献 [1] 吉 宇 莹, 张 王 刚, 陈 银 霞.GHA 预 激 方 案 治 疗 急 性 单 核 细 胞 白 血 病 的 机 制 及 临 床 研 究 [J]. 中 国 实 验 血 液 学 杂 志,2010,18 (1):213-8. [2] 蔡 真, 林 茂 芳,ChristanW, 等. 线 粒 体 膜 电 位 在 高 三 尖 杉 酯 碱 诱 导 T 淋 巴 细 胞 白 血 病 细 胞 Molt3 凋 亡 中 的 作 用 [J]. 中 华 血 液 学 杂 志,2001,22(5):238-40. [3] 陈 苏 宁, 薛 永 权, 张 学 光, 等. 一 株 伴 有 t(6;l1)(q27;q23) 和 p53 基 因 异 常 的 人 单 核 细 胞 白 血 病 细 胞 系 SHI 1 的 建 立 及 鉴 定 [J]. 中 华 血 液 学 杂 志,2005,26(2):94-9. [4] LiuJ,BiG,WenP,etal.Down regulationofcd44contributesto thediferentiationofhl 60celsinducedbyATRAorHMBA[J]. Celular&MolecularImmunology,2007,4(1):59-63. [5] 张 小 雨, 杨 明 珍. 高 三 尖 杉 酯 碱 对 急 性 白 血 病 NB4 细 胞 凋 亡 机 制 的 影 响 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2011,46(9):879-82. [6] 陈 苏 宁, 薛 永 权, 吴 亚 芳, 等. 人 单 核 细 胞 白 血 病 细 胞 系 SHI 1 的 诱 导 分 化 和 凋 亡 [J]. 白 血 病 淋 巴 瘤,2006,15(6):408-11. [7] HildemanDA,MitchelT,TeagueTK,etal.Reactiveoxygen speciesregulateactivation inducedt celapoptosis[j].immunity, 1999,10(6):735-44. [8] LiP,NijhawanD,BudihardjoI,etal.CytochromeCanddATP dependentformationofapa f1/caspase9complexinitiatesanapop toticproteasecascade[j].cel,1997,91(4):479-89. [9] 刘 佳 宁, 毕 高 峰, 林 汝 湘, 等.HL 60 细 胞 高 三 尖 杉 酯 碱 诱 导 后 CD44 表 达 变 化 及 机 制 的 研 究 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2008, 15(18):1361-4. [10] 任 艳 玲, 佟 红 艳. 高 三 尖 杉 酯 碱 联 合 AG490 对 HEL 细 胞 JAK2 STAT5 相 关 信 号 通 路 的 影 响 [J]. 中 国 实 验 血 液 学 杂 志,2011, 19(5):1117-20. [11]ChenR,GuoL,ChenY,etal.HomoharingtoninereducedMcl 1 expresionandinducedapoptosisinchroniclymphocyticleukemia [J].Blood,2011,117(1):156-4. [12]WangL,YouLS,NiW M,etal.β CateninandAKTareprom isingtargetsforcombinationtherapyinacutemyeloidleukemia [J].LeukRes,2013,37(10):1329-40. [13] TongH,RenY,ZhangF,etal.Homoharingtonineafectsthe JAK2 STAT5signalpathwaythroughalterationofproteintyrosine kinasephosphorylationinacutemyeloidleukemiacels[j].eurj Haematol,2008,81(4):259-66. [14]YinS,WangR,ZhouF,etal.Bcl xlisadominantantiapoptotic proteinthatinhibitshomoharingtonine inducedapoptosisinleuke miacels[j].molpharmacol,2011,79(6):1072-83. Inducing apoptosisefectofhomoharringtonineonacutemonocytic leukemiacellineshi 1anditsrelevantmechanism ZhaoYuchen,YangMingzhen (DeptofHematology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022) Abstract Objective Toexploretheefectofhomoharingtonine(HHT)onproliferationandinduceapoptosisof acutemonocyticleukemiacellineshi 1,andwhethertheinductionofapoptosisismediatedbymitochondrialap optosispathway.methods Experimentsweredividedintocontrolandtestgroups(5,10,50,100,500μg/L).The growthinhibitoryrateofshi 1celswasdetectedusingCelCountingKit 8(CCK 8)method,whilethecelapop toticratewasmeasuredbyannexinv FITC/PIusingflowcytometry.Mitochondrialmembranepotentialacrosthe membrane(δψm)wasdeterminedbymitochondrialmembranepotentialasaykitwithjc 1.Results HHTinhibi tedthegrowthofshi 1celsandinducedapoptosisinconcentration dependentmanners(p<0 05).Mitochondrial

1084 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 不 同 浓 度 葡 萄 糖 对 肺 腺 癌 细 胞 PEDF 表 达 的 影 响 金 程 1, 束 军 1, 娄 志 霞 1 2, 沈 继 龙 摘 要 目 的 观 察 不 同 浓 度 葡 萄 糖 对 肺 腺 癌 细 胞 株 A549 中 色 素 上 皮 衍 生 因 子 (PEDF) 表 达 的 影 响 方 法 在 基 础 培 养 液 中, 根 据 加 入 的 葡 萄 糖 浓 度 分 为 : 对 照 组 (5.6mmol/L 葡 萄 糖 ) 甘 露 醇 组 (5 6mmol/L 葡 萄 糖 +25mmol/L 甘 露 醇 ) 高 糖 A 组 (10mmol/L 葡 萄 糖 ) 高 糖 B 组 (20mmol/L 葡 萄 糖 ) 高 糖 C 组 (30mmol/L 葡 萄 糖 ), 进 行 A549 细 胞 培 养, 分 别 于 24 48 96h 后 取 样 : 采 用 半 定 量 RT PCR 法 检 测 不 同 时 间 点 含 不 同 浓 度 葡 萄 糖 组 细 胞 PEDFmRNA 水 平, 用 ELISA 法 检 测 细 胞 培 养 上 清 液 中 和 胞 内 PEDF 蛋 白, 比 较 不 同 组 间 PEDF 表 达 水 平 差 异 结 果 与 对 照 组 相 比, 随 着 葡 萄 糖 浓 度 的 增 加, 各 组 A549 细 胞 PEDF 的 表 达 水 平 有 明 显 下 降 趋 势 (P<0 05), 呈 剂 量 依 赖 性 改 变 ; 随 着 葡 萄 糖 作 用 时 间 的 延 长, 除 RT PCR 检 测 中 的 高 糖 C 组, 及 ELISA 检 测 中 的 高 糖 B 组 外, 各 组 A549 细 胞 PEDF 的 表 达 水 平 有 明 显 下 降 趋 势 (P<0 05), 呈 时 间 依 赖 性 改 变 结 论 高 浓 度 葡 萄 糖 较 长 时 间 作 用 可 能 降 低 肺 腺 癌 细 胞 PEDF 的 表 达 水 平 关 键 词 肺 腺 癌 ; 色 素 上 皮 衍 生 因 子 ; 葡 萄 糖 ; 浓 度 ; 影 响 中 图 分 类 号 R734.2 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1084-04 色 素 上 皮 衍 生 因 子 (pigmentepithelium derived factor,pedf) 是 目 前 已 知 最 强 的 内 源 性 血 管 形 成 抑 2014-04-02 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目 ( 编 号 :1308085MH141); 安 徽 高 等 学 校 省 级 自 然 科 学 研 究 重 点 项 目 ( 编 号 : KJ2011A173); 安 徽 医 科 大 学 科 研 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 : 2010xkj115); 安 徽 医 科 大 学 第 四 附 属 医 院 引 进 人 才 科 研 启 动 基 金 资 助 项 目 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 第 四 附 属 医 院 呼 吸 内 科, 合 肥 230022 2 安 徽 病 原 生 物 学 省 级 实 验 室 和 人 兽 共 患 病 安 徽 省 重 点 实 验 室, 安 徽 医 科 大 学 基 础 医 学 院 病 原 生 物 学 教 研 室, 合 肥 230032 作 者 简 介 : 金 程, 男, 硕 士 研 究 生 ; 束 军, 男, 医 学 博 士, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:j. Shu@126.com [1] 制 剂 研 究 表 明,PEDF 在 各 种 类 型 的 肺 癌 细 胞 [2] 株 中 均 有 表 达 ; 有 报 道 称,PEDF 在 糖 尿 病 性 肾 病 中 分 泌 降 低, 并 且 高 血 糖 是 其 分 泌 下 降 的 直 接 原 因 ; [3] 另 有 报 道 称, 糖 尿 病 患 者 中 肺 癌 的 发 病 率 远 高 于 普 通 人 群 由 此 推 测 较 高 血 糖 浓 度 可 能 对 肺 癌 细 胞 的 发 生 发 展 产 生 影 响, 但 相 关 研 究 尚 未 见 报 道 该 实 验 拟 通 过 体 外 条 件 下 改 变 细 胞 培 养 液 中 葡 萄 糖 的 浓 度, 观 察 不 同 浓 度 的 葡 萄 糖 对 肺 腺 癌 细 胞 PEDF 表 达 的 影 响 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 1.1.1 细 胞 系 A549 细 胞 株 由 安 徽 医 科 大 学 附 属 省 立 医 院 检 验 科 实 验 室 惠 赠 1.1.2 主 要 试 剂 及 仪 器 检 测 PEDFmRNA 的 RT PCR 引 物 购 于 生 工 生 物 ( 上 海 ) 有 限 公 司 ;TRIzol 购 于 美 国 Invitrogen 公 司 ;RT PCR 第 一 链 cdna 合 成 试 剂 盒 购 于 德 国 ThermoScientific 公 司 ;ELISA 试 剂 盒 购 于 上 海 原 叶 公 司 ; 无 糖 型 1640 培 养 液 胎 牛 血 清 购 于 美 国 Gibco 公 司 ; 葡 萄 糖 购 于 美 国 Sigma 公 司 ;DNAMarker(DL2000) 购 于 日 本 TaKaRa 公 司 电 热 恒 温 水 浴 锅 购 于 上 海 天 平 仪 器 厂 ; 超 速 离 心 机 购 于 德 国 Beckman 公 司 ; 超 净 工 作 台 购 于 苏 州 安 泰 空 气 技 术 有 限 公 司 ;165 4000IEF 电 泳 仪 购 于 美 国 Bio Rad 公 司 ;D 801 凝 胶 成 像 分 析 系 统 购 于 江 苏 捷 达 科 技 发 展 有 限 公 司 1.2 方 法 1.2.1 细 胞 培 养 复 苏 A549 细 胞, 用 含 100ml/L 胎 牛 血 清 2mmol/L 谷 氨 酰 胺 5 6mmol/L 葡 萄 糖 的 1640 培 养 液 培 养 于 5%CO 2 37 细 胞 培 养 箱, 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 用 于 实 验 1.2.2 实 验 分 组 将 无 糖 型 1640 培 养 液 作 为 细 胞 membranepotentialacrosthemembraneanalysisshowedthatshi 1celssignificantlyshowedanalterationoffluor esenceaftertreatingwithhhtfor20hours,ascomparedwithcontrolgroup.conclusion HHTisabletoinhibit proliferationandinduceapoptosisofshi 1cels,themechanismmaybeasociatedwiththemediationbymitochon drialapoptosispathway. Keywords homoharingtonine;shi 1cel;acutemonocyticleukemia;celproliferation;celapoptosis

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1085 培 养 基 础 液, 按 照 实 验 设 计 分 别 加 入 不 同 浓 度 的 葡 萄 糖 后 分 为 以 下 5 组 :1 对 照 组 : 加 入 5 6mmol/L 葡 萄 糖 ;2 甘 露 醇 组 : 加 入 5.6mmol/L 葡 萄 糖 +25 mmol/l 甘 露 醇 ( 甘 露 醇 作 为 渗 透 压 对 照 );3 高 糖 A 组 : 加 入 10mmol/L 葡 萄 糖 ;4 高 糖 B 组 : 加 入 20 mmol/l 葡 萄 糖 ;5 高 糖 C 组 : 加 入 30mmol/L 葡 萄 糖 分 别 培 养 24 48 96h 后 取 样, 行 后 续 实 验 检 测 1.2.3 细 胞 总 RNA 提 取 及 RT PCR 法 检 测 细 胞 PEDFmRNA 取 细 胞,PBS 洗 2 遍, 消 化 后 800r/ min 离 心 5min, 去 上 清 液, 加 1mlTRIzol, 按 照 TR Izol 法 提 取 总 RNA 逆 转 录 合 成 cdna, 步 骤 依 据 试 剂 盒 说 明 书 进 行 操 作, 最 后 产 物 总 体 积 为 20μl GAPDH 上 游 引 物 序 列 : 5 GATTGTTGCCAT CAACGACC 3, 下 游 引 物 序 列 :5 GTGCAGGATG CATTGCTGAC 3,370bp;PEDF 上 游 引 物 序 列 :5 CTCCTGTCTCCTCTCAGTGTGG 3, 下 游 引 物 序 列 : 5 CGGTCCTCTCTTCATCCAAGTA 3,481bp 扩 增 条 件 为 95 2min,94 30s,63 1 40s,72 40s,72 10min,35 个 循 环 循 环 结 束 后,1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳, 紫 外 透 射 灯 下 观 察 实 验 结 果, 运 用 凝 胶 图 像 扫 描 分 析 系 统, 以 目 的 基 因 片 段 与 GAPDH 片 段 的 条 带 灰 度 值 比 值 作 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 分 析 1.2.4 ELISA 法 检 测 细 胞 内 及 上 清 液 中 PEDF 蛋 白 含 量 取 生 长 状 态 良 好 的 A549 细 胞, 接 种 于 6 孔 板 中 培 养, 按 说 明 书 操 作,ELISA 法 测 定 细 胞 内 和 上 清 液 中 PEDF 蛋 白 的 含 量 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS19 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 计 量 资 料 以 x±s 珋 表 示, 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析, 数 据 两 两 比 较 采 用 SNK 检 验 2 结 果 2.1 RT PCR 检 测 对 照 组 与 甘 露 醇 组 中 A549 细 胞 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 均 较 高, 两 组 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05); 与 对 照 组 或 甘 露 醇 组 相 比, 高 糖 A B C 组 任 一 组 中 A549 细 胞 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 均 较 低, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 相 同 时 间 点, 高 糖 A B C 组 组 间 相 比,A549 细 胞 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 递 减 (P<0 05), 提 示 随 着 葡 萄 糖 浓 度 的 增 加,A549 细 胞 PEDF 表 达 呈 剂 量 依 赖 性 下 降 不 同 时 间 点, 高 糖 A B C 组 组 内 相 比 提 示 : 在 高 糖 A 组 和 高 糖 B 组 中, 随 着 作 用 时 间 的 延 长,A549 细 胞 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 呈 时 间 依 赖 性 下 降, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05); 在 高 糖 C 组 中, 随 着 作 用 时 间 的 延 长,A549 细 胞 PEDF 表 达 亦 呈 时 间 依 赖 性 下 降, 但 48h 和 96h 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 见 图 1~4 bp 700 600 500 400 300 250 M 1 2 3 4 5 图 1 不 同 浓 度 葡 萄 糖 作 用 24h 后 A549 细 胞 中 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 PEDF GAPDH M:Marker;1: 对 照 组 ;2: 甘 露 醇 组 ;3: 高 糖 A 组 ;4: 高 糖 B 组 ;5: 高 糖 C 组 bp 700 600 500 400 300 250 M 1 2 3 4 5 图 2 不 同 浓 度 葡 萄 糖 作 用 48h 后 A549 细 胞 中 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 PEDF GAPDH M:Marker;1: 对 照 组 ;2: 甘 露 醇 组 ;3: 高 糖 A 组 ;4: 高 糖 B 组 ;5: 高 糖 C 组 bp 700 600 500 400 300 250 M 1 2 3 4 5 图 3 不 同 浓 度 葡 萄 糖 作 用 96h 后 A549 细 胞 中 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 PEDF GAPDH M:Marker;1: 对 照 组 ;2: 甘 露 醇 组 ;3: 高 糖 A 组 ;4: 高 糖 B 组 ;5: 高 糖 C 组 2.2 ELISA 检 测 不 同 组 A549 细 胞 培 养 上 清 液 中 和 细 胞 内 PEDF 蛋 白 浓 度 见 表 1 无 论 细 胞 培 养 上 清 液 还 是 细 胞 内 PEDF 蛋 白, 在 对 照 组 与 甘 露 醇 组 中 均 有 较 高 表 达, 两 组 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (P> 0 05); 与 对 照 组 或 甘 露 醇 组 相 比, 高 糖 A B C 组 任 一 组 中 A549 细 胞 PEDF 蛋 白 浓 度 均 较 低, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 相 同 时 间 点, 高 糖 A B C 组 组 间 相 比,A549 细 胞 PEDF 蛋 白 浓 度 递 减 (P< 0 05), 亦 提 示 随 着 葡 萄 糖 浓 度 的 增 加,A549 细 胞 PEDF 表 达 呈 剂 量 依 赖 性 下 降 ( 上 清 液 蛋 白 F 24h =

1086 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 1 不 同 组 A549 细 胞 培 养 上 清 液 中 和 细 胞 内 PEDF 蛋 白 浓 度 (n=3, x±s) 珋 组 别 上 清 液 PEDF(ng/L) 细 胞 内 PEDF(ng/L) 24h 48h 96h 24h 48h 96h 对 照 1406.359±11.486 1395.978±44.881 1319.521±23.037 1314.883±9.733 1294.356±32.984 1318.492±42.916 甘 露 醇 1393.401±11.689 1423.238±16.810 1320.239±16.877 1313.522±23.595 1302.282±38.685 1311.695±6.132 高 糖 A 1281.643±22.497 ab 1210.511±27.114 abe 1126.382±51.940 abef 1241.512±25.417 ab 1082.120±12.429 abe 1016.843±42.626 abef 高 糖 B 1107.296±24.847 abc 1067.593±37.995 abc 965.511±39.965 abcef 979.361±38.710 abc 899.994±24.036 abce 835.552±9.598 abcef 高 糖 C 954.045±19.504 abcd 869.992±26.950 abcde 811.849±10.753 abcdef 810.866±27.525 abcd 737.692±7.440 abcde 669.641±27.611 abcdef 相 同 时 间 点 : 与 对 照 组 比 较 : a P<0 05; 与 甘 露 醇 组 比 较 : b P<0 05; 与 高 糖 A 组 比 较 : c P<0 05; 与 高 糖 B 组 比 较 : d P<0 05; 不 同 时 间 组 内 比 较 : 与 作 用 24h 比 较 : e P<0.05; 与 作 用 48h 比 较 : f P<0 05 图 4 各 组 PEDFmRNA 相 对 含 量 平 均 值 比 较 相 同 时 间 点 : 与 对 照 组 比 较 : a P<0.05; 与 甘 露 醇 组 比 较 : b P< 0 05; 与 高 糖 A 组 比 较 : c P<0.05; 与 高 糖 B 组 比 较 : d P<0 05; 不 同 时 间 点 组 内 比 较 : 与 作 用 24h 比 较 : e P<0 05; 与 作 用 48h 比 较 : f P <0 05 320 877,F 48h =154 686,F 96h =142 170,P<0 05; 细 胞 内 蛋 白 F 24h =216 140,F 48h =155 526,F 96h = 217 535,P<0 05) 不 同 时 间 点, 高 糖 A B C 组 组 内 相 比 提 示 : 除 了 高 糖 B 组 上 清 液 中 PEDF 蛋 白 浓 度 24h 和 48h 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 外, 无 论 细 胞 培 养 上 清 液 还 是 细 胞 内 PEDF 蛋 白, 随 着 作 用 时 间 的 延 长,A549 细 胞 PEDF 蛋 白 浓 度 均 呈 时 间 依 赖 性 下 降, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 3 讨 论 PEDF 是 目 前 已 知 最 强 的 抑 制 血 管 形 成 的 内 源 性 生 物 活 性 因 子, 在 全 身 广 泛 表 达, 其 抑 制 血 管 形 成 的 效 果 是 血 管 他 丁 的 2 倍 内 皮 他 丁 的 7 倍 多 PEDF 与 乳 腺 癌 前 列 腺 癌 骨 肉 瘤 胰 腺 癌 等 肿 瘤 有 密 切 的 关 联 [2] 敲 除 PEDF 基 因, 可 以 促 进 内 皮 细 胞 和 肺 癌 细 胞 A549 的 生 长 ;PEDF 低 表 达 与 肺 癌 较 差 的 预 后 及 淋 巴 转 移 相 关 [4-5] [6] 研 究 提 示, PEDF 蛋 白 可 抑 制 肺 癌 的 生 长 以 及 肿 瘤 血 管 形 成, 因 而 可 能 成 为 治 疗 肺 癌 的 新 策 略 PEDF 表 达 水 平 与 血 糖 浓 度 高 低 也 可 能 存 在 着 一 定 的 联 系 : 在 49 例 健 康 对 照 和 132 例 2 型 糖 尿 病 患 者 中, 用 ELISA 法 检 测 血 清 PEDF 水 平, 结 果 显 示 患 者 血 清 PEDF 水 平 显 著 低 于 健 康 对 照 组 [7] 在 糖 尿 病 性 视 网 膜 病 变 中,PEDF 明 显 减 低 而 血 管 内 皮 生 长 因 子 则 明 显 升 高 [8], 在 糖 尿 病 大 鼠 肾 脏 中, [2] PEDFmRNA 和 蛋 白 质 含 量 均 下 降 体 外 研 究 表 明, 高 血 糖 是 肾 脏 分 泌 PEDF 减 少 的 直 接 原 因 之 一 [9] 研 究 报 道 称, 在 体 外 培 养 人 视 网 膜 色 素 上 皮 细 胞, 通 过 氧 气 含 量 和 葡 萄 糖 浓 度 变 化 检 测 PEDF 表 达 情 况, 结 果 显 示 高 浓 度 葡 萄 糖 直 接 下 调 PEDF 的 表 达 在 2 型 糖 尿 病 患 者 中, 发 生 各 种 恶 性 肿 瘤 的 危 险 性 比 正 常 人 群 增 加 [10] ; 肺 癌 在 2 型 糖 尿 病 患 者 恶 性 肿 瘤 的 发 病 中 居 前 3 位 在 日 本, 糖 尿 病 合 并 肺 癌 发 病 率 为 4 98% [11], 英 国 糖 尿 病 患 者 肺 癌 发 病 率 为 1.63/(1000 人 / 年 ) [12] 但 较 高 浓 度 葡 萄 糖 对 于 肺 癌 的 发 生 发 展 究 竟 有 何 影 响 及 其 可 能 机 制 如 何, 如 高 糖 是 否 可 能 通 过 抑 制 肺 癌 细 胞 PEDF 的 表 达 而 促 进 肿 瘤 发 展, 有 待 实 验 观 察 探 讨 鉴 于 肺 腺 癌 在 肺 癌 中 约 占 40%, 较 其 他 类 型 肺 癌 ( 肺 鳞 癌 25%, 小 细 胞 癌 24%, 大 细 胞 癌 9%) 更 为 常 见, 本 实 验 研 究 在 体 外 首 选 肺 腺 癌 细 胞 株 为 研 究 对 象 实 验 分 组 时 参 照 正 常 者 的 血 糖 浓 度, 以 5 6mmol/L 葡 萄 糖 组 为 对 照 组, 逐 渐 增 加 每 组 的 葡 萄 糖 含 量 本 实 验 观 察 结 果 提 示 : 随 着 葡 萄 糖 浓 度 的 逐 渐 上 升, 肺 腺 癌 细 胞 PEDF 的 表 达 水 平 逐 渐 下 降 ; 且 随 着 较 高 浓 度 葡 萄 糖 作 用 时 间 的 延 长,PEDF 表 达 呈 时 间 依 赖 性 下 降 此 外, 甘 露 醇 对 PEDF 的 表 达 未 见 明 显 影 响 总 之, 与 对 照 组 相 比, 除 RT PCR 检 测 中 的 高 糖 C 组, 及 ELISA 检 测 中 的 高 糖 B 组 外, 各 组 随 着 葡 萄 糖 浓 度 的 增 加 和 葡 萄 糖 作 用 时 间 的 延 长,A549 细 胞 PEDF 的 表 达 水 平 有 明 显 下 降 趋 势, 呈 剂 量 时 间 依 赖 性 改 变 因 此, 高 浓 度 葡 萄 糖 较 长 时 间 作 用 可 能 降 低 肺 腺 癌 细 胞 PEDF 的 表 达 水 平 由 于 PEDF 可 能 抑 制 肺 癌 细 胞 的 生 长 与 运

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1087 动 [5], 高 浓 度 葡 萄 糖 较 长 时 间 作 用 可 能 有 利 于 肺 癌 的 发 生 发 展, 包 括 其 他 类 型 细 胞 株 及 在 体 实 验 的 实 验 研 究 有 待 于 进 一 步 开 展 参 考 文 献 [1] 王 莉 苹, 束 军. 不 同 类 型 非 小 细 胞 癌 细 胞 株 中 PEDF 的 表 达 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2013,48(8):889-92. [2] WangJJ,ZhangSX,LuK,etal.Decreasedexpresionofpig mentepithelium derivedfactorisinvolvedinthepathogenesisof diabeticnephropathy[j].diabetes,2005,54(1):243-50. [3] 陈 思 敏, 柳 广 南.2 型 糖 尿 病 合 并 肺 癌 的 流 行 病 学 危 险 因 素 及 发 病 机 制 的 研 究 进 展 [J]. 广 西 医 科 大 学 学 报,2011,28 (6):967. [4] ZhangL,ChenJ,KeY,etal.Down regulationofpedfexpres sionbyribozymetransgeneinendothelialandlungcancercelsand itsimpactonangiogenesisinvitro[j].oncolrep,2005,14 (6):1615-9. [5] ChenJ,YeL,ZhangL,etal.Themolecularimpactofpigment epithelium derivedfactor,pedf,onlungcancercelsandthe clinicalsignificance[j].intjoncol,2009,35(1):159-66. [6] 陈 晋 峰, 赵 威, 张 建 芝, 等. 色 素 上 皮 衍 生 因 子 基 因 的 克 隆 以 及 与 肺 癌 细 胞 生 长 和 肿 瘤 新 生 血 管 形 成 影 响 的 研 究 [J]. 中 华 医 学 杂 志,2009,89(7):485-90. [7] 陈 海 冰, 贾 伟 平, 陈 俊 茜, 等.2 型 糖 尿 病 肾 病 患 者 血 清 色 素 上 皮 源 因 子 水 平 的 变 化 及 意 义 [J]. 中 华 医 学 杂 志,2007,87 (18):1230-3. [8] MohanN,MonickarajF,BalasubramanyamM,etal.Imbalanced levelsofangiogenicandangiostaticfactorsinvitreous,plasmaand postmortemretinaltisueofpatientswithproliferativediabeticreti nopathy[j].jdiabetescomplications,2012,26(5):435-41. [9] 姚 毅, 关 明, 赵 秀 琴, 等. 缺 氧 和 高 浓 度 葡 萄 糖 对 体 外 培 养 人 视 网 膜 色 素 上 皮 衍 生 因 子 表 达 的 影 响 [J]. 中 华 医 学 杂 志, 2003,83(22):1989-92. [10] HemminkiK,LiX,SundquistJ,etal.Riskofcancerfolowing hospitalizationfortype2diabetes[j].oncologist,2010,15(6): 548-55. [11] KurikiK,HiroseK,TajimaK.Diabetesandcancerriskforal andspecificsitesamongjapanesemenandwomen[j].eurj CancerPrev,2007,6(1):83-9. [12] HalGC,RobertsCM,BoulisM,etal.Diabetesandtheriskof lungcancer[j].diabetescare,2005,28(3):590-4. Efectsofglucoseofdiferentconcentrationsontheexpresionof PEDFinlungadenocarcinomacels JinCheng,ShuJun,LouZhixia,etal (DeptofRespiratoryMedicine,TheFourthAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022) Abstract Objective Toobservetheefectsofglucoseofdiferentconcentrationsontheexpresionofpigmentepi thelium derivedfactor(pedf)inlungadenocarcinomacellinea549.methods Accordingtotheconcentration ofglucoseintheculturemedium,a549celsweredividedinto5groups:normalgroup(5.6mmol/lglucose), mannitolgroup(5.6mmol/lglucose+25mmol/lmannitol),groupa(10mmol/lglucose),groupb(20mmol/ Lglucose),groupC(30mmol/Lglucose).ThelevelsofPEDFinA549celsatdiferenttimepointswithdiferent concentrationsofglucosewasexaminedbyasemi quantitativert PCRandELISAasay,andthencomparedwith eachother.results Comparedwiththecontrolgroup,theexpresionlevelofPEDFwasremarkablydecreasedin aglucosedosedependentmanner;whilethea549celswereexposedtodiferentconcentrationsofglucose(p< 0 05).ExcepttheRT PCRdetectionofgroupC,andtheELISAdetectionofgroupB,theexpresionlevelof PEDFwasremarkablydecreasedinaactiontimedependentmanner;whiletheA549celswereexposedtodiferent durations(p<0 05).Conclusion Highconcentrationofglucosewithlongerdurationsmayreducethelevelof PEDFinlungadenocarcinomacels. Keywords lungadenocarcinoma;pigmentepitheliumderivedfactor;glucose;concentrations;efects

1088 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 鼠 IL 6 受 体 融 合 蛋 白 的 表 达 及 初 步 鉴 定 程 海 燕 1, 高 闻 达 2, 任 翠 平 1, 刁 玉 洁 1, 杨 菲 1, 平 春 光 1, 李 冬 冬 3 1, 沈 际 佳 摘 要 目 的 构 建 以 及 表 达 鼠 白 介 素 6(IL 6) 受 体 融 合 蛋 白 方 法 采 用 基 因 重 组 技 术 将 鼠 IL 6 受 体 融 合 基 因 克 隆 到 杆 状 病 毒 质 粒 Bacmid 上, 重 组 杆 状 病 毒 质 粒 在 脂 质 体 的 介 导 下 转 染 昆 虫 细 胞 Sf9, 转 染 后 收 集 重 组 杆 状 病 毒, 采 用 空 斑 实 验 检 测 第 3 代 重 组 杆 状 病 毒 的 滴 度, 并 通 过 Western blot 来 确 定 目 的 蛋 白 的 表 达 结 果 重 组 杆 状 病 毒 质 粒 在 DH10Bac 大 肠 杆 菌 中 包 装 成 功, 并 转 染 Sf9 细 胞 后 得 到 重 组 杆 状 病 毒, 第 3 代 重 组 杆 状 病 毒 的 滴 度 为 5 10 7 pfu/ml, Westernblot 表 明 目 的 蛋 白 在 Sf9 细 胞 中 表 达 结 论 成 功 表 达 了 鼠 IL 6 受 体 融 合 蛋 白, 为 进 一 步 研 究 IL 6 在 炎 症 性 疾 病 中 的 作 用 奠 定 了 实 验 基 础 关 键 词 IL 6 受 体 ; 杆 状 病 毒 ; 蛋 白 表 达 中 图 分 类 号 R392.1 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1088-04 白 介 素 6(interleukin6,IL 6) 是 一 种 作 用 非 常 广 泛 的 细 胞 因 子, 由 成 纤 维 细 胞 内 皮 细 胞 巨 噬 细 胞 以 及 淋 巴 细 胞 等 多 种 细 胞 分 泌, 可 以 促 进 细 胞 生 长, 参 与 免 疫 应 答 [1], 与 多 种 慢 性 炎 性 疾 病 [2] 癌 症 相 关 [3-4] IL 6 受 体 有 IL 6 受 体 α 及 gp130 两 种 亚 型 [5], 本 研 究 根 据 IL 6 受 体 结 构 特 点 构 建 并 表 达 出 鼠 IL 6 受 体 融 合 蛋 白 (mouseil 6receptorfusion protein,mil 6RFP), 其 通 过 结 合 IL 6 而 竞 争 性 抑 制 IL 6 通 路, 为 进 一 步 研 究 IL 6 在 炎 症 性 疾 病 中 作 用 奠 定 实 验 基 础 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 1.1.1 主 要 试 剂 限 制 性 内 切 酶 连 接 酶 PCR 试 剂 盒 购 自 大 连 宝 生 物 技 术 有 限 公 司 ;SphI StuI BCA 蛋 白 浓 度 检 测 试 剂 盒 全 蛋 白 提 取 试 剂 盒 购 自 上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司 ;OMEGA E.Z.N.A BAC/PAC 质 粒 提 取 试 剂 盒 购 自 北 京 美 科 美 生 物 技 2014-02-25 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :30972569) 1 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 病 原 生 物 学 教 研 室 3 生 命 科 学 学 院, 合 肥 230032 2 美 国 安 泰 吉 生 物 技 术 与 制 药 有 限 公 司, 波 士 顿 02118 作 者 简 介 : 程 海 燕, 女, 硕 士 研 究 生 ; 沈 际 佳, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:shenjijia @hotmail.com 术 开 发 有 限 公 司 ; 细 胞 培 养 基 1 Sf900Ⅱ 细 胞 培 养 基 Grace 转 染 试 剂 celfectin 购 自 美 国 Invitrogen 公 司 ; 兔 抗 鼠 IL 6R 抗 体 (50280 RP01) 购 自 北 京 义 翘 神 州 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 兔 抗 鼠 β actin 抗 体 购 自 北 京 博 奥 森 生 物 技 术 公 司 ; 山 羊 抗 兔 IgG/ 辣 根 酶 购 自 北 京 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 其 余 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 1.1.2 质 粒 菌 株 细 胞 株 载 体 pcdna3.1 携 带 鼠 IL 6 受 体 融 合 蛋 白 质 粒 (mil 6RFP pcdna3.1) 由 美 国 波 士 顿 安 泰 吉 生 物 技 术 与 制 药 有 限 公 司 高 闻 达 教 授 惠 赠 ; 菌 株 DH10Bac DH5α 由 本 实 验 室 保 存 ;Sf9 细 胞 由 北 京 交 通 大 学 生 命 科 学 与 生 物 工 程 研 究 院 何 金 生 教 授 惠 赠 1.2 方 法 1.2.1 重 组 Bacmid 的 获 得 和 鉴 定 用 SphI 和 Stu I 双 酶 切 mil 6RFP pcdna3.1 和 pfastbachta 后 胶 回 收 并 连 接, 转 化 DH5α 大 肠 杆 菌, 经 氨 苄 霉 素 筛 选 后 的 阳 性 菌 落, 扩 大 培 养 后 提 取 质 粒, 命 名 为 mil 6RFP pfastbachta mil 6RFP pfastbachta 经 测 序 鉴 定 正 确 后 转 化 含 有 杆 状 病 毒 质 粒 的 DH10Bac 大 肠 杆 菌, 经 四 环 素 卡 那 霉 素 氨 苄 霉 素 IPTG 和 X gal 重 复 两 次 筛 选 阳 性 菌 落, 经 扩 大 培 养 后 提 取 重 组 杆 状 病 毒 质 粒, 经 PCR 鉴 定 正 确 后 命 名 为 重 组 Bacmid, 重 组 Bacmid 的 PCR 引 物 为 puc/m13: 正 向 5 CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG 3 ; 反 向 5 AGCGGATAACAATTTCACACAGG 3 1.2.2 重 组 Bacmid 转 染 昆 虫 细 胞 昆 虫 细 胞 完 全 培 养 基 为 含 100U/ml 青 霉 素,100μg/ml 链 霉 素, 10%FBS 的 Sf900Ⅱ 在 转 染 前 1d 换 成 无 抗 生 素 无 血 清 的 Sf900Ⅱ, 转 染 当 天 细 胞 处 于 对 数 生 长 期, 吹 打 成 单 细 胞 悬 液 后 接 种 6 孔 板, 接 种 密 度 为 4 10 5 /ml, 每 孔 接 种 2ml,27 孵 育 1h 后 更 换 为 新 鲜 的 无 抗 生 素 无 血 清 Sf900Ⅱ 孵 育 期 间 用 无 抗 生 素 无 血 清 无 添 加 物 的 培 养 基 Grace 稀 释 重 组 Bacmid 及 转 染 试 剂 celfectin, 将 二 者 混 匀 后 逐 滴 加 到 细 胞 上,27 孵 育 4.5h 后 更 换 成 Sf900Ⅱ 完 全 培 养 基, 27 孵 育, 第 5 天 观 察 细 胞 病 变 1.2.3 大 量 重 组 杆 状 病 毒 的 获 得 转 染 后 观 察 到 细 胞 病 变 后 收 集 上 清 液, 离 心 4,1611r/min,

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1089 5min, 上 清 液 为 第 1 代 重 组 杆 状 病 毒 命 名 为 P1, 添 加 2%FBS,4 避 光 保 存 T75 型 细 胞 培 养 瓶 80% 满 时 感 染 P1, 在 第 5 天 出 现 明 显 病 变 后, 收 集 上 清 液 离 心 为 第 2 代 重 组 杆 状 病 毒 命 名 为 P2, 按 同 样 的 方 法 得 到 第 3 代 重 组 杆 状 病 毒 P3, 添 加 2%FBS,- 80 分 装 避 光 保 存 1.2.4 重 组 杆 状 病 毒 滴 度 测 定 空 斑 试 验 测 定 P3 病 毒 滴 度 Sf9 处 于 对 数 生 长 期, 稀 释 成 单 细 胞 悬 液 6 10 5 /ml, 按 2ml/ 孔 接 种 6 孔 板, 贴 壁 1h 后 用 Sf900Ⅱ 梯 度 稀 释 P3:10-2,10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 细 胞 贴 壁 1h 后 轻 轻 弃 去 细 胞 培 养 基 后 轻 轻 加 入 不 同 稀 释 度 的 重 组 杆 状 病 毒 病 毒 1ml, 每 个 稀 释 度 2 个 复 孔 室 温 摇 床 摇 晃 60 次 /min 使 病 毒 吸 附,1h 后 轻 轻 彻 底 去 掉 病 毒 液, 按 2ml/ 孔 轻 轻 加 入 低 熔 点 琼 脂 糖 与 培 养 基 的 混 合 物 ( 将 含 2%FBS 的 1 Sf900Ⅱ 和 4% 低 熔 点 琼 脂 糖 按 比 例 混 合 成 含 0 8% 低 熔 点 琼 脂 糖 的 混 合 物 ), 超 净 台 内 静 置 1h 使 低 熔 点 琼 脂 糖 凝 固 后 置 于 27 孵 育, 第 14 天 观 察 空 斑 取 能 使 细 胞 产 生 约 20 个 空 斑 数 的 病 毒 稀 释 度, 进 行 空 斑 计 数 后 计 算 滴 度, 病 毒 滴 度 (pfu/ml) = 平 均 空 斑 数 稀 释 倍 数 每 孔 病 毒 液 1.2.5 Westernblot 检 测 mil 6RFP 的 表 达 取 第 2 代 病 毒 P2 感 染 细 胞 后 收 集 细 胞, 用 预 冷 的 PBS 漂 洗 后 离 心,4,1000r/min,10min, 共 2 次 按 全 蛋 白 提 取 试 剂 盒 操 作 提 取 细 胞 总 蛋 白,BCA 法 定 量 Westernblot 蛋 白 上 样 30μg/ 孔 电 泳, 半 干 法 转 膜 后 用 5% 脱 脂 牛 奶 室 温 封 闭 2h, 兔 抗 鼠 IL 6R 抗 体 (1 2000) 和 兔 抗 鼠 β actin 抗 体 (1 2000)4 孵 育 过 夜, 室 温 孵 育 HRP 山 羊 抗 兔 IgG(1 80000) 1h 后 ECL 发 光 液 检 测 发 光 信 号 2 结 果 2.1 重 组 杆 状 病 毒 质 粒 的 获 得 和 鉴 定 挑 取 DH5α 大 肠 杆 菌 抗 生 素 筛 选 阳 性 菌 落 扩 大 培 养, 提 取 重 组 质 粒 mil 6RFP pfastbachta, 经 SphI 和 Stu I 双 酶 切 鉴 定, 电 泳 显 示 插 入 片 段 为 2088bp 与 预 期 大 小 一 致,mIL 6RFP pfastbachta 测 序 显 示 仅 1717 位 发 生 突 变, 使 甘 氨 酸 突 变 为 天 冬 氨 酸, 不 影 响 蛋 白 表 达 挑 取 DH10Bac 大 肠 杆 菌 抗 生 素 及 蓝 白 斑 筛 选 白 色 的 阳 性 菌 落 提 取 重 组 杆 状 病 毒 质 粒 命 名 为 重 组 Bacmid, 经 puc/m13 引 物 PCR 鉴 定, 电 泳 显 示 在 5000bp 与 3000bp 之 间 有 条 带, 与 预 期 大 小 一 致, 见 图 1 2.2 重 组 杆 状 病 毒 的 获 得 扩 增 重 组 Bacmid 感 图 1 重 组 Bacmid 及 PCR 鉴 定 M:DNAMarkerDL5000;1: 重 组 Bacmid;2: 重 组 Bacmid 的 PCR 鉴 定, 引 物 为 puc/m13 染 昆 虫 细 胞 Sf9 后 第 5 天, 显 微 镜 下 观 察 到 细 胞 变 圆 变 大 呈 气 球 样 细 胞 病 变, 见 图 2 P1 经 连 续 扩 毒 2 次, 获 得 40ml 第 3 代 重 组 杆 状 病 毒 P3, 病 毒 分 装 避 光 保 存 于 -80 待 用 图 2 Sf9 正 常 细 胞 和 病 变 细 胞 100 A: 正 常 Sf9 细 胞 ;B: 病 变 Sf9 细 胞 2.3 重 组 病 毒 的 滴 度 测 定 Sf9 细 胞 在 感 染 后 15d 可 见 明 显 空 斑, 见 图 3 将 B E 两 孔 的 平 均 空 斑 数 代 入 公 式 计 算, 得 到 P3 的 滴 度 为 5 10 7 pfu/ml 2.4 重 组 目 标 蛋 白 mil 6RFP 的 鉴 定 Western blot 检 测 目 标 蛋 白 的 表 达, 结 果 显 示 感 染 重 组 杆 状 病 毒 后 的 Sf9 总 蛋 白 在 94ku 左 右 有 条 带, 而 正 常 Sf9 细 胞 蛋 白 在 该 特 定 区 域 无 反 应, 见 图 4 3 讨 论 多 种 疾 病 如 哮 喘 多 发 性 硬 化 慢 性 类 风 湿 性 关 节 炎, 炎 症 性 肠 炎 等 伴 有 IL 6 水 平 异 常 增 高, 而 阻 [6] 断 IL 6 后 疾 病 严 重 程 度 减 轻 研 究 显 示 哮 喘 时 IL 6 水 平 升 高, 而 当 哮 喘 模 型 小 鼠 用 IL 6 单 克 隆 抗

1090 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 图 3 Sf9 在 6 孔 板 空 斑 形 成 A D: 病 毒 稀 释 度 10-5 ;B E: 病 毒 稀 释 度 10-6 ;C F: 病 毒 稀 释 度 10-7 聚 化 从 而 引 起 下 游 基 因 的 表 达, 而 可 溶 型 IL 6Rα 与 可 溶 型 gp130 结 合 后 可 以 竞 争 性 抑 制 IL 6 信 号 通 路 [11] 细 胞 因 子 受 体 融 合 蛋 白 可 以 竞 争 性 抑 制 细 胞 因 子 通 路 在 IL 1 [12] 已 有 研 究 本 研 究 构 建 的 mil 6RFP 用 肽 段 连 接 鼠 IL 6 受 体 α 和 gp130 上 的 配 体 结 合 域 形 成 鼠 IL 6 受 体 融 合 蛋 白, 可 以 与 IL 6 结 合 从 而 竞 争 性 抑 制 IL 6, 发 挥 抑 制 IL 6 参 与 自 身 免 疫 性 疾 病 的 作 用 本 研 究 采 用 Bac to Bac 昆 虫 杆 状 病 毒 表 达 系 统, 获 得 重 组 杆 状 病 毒 及 重 组 目 的 蛋 白, 昆 虫 细 胞 具 有 翻 译 和 翻 译 后 蛋 白 修 饰 的 能 力, 包 括 糖 基 化 磷 酸 化 和 其 他 后 加 工 等, 并 能 定 位, 保 持 生 物 的 高 活 性 [13] 该 研 究 成 功 表 达 了 鼠 IL 6 受 体 融 合 蛋 白, 为 进 一 步 研 究 IL 6 在 炎 性 疾 病 中 的 作 用 奠 定 了 实 验 基 础 参 考 文 献 图 4 mil 6RFP 的 Westernblot 鉴 定 1: 正 常 Sf9 细 胞 总 蛋 白 ;2: 感 染 病 毒 后 Sf9 细 胞 总 蛋 白 体 中 和 IL 6 后, 气 道 纤 维 化 减 轻, 表 明 IL 6 在 哮 喘 中 可 能 发 挥 了 促 炎 功 能 多 发 性 硬 化 是 以 中 枢 神 经 系 统 白 质 炎 性 脱 髓 鞘 病 变 为 主 的 自 身 免 疫 性 疾 病, 在 多 发 性 硬 化 的 动 物 模 型 实 验 性 自 身 反 应 性 脑 脊 髓 炎 (EAE) 中,IL 6 的 单 克 隆 抗 体 能 减 缓 EAE 进 展 ; 敲 除 IL 6 基 因 后, 小 鼠 不 易 形 成 髓 鞘 少 突 胶 质 细 胞 糖 蛋 白 诱 导 的 EAE, 且 中 枢 神 经 系 统 中 炎 症 细 胞 浸 润 减 少 [7] 在 类 风 湿 性 关 节 炎 (RA) 急 性 期 血 清 以 及 关 节 的 滑 液 中 IL 6 水 平 升 高, 与 骨 和 软 骨 破 坏 严 重 程 度 明 显 相 关, 抗 IL 6 受 体 抗 体 可 以 减 轻 RA 的 严 重 程 度 [8] IL 6 在 炎 症 性 肠 病 发 病 过 程 中 也 发 挥 重 要 作 用 IL 6 使 信 号 传 导 与 转 录 激 活 因 子 3 磷 酸 化, 进 而 可 诱 导 抗 凋 亡 因 子 bcl 2 和 bcl xl 表 达, 引 起 T 细 胞 抗 凋 亡 后 不 断 累 积, 最 终 导 致 慢 性 炎 症 在 炎 症 性 肠 病 实 验 动 物 模 型 中, 发 现 抗 IL 6 受 体 抗 体 可 以 抑 制 T 细 胞 抗 凋 亡 从 而 减 轻 肠 炎 [9] IL 6 的 受 体 分 为 IL 6 受 体 α 和 gp130 这 两 种 亚 型,IL 6 受 体 α 主 要 局 限 于 肝 细 胞, 巨 噬 细 胞 等 细 胞 膜 上, 但 是 在 整 合 素 样 金 属 蛋 白 酶 17 或 12 的 作 用 下 可 以 变 为 可 溶 型 受 体,gp130 几 乎 表 达 于 所 有 细 胞 膜 上, 同 时 也 存 在 可 溶 型 gp130 [10] IL 6 与 膜 型 IL 6Rα 或 者 可 溶 型 IL 6Rα 结 合 引 起 gp130 二 [1] YaoX,HuangJ,Zhong,etal.Targetinginterleukin 6ininflamma toryautoimmunediseasesandcancers[j].pharmacolther,2014, 141(2)::125-39. [2] Rose JohnS.IL 6trans signalingviathesolubleil 6receptor: importanceforthepro inflammatoryactivitiesofil 6[J].IntJBi olsci,2012,8(9):1237-47. [3] GuoY,XuF,LuT,etal.Interleukin 6signalingpathwayintarge tedtherapyforcancer[j].cancertreatrev,2012,38(7):904-10. [4] Ataie KachoieP,PourgholamiM H,MorisDL.Inhibitionofthe IL 6signalingpathway:astrategytocombatchronicinflammatory diseasesandcancer[j].cytokinegrowthfactorrev,2013,24 (2):163-73. [5] MurakamiM,HiranoT.Thepathologicalandphysiologicalrolesof IL 6amplifieractivation[J].IntJBiolSci,2012,8(9):1267-80. [6] AmmitAJ,MoirLM,OliverBG,etal.EfectofIL 6trans sig nalingonthepro remodelingphenotypeofairwaysmoothmuscle [J].AmJPhysiolLungCelMolPhysiol,2007,292(1):199-206. [7] SeradaS,FujimotoM,MiharaM,etal.IL 6blockadeinhibitsthe inductionofmyelinntigen specificth17celsandth1celsinex perimentalautoimmuneencephalomyelitis[j].pnas,2008,105 (26):9041-6. [8] NishimotoN.Clinicalbenefitsofanti humanil 6receptoranti bodytherapy[j].clincalcium,2007,17(4):562-8. [9] MudterJ,NeurathM F.IL 6signalingininflammatoryboweldis easepatho physiologicalroleandclinicalrelevance[j].inflamm BowelDis,2007,13(8):1016-23. [10]MiharaM,HashizumeM,YoshidaH,etal.IL 6/IL 6receptorsys temanditsroleinphysiologicalandpathologicalconditions[j]. ClinSci(Lond),2012,122(4):143-59.

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1091 甲 状 腺 素 联 合 多 奈 哌 齐 对 甲 减 大 鼠 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 乙 酰 胆 碱 含 量 和 synaptotagmin 1 表 达 的 影 响 吴 洋 1, 蔡 瑶 俊 2 2, 朱 德 发 摘 要 目 的 探 讨 甲 状 腺 素 联 合 多 奈 哌 齐 对 成 年 期 甲 状 腺 功 能 减 退 模 型 SD 大 鼠 的 海 马 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 及 乙 酰 胆 碱 含 量 和 突 触 结 合 蛋 白 (Syt 1) 表 达 的 影 响 方 法 将 成 年 SD 大 鼠 随 机 分 为 正 常 对 照 组 甲 状 腺 功 能 减 退 组 ( 甲 减 组 ) 单 独 甲 状 腺 素 治 疗 组 和 甲 状 腺 素 联 合 多 奈 哌 齐 治 疗 组 ( 联 合 治 疗 组 ), 每 组 10 只 采 用 色 度 法 测 定 各 组 大 鼠 海 马 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 和 乙 酰 胆 碱 含 量, 并 应 用 免 疫 组 织 化 学 法 检 测 大 鼠 海 马 不 同 亚 层 Syt 1 表 达 结 果 与 正 常 对 照 组 相 比, 甲 减 组 大 鼠 海 马 CA1 CA3 和 齿 状 回 区 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 乙 酰 胆 碱 含 量 及 Syt 1 表 达 显 著 降 低 (P<0 05) 单 独 甲 状 腺 素 治 疗 组 大 鼠 海 马 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 和 乙 酰 胆 碱 含 量 恢 2014-03-20 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :81272152) 1 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 药 学 部 2 干 部 内 分 泌 科, 合 肥 230022 作 者 简 介 : 吴 洋, 男, 主 管 药 师 ; 朱 德 发, 男, 博 士, 主 任 医 师, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:defazhucn@163.com 复 正 常, 但 Syt 1 蛋 白 表 达 未 恢 复 联 合 治 疗 组 大 鼠 海 马 乙 酰 胆 碱 含 量 和 Syt 1 表 达 均 恢 复 至 正 常 结 论 甲 减 可 引 起 脑 内 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 乙 酰 胆 碱 含 量 及 Syt 1 表 达 下 降, 甲 状 腺 激 素 单 独 治 疗 对 上 述 损 伤 有 改 善 作 用, 但 联 合 多 奈 哌 齐 治 疗 效 果 可 能 更 好 关 键 词 甲 状 腺 功 能 减 退 ; 海 马 ; 甲 状 腺 素 ; 多 奈 哌 齐 ;syn aptotagmin 1 中 图 分 类 号 R581.2;R977.1+4;R971+.92 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1091-05 甲 状 腺 激 素 在 中 枢 神 经 系 统 的 发 育 和 功 能 成 熟 中 发 挥 重 要 的 作 用 [1] [2] 有 研 究 显 示 成 年 期 甲 状 腺 功 能 减 退 ( 甲 减 ) 可 致 广 泛 的 中 枢 神 经 系 统 结 构 损 伤 和 功 能 紊 乱 然 而, 关 于 甲 状 腺 素 替 代 治 疗 是 否 能 恢 复 这 些 结 构 和 功 能 的 改 变 的 研 究 结 论 并 不 一 致 [3-4] 成 年 期 甲 减 主 要 表 现 为 认 知 功 能 损 伤, 其 神 经 机 制 可 能 涉 及 神 经 元 突 触 可 塑 性 乙 酰 胆 碱 是 广 泛 存 在 脑 内 的 与 学 习 和 记 忆 功 能 相 关 的 重 要 神 经 [11]Müler NewenG,KüsterA,HemmannU,etal.SolubleIL 6recep torpotentiatestheantagonisticactivityofsolublegp130onil 6re sponses[j].jimmunol,1998,161(11):6347-55. [12] RydgrenT,OsterE,SandbergM,etal.AdministrationofIL 1pro longssurvivaloftransplantedpancreaticisletstotype1diabetic NODmice[J].Cytokine,2013,63(2):123-9. [13] LamsonDR,HouseAJ,DanshinaPV,etal.Recombinanthuman sperm specificglyceraldehyde 3 phosphatedehydrogenase(gap DHS)isexpresedathighyieldasanactivehomotetramerinbacu lovirus infectedinsectcels[j].proteinexprpurif,2011,75(1): 104-13. ExpresionandidentificationofmouseIL 6receptorfusionprotein ChengHaiyan 1,GaoWenda 2,RenCuiping 1,etal ( 1 DeptofMicrobiologyandParasitology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230032; 2 AntagenPharmaceuticals,Inc.,Boston 02118) Abstract Objective ToconstructandexpresmouseIL 6receptorfusionprotein.Methods MouseIL 6recep torfusiongenewasclonedonthebaculovirusplasmidbacmidbyrecombinanttechnology.recombinantbaculovirus transfectedinsectcelsf9wasmediatedbyliposome,thenthetiterofrecombinantbaculoviruswascalculatedby plaqueasay,andtheexpresionofmouseil 6receptorfusionproteinwasidentifiedbyWesternblot.Results RecombinantbaculoviruswasobtainedfromDH10Bac,thethirdgenerationrecombinantbaculovirustiterwas5 10 7 pfu/ml,westernblotshowedthatmouseil 6receptorfusionproteinexpresedininfectedcels.Conclusion WesuccesfulyexpresedmouseIL 6receptorfusionprotein,laysthefoundationforfurtherstudyontheroleofIL 6ininflammatorydiseases. Keywords IL 6receptors;baculovirus;proteinexpresion

1092 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 递 质 [5-6] [7-9] 研 究 显 示 甲 状 腺 素 与 胆 碱 酯 酶 活 性 和 乙 酰 胆 碱 含 量 关 系 密 切, 成 年 期 甲 减 可 以 引 起 脑 [10] 内 胆 碱 能 系 统 功 能 紊 乱, 前 期 研 究 也 显 示 甲 减 大 鼠 脑 内 乙 酰 胆 碱 含 量 降 低 并 与 学 习 记 忆 减 退 有 关 然 而, 关 于 成 年 期 甲 减 导 致 特 定 脑 区 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 和 乙 酰 胆 碱 含 量 变 化 及 甲 状 腺 素 替 代 治 疗 对 这 些 指 标 影 响 的 报 道 甚 少 突 触 结 合 蛋 白 (synapto tagmin,syt) 属 于 突 触 前 囊 泡 蛋 白, 是 涉 及 神 经 递 质 释 放 过 程 的 关 键 蛋 白 之 一, 其 中 Syt 1 是 Syt 家 族 中 脑 特 异 性 亚 型, 高 度 表 达 于 海 马 神 经 元 目 前 研 [11-12] 究 显 示 Syt 1 可 能 与 学 习 和 记 忆 有 关, 如 阿 尔 茨 海 默 病 (Alzheimerdisease,AD) 患 者 脑 内 Syt 水 平 显 著 降 低 自 然 衰 老 小 鼠 海 马 Syt 1 表 达 存 在 年 龄 相 关 性 改 变 且 与 学 习 记 忆 减 退 有 关 等 该 研 究 选 用 SD 大 鼠 作 为 研 究 对 象, 探 讨 甲 状 腺 素 联 合 多 奈 哌 齐 对 成 年 期 甲 减 大 鼠 的 海 马 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 及 乙 酰 胆 碱 含 量 和 Syt 1 表 达 的 影 响 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 动 物 3 月 龄 SD 大 鼠 40 只, 雄 性, 清 洁 级, 体 重 (170±20)g, 购 自 北 京 维 通 利 华 实 验 动 物 公 司 常 规 条 件 下 喂 养 ( 温 度 21~23, 湿 度 50% ~60%, 明 暗 周 期 为 12h), 所 有 大 鼠 接 受 标 准 啮 齿 类 食 物, 并 自 由 进 水, 适 应 性 喂 养 1 周 1.2 模 型 制 作 将 40 只 SD 大 鼠 随 机 均 分 为 4 组 : 正 常 对 照 组 甲 减 组 单 独 甲 状 腺 素 治 疗 组 ( 单 独 治 疗 组 ) 和 甲 状 腺 素 联 合 多 奈 哌 齐 治 疗 组 ( 联 合 治 疗 组 ) 除 正 常 对 照 组 外 每 组 大 鼠 于 每 日 饮 水 中 给 予 丙 基 硫 氧 嘧 啶 (PTU,0.05%,Sigma 公 司 ),4 周 后 甲 减 组 继 续 予 以 PTU 处 理, 而 单 独 治 疗 组 开 始 腹 腔 注 射 左 旋 甲 状 腺 素 [6μg/100(g d),sigma 公 司 ], 联 合 治 疗 组 在 单 独 治 疗 基 础 上 饮 水 中 加 入 浓 度 为 0.005% 的 多 奈 哌 齐 正 常 对 照 组 大 鼠 饮 用 正 常 自 来 水,4 周 后 腹 腔 内 注 射 相 同 体 积 生 理 盐 水, 造 模 时 间 共 6 周 1.3 标 本 制 备 血 清 制 备 : 造 模 结 束 后 称 取 大 鼠 体 重, 予 7% 水 合 氯 醛 (350mg/kg) 麻 醉 后 打 开 胸 腔, 腹 主 动 脉 取 血, 离 心 后 取 血 清 置 于 4 冰 箱 保 存 待 测 总 三 碘 甲 状 腺 原 氨 酸 (Triodothyronine,T3) 总 甲 状 腺 素 (Tyroxine,T4) 和 促 甲 状 腺 激 素 (thyrotropin, TSH) 脑 标 本 制 备 : 取 血 后 将 大 鼠 断 头 处 死, 冰 上 迅 速 开 颅 取 脑, 右 大 脑 半 球 置 于 4% 多 聚 甲 醛 溶 液 固 定, 流 水 冲 洗, 修 块, 脱 水, 透 明, 浸 蜡,HE 染 色 定 位,4 μm 连 续 冠 状 切 片 ( 德 国 Leica 公 司,RM2235 型 ), 进 行 免 疫 组 织 化 学 染 色 检 测 Syt 1 蛋 白 的 表 达 左 大 脑 半 球 在 冰 上 分 离 出 海 马, 用 于 比 色 法 检 测 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 和 乙 酰 胆 碱 含 量 1.4 甲 状 腺 水 平 测 定 采 用 放 射 免 疫 法 根 据 试 剂 盒 指 示 测 定 血 清 T3 T4 和 TSH 水 平 1.5 比 色 法 检 测 将 左 侧 半 球 的 海 马, 按 照 重 量 和 体 积 比 1 9 的 比 例, 加 入 预 冷 的 生 理 盐 水, 在 冰 浴 中 制 成 10% 的 组 织 匀 浆,4 离 心 分 离 上 清 液 (3500r/min,10min), 按 试 剂 盒 说 明 书 测 定 乙 酰 胆 碱 酯 酶 酶 活 性 和 乙 酰 胆 碱 含 量 1.6 免 疫 组 织 化 学 染 色 免 疫 组 化 采 用 超 敏 SP 法 一 抗 为 重 组 单 克 隆 Syt 1 蛋 白 抗 体 ( 美 国 Sigma 公 司 );SP 二 抗 超 敏 试 剂 盒 (SP 9001, 生 物 素 标 记 羊 抗 兔 / 小 鼠 IgG) 和 DAB 显 色 试 剂 盒 均 购 自 北 京 中 杉 金 桥 生 物 科 技 有 限 公 司 10 40 倍 显 微 镜 (O lympus, 日 本 ) 下 对 背 海 马 齿 状 回 (DG 区 : 颗 粒 细 胞 层 分 子 层 ) CA1 区 ( 起 层 放 射 层 腔 隙 层 ) 和 CA3 区 ( 起 层 透 明 层 放 射 层 ) 观 察 照 相 图 像 以 TIFF 格 式 保 存, 用 ImageProPlus6.0 图 像 分 析 系 统 ( 美 国 MediaCygernetics 公 司 ) 分 析 亚 区 各 层 的 Syt 1 含 量 用 免 疫 反 应 产 物 光 密 度 值 (opticaldensity,od) 代 表 由 于 每 个 标 本 各 层 选 取 的 形 状 大 小 有 异, 故 以 平 均 OD( 累 积 OD 与 选 取 面 积 的 比 值 ) 进 入 统 计 学 分 析 1.7 统 计 学 处 理 采 用 SPSS17.0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示 采 用 单 因 数 方 差 分 析 (one way ANOVA), 进 一 步 用 LSD 法 进 行 多 重 比 较 2 结 果 2.1 大 鼠 血 清 甲 状 腺 激 素 水 平 与 正 常 对 照 组 相 比, 甲 减 组 大 鼠 血 清 T3 T4 水 平 明 显 减 低 (P< 0 05),TSH 显 著 增 高 (P<0 01), 而 单 独 治 疗 组 和 联 合 治 疗 组 大 鼠 血 T3 T4 明 显 升 高 (P<0 05), TSH 接 近 正 常 水 平, 见 表 1 表 1 各 组 大 鼠 血 清 T3 T4 和 TSH 水 平 (n=10, 珋 x±s) 组 别 T3(nmol/L) T4(nmol/L) TSH(μIU/ml) 正 常 对 照 0.81±0.06 49.31±3.71 1.31±0.28 甲 减 0.62±0.03 18.14±4.30 19.28±9.79 单 独 治 疗 0.81±0.05 # 52.40±5.86 # 1.23±1.21 联 合 治 疗 0.76±0.06 # 52.75±2.02 # 1.08±0.13 与 正 常 对 照 组 比 较 : P<0.05; 与 甲 减 组 比 较 : # P<0 05

安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １９３ ２ ２ 大鼠海马乙酰胆碱酯酶活性和乙酰胆碱含量 ２ ３ 大鼠海马各区 Ｓｙ １蛋白表达的变化 光镜 的变化 与正常对照组大鼠相比 甲减组大鼠海马 下观察各组大鼠海马不同亚区结构 见图 １ 可见 乙酰胆碱酯酶活性和乙酰胆碱含量明显降低 Ｐ Ｓｙ １在海马所有亚区各层均有表达 阳性着色呈棕 ５ 单独甲状腺素治疗后 大鼠乙酰胆碱酯酶 红色 甲减组和单独治疗组 尤其是甲减组 大鼠 活性和乙酰胆碱含量升至正常水平 Ｐ ５ 甲 海马 ＤＧ分子层 ＣＡ１起层和放射层及 ＣＡ３透明层 状腺素联合多奈哌齐治疗后 大鼠乙酰胆碱酯酶活 和放射层的 Ｓｙ １较正常对照组呈低表达 而联合治 性明显降低 Ｐ ５ 而乙酰胆碱含量恢复至正 疗组和正常对照组 Ｓ ｙ １在海马不同亚区的表达基 ５ 见表 ２ 常水平 Ｐ 本相似 珋±ｓ 表 ２ 大鼠海马乙酰胆碱酯酶活性和乙酰胆碱含量 ｎ １ ｘ 乙酰胆碱酯酶活性 乙酰胆碱含量 ｍｇ μｇ ３ ２ ４ ２ ７±２２ １２ μｇ ｍｇ ２ ２７±３ ８２ 单独治疗 ２ ３ ２ ７±２ ８７ ２ ９ ２ ７±２１ ５３ １４ ８±２ ２ ４ ２１ ９８±４ ８８ 联合治疗 ２ ２ ２ ７±１９ ４１ ２２ ２７±３ ４ ５ 组别 正常对照 甲减 ５ 与正常对照组比较 Ｐ 以 Ｉ ｍａ ｇ Ｐｒ ｏｐｌ ｕｓ６ 图像分析系统对海马不 同亚区 Ｓｙ １的免疫产物进行平均光密度值分析 结 果显示 与正常对照组相比 甲减组大鼠海马 ＤＧ分 子层 ＣＡ１起层和放射层及 ＣＡ３透明层和放射层的 Ｓｙ １表达显著降低 Ｐ １ 而 ＤＧ颗粒细胞层 ＣＡ１腔隙层及 ＣＡ３起层的Ｓｙ １表达未见明显改变 １免疫反应 Ｐ ５ 单独甲状腺素治疗后Ｓｙ 图 １ 各组大鼠海马不同亚层的 Ｓｙ １的免疫反应物的表达 ４ Ｃ 正常对照组 Ｈｙ ｐ ｏ 甲减组 Ｔ４ 单独治疗组 Ｔ４ ＤＯＮ 联合治疗组 ＳＯ 起层 Ｓ Ｒ 放射层 Ｓ ＬＭ 腔隙层 Ｓ Ｌ 透明层 ＭＬ 分子层 ＰＬ 颗 粒细胞层

1094 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 3 大 鼠 海 马 Syt 1 蛋 白 水 平 ( 珋 x±s,od) 亚 区 分 层 正 常 对 照 组 甲 减 组 单 独 治 疗 组 联 合 治 疗 组 DG 分 子 层 4.75±0.06 4.09±0.03 4.37±0.05 4.61±0.05 颗 粒 细 胞 层 3.76±0.05 3.51±0.03 3.67±0.07 3.72±0.06 CA1 起 层 5.06±0.15 3.49±0.13 4.09±0.20 4.79±0.16 放 射 层 4.75±0.19 3.19±0.14 3.60±0.29 4.29±0.28 腔 隙 层 4.31±0.09 3.91±0.16 3.99±0.05 4.42±0.09 CA3 起 层 5.01±0.18 4.55±0.17 4.87±0.10 4.98±0.14 透 明 层 4.85±0.10 3.94±0.04 4.23±0.07 4.71±0.08 放 射 层 4.94±0.05 3.90±0.07 4.46±0.09 4.81±0.06 与 正 常 对 照 组 比 较 : P<0.01 产 物 分 布 及 细 胞 内 表 达 与 甲 减 大 鼠 相 似, 但 甲 状 腺 素 联 合 多 奈 哌 齐 治 疗 后 大 鼠 Syt 1 阳 性 免 疫 反 应 物 在 海 马 各 层 均 恢 复 至 正 常 对 照 组 大 鼠 水 平, 两 者 比 较 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 见 表 3 3 讨 论 甲 状 腺 功 能 减 退 症 是 一 种 常 见 的 内 分 泌 疾 病, 目 前 建 立 甲 减 的 动 物 模 型 的 方 法 较 成 熟, 其 中 科 研 上 最 常 用 的 方 法 之 一 是 利 用 抗 甲 状 腺 药 物 诱 导 甲 减 模 型, 其 主 要 优 点 为 实 验 方 法 操 作 简 单, 成 功 率 高, 重 复 性 好, 便 于 观 察 等 本 实 验 采 用 PTU 饮 水 ( 浓 度 为 0.05%)6 周 进 行 造 模, 并 检 测 血 清 T3 T4 水 平, 结 果 显 示 甲 减 组 大 鼠 血 清 T3 T4 明 显 低 于 正 常 对 照 组, 提 示 甲 减 模 型 制 备 成 功 此 外, 甲 状 腺 单 独 和 联 合 治 疗 后 T3 T4 明 显 升 高, 说 明 甲 状 腺 素 治 疗 可 使 甲 状 腺 相 关 指 标 恢 复 至 正 常 与 既 往 的 研 [13] 究 结 果 基 本 一 致 目 前 认 为 突 触 联 络 的 完 整 性 遭 到 破 坏 可 能 是 成 年 期 后 认 知 功 能 减 退 ( 包 括 甲 减 ) 的 原 因 [14] 突 触 蛋 白 由 于 参 与 化 学 突 触 传 递 的 全 过 程 正 受 到 广 泛 的 关 注,Syt 1 是 一 种 含 有 两 个 Ca 2+ 结 合 的 C2 结 构 域 的 突 触 囊 泡 整 合 膜 蛋 白, 介 导 快 速 同 步 神 经 递 质 释 放, 参 与 调 节 突 触 囊 泡 循 环 的 锚 定 融 合 和 再 利 用, 进 而 在 神 经 递 质 释 放 过 程 中 发 挥 重 要 作 用 Syt 1 广 泛 分 布 与 神 经 及 神 经 内 分 泌 组 织 中, 在 生 物 体 内 主 要 集 中 于 大 脑 皮 质 和 海 马 的 小 突 触 囊 泡 和 大 致 密 核 [11-12] 心 囊 泡 表 面 近 期 研 究 显 示 Syt 1 可 能 与 自 然 衰 老 状 态 和 病 理 性 状 态 ( 如 AD 甲 减 ) 相 关 学 习 记 [15] 忆 减 退 有 关, 之 前 的 研 究 显 示 成 年 期 甲 减 大 鼠 海 马 CA1 CA3 和 DG 区 Syt 1 的 表 达 明 显 降 低, 且 单 独 甲 状 腺 素 替 代 治 疗 并 不 能 使 Syt 1 在 海 马 中 的 表 [15] 达 恢 复 至 正 常 本 研 究 与 既 往 研 究 结 果 基 本 一 致 脑 内 胆 碱 能 神 经 元 对 甲 状 腺 激 素 非 常 敏 感, 在 脑 发 育 关 键 期, 甲 状 腺 激 素 缺 乏 会 导 致 大 脑 皮 层 海 马 及 前 脑 基 底 部 胆 碱 能 神 经 元 相 关 酶 的 活 性 明 显 降 低, 造 成 中 枢 胆 碱 能 神 经 发 育 障 碍 然 而, 对 成 年 期 甲 减 对 脑 内 ( 尤 其 是 特 定 脑 区 ) 胆 碱 能 神 经 元 研 究 [10] 较 少 本 课 题 组 先 前 的 研 究 显 示 甲 减 大 鼠 额 叶 乙 酰 胆 碱 含 量 显 著 减 少, 而 脑 内 乙 酰 胆 碱 含 量 降 低 可 能 是 甲 减 引 起 学 习 记 忆 能 力 减 退 的 原 因 之 一 海 马 位 于 颞 叶 内 侧 面 的 基 底 部, 是 内 侧 颞 叶 记 忆 系 统 的 重 要 组 成 部 分, 主 要 参 与 空 间 记 忆 和 事 件 记 忆 的 形 成 [16] [17] 研 究 显 示 海 马 在 自 然 衰 老 和 AD 更 容 易 受 损, 且 与 其 相 关 认 知 功 能 减 退 密 切 相 关 因 此, 海 马 是 研 究 学 习 记 忆 改 变 机 制 的 理 想 目 标 脑 区 本 研 究 显 示 甲 减 大 鼠 海 马 CA1 CA3 和 齿 状 回 区 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 和 乙 酰 胆 碱 含 量 明 显 降 低, 与 额 叶 部 位 的 研 究 结 果 相 似 [10] 多 奈 哌 齐 是 乙 酰 胆 碱 酯 酶 抑 制 剂, 可 以 提 高 突 [15] 触 间 隙 乙 酰 胆 碱 含 量, 研 究 显 示 多 奈 哌 齐 可 以 改 善 甲 减 大 鼠 的 认 知 功 能, 但 具 体 机 制 不 明 确, 可 能 与 某 些 突 触 相 关 蛋 白 有 关 本 实 验 采 用 甲 状 腺 激 素 联 合 多 奈 哌 齐 干 预 成 年 甲 减 大 鼠, 发 现 海 马 内 乙 酰 胆 碱 含 量 和 Syt 1 均 可 恢 复 至 正 常 范 围, 提 示 甲 状 腺 素 联 合 多 奈 哌 齐 可 能 用 于 治 疗 甲 减 引 起 的 脑 功 能 损 伤 综 上 所 述, 血 清 甲 状 腺 素 可 引 起 脑 内 乙 酰 胆 碱 含 量 的 变 化, 因 此, 甲 减 脑 功 能 受 损 可 能 与 海 马 内 乙 酰 胆 碱 含 量 异 常 有 关 然 而, 甲 减 导 致 脑 内 乙 酰 胆 碱 含 量 降 低 的 确 切 原 因 未 明, 可 能 与 甲 减 引 起 脑 内 突 触 相 关 蛋 白 表 达 异 常 和 ( 或 ) 血 清 甲 状 腺 素 水 平 改 变 直 接 影 响 脑 内 乙 酰 胆 碱 含 量 有 关 总 之, 甲 减 可 引 起 脑 内 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 乙 酰 胆 碱 含 量 及 Syt 1 表 达 降 低, 甲 状 腺 激 素 单 独 治 疗 对 上 述 损 伤 有 改 善 作 用, 但 联 合 多 奈 哌 齐 治 疗 效 果 可 能 更 好, 提 示 多 奈 哌 齐 对 甲 减 的 认 知 功 能 恢 复 可 能 更 有 价 值 参 考 文 献 [1] DiLiegroI.Thyroidhormonesandthecentralnervoussystem of mammals(review)[j].molmedrep,2008,1(3):279-95. [2] KoromilasC,LiapiC,SchulpisKH,etal.Structuralandfunc tionalalterationsinthehippocampusduetohypothyroidism [J]. MetabBrainDis,2010,25(3):339-54. [3] AmbroginiP,CuppiniR,FeriP,etal.Thyroidhormonesafect neurogenesisinthedentategyrusofadultrat[j].neuroendocri nology,2005,81(4):244-53.

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1095 [4] AlzoubiKH,GergesNZ,AlkadhiKA.Levothyroxinrestores hypothyroidism inducedimpairmentofltpofhippocampalca1: electrophysiologicaland molecularstudies[j]. Exp Neurol, 2005,195(2):330-41. [5] DeNicolaAF,LabombardaF,DeniseleM C,etal.Progester oneneuroprotectionintraumaticcnsinjuryandmotoneuronde generation[j].frontneuroendocrinol,2009,30(2):173-87. [6] DjebailiM,GuoQ,PetusEH,etal.Theneurosteroidsproges teroneandalopregnanolonereduceceldeath,gliosis,andfunc tionaldeficitsaftertraumaticbraininjuryinrats[j].jneurotrau ma,2005,22(1):106-18. [7] SmithJW,EvansAT,CostalB,etal.Thyroidhormones,brain functionandcognition:abriefreview[j].neuroscibiobehav Rev,2002,26(1):45-160. [8] SarkarPK,RayAK.InvolvementofL triodothyronineinacetyl cholinemetabolisminadultratcerebrocorticalsynaptosomes[j]. HormMetabRes,2001,33(5):270-5. [9] 李 永 军, 王 群, 陆 兵 勤. 成 年 甲 减 大 鼠 认 知 行 为 及 其 机 制 研 究 [J]. 中 华 现 代 内 科 学 杂 志,2008,5(7):577-9. [10] 刘 俊 霞, 朱 德 发, 王 芬, 等. 甲 状 腺 激 素 对 大 鼠 额 叶 乙 酰 胆 碱 的 影 响 [J]. 中 国 临 床 保 健 杂 志,2011,14(6):608-10. [11]MasliahE,MaloryM,AlfordM,etal.Alteredexpresionofsyn apticproteinsoccursearlyduringprogresionofalzheimer sdis ease[j].neurology,2001,56(1):127-9. [12]ChenGH,WangYJ,QinS,etal.Age relatedspatialcognitive impairmentiscorelatedwithincreaseinsynaptotagmin1indorsal hippocampusinsamp8mice[j].neurobiolaging,2007,28 (4):611-8. [13] AlmandozJP,GharibH.Hypothyroidism:etiology,diagnosis, andmanagement[j].medclinnortham,2012,96(2):203-21. [14] orisonjh,baxterm G.Theageingcorticalsynapse:halmarks andimplicationsforcognitivedecline[j].natrevneurosci, 2012,13(4):240-50. [15]ZhuY,NingD,WangF,etal.Efectofthyroxineonmunc 18 andsyntaxin 1expresionindorsalhippocampusofadult onsethy pothyroidrats[j].eurjhistochem,2012,56(2):e22. [16]VannSD,AlbaserM M.Hippocampusandneocortex:recogni tionandspatialmemory[j].curopinneurobiol,2011,21 (3):440-5. [17] BurkeSN,BarnesCA.Neuralplasticityintheageingbrain [J].NatRevNeurosci,2006,7(1):30-40. Efectsofthyroxineanddonepezilonacetylcholinecontent,acetylcholinesterase activityandsynaptotagmin 1expresioninhypothyroidrats WuYang 1,CaiYaojun 2,ZhuDefa 2 ( 1 DeptofPharmacy, 2 DeptofEndocrinology,TheFirstAfiliatedHospitalof AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022) Abstract Objective Toinvestigatetheefectsofthyroxineanddonepeziltreatmentonthehypothyroidism in ducedalterationsofacetylcholine(ach)contentandacetycholinesterase(ache)activityandsynaptotagmin 1 (Syt 1)expresioninthehippocampusofadultrats.Methods AdultmaleSDratswererandomlydividedinto threegroups:blankcontrolgroup,hypothyroidismgroup,thyroxinetreatmentgroup,thyroxineanddonepeziltreat mentgroup.concentrationofachandtheactivityofacheweredeterminedcolorimetricaly,andproteinlevelof Syt 1wasdeterminedbyimmunohistochemistry.Results Compairedtothecontrols,thehypothyroidismratshad significantdecrementsofachlevels,acheactivityandsyt 1expresioninthehippocampus(P<0 05).Thyrox ine,achlevelsandacheactivitywererestoredbythyroxineadministration,whileexpresionofsyt 1didnot reachthecontrollevel.co administrationofthyroxineanddonepezilledtonormalizationofthyroxine,achlevels aswelasthesyt 1expresion.Conclusion HypothyroidismcanleadtothedeclineofAChlevels,AChEactivity andsyt 1expresioninthehippocampus,andthyroidreplacementalonemayreducesomeofthesedamages,but thyroidcombinedwithdonepeziltreatmentcanbebeterinthehypothyroidismadultrats. Keywords hypothyroidism;hippocampus;thyroxine;donepezil;synaptotagmin 1

1096 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) SDF 1α 复 合 PluronicF 127 的 构 建 及 其 对 BMSCs 的 体 外 生 物 效 应 研 究 田 甜 1, 程 继 光 2 1, 周 健 摘 要 目 的 构 建 装 载 基 质 细 胞 衍 生 因 子 1α(SDF 1α) 的 PluronicF 127 新 型 复 合 材 料, 并 研 究 其 对 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 (BMSCs) 的 体 外 生 物 效 应 方 法 构 建 装 载 不 同 浓 度 SDF 1α(200 50ng/ml) 的 PluronicF 127 复 合 水 凝 胶, 采 用 Transwel 小 室 进 行 复 合 水 凝 胶 对 BMSCs 的 体 外 趋 化 实 验 将 BMSCs 与 复 合 材 料 均 匀 混 合, 加 成 骨 细 胞 诱 导 液 进 行 培 养, 并 对 其 行 碱 性 磷 酸 酶 (AKP) 活 性 测 定 及 茜 素 红 染 色, 由 结 果 可 观 察 到 BMSCs 的 成 骨 诱 导 分 化 情 况, 并 用 MTT 法 检 测 复 合 培 养 后 细 胞 的 活 性 状 况 结 果 趋 化 实 验 结 果 显 示, 含 SDF 1α 浓 度 为 200ng/ml 的 复 合 水 凝 胶 对 BMSCs 的 募 集 效 果 显 著 (P<0 05) MTT 法 证 实 了 PluronicF 127 对 细 胞 增 殖 不 产 生 影 响 (P>0 05) BMSCs 复 合 材 料 单 纯 BMSCs 在 成 骨 诱 导 培 养 条 件 下, 两 组 细 胞 的 AKP 表 达 量 均 明 显 增 高, 并 且 都 高 于 非 成 骨 诱 导 组 (P<0 05), 同 时 诱 导 组 镜 下 可 见 明 显 的 钙 结 节 形 成 结 论 成 功 构 建 装 载 SDF 1α 的 PluronicF 127 新 型 复 合 材 料, 其 在 体 外 对 BMSCs 有 明 显 的 趋 化 作 用, 在 细 胞 材 料 复 合 培 养 的 三 维 支 架 中,BMSCs 能 够 存 活 并 被 成 功 诱 导 分 化 为 成 骨 细 胞 关 键 词 基 质 细 胞 衍 生 因 子 1α;PluronicF 127 水 凝 胶 ; 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 ; 成 骨 诱 导 分 化 中 图 分 类 号 R318.08 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1096-04 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 (bonemesenchymalstem cels,bmscs) 具 有 多 向 分 化 能 力, 被 认 为 是 最 具 潜 能 的 种 子 细 胞 [1] 基 质 细 胞 衍 生 因 子 1α(stromal celderivedfactor 1α,SDF 1α) 可 通 过 其 受 体 CX CR4 对 BMSCs 起 活 化 迁 移 的 作 用, 在 众 多 的 细 胞 因 子 / 趋 化 因 子 中,SDF 1α 对 BMSCs 的 归 巢 和 定 位 尤 为 重 要 [2-3] SDF 1α/CXCR4 轴 对 BMSCs 迁 移 至 骨 折 部 位 起 着 关 键 作 用, 并 且 募 集 到 骨 折 部 位 的 细 2014-02-25 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :81070864) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 口 腔 医 学 院, 安 徽 医 科 大 学 附 属 口 腔 医 院, 安 徽 省 口 腔 疾 病 研 究 中 心 实 验 室, 合 肥 230032 2 安 徽 医 科 大 学 口 腔 医 学 院, 安 徽 医 科 大 学 附 属 口 腔 医 院, 口 腔 颌 面 外 科, 合 肥 230032 作 者 简 介 : 田 甜, 女, 硕 士 研 究 生 ; 周 健, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:zj@ah mu.edu.cn 胞 可 积 极 地 参 与 软 骨 内 的 骨 修 复 [4] 然 而, 骨 缺 损 处 相 对 较 低 的 骨 再 生 能 力 限 制 了 骨 的 再 生 数 量 [5], 并 且 骨 的 再 生 修 复 主 要 取 决 于 其 募 集 的 干 细 胞 数 量 因 此, 增 加 骨 损 处 SDF 1α 的 表 达 对 其 募 集 BMSCs 以 及 骨 损 修 复 都 起 着 关 键 作 用 现 通 过 构 建 复 合 SDF 1α 的 PluronicF 127 水 凝 胶, 探 讨 其 在 体 外 条 件 下 对 BMSCs 的 募 集 能 力 和 促 成 骨 作 用, 以 期 为 应 用 细 胞 复 合 材 料 进 行 骨 缺 损 的 组 织 工 程 修 复 研 究 提 供 新 的 途 径 和 实 验 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 1.1.1 实 验 动 物 SD 大 鼠, 清 洁 级,4~6 周 龄, 体 重 60~80g, 雌 雄 不 限, 由 安 徽 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心 提 供 1.1.2 仪 器 与 试 剂 恒 温 CO 2 培 养 箱 ( 美 国 Ther moforma 公 司 ); 自 动 酶 标 仪 ( 美 国 Bio tek 公 司 ); 荧 光 倒 置 显 微 镜 ( 德 国 Leica 公 司 ); 大 鼠 SDF 1α ( 以 色 列 ProSpecbio 公 司 ); 低 糖 型 DMEM 培 养 基 胎 牛 血 清 (FBS) 和 胰 蛋 白 酶 ( 美 国 Hyclone 公 司 ); β 甘 油 磷 酸 钠 地 塞 米 松 维 生 素 C MTT 和 Pluronic F 127( 美 国 Sigma 公 司 );Transwel 小 室 ( 美 国 Cost ar 公 司 );BCA 蛋 白 定 量 试 剂 盒 ( 北 京 原 平 皓 生 物 技 术 有 限 公 司 ); 碱 性 磷 酸 酶 试 剂 盒 ( 南 京 建 成 生 物 工 程 有 限 公 司 ); 茜 素 红 ( 上 海 三 爱 思 试 剂 公 司 ) 1.2 方 法 1.2.1 大 鼠 BMSCs 的 分 离 和 培 养 取 4~6 周 龄, 体 重 约 80g 的 SD 大 鼠 无 菌 条 件 下 剥 离 双 侧 股 骨 和 胫 骨, 冲 出 骨 髓, 采 用 全 骨 髓 贴 壁 培 养 法, 分 离 培 养 BMSCs 至 第 3 代, 并 对 其 进 行 PI/AO 染 色 以 观 察 细 胞 的 活 性 状 况 和 形 态 1.2.2 PluronicF 127 水 凝 胶 的 配 制 及 其 与 SDF 1α 的 复 合 将 PluronicF 127 粉 末 与 低 糖 DMEM 不 完 全 培 养 基 以 质 量 分 数 为 25% 的 比 例 混 合 配 制, 置 于 4 冰 箱 内, 至 絮 状 白 色 颗 粒 完 全 消 失 之 后 经 0 22 μm 的 滤 器 过 滤 于 4 保 存 冰 浴 下, 将 不 等 量 的 SDF 1α 分 别 滴 入 PluronicF 127 溶 液 中 混 匀, 使 配 制 的 复 合 液 中 SDF 1α 浓 度 分 别 为 200 50ng/ml, 以 2.5

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1097 ml 注 射 器 抽 取 复 合 液 置 于 4 保 存 备 用 1.2.3 复 合 SDF 1α 水 凝 胶 对 BMSCs 的 体 外 趋 化 作 用 采 用 Transwel 小 室 趋 化 实 验, 检 测 体 外 条 件 下, 复 合 SDF 1α 水 凝 胶 对 大 鼠 BMSCs 的 趋 化 作 用 实 验 组 分 两 组, 在 其 中 一 组 的 趋 化 体 系 下 层 放 入 0 1ml 含 SDF 1α 浓 度 为 200ng/ml 的 复 合 水 凝 胶, 另 一 组 则 放 入 0.1ml 含 SDF 1α 浓 度 为 50ng/ml 的 复 合 水 凝 胶, 两 组 体 系 下 层 均 添 加 0.4ml 含 10% FBS 的 培 养 基, 对 照 组 体 系 下 层 为 单 纯 0.5ml 含 10% FBS 的 培 养 基, 各 组 均 覆 以 孔 径 8μm 的 微 孔 聚 碳 酸 酯 滤 膜, 各 组 体 系 上 层 均 加 入 0.2ml 含 10% FBS 的 培 养 基, 其 中 BMSCs 浓 度 约 5 10 4 /ml, 每 组 3 孔, 置 于 37 5% CO 2 培 养 箱 中,10h 后 取 出 滤 膜 并 刮 去 上 层 表 面 细 胞,PBS 冲 洗 3 次,4% 多 聚 甲 醛 固 定, 结 晶 紫 染 色, 倒 置 显 微 镜 ( 400 倍 ) 下 选 6 个 随 机 视 野 观 察 计 数, 将 结 果 进 行 统 计 学 分 析 1.2.4 PluronicF 127 凝 胶 的 细 胞 毒 性 检 测 将 第 3 代 BMSCs 消 化 1000r/min 离 心 3min 实 验 组 : 细 胞 与 PluronicF 127 溶 液 复 合, 细 胞 浓 度 调 至 8 10 4 /ml, 每 孔 200μl 接 种 于 48 孔 板, 放 于 37 培 养 箱, 待 凝 胶 形 成 对 照 组 : 取 200μlBMSCs 接 种 于 48 孔 板, 密 度 与 实 验 组 相 同 两 组 均 加 10% FBS 的 培 养 基 培 养, 分 别 于 接 种 后 的 第 1 3 5 7 天 各 取 6 孔 采 用 MTT 法 检 测 其 吸 光 值 (opticaldensity, OD) 1.2.5 复 合 水 凝 胶 三 维 培 养 BMSCs 并 诱 导 成 骨 分 化 取 第 3 代 BMSCs 消 化 1000r/min 离 心 3min 实 验 A 组 : 冰 浴 下, 将 细 胞 重 悬 于 含 SDF 1α 浓 度 为 200ng/ml 的 复 合 水 凝 胶, 吹 打 混 匀 使 细 胞 较 均 匀 分 布 于 复 合 材 料 中, 调 节 细 胞 浓 度 约 为 5 10 4 /ml, 将 BMSCs 复 合 材 料 混 合 液 加 入 24 孔 板, 每 孔 300μl, 置 于 CO 2 培 养 箱 中, 待 凝 胶 形 成, 每 孔 加 700μl 含 10% FBS 的 培 养 基 实 验 B 组 : 细 胞 浓 度 为 5 10 4 /ml, 每 孔 300μl 接 种 于 24 孔 板, 并 加 700μl 含 10% FBS 的 培 养 基 两 组 均 培 养 24h 后, 更 换 成 骨 细 胞 诱 导 液 ( 含 10mmol/L 的 β 甘 油 磷 酸 钠 100 mmol/l 的 地 塞 米 松 0.05g/L 的 维 生 素 C 10% FBS 低 糖 DMEM) 进 行 培 养 对 照 组 情 况 同 实 验 B 组, 培 养 基 选 用 含 10% FBS 的 培 养 基, 不 加 成 骨 诱 导 液 分 别 于 成 骨 诱 导 后 的 第 7 14 天,3 组 各 取 3 孔 内 细 胞 进 行 碱 性 磷 酸 酶 (alkalinephosphatase, AKP) 检 测, 用 BCA 法 测 定 出 各 样 本 中 的 蛋 白 浓 度, 按 AKP 试 剂 盒 说 明 书 计 算 出 样 本 产 生 AKP 的 量 并 于 诱 导 后 14d 进 行 茜 素 红 染 色 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS17.0 统 计 软 件 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 将 各 组 样 本 进 行 单 因 素 方 差 分 析, 检 验 水 准 取 α=0 05 2 结 果 2.1 BMSCs 的 体 外 培 养 BMSCs 分 离 培 养,24h 后 半 换 液, 倒 置 显 微 镜 下 显 示 已 有 细 胞 贴 壁,3~5d 后 细 胞 形 态 呈 现 多 样 : 如 纺 锤 形 多 角 形 梭 形 约 14d 细 胞 融 合 达 约 90%, 可 进 行 传 代, 传 代 后 细 胞 形 态 逐 渐 趋 向 一 致, 主 要 为 大 而 扁 的 梭 形 PI/AO 染 色 结 果 显 示 细 胞 呈 现 明 亮 的 绿 色 荧 光, 胞 核 清 晰, 细 胞 形 态 多 为 梭 形, 见 图 1 图 1 倒 置 相 差 显 微 镜 下 BM SCs 形 态 100 A:BMSCs 原 代 培 养 3d;B: BMSCs 第 3 代 ;C:BMSCs 的 PI/ AO 荧 光 染 色 2.2 含 不 同 浓 度 SDF 1α 的 复 合 水 凝 胶 对 BMSCs 的 趋 化 测 定 将 实 验 组 和 对 照 组 迁 移 的 BMSCs 统 计 结 果 进 行 方 差 分 析 (n=18, x±s), 珋 结 果 显 示 :3 组 的 细 胞 迁 移 数 分 别 为 :30 333±8 051 20 111± 4 575 11 222±3 735, 组 间 F=49 536, 根 据 分 析 结 果 LSD 可 知, 相 比 含 SDF 1α50ng/ml 复 合 水 凝 胶 组 和 对 照 组, 含 SDF 1α200ng/ml 复 合 水 凝 胶 组 对 BMSCs 有 明 显 的 趋 化 效 果 (P<0 05), 在 两 实 验 组 中, 又 以 含 SDF 1α200ng/ml 复 合 水 凝 胶 组 趋 化 效 果 较 佳 (P<0 05), 见 图 2 2.3 MTT 法 测 定 细 胞 在 PluronicF 127 凝 胶 中 的 增 殖 随 着 时 间 的 延 长, 两 组 细 胞 测 定 的 OD 值 均 逐 渐 增 高, 在 7d 时 达 到 最 大 在 1 3 5 7d 各 时 间 点, 将 两 组 的 OD 值 进 行 单 因 素 方 差 分 析, 结 果 显 示 :F 值 分 别 为 0 000 1 122 0 153 0 439, 由 分 析 结 果 LSD 得 出 各 时 间 点 两 组 OD 值 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 见 表 1 2.4 BMSCs 在 复 合 水 凝 胶 中 诱 导 成 骨 分 化 的 AKP 检 测 结 果 显 示, 实 验 组 与 对 照 组 的 AKP 在

１９８ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ B A 图 ２ Ｔｒ ａｎｓ ｗ ｌ ｌ迁 移 细 胞 的 结 图 ３ 倒置相差显微镜下茜素红 晶紫染色 １ 染色 ４ Ａ 含 Ｓ ＤＦ １α２ｎｇ ｍｌ复 Ａ 实验 Ａ组 Ｂ 实验 Ｂ组 合 水 凝 胶 组 Ｂ 含 ＳＤＦ １α ５ Ｃ 对照组 ｎｇ ｍｌ复合水凝胶组 Ｃ 对照组 C 珋±ｓ 表 １ ＭＴＴ法检测 ＢＭＳＣｓ在 Ｐｌ ｕｒ ｏｎ ｃｆ １２ ７中的增殖 ｎ ６ ｘ 组别 １ ３ 损位点的骨再生 为了达到这个目的 通过物理吸附 的作用 不同浓度的 ＳＤＦ １α可被装载到水凝胶中 接种后培养时间 ｄ ５ ７ 实验 ２１７± １２４ ４９２± １１７ ６８６± １３１ ９４± １７２ 对照 ２１６± ６２ ５４８± １ ７１８± １９７ ９５６± １５ 从而使获得的复合材料在体外可对 ＳＤＦ １α进行缓 释并对 ＢＭＳＣｓ募集增加 随后可进行体外材料细胞 共同培养的实验 本研究显示 Ｐｌ ｕ ｒ ｏ ｎ ｃｆ １ ２７可作 诱导过程中的表达均逐渐增高 １４ｄ内呈增高 趋 为 ＳＤＦ １α的有效载体 提供一个可控制 ＳＤＦ １α释 势 将各组 ＡＫＰ数值进行组间单因素方差分析 在 放的空间 此外 装载 ＳＤＦ １α的 Ｐｌ ｕｒ ｏ ｎ ｃｆ １２ ７在 诱导 ７ｄ时 组间 Ｆ １ ２１ １８ ８ ＬＳＤ结果显示实验 体外能明显引起 ＢＭＳＣｓ的募集 其对 ＢＭＳＣｓ的募 Ａ Ｂ两组的 ＡＫＰ表达在 ７ｄ时差异无统计学意义 集由实验结果看与装载 Ｓ ＤＦ １α浓度相关 但是否 Ｐ ５ 在 １４ｄ时组间 Ｆ ２ ５ ８１ ＬＳ Ｄ结果显 存在剂量依赖性 则依赖进一步研究明确 示 Ａ组 ＡＫＰ表达高于 Ｂ组 Ｐ ５ 实验 Ａ Ｂ Ｓ ＤＦ １按照其氨基酸序列可归为趋化因子 ＣＸＣ 两组 ＡＫＰ的表达在 ７ １４ｄ均明显高于未加诱导液 亚家族成员 又称为 ＣＸＣＬ１２ 包括 ＳＤＦ １α和 Ｓ ＤＦ ５ 见表 ２ 的对照组 Ｐ １β两种 ＳＤＦ １β比 ＳＤＦ １α多了 ４个氨基酸 人源 性 ＳＤＦ １基因位于 １号染色体长臂 其种群间保守 珋 表２ 实验 Ａ Ｂ组与对照组 ＡＫＰ的表达比较 Ｕ ｇ ｐ ｒ ｏ ｎ ６ ｘ±ｓ 受体 ＣＸＣＲ４特异性结合形成 Ｓ ＤＦ １ ＣＸＣＲ４轴 从 接种后培养时间 ｄ 组别 性极强 可在心 脑 肝 骨骼肌等组织中表达 与其 ７ １４ 而发挥生物学效应 ＣＸＣＲ４是一种 ７次跨膜的 Ｇ 实验 Ａ ７ ８ ６ ６± ７ ９ ６ １７ ９９±３ ８３４ 实验 Ｂ ７ ４ ７± ２ ２ ３ ３ ８ ８ ３± １４ ６ １ ９ １５± ３８３ ７ ９９３± ４７ ７ 蛋白藕连受体 广泛表达于 ＣＤ３４ 细胞及炎症细胞 对照 与对照组比较 Ｐ ５ 与实验 Ｂ组比较 Ｐ ５ 表面 Ｓ ＤＦ １ ＣＸＣＲ４轴可对 ＣＤ３ ４ 细胞及循环淋巴 细胞进行定向性诱导迁移 对造血 神经系统发育及 ２ ５ 矿化结节茜素红染色 诱导培养 １４ｄ后 进 干细胞运动 肿瘤发生等产生重要的生物学作用 行茜素红染色 显微镜下 实验 Ａ Ｂ组的细胞均可 不仅 如 此 ＳＤＦ １ ＣＸＣＲ４轴 还 与 血 管 再 生 关 系 密 见橘红色钙结节团块 其形态 大小不等 而未加成 切 其可募集骨髓源性的干 祖细胞并能诱导细胞分 骨诱导液的对照组则未见钙结节的形成 见图 ３ 泌血管生成因子 从而促进血管新生 ６ 此外 Ｓ ＤＦ ３ 讨论 １还可与内皮祖细胞膜表面受体 ＣＸＣＲ４结合 诱导 成熟或不成熟的祖细胞动员 参与血管的生成 ７ 本研究的目的在于构建一种可释放 ＳＤＦ １α的 Ｐｌ ｕ ｒ ｏ ｎ ｃｆ １ ２７是一种非离子表面活性共聚物 复合水凝胶 作为有生物活性的支架材料 并评价其 ＰＥＯ ＰＰＯ ＰＥＯ 由 聚 氧 乙 烯 ＰＥＯ 与 聚 氧 丙 烯 对 ＢＭＳＣｓ的募集和促分化作用 假定装载 ＳＤＦ １α ＰＰＯ 组成 具有温度依赖性变化的物理特性并可 的水凝胶可诱导 ＢＭＳＣｓ的募集 并因此增强了骨缺 重复发生 在体内约 ６周可完全降解吸收 无明显的

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1099 免 疫 排 斥 反 应 等 特 点 作 为 细 胞 支 架,PluronicF 127 在 组 织 工 程 中 已 广 泛 应 用 于 软 骨 皮 肤 等 的 构 建 本 实 验 表 明 PluronicF 127 与 BMSCs 之 间 的 生 物 相 容 性 良 好,BMSCs 在 复 合 SDF 1α 水 凝 胶 三 维 支 架 中 的 生 长 增 殖 也 较 为 稳 定, 在 此 基 础 上 本 实 验 将 BMSCs 成 功 诱 导 分 化 为 成 骨 细 胞, 由 此, 可 设 想 为 干 细 胞 工 程 治 疗 骨 损 的 研 究 提 供 新 的 思 路 和 方 法 但 在 同 时, 本 研 究 显 示 PluronicF 127 强 度 较 差, 降 解 速 度 较 快, 这 给 体 外 实 验 的 进 行 增 加 了 较 大 的 难 度, 这 些 不 足 在 一 定 程 度 上 限 制 了 其 作 为 骨 修 复 材 料 的 使 用 本 研 究 表 明 装 载 SDF 1α 的 PluronicF 127 新 型 复 合 材 料, 对 MBSCs 具 有 募 集 和 诱 导 成 骨 分 化 的 能 力, 通 过 改 善 骨 创 部 位 的 微 环 境, 来 促 进 内 源 性 BM SCs 在 损 伤 部 位 的 募 集, 参 与 骨 缺 损 修 复, 为 新 型 颌 面 骨 修 复 材 料 的 制 备 提 供 实 验 依 据, 最 终 达 到 治 疗 骨 软 骨 缺 损 的 目 的 然 而, 复 合 SDF 1α 水 凝 胶 对 SDF 1α 的 释 放 规 律 以 及 细 胞 复 合 凝 胶 共 同 培 养 的 具 体 机 制 并 不 明 确, 还 需 进 一 步 的 深 入 研 究 参 考 文 献 [1] FongELS,ChanCK,GoodmanSB.Stemcelhominginmus culoskeletalinjury[j].biomaterials,2011,32(2):395-409. [2] HonczarenkoM,LeYI,SwierkowskiM,etal.Humanbonemar rowstromalcelsexpresadistinctsetofbiologicalyfunctional chemokinereceptors[j].stemcels,2006,24(4):1030-41. [3] PeledA,PetitI,KoletO,etal.Dependenceofhumanstemcel engraftmentandrepopulationofnod/scidmiceoncxcr4[j]. Science,1999,283(5403):845-8. [4] KitaoriT,ItoH,SchwarzEM,etal.Stromalcel derivedfactor 1/CXCR4signalingiscriticalfortherecruitmentofmesenchymal stemcelstothefracturesiteduringskeletalrepairinamouse model[j].arthritis&rheumatism,2009,60(3):813-23. [5] SculeanA,NikolidakisD,SchwarzF.Regenerationofperiodontal tisues:combinationsofbariermembranesandgraftingmaterials biologicalfoundationandpreclinicalevidence:asystematicreview [J].JClinPeriodontol,2008,35(s8):106-16. [6] TakahashiM.RoleoftheSDF 1/CXCR4systeminmyocardialin farction[j].circj,2010,74(3):418-23. [7] PetitI,JinD,RafiS.TheSDF 1 CXCR4signalingpathway:a molecularhubmodulatingneo angiogenesis[j].trendsimmunol, 2007,28(7):299-307. IncorporationofSDF 1αinPluronicF 127hydrogeland itsbiologicalefectonbmscsinvitro TianTian 1,ChengJiguang 2,ZhouJian 1 ( 1 StomatologicHospitalColege,AnhuiMedicalUniversity,KeyLab.ofOralDiseasesResearchof AnhuiProvince,Hefei 230032; 2 StomatologicHospitalColege,AnhuiMedicalUniversity, DeptofOralandMaxilofacialSurgery,Hefei 230032) Abstract Objective TodetecttheefectofPluronicF 127hydrogelcombinedwithstromalcelderivedfactor 1α (SDF 1α)onbonemesenchymalstemcels(BMSCs) biologicalefectinvitro.methods Transwelchamberwas usedtodetecttheefectofpluronicf 127hydrogelcombinedwithvariousconcentrationofSDF 1α(200,50ng/ ml)onbmscs migration.thebmscswereosteogenesisculturedin3 dimensionalscafoldsdf 1α PluronicF 127hydrogel,thenalkalinephosphatase(AKP)activityandalizarinredwasevaluated,andMTTwasusedtoex plorethecytoactiveofbmscsafterculturedinsdf 1α gel.results Theresultofchemotaxisdisplayedthatthe concentrationofsdf 1α200ng/mlinhydrogelhadobviousefectonmigrationofBMSCs(P<0 05).MTTcon firmedpluronicf 127hadnoefectoncelproliferation(P>0 05).Comparedwithcontrolgroup,BMSCs gel groupandpurebmscsgroup sakphadsignificantlyincreasedinthecircumstancesofosteogenesisinduction(p< 0 05),andcalcium nodulecouldbefoundintheinductiongroup.conclusion ThecompositematerialF 127 loadedwithsdf 1αsignificantlypromoteschemotacticmigrationofBMSCsinvitro,BMSCscansurviveandbein duceddiferentiationintoosteoblastinthe3 dimensionalscafoldsdf 1α gel. Keywords stromalcelderivedfactor 1α;PluronicF 127hydrogel;bonemesenchymalstemcels;osteogenicdif ferentiation

1100 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 预 防 医 学 研 究 安 徽 省 长 丰 县 农 村 已 婚 妇 女 焦 虑 现 况 及 其 影 响 因 素 研 究 周 洋 洋 1, 苏 虹 1, 宋 健 1, 郭 亮 亮 1, 程 健 1, 王 旭 1, 金 鎏 1, 孙 业 桓 1 2, 陈 明 春 摘 要 目 的 探 讨 农 村 留 守 妇 女 焦 虑 现 况 及 其 影 响 因 素, 为 开 展 有 针 对 性 的 干 预 提 供 信 息 方 法 采 用 多 阶 段 抽 样 的 方 法 抽 取 长 丰 县 2036 名 农 村 已 婚 妇 女, 运 用 焦 虑 自 评 量 表 (SAS) 匹 兹 堡 睡 眠 质 量 指 数 量 表 (PSQI) 自 编 一 般 情 况 问 卷 进 行 现 场 调 查 结 果 2036 名 农 村 已 婚 妇 女 中 留 守 妇 女 672 名, 占 总 数 的 33 0%; 其 中 40 6% 的 留 守 妇 女 出 现 焦 虑 症 状, 高 于 非 留 守 妇 女 焦 虑 症 状 的 患 病 率 27 5%, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (χ 2 =35 78,P<0 01) 在 不 同 年 龄 段 上 比 较, 留 守 妇 女 的 焦 虑 睡 眠 障 碍 患 病 率 均 高 于 非 留 守 妇 女, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 01) 对 留 守 妇 女 焦 虑 进 行 多 因 素 回 归 分 析, 结 果 显 示 : 健 康 较 差 (OR=2 862,95%CI=1 361 ~34 718) 睡 眠 障 碍 (OR =1 780,95% CI=1 305~ 2 188) 经 常 感 到 孤 独 (OR=1 452,95% CI=1 142~ 1 855) 年 龄 41 岁 (OR =2 419,95% CI=1 636~ 5 031) 留 守 时 间 3 年 (OR=2 013,95% CI=1 269~ 3 625) 是 影 响 留 守 妇 女 焦 虑 的 危 险 因 素 ; 经 常 联 系 (OR= 0 503,95%CI=0 291~0 834) 家 庭 月 收 入 3001 元 (OR =0 481,95%CI=0 063~0 946) 是 影 响 留 守 妇 女 焦 虑 的 保 护 性 因 素 结 论 留 守 妇 女 出 现 焦 虑 症 状 较 为 普 遍, 其 发 生 可 能 是 多 种 因 素 共 同 作 用 的 结 果 在 制 定 干 预 措 施 时, 应 综 合 考 虑 留 守 时 间 夫 妻 联 系 频 率 睡 眠 质 量 等 因 素 关 键 词 中 图 分 类 号 农 村 留 守 妇 女 ; 焦 虑 ; 影 响 因 素 R173 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1100-04 留 守 妇 女 是 指 丈 夫 长 期 ( 通 常 指 半 年 及 半 年 以 上 ) 离 家 进 城 务 工 经 商 或 从 事 其 他 生 产 经 营 活 动 的 农 民 群 体 的 妻 子 [1] 安 徽 是 劳 务 输 出 大 省, 根 据 2007 年 安 徽 统 计 年 鉴 显 示, 全 省 有 农 村 留 守 妇 女 483 万, 约 占 总 人 口 的 10% [2] 由 于 丈 夫 长 年 在 外 务 工, 留 守 妇 女 成 为 农 业 生 产 家 庭 生 活 的 主 体, 加 之 与 丈 夫 的 情 感 交 流 减 少, 导 致 留 守 妇 女 较 易 出 现 2014-02-25 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :81172763) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 流 行 病 与 卫 生 统 计 学 系, 合 肥 230032 2 合 肥 市 长 丰 县 疾 病 控 制 中 心, 合 肥 231100 作 者 简 介 : 周 洋 洋, 男, 硕 士 研 究 生 ; 苏 虹, 女, 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:su hong5151@ sina.com 一 些 心 身 疾 病 和 不 良 情 绪 [3], 然 而 目 前 尚 无 有 关 留 [4] 守 妇 女 焦 虑 的 研 究 根 据 文 献 报 道, 焦 虑 可 增 加 患 冠 心 病 和 心 脏 病 的 机 率, 也 是 女 性 多 囊 卵 巢 综 合 征 的 一 个 独 立 危 险 因 素 [5] 因 此, 该 研 究 以 合 肥 市 长 丰 县 地 区 农 村 留 守 妇 女 为 研 究 对 象, 探 讨 该 特 殊 人 群 焦 虑 的 现 状 及 其 影 响 因 素, 为 有 针 对 性 地 开 展 农 村 留 守 妇 女 焦 虑 的 预 防 干 预, 提 供 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 研 究 对 象 采 用 多 级 抽 样 方 法, 首 先 将 长 丰 县 16 个 乡 镇 开 发 区 根 据 人 口 密 度 分 成 3 层 ; 其 次, 在 每 层 随 机 选 取 1 个 乡 镇 ; 最 后, 在 所 抽 乡 镇 中 随 机 抽 取 若 干 名 农 村 已 婚 妇 女 于 2012 年 9 月 ~2012 年 10 月, 共 发 放 问 卷 2087 份, 全 部 收 回, 剔 除 不 合 格 问 卷 51 份, 得 到 有 效 问 卷 2036 份, 有 效 率 为 97 56% 1.2 方 法 采 用 问 卷 方 式, 由 经 过 培 训 的 调 查 员 对 调 查 者 进 行 施 测, 测 试 前 向 受 试 者 使 用 统 一 指 导 语, 当 场 填 写 并 回 收 问 卷 调 查 内 容 包 括 :1 自 编 一 般 情 况 问 卷 : 包 括 一 般 人 口 学 特 征 留 守 情 况 夫 妻 日 常 联 系 频 率 孤 独 感 身 体 状 况 等 其 中 身 体 状 况, 根 据 调 查 对 象 自 身 的 描 述 分 为 较 好 一 般 较 差 3 个 等 级 ; 孤 独 感 夫 妻 联 系 频 率, 根 据 调 查 对 象 自 身 描 述 分 别 分 为 偶 尔 有 时 经 常, 很 少 有 时 经 常 2 焦 虑 自 评 量 表 (Self RatingAnxietyScale,SAS) [6] : 共 20 个 题 目, 用 于 测 量 过 去 1 周 内 焦 虑 状 态 SAS 的 主 要 统 计 指 标 为 总 分 将 20 个 项 目 的 各 个 得 分 相 加, 即 得 粗 分 ; 用 粗 分 乘 以 1 25 以 后 取 整 数 部 份, 就 得 到 标 准 分,SAS 标 准 分 的 分 界 值 为 50 分, 以 得 分 越 高, 焦 虑 倾 向 越 明 显 3 匹 兹 堡 睡 眠 质 量 指 数 量 表 (Pitsburgh SleepQualityIndex,PSQI) [7] : 量 表 评 定 期 限 为 1 个 月, 由 18 个 自 评 条 目 7 个 成 份 构 成, 每 个 成 份 按 0 ~3 等 级 计 分, 累 积 各 成 份 得 分 即 为 PSQI 总 分, 总 分 范 围 为 0~21, 以 得 分 7 为 界 值, 得 分 越 高, 表 明 睡 眠 质 量 越 差 该 量 表 有 较 好 的 信 效 度 1.3 质 量 控 制 采 用 现 场 问 卷 调 查, 在 获 得 调 查 对

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1101 象 口 头 知 情 同 意 的 情 况 下, 由 经 过 统 一 培 训 的 调 查 员 进 行 面 对 面 问 答 现 场 对 收 回 问 卷 进 行 核 对 检 查, 剔 除 填 写 不 完 整 的 问 卷 1.4 统 计 学 处 理 采 用 EpiData3 1 软 件 进 行 数 据 的 建 库 录 入 应 用 SPSS17 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 两 独 立 样 本 t 检 验 χ 2 检 验, 非 条 件 Logistic 回 归 分 析 对 单 因 素 筛 选 出 的 变 量 (P<0 10), 采 用 多 因 素 Logistic 回 归 分 析, 应 用 逐 步 向 前 法 进 行 模 型 拟 合 2 结 果 2.1 一 般 情 况 共 调 查 2036 名 农 村 已 婚 妇 女, 留 守 妇 女 672 人 (33 0%), 平 均 年 龄 (39 5±6 96) 岁, 其 中 <30 岁 108 人,30~40 岁 181 人,41~50 岁 222 人, 51 岁 161 人 ; 非 留 守 妇 女 1364 人 (67 0%), 平 均 年 龄 (40 3±7 48) 岁, 其 中 <30 岁 189 人,30~40 岁 425 人,41~50 岁 396 人, 51 岁 354 人 年 龄 文 化 程 度 家 庭 收 工 作 情 况 在 留 守 妇 女 组 与 非 留 守 妇 女 组 之 间 的 差 异 均 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 而 身 体 状 况 孤 独 感 在 两 组 之 间 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05), 见 表 1 表 1 留 守 妇 女 与 非 留 守 妇 女 的 一 般 人 口 学 特 征 比 较 [n(%)] 项 目 留 守 妇 女 非 留 守 妇 女 合 计 χ 2 /t 值 P 值 人 数 672(33.0) 1364(67.0) 2036 年 龄 ( 岁 ) 39.5±6.96 40.3±7.48 1.45 0.15 文 化 程 度 0.29 0.87 文 盲 226(33.6) 462(33.9) 688(33.8) 小 学 或 初 中 434(64.6) 873(64.0) 1307(64.2) 高 中 及 以 上 12(1.8) 29(2.1) 41(2.0) 家 庭 月 收 入 ( 元 ) 3.81 0.15 <1000 34(5.0) 67(4.9) 101(5.0) 1000~3000 513(76.3) 1089(79.8) 1602(78.7) 3001 125(18.7) 208(15.3) 333(16.3) 身 体 状 况 13.15<0.01 较 好 67(10.0) 153(11.2) 220(10.8) 一 般 366(54.5) 842(61.7) 1208(59.3) 较 差 239(35.5) 369(27.1) 608(29.9) 工 作 情 况 0.46 0.79 务 农 487(72.4) 987(72.3) 1474(72.4) 非 务 农 工 作 112(16.7) 217(16.0) 329(16.2) 无 73(10.9) 160(11.7) 233(11.4) 孤 独 感 8.16 0.02 经 常 121(18.0) 184(13.5) 305(15.0) 有 时 353(52.5) 727(31.3) 1080(53.1) 偶 尔 198(29.5) 453(55.2) 651(31.9) 2.2 留 守 妇 女 与 非 留 守 妇 女 的 焦 虑 睡 眠 质 量 的 比 较 留 守 妇 女 与 非 留 守 妇 女 的 焦 虑 睡 眠 障 碍 在 < 30 岁 30~40 岁 41~50 岁 51 岁 4 个 年 龄 段 的 患 病 人 数 ( 患 病 率 ), 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P< 0 01), 见 表 2 表 2 留 守 妇 女 与 非 留 守 妇 女 的 焦 虑 睡 眠 质 量 比 较 [n(%)] 年 龄 ( 岁 ) 留 守 妇 女 非 留 守 妇 女 合 计 χ 2 值 P 值 <30 焦 虑 28(25.7) 23(12.1) 51(17.1) 9.27 0.002 睡 眠 障 碍 36(32.9) 22(11.4) 58(19.5) 22.40 <0.001 30~40 焦 虑 58(32.3) 85(20.1) 143(23.7) 10.22 0.002 睡 眠 障 碍 74(40.8) 97(23.0) 171(28.3) 20.15 <0.001 41~50 焦 虑 101(45.4) 125(31.6) 226(36.6) 11.91 0.001 睡 眠 障 碍 106(47.6) 113(28.8) 219(35.4) 22.90 <0.001 51 焦 虑 86(53.4) 141(39.7) 227(44.0) 8.44 0.004 睡 眠 障 碍 82(51.2) 110(31.2) 192(37.2) 18.70 <0.001 合 计 焦 虑 273(40.6) 375(27.5) 648(31.8) 35.78 <0.001 睡 眠 障 碍 298(44.3) 342(25.1) 640(31.4) 47.05 <0.001 2.3 留 守 妇 女 焦 虑 相 关 影 响 因 素 的 Logistic 回 归 分 析 将 留 守 妇 女 是 否 出 现 SAS 总 得 分 50 作 为 因 变 量 (<50=0, 50=1), 并 对 相 关 因 素 进 行 赋 值, 见 表 3 首 先 对 可 能 影 响 焦 虑 的 因 素 作 为 自 变 量, 进 行 单 因 素 非 条 件 Logistic 回 归 分 析 结 果 显 示 : 焦 虑 在 不 同 年 龄 文 化 程 度 身 体 状 况 家 庭 月 收 入 留 守 时 间 联 系 频 率 工 作 孤 独 感 以 及 睡 眠 较 差 的 组 间 存 在 差 异, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 在 单 因 素 分 析 的 基 础 上, 筛 选 P<0 10 的 变 量, 进 行 多 因 素 Logistic 回 归 模 型, 采 用 逐 步 向 前 法 对 模 型 进 行 拟 合 分 析 结 果 显 示 身 体 较 差, 年 龄 41 岁, 留 守 时 间 3 年, 睡 眠 质 量 较 差, 经 常 感 到 孤 独 是 影 响 留 守 妇 女 焦 虑 的 危 险 因 素 ; 经 常 联 系, 家 庭 月 收 入 3001 元 是 保 护 性 因 素, 见 表 4 表 3 变 量 赋 值 情 况 变 量 变 量 赋 值 焦 虑 SAS<50=0;SAS 50=1 年 龄 ( 岁 ) <30=0;30~40=1;41~50=2; 51=3 文 化 程 度 文 盲 =0; 小 学 及 初 中 =1; 高 中 及 以 上 =2 身 体 状 况 较 好 =0; 一 般 =1; 较 差 =2 家 庭 月 收 入 ( 元 ) <1000=0;1000~3000=1; 3001=2 独 居 否 =0; 是 =1 留 守 时 间 ( 年 ) <3=0;3~6=1; 7=2 担 心 丈 夫 否 =0; 是 =1 联 系 频 率 很 少 =0; 有 时 =1; 经 常 =2 工 作 种 地 =0; 非 务 农 工 作 =1; 无 =2 倾 诉 对 象 无 =0; 有 =1 孤 独 感 偶 尔 =0; 有 时 =1; 经 常 =2 睡 眠 质 量 PSQI<7=0;PSQI 7=1

1102 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 4 留 守 妇 女 焦 虑 相 关 因 素 的 多 因 素 非 条 件 Logistic 回 归 分 析 项 目 B Wald OR 值 95% CI P 值 家 庭 月 收 入 ( 元 ) 7.810 0.005 <1000 1 1000~3000-0.463 1.059 1.293 (0.829~2.082) 0.303 3001-0.734 6.256 0.481 (0.063~0.946) 0.012 身 体 状 况 18.227 <0.001 较 好 1 一 般 0.994 6.427 1.692 (1.525~4.754) 0.010 较 差 1.923 16.541 2.862 (1.361~34.718) <0.001 联 系 频 率 12.148 <0.001 很 少 1 有 时 -0.593 2.681 0.658 (0.343~1.116) 0.090 经 常 -0.694 10.291 0.503 (0.291~0.834) 0.001 留 守 时 间 ( 年 ) 15.374 <0.001 <3 1 3~6 0.901 14.482 2.013 (1.269~3.625) <0.001 7 0.193 7.381 1.226 (1.043~2.931) 0.005 睡 眠 质 量 0.394 6.113 1.780 (1.305~2.188) 0.010 年 龄 ( 岁 ) 15.465 <0.001 <30 1 30~40 0.345 0.616 0.265 (0.028~3.170) 0.402 41~50 1.890 13.483 2.419 (1.636~5.031) <0.001 51 0.583 10.141 1.624 (1.051~7.895) 0.002 孤 独 感 10.649 0.001 偶 尔 1 有 时 0.537 3.573 0.727 (0.438~1.205) 0.059 经 常 1.382 9.216 1.452 (1.142~1.855) 0.002 3 讨 论 [3] 调 查 显 示, 本 地 区 农 村 妇 女 留 守 率 为 33 0%, 高 于 2008 年 湖 南 省 调 查 的 留 守 率 30 6%, 原 因 可 能 与 安 徽 省 是 劳 务 输 出 大 省, 外 出 务 工 人 员 较 多 有 关 本 次 研 究 中,40 6% 的 留 守 妇 女 具 有 焦 虑 情 绪, 明 显 高 于 非 留 守 妇 女 的 27 5%, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 ; 两 组 间 各 个 年 龄 段 焦 虑 情 绪 的 差 异 也 都 具 有 统 计 学 意 义, 提 示 留 守 状 态 增 加 各 年 龄 段 妇 女 的 焦 虑 情 绪 多 因 素 非 条 件 Logistic 回 归 分 析 留 守 妇 女 焦 虑 的 影 响 因 素, 最 终 纳 入 的 因 素 有 : 家 庭 月 收 入 身 体 状 况 联 系 频 率 留 守 时 间 睡 眠 质 量 年 龄 孤 独 感 家 庭 月 收 入 高 ( 3001 元 ) 的 留 守 妇 女 具 有 焦 [8-9] 虑 情 绪 危 险 性 较 低, 这 与 国 内 外 的 研 究 结 果 相 一 致 可 能 因 为 较 好 的 经 济 条 件, 能 够 为 居 住 饮 食 就 医 等 方 面 提 供 保 障, 充 分 降 低 留 守 妇 女 的 生 活 压 力 和 精 神 负 担, 进 而 降 低 其 产 生 焦 虑 情 绪 的 风 险 身 体 状 况 较 差 的 留 守 妇 女 较 易 出 现 焦 虑, 这 可 能 由 于 一 些 慢 性 病 妇 科 病 等 躯 体 疾 患 易 继 发 焦 虑 [10-11] 此 外, 农 村 留 守 妇 女 需 要 承 担 繁 杂 的 家 务 劳 动 以 及 繁 重 的 农 业 生 产 活 动, 而 健 康 状 况 差 会 对 农 业 生 产 活 动 及 家 庭 经 济 状 况 产 生 影 响, 这 也 可 能 是 导 致 焦 虑 的 原 因 之 一 本 研 究 显 示, 偶 尔 有 孤 独 感 与 丈 夫 经 常 联 系 的 留 守 妇 女, 焦 虑 情 绪 的 出 现 率 较 低, 可 能 是 通 过 在 与 丈 夫 或 朋 友 的 交 流 过 程 中 经 常 倾 诉, 可 以 缓 解 由 于 情 感 缺 失 带 来 的 负 面 情 绪 有 关 留 守 时 间 3 年 是 影 响 焦 虑 的 危 险 因 素, 造 成 此 种 结 果 的 原 因 可 能 有 : 留 守 时 间 越 长, 留 守 妇 女 独 [12] 自 经 历 生 活 事 件 的 次 数 越 多 有 研 究 表 明, 心 理 应 激 是 包 括 生 活 事 件 ( 应 激 源 ) 应 对 方 式 社 会 支 持 和 身 心 反 应 等 多 种 因 素 的 作 用 系 统 而 生 活 事 件 所 引 发 的 各 种 压 力 反 应, 长 时 间 持 续 的 作 用 于 留 守 妇 女, 将 耗 尽 用 以 调 适 压 力 的 能 力 与 精 力, 从 而 导 致 机 体 产 生 生 理 反 应 以 及 焦 虑 等 心 理 反 应 [13] 焦 虑 是 常 见 的 一 种 心 理 障 碍, 与 睡 眠 障 碍 关 系 密 切 并 可 相 互 影 响 本 研 究 结 果 提 示 睡 眠 障 碍 与 焦 虑 有 密 切 关 联, 这 也 与 Kofeletal [14] 研 究 结 果 相 一 致 本 次 研 究 还 显 示 40 岁 以 上 留 守 妇 女 焦 虑 发 生 [15] 率 较 高, 这 与 之 前 一 些 文 献 结 论 相 一 致 随 着 年 龄 的 增 长, 农 村 留 守 妇 女 往 往 承 担 着 较 多 的 家 庭 社 会 责 任, 加 上 该 年 龄 段 的 人 群 躯 体 健 康 状 况 呈 下 降 趋 势, 身 心 更 可 能 处 于 应 激 状 况, 导 致 发 生 焦 虑 情 绪 的 风 险 增 加 农 村 留 守 妇 女 作 为 家 庭 结 构 中 重 要 的 一 员, 承 担 着 更 多 的 家 庭 责 任, 其 健 康 的 心 理 和 生 理 对 个 人 及 家 庭 都 起 到 重 要 的 作 用 本 研 究 结 果 提 示, 农 村 留 守 妇 女 的 焦 虑 情 绪 较 为 普 遍, 且 影 响 因 素 众 多 为 此, 制 定 干 预 对 策 时 应 综 合 考 虑 心 理 护 理 加 强 夫 妻 双 方 联 系 频 率, 并 把 留 守 时 间 较 长 者 作 为 重 点 干 预 对 象 开 展 健 康 教 育, 积 极 组 织 留 守 妇 女 之 间 的 交 流, 以 缓 解 留 守 带 来 的 焦 虑 情 绪, 提 高 留 守 妇 女 的 健 康 水 平 参 考 文 献 [1] 吴 惠 芳, 饶 静. 农 村 留 守 妇 女 研 究 综 述 [J]. 中 国 农 业 大 学 学 报 ( 社 会 科 学 版 ),2009,26(2):18-23. [2] 张 巧 遇. 安 徽 省 农 村 留 守 妇 女 研 究 [D]. 合 肥 : 安 徽 大 学, 2010. [3] 钟 斌, 姚 树 桥. 农 村 留 守 妇 女 的 抑 郁 症 状 及 相 关 心 理 社 会 因 素 [J]. 中 国 临 床 心 理 学 杂 志,2012,20(6):839-41. [4] RoestAM,MartensEJ,deJongeP,etal.Anxietyandriskof incidentcoronaryheartdisease:ameta analysis[j].jam Col

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1103 Cardiol,2010,56(1):38-46. [5] Veltman VerhulstSM,BoivinJ,EijkemansMJ,etal.Emotional distresisacommonriskinwomenwithpolycysticovarysyn drome:asystematicreviewandmeta analysisof28studies[j]. HumReprodUpdate,2012,18(6):638-51. [6] 汪 向 东, 王 希 林, 马 弘, 等. 心 理 卫 生 评 定 量 表 手 册 [J]. 中 国 心 理 卫 生 杂 志,1999,( 增 刊 ):306-10. [7] 刘 贤 臣, 唐 茂 芹, 胡 蕾, 等. 匹 兹 堡 睡 眠 质 量 指 数 的 信 度 和 效 度 研 究 [J]. 中 华 精 神 科 杂 志,1996,29(2):103-7. [8] GrantBF,HasinDS,StinsonFS,etal.Prevalence,corelates, comorbidity,andcomparativedisabilityofdsm Ⅳ generalized anxietydisorderintheusa:resultsfromthenationalepidemiolog icsurveyonalcoholandrelatedconditions[j].psychological Medicine,2005,35(12):1747-59. [9] 王 小 燕, 方 鹏 骞, 傅 新 巧, 等. 中 部 地 区 城 市 社 区 居 民 焦 虑 流 行 特 点 及 心 理 护 理 服 务 利 用 态 度 调 查 [J]. 医 学 与 社 会,2012,25 (10):74-6. [10] 陆 文, 赵 宝 龙. 女 性 尿 路 感 染 患 者 焦 虑 抑 郁 症 状 发 生 率 调 查 [J]. 吉 林 医 学,2010,28(31):4965-6. [11] 付 朝 伟, 徐 飚, 栾 荣 生, 等. 大 城 市 综 合 医 院 冠 心 病 病 人 抑 郁 / 焦 虑 影 响 因 素 探 讨 [J]. 卫 生 研 究,2006,5(35):63-6. [12] 姜 乾 金. 医 学 心 理 学 [M].4 版. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社,2004: 88-99. [13] 栾 荣 生. 心 血 管 疾 病 与 心 理 社 会 因 素 [M]. 北 京 : 北 京 医 科 大 学 中 国 协 和 医 科 大 学 联 合 出 版 社,1994:205-6. [14] KofelE,WatsonD.Thetwo factorstructureofsleepcomplaints anditsrelationtodepresionandanxiety[j].jabnormpsychol, 2009,118(1):183-94. [15] 朱 大 方, 徐 水 洋, 杨 清, 等. 浙 江 省 城 市 居 民 焦 虑 抑 郁 现 状 及 影 响 因 素 [J]. 中 国 公 共 卫 生,2010,26(4):429-31. Studyonthecurrentstatusandinfluentialfactorsofanxietyof marriedwomeninruralareasofanhuiprovince ZhouYangyang,SuHong,SongJian,etal (DeptofEpidemiologyandBiostatistics,SchoolofPublicHealth,AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230032) Abstract Objective Toinvestigatetheprevalenceofanxietyandtheefectfactorsamongleft behindwomenin ruralareas.methods Withmultistagesamplingmethod,2036left behindwomenweremeasuredwithpitsburgh SleepQualityIndex(PSQI),Self RatingAnxietyScale(SAS)andaself administeredquestionnaireduringsep tember,2012tooctober,2012.results 672left behindwomen,accountingfor33 0% ofthetotalwomen,were surveyedinthisinvestigation.theprevalenceratesofanxiety,amongleft behindwomenandnon left behind womenwere40 6%,27 5%,respectively.Thediferenceofanxietybetweenleft behindwomenandnon left be hindwomenwasobviouslysignificant(χ 2 =35 78,P<0 01).Comparedwithnon left behindwomen,thedifer encesoftheprevalenceofanxietyandsleepdisorderwerestatisticalysignificantregardingagediferences.results frommultivariatelogisticregresionanalysisindicatedthatphysicalhealthstatus(or=2 862,95%CI=1 361~ 34 718),sleepdisorder(OR=1.780,95% CI=1 305~2 188),alone(OR=1 452,95% CI=1 142~ 1 855),elder( 41,OR=2.419,95%CI=1 636~5 031),timeofleft behind( 3years,OR=2.013, 95%CI=1 269~3 625)weretheriskfactors.Whileregularintouch(OR=0 503,95%CI=0 291~0 834), monthlyfamilyincome( 3001Yuan,OR=0 481,95%CI=0 063~0 946)wasprotectivefactors.Conclu sion Ourfindingsindicatethatthestatusofanxietyamongtheleft behindwomenisserious.itsoccurencemay betheresultofmanyfactors;thedevelopmentofpreventivemeasuresmustbeconsideredpsychologicalcareand strengtheningthelinkagesbetweenhusbandandwifetoimprovethequalityofsleepbehindwomen. Keywords left behindwomen;anxiety;influencingfactors

1104 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 药 学 研 究 白 藜 芦 醇 改 善 高 脂 血 症 小 鼠 脂 肪 组 织 胰 岛 素 抵 抗 的 机 制 探 讨 陈 莉 1,2, 陈 冠 军 3, 陈 兵 1, 程 静 静 1 1, 鲁 云 霞 摘 要 目 的 探 讨 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 2 种 白 色 脂 肪 组 织 胰 岛 素 抵 抗 相 关 基 因 瘦 素 (Leptin) 肿 瘤 坏 死 因 子 α (TNF α) 和 葡 萄 糖 调 节 蛋 白 78(GRP78) 表 达 的 影 响 方 法 24 只 雄 性 C57BL/6 小 鼠 随 机 分 为 标 准 饮 食 组 (SCD) 高 热 量 高 胆 固 醇 饮 食 组 (HCD) 及 高 热 量 高 胆 固 醇 饮 食 + 白 藜 芦 醇 组 [HCD+RES, 白 藜 芦 醇 400mg/(kg d),12 周 ] 葡 萄 糖 耐 量 实 验 和 胰 岛 素 耐 量 实 验 分 析 胰 岛 素 抵 抗 的 改 善 作 用, 检 测 血 脂 指 标, 称 取 皮 下 脂 肪 (SAT) 和 肾 周 脂 肪 组 织 (VAT) 重 量,HE 染 色 检 测 脂 肪 组 织 的 病 理 学 变 化, 免 疫 组 化 和 实 时 荧 光 定 量 PCR 分 析 Leptin TNF α GRP78 的 胞 内 分 布 和 基 因 表 达 的 改 变 结 果 HCD 组 小 鼠 出 现 明 显 的 胰 岛 素 抵 抗, 血 清 总 胆 固 醇 (TC) 三 酰 甘 油 (TG) 低 密 度 脂 蛋 白 C(LDL C) 显 著 增 高, 高 密 度 脂 蛋 白 C(HDL C) 明 显 降 低, 体 重 SAT VAT 的 重 量 均 明 显 增 加, 脂 肪 细 胞 体 积 明 显 增 大, Leptin TNF α GRP78 的 mrna 和 蛋 白 表 达 显 著 增 加, 且 均 位 于 胞 质 中 ; 白 藜 芦 醇 能 显 著 改 善 胰 岛 素 抵 抗, 明 显 降 低 体 重 和 逆 转 血 脂 水 平 变 化, 明 显 下 调 SAT 和 VAT 中 Leptin TNF α GRP78 的 蛋 白 表 达 和 分 布, 显 著 降 低 SAT 中 Leptin TNF α GRP78 和 VAT 中 Leptin TNF αmrna 的 表 达 结 论 白 藜 芦 醇 具 有 明 显 的 改 善 胰 岛 素 抵 抗 和 降 脂 作 用, 其 机 制 可 能 是 通 过 抗 炎 减 少 Leptin 表 达 和 内 质 网 (ER) 应 激 有 关, 但 对 不 同 部 位 白 色 脂 肪 组 织 基 因 表 达 的 影 响 差 异 不 大 关 键 词 抵 抗 中 图 分 类 号 白 藜 芦 醇 ; 高 脂 血 症 ; 小 鼠 ; 白 色 脂 肪 组 织 ; 胰 岛 素 R615;R332;R446.41 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1104-06 脂 肪 组 织 不 仅 参 与 能 量 的 储 存, 也 是 重 要 的 内 分 泌 器 官, 能 分 泌 多 种 不 同 的 生 物 活 性 物 质, 如 瘦 素 (Leptin) 肿 瘤 坏 死 因 子 α(tumornecrosisfactor α, TNF α) 视 黄 醇 结 合 蛋 白 4(retinolbindingprotein, 2014-04-12 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :1208085MH168 1308085MH154); 安 徽 医 科 大 学 校 级 博 士 基 金 ( 编 号 : XJ201013) 1 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 生 物 化 学 教 研 室 3 化 学 教 研 室, 合 肥 230032 2 安 徽 医 科 大 学 附 属 省 立 医 院 检 验 科, 合 肥 230001 作 者 简 介 : 陈 莉, 女, 硕 士 研 究 生 ; 鲁 云 霞, 女, 副 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:wwwd luyx@sina.com RBP4) 抵 抗 素 (resistin) 等 多 种 脂 肪 因 子 [1-2] 研 [3] 究 表 明 胰 岛 素 抵 抗 与 脂 肪 组 织 中 激 活 的 内 质 网 (endoplasmicreticulum,er) 应 激 有 关 [4-5] 脂 肪 细 胞 具 有 ER, 过 度 的 ER 应 激 可 能 会 导 致 细 胞 功 能 受 损 甚 至 凋 亡, 并 伴 随 脂 肪 因 子 炎 症 细 胞 因 子 表 达 的 改 变, 最 终 导 致 胰 岛 素 抵 抗 的 发 生 [6] 白 藜 芦 醇 是 一 种 天 然 的 非 黄 酮 类 多 酚 化 合 物, 具 有 抗 炎 抗 氧 化 抗 肿 瘤 和 延 缓 衰 老 等 功 效 [7] [8] 既 往 报 道 称 白 藜 芦 醇 抑 制 前 脂 肪 细 胞 增 殖 和 向 成 熟 脂 肪 细 胞 分 化, 且 由 于 其 毒 性 较 小, 可 能 开 发 成 有 效 的 减 肥 降 脂 药 物, 但 是 关 于 白 藜 芦 醇 是 否 能 同 时 改 善 不 同 部 位 脂 肪 组 织 中 炎 性 激 活 Leptin 表 达 和 ER 应 激 的 研 究 较 少 该 研 究 以 高 脂 血 症 小 鼠 为 研 究 对 象, 探 讨 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 2 种 典 型 的 白 色 脂 肪 组 织 : 皮 下 脂 肪 组 织 (subcutaneousadiposetisue,sat) 和 肾 周 脂 肪 组 织 (visceraladiposetisue,vat) 中 炎 性 激 活 Leptin 表 达 和 ER 应 激 相 关 基 因 的 表 达 的 影 响 ; 由 于 白 藜 芦 醇 是 天 然 无 毒 化 合 物, 但 作 用 较 缓 [9] 慢, 因 此 参 照 文 献 选 取 单 一 的 较 高 剂 量 白 藜 芦 醇 400mg/(kg d) 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 动 物 8 周 龄 C57BL/6 小 鼠 24 只, 清 洁 级, 雄 性, 体 重 (21 43±2 08)g, 由 安 徽 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心 提 供, 适 应 性 饲 养 1 周 后 实 验 1.2 主 要 试 剂 白 藜 芦 醇 ( 南 京 泽 朗 医 药 科 学 技 术 有 限 公 司 );RNAStore 样 品 保 存 液 ( 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ); 兔 抗 鼠 葡 萄 糖 调 节 蛋 白 78(glucose regulatedprotein,grp78) 一 抗 ( 美 国 Abcam 公 司 ); 兔 抗 鼠 Leptin TNF α 一 抗 山 羊 抗 兔 及 山 羊 抗 鼠 辣 根 过 氧 化 物 酶 抗 体 ( 武 汉 博 士 德 生 物 技 术 有 限 公 司 );TRIzol 试 剂 ( 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 ); 逆 转 录 试 剂 盒 Revert TM FirstStrandcDNA SynthesisKit ( 立 陶 宛 FermentasLifeSciences 公 司 );GRP78 Lep tin TNF α GAPDH 引 物 ( 上 海 生 工 生 物 工 程 公 司 ); itaq TM UniversalSYBR Greensupermix( 美 国 Bio Rad 公 司 ) 1.3 造 模 及 分 组 将 C57BL/6 小 鼠 随 机 分 为 标 准

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1105 饮 食 组 (SCD) 高 热 量 高 胆 固 醇 饮 食 组 (HCD,20% 猪 油 20% 蔗 糖 10% 蛋 黄 粉 1% 胆 固 醇 ) 和 高 热 量 高 胆 固 醇 饮 食 + 白 藜 芦 醇 组 (HCD+RES) 除 SCD 组 外, 其 余 两 组 均 为 HCD 喂 养,HCD+RES 组 在 HCD 的 同 时 灌 胃 白 藜 芦 醇 400mg/(kg d) 治 疗 12 周 操 作 均 遵 守 安 徽 医 科 大 学 实 验 动 物 伦 理 委 员 会 要 求 1.4 葡 萄 糖 耐 量 (glucosetolerancetest,gtt) 和 胰 岛 素 耐 量 实 验 (insulintolerancetest,itt) 小 鼠 禁 食 12h 后, 灌 胃 给 予 葡 萄 糖 2g/kg, 分 别 于 0 30 60 90 120min 鼠 尾 采 血 测 定 血 糖 水 平, 行 GTT; 小 鼠 禁 食 4h 后, 腹 腔 注 射 胰 岛 素 0.1U/kg, 分 别 于 0 30 60 90 120min 采 血 测 定 血 糖 值, 行 ITT 采 血 量 约 为 5μl, 采 血 过 程 中 小 鼠 生 命 体 征 平 稳 1.5 小 鼠 血 标 本 及 组 织 留 取 所 有 小 鼠 禁 食 12h, 称 重, 麻 醉, 腹 主 动 脉 采 血, 常 规 制 备 血 清, 测 定 总 胆 固 醇 (totalcholesterol,tc) 三 酰 甘 油 (triglyceride, TG) 高 密 度 脂 蛋 白 (highdensitylipoprotein choles terol,hdl C) 和 低 密 度 脂 蛋 白 (lowdensitylipopro tein cholesterol,ldl C) 的 浓 度 (OlympusAU640 全 自 动 生 化 分 析 仪 ) 完 整 分 离 小 鼠 SAT 及 VAT( 代 表 内 脏 脂 肪 组 织 ), 电 子 天 平 称 重, 计 算 2 种 脂 肪 组 织 占 体 重 的 比 例 (g/g) 一 部 分 甲 醛 中 固 定, 另 一 部 分 在 预 冷 的 1 DEPC 水 中 清 洗 后 置 于 RNAStore 样 品 保 存 液 中,4 过 夜 后 倾 去 保 护 液, 储 存 在 -80 冰 箱 中 备 用 1.6 病 理 形 态 学 观 察 每 只 小 鼠 的 2 种 脂 肪 组 织 均 以 10% 中 性 多 聚 甲 醛 固 定, 石 蜡 包 埋 切 片, 常 规 HE 染 色, 光 镜 下 观 察 并 拍 照, 每 个 组 织 随 机 取 5 个 视 野 ( 200), 测 定 约 300 个 细 胞 的 大 小 1.7 免 疫 组 化 分 析 石 蜡 包 埋 脂 肪 组 织 以 4μm 连 续 切 片,SABC 法 进 行 Leptin TNF α GRP78 的 免 疫 组 化 分 析, 一 抗 为 羊 抗 兔 的 多 克 隆 抗 体,DAB 显 色, 脱 水 透 明 和 封 片, 光 镜 下 观 察 并 拍 照, 每 张 切 片 随 机 选 取 5 个 视 野, 再 用 metamorph 生 物 图 像 软 件 计 算 各 组 免 疫 阳 性 细 胞 的 平 均 光 密 度 值 (integral opticaldensity,iod) 1.8 实 时 荧 光 定 量 PCR 分 析 从 100mg 脂 肪 组 织 提 取 总 RNA, 取 RNA3μg 逆 转 录 合 成 cdna, 在 StepOnePlus(ABI 公 司 ) 上 进 行 实 时 荧 光 定 量 PCR 分 析 内 参 GAPDH 上 游 :5 TGTGTCCGTCGTG GATCTGA 3, 下 游 :5 CCTGCTTCAC CACCTTCTT GAT 3 Leptin 上 游 :5 GAGACCCCTGTGTCGGT TC 3, 下 游 :5 CTGCGTGTGTGAAATGTCATTG 3 TNF α 上 游 :5 CCCTCACACTCA GATCATCTTCT 3, 下 游 :5 GCTACGACGTGGGCTACAG 3 GRP78 上 游 :5 TGTGGTACCCACCAAGAAGTC 3, 下 游 :5 TTCAGCTGTCACTCGGAGAAT 3 反 应 体 系 为 20 μl, 反 应 条 件 为 95 30s 预 变 性,95 5s,60 30s,40 个 循 环 通 过 计 算 2 -ΔΔCt 得 出 各 组 基 因 的 相 对 表 达 水 平 1.9 统 计 学 处 理 采 用 SPSS13.0 统 计 软 件 进 行 分 析, 计 量 资 料 以 x±s 珋 表 示, 多 组 间 均 数 比 较 采 用 方 差 分 析 (ANOVA), 两 两 比 较 采 用 最 小 显 著 差 异 法 (LSD 法 ) 2 结 果 2.1 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 胰 岛 素 抵 抗 的 影 响 GTT 和 ITT 实 验 均 表 明 HCD 组 小 鼠 空 腹 血 糖 比 SCD 和 HCD+RES 组 高, 注 射 葡 萄 糖 30min 后 血 糖 达 到 峰 值, 且 明 显 高 于 SCD 和 HCD+RES 组 ;HCD +RES 各 时 间 点 的 血 糖 值 介 于 SCD 和 HCD 组 之 间, 表 明 白 藜 芦 醇 有 明 显 的 改 善 胰 岛 素 抵 抗 的 作 用, 见 图 1 2.2 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 血 脂 指 标 的 影 响 与 SCD 组 比 较,HCD 组 小 鼠 TC TG LDL C 均 显 著 升 高,HDL C 明 显 降 低 (P<0 05,P<0 01);HCD+ RES 组 TG LDL C 均 显 著 低 于 HCD 组,HDL C 显 著 升 高 (P<0 05), 而 TC 与 HCD 组 比 较 降 低 不 明 显, 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 见 表 1 表 1 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 血 脂 指 标 的 影 响 (n=8, x±s) 珋 组 别 TC TG HDL C LDL C (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) SCD 1.49±0.43 0.34±0.07 1.84±0.31 0.18±0.05 HCD 3.10±0.42 0.60±0.05 1.28±0.35 0.74±0.12 HCD+RES 2.80±0.36 0.41±0.10 # 1.72±0.36 # 0.47±0.09 # F 值 22.797 26.293 6.565 57.712 与 SCD 组 比 较 : P<0.05, P<0.01; 与 HCD 组 比 较 : # P<0 05 2.3 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 体 重 及 SAT VAT 的 影 响 与 SCD 组 比 较,HCD 组 小 鼠 体 重 SAT VAT 均 显 著 升 高 ; 与 HCD 组 比 较,HCD+RES 组 小 鼠 体 重 显 著 下 降 (P<0 05),SAT 和 VAT 组 织 SAT/ 体 重 和 VAT/ 体 重 的 比 值 均 降 低, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 见 表 2 2.4 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 脂 肪 细 胞 病 理 学 的 影 响 与 SCD 组 相 比,HCD 组 小 鼠 的 SAT 和 VAT 中 脂 肪 细 胞 的 体 积 明 显 增 大, 且 细 胞 大 小 不 一, 出 现

1106 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) A 25 B 16 20 (mmol/l) 15 10 5 HCD HCD+RES SCD (mmol/l) 10 6 HCD HCD+RES SCD C (GTT) 0 2 500 2 000 1 500 1 000 500 0 30 60 90 120 (min) SCD HCD HCD+RES * ** (ITT) 0 D 2 000 1 500 1 000 500 0 30 60 90 120 (min) SCD HCD HCD+RES * ** 0 1 2 3 0 1 2 3 图 1 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 胰 岛 素 抵 抗 的 影 响 A:GTT;B:ITT;C:GTT 曲 线 下 面 积 ;D:ITT 曲 线 下 面 积 ;1:SCD 组 ;2:HCD 组 ;3:HCD+RES 组 表 2 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 体 重 和 脂 肪 重 量 的 影 响 (n=8, x±s) 珋 组 别 体 重 (g) SAT(g) VAT(g) SAT/ 体 重 VAT/ 体 重 SCD 32.33±1.96 0.47±0.06 0.27±0.11 0.015±0.001 0.008±0.003 HCD 35.67±1.96 1.46±0.29 1.45±0.28 0.041±0.008 0.040±0.009 HCD+RES 31.00±3.03 # 0.98±0.32 1.00±0.41 0.032±0.010 0.030±0.010 F 值 6.142 21.927 24.334 与 SCD 组 比 较 : P<0.05, P<0.01; 与 HCD 组 比 较 : # P<0.05 冠 状 结 构 (crown likestructures,cls)( 见 图 2 中 箭 头 所 示 ); 与 HCD 组 相 比,HCD+RES 组 的 SAT 和 VAT 中 脂 肪 细 胞 明 显 变 小, 几 乎 无 CLS 脂 肪 细 胞 大 小 的 测 量 结 果 表 明, 高 脂 可 诱 导 SAT 和 VAT 中 的 脂 肪 细 胞 体 积 显 著 增 大, 白 藜 芦 醇 则 可 使 脂 肪 细 胞 体 积 明 显 减 小 (P<0 01), 见 表 3 表 3 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 脂 肪 细 胞 大 小 的 影 响 (μm, x±s) 珋 组 别 SAT VAT SCD 45.71±0.40 67.80±0.64 HCD 91.47±0.81 112.85±1.86 HCD+RES 40.25±0.36 ## 70.20±0.54 ## F 值 24.006 116.639 与 SCD 组 比 较 : P<0.05; 与 HCD 组 比 较 : ## P<0 01 2.5 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 脂 肪 组 织 蛋 白 表 达 的 影 响 与 SCD 组 相 比,HCD 组 小 鼠 的 SAT 和 VAT 中 Leptin TNF α 和 GRP78 蛋 白 表 达 水 平 均 明 显 升 高, 且 主 要 分 布 在 胞 质 中 ;HCD+RES 组 小 鼠 SAT 和 VAT 中 Leptin TNF α 和 GRP78 的 蛋 白 表 达 均 明 显 减 少, 见 图 3~5; 免 疫 组 化 的 半 定 量 结 果 表 明,SCD 组 和 HCD 组 HCD 组 和 HCD+RES 组 间 各 基 因 的 蛋 白 表 达 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P<0 05), 见 表 4 2.6 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 脂 肪 组 织 mrna 表 达 的 影 响 与 SCD 组 相 比,HCD 组 小 鼠 SAT VAT 中 Leptin TNF α GRP78mRNA 表 达 显 著 增 高 (P< 0 05) 与 HCD 组 相 比,HCD+RES 组 SAT 中 Lep tin TNF α GRP78mRNA 表 达 明 显 降 低 ;HCD + RES 组 VAT 中 Leptin TNF αmrna 表 达 明 显 降 低 (P<0 05), 而 GRP78 的 mrna 表 达 虽 然 降 低, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 见 图 6

安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ 图 ２ ＳＡＴ和 ＶＡＴ组织的 ＨＥ染色图片 ２ ＣＤ组 Ｂ ＨＣＤ组 Ｃ ＨＣＤ ＲＥＳ组 １ ＳＡＴ组织 ２ ＶＡＴ组织 Ａ Ｓ １１７ 图 ４ ＳＡＴ和 ＶＡＴ组织的 ＴＮＦ Ｐ ２ α免疫组化图片 Ｓ ＣＤ组 Ｂ ＨＣＤ组 Ｃ ＨＣＤ ＲＥＳ组 １ Ｓ ＡＴ组织 ２ ＶＡＴ组织 Ａ Ｓ 图 ３ ＳＡＴ和 ＶＡＴ组织的 Ｌ ｐ ｎ免疫组化图片 ＳＰ ２ 图 ５ ＳＡＴ和 ＶＡＴ组织的 ＧＲＰ７ ８免疫组化图片 Ｓ Ｐ ２ １ ＳＡＴ组织 ２ ＶＡＴ组织 Ａ ＳＣＤ组 Ｂ ＨＣＤ组 Ｃ ＨＣＤ ＲＥＳ组 Ａ Ｓ ＣＤ组 Ｂ ＨＣＤ组 Ｃ ＨＣＤ ＲＥＳ组 １ Ｓ ＡＴ组织 ２ ＶＡＴ组织 ３ 讨论 脂血症小鼠的降脂作用报道虽然较多 １ １１ 但尚无 其对不同脂肪组织基因表达影响的报道 本文的通 白藜芦醇是一类天然的抗氧化剂 可降低血液 黏稠度 抑制血小板聚集等功效 有关白藜芦醇对高 过研究白藜芦醇对高脂血症小鼠不同脂肪组织基因 表达的影响 探讨白藜芦醇改善胰岛素抵抗的机制

1108 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 4 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 脂 肪 组 织 蛋 白 表 达 的 影 响 (IOD, x±s) 珋 组 别 SAT VAT Leptin TNF α GRP78 Leptin TNF α GRP78 SCD 0.073±0.006 0.088±0.01 0.085±0.008 0.063±0.007 0.070±0.005 0.078±0.008 HCD 0.124±0.010 0.150±0.010 0.101±0.018 0.159±0.014 0.190±0.001 0.090±0.003 HCD+RES 0.104±0.007 # 0.070±0.007 ## 0.078±0.004 0.110±0.011 # 0.110±0.009 ## 0.075±0.008 # F 值 35.617 54.160 3.146 55.638 164.658 4.167 与 SCD 组 比 较 : P<0 05; 与 HCD 组 比 较 : # P<0.05 图 6 SAT 和 VAT 组 织 mrna 表 达 水 平 分 析 A:Leptin;B:TNF α;c:grp78;1:scd 组 ;2:HCD 组 ;3:HCD+ RES 组 ; 与 SCD 组 比 较 : P<0.05; 与 HCD 组 比 较 : # P<0.05 同 时 比 较 白 藜 芦 醇 在 抗 炎 和 缓 解 ER 应 激 时 是 否 存 在 差 异 本 实 验 显 示 HCD 饮 食 喂 养 3 个 月 后,HCD 组 小 鼠 的 血 脂 指 标 TG TC LDL C 显 著 增 加,HDL C 明 显 降 低, 体 重 SAT 和 VAT 重 量 均 明 显 增 加,GTT 和 ITT 实 验 结 果 表 明 成 功 建 立 了 胰 岛 素 抵 抗 模 型 ; HCD+RES 组 血 清 TC TG LDL C 与 HCD 组 相 比 显 著 下 降, 小 鼠 体 重 明 显 下 降,SAT 和 VAT 重 量 也 有 所 下 降,HCD+RES 组 各 时 间 点 血 糖 和 胰 岛 素 水 平 均 低 于 HCD 组, 表 明 白 藜 芦 醇 具 有 较 好 的 改 善 胰 岛 素 抵 抗 和 高 脂 血 症 的 作 用 Leptin 是 成 熟 脂 肪 细 胞 分 泌 的 细 胞 因 子, 当 动 物 和 人 体 重 增 加 时 脂 肪 组 织 通 过 分 泌 Leptin 作 用 于 中 枢 神 经 系 统 来 降 低 体 重, 但 肥 胖 时 会 出 现 Leptin 抵 抗 本 实 验 中 白 藜 芦 醇 减 少 Leptin 表 达 的 机 制 可 能 是 通 过 抑 制 脂 肪 细 胞 的 分 化 [7] [12] 有 报 道 称 TNF α 水 平 与 体 重 呈 正 相 关, 肥 胖 者 TNF α 水 平 显 著 增 高, 体 重 减 轻 后 TNF α 水 平 也 随 之 降 低, 本 实 验 观 察 到 HCD 组 小 鼠 SAT 和 VAT 中 TNF α Leptin 表 达 均 明 显 增 加,HCD+RES 组 小 鼠 TNF α Leptin 表 达 明 显 降 低, 与 SAT 和 VAT 的 改 变 一 致, 这 表 明 白 藜 芦 醇 减 少 脂 肪 组 织 TNF α 和 Leptin 表 达 可 能 与 减 少 SAT 和 VAT 重 量 有 关 白 藜 芦 醇 是 天 然 的 自 由 基 清 除 剂, 能 有 效 降 低 高 脂 引 起 的 氧 化 应 激, 而 氧 化 应 激 与 ER 应 激 密 切 相 关, 故 推 测 白 藜 芦 醇 可 能 也 会 影 响 高 脂 血 症 小 鼠 脂 肪 组 织 中 的 ER 应 激 GRP78 是 参 与 ER 蛋 白 质 折 叠 和 转 运 的 一 种 重 要 分 子 伴 侣, 生 理 状 态 下, GRP78 与 ER 膜 上 无 活 性 的 跨 膜 蛋 白 ATF6 PERK IRE1 结 合 在 低 氧 低 葡 萄 糖 低 Ca 2+ 和 高 脂 等 应 激 状 态 下,GRP78 与 三 种 跨 膜 蛋 白 分 离, 转 而 与 未 折 叠 蛋 白 结 合, 导 致 未 折 叠 蛋 白 反 应 (UPR) 研 [13] 究 表 明 TG 是 引 起 ER 应 激 标 志 物 GRP78 等 增 加 的 重 要 因 素 本 实 验 中, 由 于 血 清 TG 的 明 显 增 加,HCD 组 小 鼠 SAT 和 VAT 组 织 的 GRP78 表 达 显 著 增 加, 表 明 小 鼠 脂 肪 组 织 已 出 现 明 显 的 ER 应 激 ; 白 藜 芦 醇 组 小 鼠 SAT 组 织 GRP78 的 表 达 显 著 下 降, VAT 组 织 GRP78 的 表 达 也 有 所 下 降, 提 示 白 藜 芦 醇 可 能 是 通 过 减 少 GRP78 的 表 达 来 改 善 脂 肪 组 织 的 ER 应 激, 但 不 同 部 位 白 色 脂 肪 组 织 基 因 表 达 的 差 异 不 大 参 考 文 献 [1] LowS,ChinM C,Deurenberg YapM.Reviewonepidemicofo

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1109 besity[j].annacadmedsingapore,2009,38(1):57-9. [2] OuchiN,ParkerJL,LugusJ,etal.Adipokinesininflammation andmetabolicdisease[j].natrevimmunol,2011,11(2):85-97. [3] KawasakinN,AsadaR,SaitoA,etal.Obesity inducedendo plasmicreticulumstrescauseschronicinflammationinadiposetis sue[j].scirep,2012,2:799. [4] CnopM,FoufeleF,VelosoLA.Endoplasmicreticulumstres, obesityanddiabetes[j].trendsmolmed,2012,18(1):59-68. [5] HosoiT,OzawaK. Endoplasmicreticulum stresin disease: mechanismsandtherapeuticopportunities[j].clinsci(lond), 2009,118(1):19-29. [6] GregorM,HotamisligilGS.Thematicreviewseries:Adipocyte Biology.Adipocytestres:theendoplasmicreticulumandmetabol icdisease[j].jlipidres,2007,48(9):1905-14. [7] YuW,FuYC,WangW.Celularandmolecularefectsofres veratrolinhealthanddiseases[j].jcelbiochem,2012,113 (3):752-9. [8] 陈 思 凡, 肖 新 才, 孙 延 霜, 等. 白 藜 芦 醇 对 小 鼠 3T3 L1 细 胞 增 殖 与 分 化 的 影 响 及 其 机 制 [J]. 中 国 药 理 学 通 报,2010,26 (1):108-11. [9] LagougeM,ArgmannC,Gerhart HinesZ,etal.Resveratrolim provesmitochondrialfunctionandprotectsagainstmetabolicdis easebyactivatingsirt1andpgc 1alpha[J].Cel,2006,127 (6):1109-22. [10]AubinM C,LajoieC,ClémentR,etal.Femaleratsfedahigh fat dietwereasociatedwithvasculardysfunctionandcardiacfibrosis intheabsenceofovertobesityandhyperlipidemia:therapeuticpo tentialofresveratrol[j].jpharmacolexpther,2008,325(3): 961-8. [11] 李 萍, 杜 洪 霞, 李 新 华, 等. 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 大 鼠 血 脂 血 小 板 聚 集 释 放 功 能 的 影 响 [J]. 细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志, 2010,26(5):502-3. [12] 赵 水 平, 吴 洁. 非 诺 贝 特 对 高 脂 血 症 兔 血 清 及 脂 肪 细 胞 分 泌 肿 瘤 坏 死 因 子 α 的 影 响 [J]. 中 国 药 理 学 通 报,2005,21(2): 157-61. [13] KimDS,JeongSK,KimHR,etal.EfectsoftriglycerideonER stresandinsulinresistance[j].biochembiophysrescommun, 2007,363(1):140-5. Researchofmechanismsofresveratrolimprovinginsulinresistance inwhiteadiposetisuesofhyperlipidemicmice ChenLi 1,2,ChenGuanjun 3,ChenBing 1,etal ( 1 DeptofBiochemistryandMolecularBiology, 3 DeptofChemistry,AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230032; 2 DeptofMedicalLaboratory,TheAfiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230001) Abstract Objective Tostudytheinfluencesofresveratroloninsulin resistancerelatedgeneexpresionoflep tin,tnf α,glucoseregulatedprotein78(grp78)intwodiferentadiposetisuesofhyperlipidemicmice.meth ods Twenty fourc57bl/6micewererandomlydividedintostandardcontroldiet(scd),high calorieandhigh cholestroldiet(hcd)andhigh calorieandhigh cholestroldietgrouptreatedwithresveratrol[hcd+res,400 mg/(kg d),12weeks].glucosetolerancetest(gtt)andinsulintolerancetest(itt)wereusedtoanalyzethe improvementoninsulinresistance.theserumlipidindicesweredetected,thebodyweight,subcutaneousadipose tisues(sat)andvisceraladiposetisues(vat)wereweighedrespectively.thepathologicalchangesoftwoadi posetisuesweredetectedwithhestaining,theproteindistributionandmrna levelsofleptin,tnf αand GRP78weremeasuredwithimmunohistochemistryandreal timefluorescencequantificationrt PCRrespectively. Results ComparedwithSCDgroupmice,micefedwithHCDshowedobviousinsulinresistance,higherserumlev elsoftotalcholesterol(tc),triglyceride(tg)andlowdensitylipoprotein cholesterol(ldl C)andlowerserumlev elofhighdensitylipoprotein cholesterol(hdl C),thebodyweight,weightofSATandVAT,celvolumeofadi pocyteswerealsoobviouslyincreased.themrnaandproteinlevelsofleptin,tnf αandgrp78wereremark ablyaugmented,mainlydistributedincytosol.resveratrolcouldobviouslyimproveinsulinresistance,reversethe serumlipidlevelsandbodyweight,decreasetheproteinexpresionanddistributionofleptin,tnf αandgrp78 insatandvat,reducethemrnaexpresionofletpin,tnf α,grp78insat,andleptin,tnf αinvatre spectively.conclusion Resveratrolhasobviousefectsofimprovinginsulinresistanceandlipid lowering.the mechanismsareposiblyrelatedwithanti inflammatoryandreduceleptinresistanceandendoplasmicreticulum stres.itsinfluenceonthegeneexpresionsofwhiteadiposetisuesindiferentsiteshasnoobviousdiferences. Keywords resveratrol;hyperlipidemia;mice;whiteadiposetisue;insulinresistance

1110 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) rhil 1α 和 rhtnf α 对 人 成 纤 维 滑 膜 细 胞 PGE 2 受 体 和 Gαs 的 影 响 及 芍 药 苷 的 作 用 戴 杏, 郭 晓 蓉, 魏 伟 摘 要 目 的 探 讨 rhil 1α 和 rhtnf α 对 人 成 纤 维 样 滑 膜 细 胞 (FLS)PGE 2 受 体 (EP 2 ) 及 Gαs 表 达 的 影 响 及 芍 药 苷 (Pae) 的 作 用 方 法 体 外 培 养 人 FLS, 使 用 不 同 浓 度 的 rhil 1α 和 rhtnf α 刺 激 人 FLS, 观 察 EP 2 及 Gαs 蛋 白 表 达 的 情 况, 观 察 Pae 对 其 的 影 响 采 用 免 疫 荧 光 标 记 法 结 合 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 分 析 技 术 检 测 人 FLS 的 EP 2 表 达,Western blot 检 测 Gαs 表 达 结 果 rhil 1α(0.1 1 10μg/L) 和 rht NF α(0.2 2 20μg/L) 明 显 降 低 人 FLSEP 2 和 Gαs 表 达, Pae(10-8 10-7 10-6 10-5 mol/l) 可 上 调 人 FLS 的 EP 2 和 Gαs 表 达 结 论 Pae 恢 复 rhil 1α 和 rhtnf α 刺 激 后 EP 2 和 Gαs 的 表 达 可 能 是 其 抑 制 滑 膜 细 胞 增 殖 和 亢 进 分 泌 功 能 的 分 子 机 制 之 一 关 键 词 rhil 1α;rhTNF α; 成 纤 维 样 滑 膜 细 胞 ;PGE 2 受 体 ; Gαs 蛋 白 ; 芍 药 苷 中 图 分 类 号 R967;R593.22;R97.5;R392.5 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1110-06 类 风 湿 关 节 炎 (rheumatoidarthritis,ra) 是 一 种 以 关 节 滑 膜 组 织 慢 性 炎 症 为 主 要 特 征 的 自 身 免 疫 性 疾 病, 伴 有 血 管 翳 形 成, 软 骨 缺 失 以 及 近 关 节 处 骨 组 织 的 侵 蚀 [1] 成 纤 维 样 滑 膜 细 胞 (fibroblast likesy noviocytes,fls) 释 放 大 量 的 炎 性 因 子 和 基 质 降 解 酶, 是 炎 症 关 节 中 关 键 的 效 应 细 胞 PGE 2 白 介 素 1 (IL 1) 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α(tnf α) 等 炎 症 介 质 和 细 胞 因 子 都 可 以 引 起 FLS 的 异 常 活 化 PGE 2 通 过 G 蛋 白 偶 联 的 4 个 受 体 (EP 1~4 ) 来 发 挥 生 物 学 功 效 EP 2 和 EP4 可 以 提 高 AC 活 性, 升 高 camp 水 平 活 化 G 蛋 白 二 者 在 滑 膜 组 织 中 均 有 表 达, 其 中 EP 2 与 关 节 炎 关 系 最 为 紧 密 且 研 究 较 多 [2] 芍 药 苷 (Pae 2014-03-20 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 :31200675 81173075 30973543 81330081); 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 :1208085QH158) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 临 床 药 理 研 究 所, 抗 炎 免 疫 药 物 教 育 部 重 点 实 验 室, 安 徽 省 中 药 研 究 与 开 发 重 点 实 验 室, 抗 炎 免 疫 药 物 安 徽 省 工 程 技 术 研 究 中 心, 合 肥 230032 作 者 简 介 : 戴 杏, 女, 博 士 研 究 生 ; 魏 伟, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:wwei@ ahmu.edu.cn oniflorin,pae) 是 白 芍 总 苷 (totalglucosidesofpaeony, TGP) 主 要 活 性 成 分, 经 研 究 证 实 具 有 免 疫 调 节, 抗 [3-4] 炎 和 镇 痛 等 作 用 该 课 题 组 前 期 研 究 表 明 : TGP 可 以 调 节 ril 1α 和 rtnf α 体 外 刺 激 的 CIA 大 鼠 FLS 功 能 ;Pae 与 ril 1α 体 外 共 同 作 用 12h 后 可 升 高 CIA 大 鼠 FLSEP4 受 体 的 表 达 Pae 可 抑 制 rhil 1α rhtnf α 诱 导 的 人 FLS 异 常 增 殖 和 产 生 TNF α IL 1β 和 PGE 2 的 水 平, 提 高 细 胞 内 camp 水 平 [5-6] 该 研 究 在 前 期 实 验 基 础 上 利 用 rhil 1α 和 rhtnf α 体 外 刺 激 正 常 人 FLS 后 观 察 EP 2 Gαs 的 表 达 情 况 以 及 Pae 对 其 的 影 响, 进 一 步 探 讨 Pae 发 挥 抑 制 滑 膜 细 胞 增 殖 和 亢 进 分 泌 功 能 的 作 用 机 制 1 材 料 与 方 法 1.1 组 织 来 源 滑 膜 组 织 取 自 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 骨 科 骨 折 患 者, 行 膝 关 节 置 换 术 时 留 取 滑 膜 标 本 分 离 培 养 滑 膜 组 织, 术 前 患 者 签 署 知 情 同 意 书 1.2 药 物 Pae(C 23 H 28 O 11 ): 由 安 徽 医 科 大 学 临 床 药 理 研 究 所 提 供 1.3 试 剂 与 仪 器 rhil 1α rhtnf α: 美 国 CYTO LAB 公 司 ; 胎 牛 血 清 (FBS) 胰 蛋 白 酶 DMEM 培 养 粉 : 美 国 Gibco 公 司 ;FITC 标 记 羊 抗 兔 IgG Vimentin 抗 体 CD68 抗 体 辣 根 酶 山 羊 抗 兔 IgG(H+L): 北 京 中 杉 金 桥 公 司 ; 兔 抗 人 Anti Gαs Anti EP 2 : 美 国 SantaCruz 公 司 ;β actin: 美 国 Sigma 公 司 ; 倒 置 相 差 显 微 镜 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 : 日 本 OLYMPUS 公 司 1.4 人 FLS 的 分 离 与 培 养 无 菌 取 患 者 少 许 关 节 滑 膜 组 织, 用 含 有 双 抗 的 PBS 洗 涤 2~3 次 后 剪 成 1 mm 2 大 小 的 组 织 块 放 置 于 DMEM 培 养 液 中, 将 组 织 块 均 匀 排 列 在 培 养 瓶 底 壁 上, 轻 轻 翻 转 使 瓶 底 朝 上, 然 后 置 于 37 5% CO 2 培 养 箱 内 培 养 使 其 贴 壁 6h 后 取 出 培 养 瓶 加 入 少 许 预 温 的 含 20%FBS 的 DMEM 培 养 液, 以 刚 刚 覆 盖 组 织 块 为 宜, 继 续 培 养, 1~2d 后 更 换 培 养 液,3~5d 后 即 会 长 出 少 量 细 胞, 待 有 大 量 细 胞 长 出 后 可 去 除 组 织 块, 细 胞 长 满 后, 用 0 25% 胰 蛋 白 酶 消 化, 并 传 代 培 养, 取 对 数 生

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1111 长 期 3~5 代 细 胞 用 于 实 验 1.5 人 FLS 的 免 疫 组 化 鉴 定 将 无 菌 小 盖 玻 片 泡 酸 消 毒 后 置 于 6 孔 板 中, 细 胞 悬 液 接 种 于 盖 玻 片 上, 待 细 胞 爬 满 玻 片 后 取 出, 按 以 下 步 骤 操 作 :1 PBS 洗 涤 玻 片 3 次, 每 次 洗 3min 2 4% 多 聚 甲 醇 固 定 10min, 再 用 PBS 冲 洗 3 次, 干 燥 3 正 常 羊 血 清 封 闭 30min,PBS 洗 涤 4 加 入 鼠 抗 人 Vimentin CD68 单 克 隆 抗 体 20 孵 育 1h,PBS 洗 涤 5 滴 加 HRP 标 记 的 羊 抗 鼠 IgG 室 温 静 置 6 DAB 显 色 5min,PBS 或 蒸 馏 水 冲 洗 10min 终 止 显 色 7 0 5% 苏 木 精 复 染, 乙 醇 梯 度 脱 水, 中 性 树 胶 封 片, 镜 下 观 察 拍 照 1.6 免 疫 荧 光 法 测 人 FLSEP 2 表 达 及 图 像 分 析 取 第 3~5 代 人 FLS 用 含 20% FBS 的 DMEM 培 养 液 制 成 1 10 7 个 /L 细 胞 悬 液 加 入 24 孔 培 养 板, 每 孔 1ml, 置 于 培 养 箱 中 培 养 12h 使 其 贴 壁 后 弃 上 清 液, 分 别 加 入 含 rhil 1α(0.1 1 10μg/L) rhtnf α (0.2 2 20μg/L) 以 及 rhil 1α(10μg/L) rhtnf α (20μg/L) 分 别 和 不 同 浓 度 的 Pae(10-8 10-7 10-6 10-5 mol/l) 混 合 的 DMEM 培 养 24h 后 终 止 反 应, 用 PBS 洗 涤 3 次, 甲 醇 -20 固 定 10min, 自 然 干 燥 10min, 用 10% 正 常 山 羊 血 清 室 温 封 闭 30 min, 加 入 按 1 100 稀 释 的 兔 抗 人 Anti EP 2,20 过 夜,PBS 液 冲 洗, 再 加 入 FITC 标 记 的 按 1 100 稀 释 的 羊 抗 兔 IgG37 避 光 孵 育 1h,PBS 冲 洗 后 用 ph 值 为 8 5 的 封 闭 液 封 片 以 PBS 替 代 一 抗 作 阴 性 对 照, 省 略 一 抗 作 空 白 对 照 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 并 采 图 图 像 采 用 ImageProPlus5 1 分 析 系 统 分 析 显 微 镜 下 发 出 黄 绿 色 荧 光 者 为 阳 性 细 胞, 取 上 下 左 右 中 5 个 显 微 镜 视 野 采 图, 图 像 分 析 系 统 分 析 每 个 视 野 的 光 密 度 值, 然 后 求 平 均 光 密 度 值 1.7 Westernblot 法 测 Gαs 蛋 白 表 达 取 第 3~5 代 人 FLS 用 含 20% FBS 的 DMEM 培 养 液 制 成 1 10 7 个 /L 细 胞 悬 液 加 入 6 孔 培 养 板, 加 入 含 rhil 1α (10μg/L) rhtnf α(20μg/l) 和 不 同 浓 度 的 Pae (10-8 10-7 10-6 10-5 mol/l) 培 养 24h 后 终 止 反 应,PBS 充 分 洗 涤 后 加 入 RIRA 裂 解 液 200μl, 裂 解 30min, 用 细 胞 刮 刮 下 细 胞 收 集 后 移 至 EP 管 中, 于 -80 冰 箱 反 复 冻 融 3 次, 冰 浴 超 声 降 解 1min 后, 14000r/min 离 心 20min, 取 上 清 液, 保 存 -80 冰 箱 制 备 电 泳 凝 胶, 将 提 取 的 蛋 白 样 本 进 行 SDS PAGE, 转 移 至 PVDF 膜 后, 用 5% 脱 脂 奶 粉 /PBS 室 温 封 闭 2h; 将 PVDF 膜 放 入 稀 释 一 抗 中 室 温 孵 育 2h,PBS 洗 3 次, 每 次 10min; 加 入 稀 释 二 抗 室 温 孵 育 2h, 再 PBS 洗 3 次, 每 次 10min; 加 入 显 色 液 显 色 结 果 采 用 凝 胶 成 像 系 统 扫 描 后, 以 特 异 性 条 带 浓 度 与 面 积 的 乘 积 为 有 效 值, 反 映 蛋 白 表 达 水 平 1.8 统 计 学 处 理 应 用 SPSS11.7 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析 和 t 检 验 2 结 果 2.1 人 FLS 体 外 的 培 养 及 鉴 定 将 人 的 滑 膜 组 织 分 离 培 养 后, 置 于 倒 置 显 微 镜 下 观 察, 发 现 细 胞 贴 壁 后 逐 渐 伸 展 呈 梭 型 长 条 形 生 长 波 形 蛋 白 免 疫 组 化 染 色 结 果 发 现 胞 质 内 见 大 量 棕 黄 色 颗 粒, 核 呈 蓝 色 CD68 免 疫 组 化 染 色 第 3 代 滑 膜 细 胞 呈 阴 性, 纯 度 为 90% 以 上, 符 合 人 FLS 的 特 征, 见 图 1 图 1 人 FLSVimentin 染 色 阳 性 200 2.2 荧 光 显 微 镜 下 人 FLSEP 2 表 达 2.2.1 不 同 浓 度 rhil 1α 和 Pae 对 人 FLSEP 2 表 达 的 影 响 免 疫 荧 光 检 测 结 果 显 示 : 人 FLS 在 胞 膜 胞 质 可 发 出 黄 绿 色 荧 光,EP 2 主 要 定 位 于 人 FLS 的 胞 质 和 胞 膜 与 未 加 刺 激 的 人 FLS 相 比,rhIL 1α (0 1 1 10μg/L) 体 外 刺 激 24h 后 人 FLS 表 现 为 荧 光 度 不 同 程 度 降 低, 图 像 分 析 显 示 平 均 光 密 度 值 呈 浓 度 依 赖 性 降 低 (F=14 044,P<0 01), 提 示 EP 2 受 体 的 表 达 减 少 与 未 加 刺 激 的 人 FLS 相 比,rhIL 1α(10μg/L) 体 外 刺 激 24h 后, 荧 光 度 降 低,EP 2 受 体 表 达 减 少 Pae(10-8 10-7 10-6 10-5 mol/l) 体 外 培 养 24h 后 荧 光 度 不 同 程 度 增 强, 图 像 分 析 显 示 平 均 光 密 度 值 呈 浓 度 依 赖 性 升 高 (F=19 554,P< 0 01), 提 示 Pae 可 不 同 程 度 的 升 高 EP 2 受 体 的 表 达 见 图 2 3

１１１２ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ A B C D E F 珋 图 ２ ｒ ｈｉ Ｌ １α体外刺激人 ＦＬＳ２ ４ｈＥＰ２ 的表达 ２ ｎ ４ ｘ±ｓ 1.5 Ａ 正常组 Ｂ Ｃ Ｄ ｒ ｈ Ｉ Ｌ １α １ １ １μｇ Ｌ 刺激组 与正常组 比较 Ｐ ５ Ｐ １ ２ ２ ２ 不同浓度 ｒ ｈｔｎｆ 对人 ＦＬＳＥＰ２ 表 α和 Ｐａ 达的影响 免疫荧光检测结果显示 与未加刺激的 人 ＦＬＳ相比 ｒ ｈ ＴＮＦ Ｌ 体外刺激 α ２ ２ ２μｇ!"#$%& ** 1.0 * * D E * ## 0.5 ２ ４ｈ后人 ＦＬＳ表现为荧光度不同程度降低 图像分 析显 示 平 均 光 密 度 值 呈 浓 度 依 赖 性 降 低 Ｆ １ ６ ３ ６ Ｐ １ 提示 ＥＰ２ 受体的表达减少 与未 0.0 A B C F 加刺激的人 ＦＬＳ相比 ｒ ｈｔｎｆ μｇ Ｌ 体外刺激 α ２ 图 ３ Ｐａ 对 ｒ ｈｉ Ｌ １α体外刺激后人 ＦＬＳＥＰ２ ２ ４ｈ后 荧 光 度 降 低 ＥＰ２ 受 体 表 达 减 少 Ｐａ １ ８ １ ７ １ ６ １ ５ ｍｏ ｌ Ｌ 体外培养 ２４ｈ后荧 珋±ｓ 受体的表达 ２ ｎ ４ ｘ Ａ 正常组 Ｂ ｒ ｈ Ｉ Ｌ １α １ μｇ Ｌ 刺激组 Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ ｒ ｈ Ｉ Ｌ １α １ 光度不同程度增强 图像分析显示平均光密度值呈 Ｌ 和 Ｐａ １ ８ １ ７ １ ６ １ ５ ｍｏ ｌ Ｌ 共同作用组 与正常组 μｇ 浓度依赖性升高 Ｆ １８ ８６６ Ｐ １ 提示 Ｐａ 比较 Ｐ １ 与 ｒ ｈｉ Ｌ １α １ μｇ Ｌ 刺激组比较 Ｐ ５ Ｐ 可不同程度的升高 ＥＰ２ 受体的表达 见图 ４ ５ １ ２ ３ Ｐａ对人 ＦＬＳＧαｓ蛋白表达的影响 分别用 ｒ ｈｉ Ｌ １α １μｇ Ｌ 和 ｒ ｈ ＴＮＦ μｇ Ｌ 体外刺激 α ２ 低 Ｐａ １ ８ １ ７ １ ６ １ ５ ｍｏ ｌ Ｌ 体外培养 ２４ 人 ＦＬＳ２４ｈ后 Ｗ ｓ ｒ ｎｂ ｌ ｏ 法检测 Ｇαｓ表达水平 ｈ后可明 显 提 升 Ｇαｓ表 达 Ｆ ７ ７ ４７ ９ ４７６ Ｐ 结果表明 与正常组相比 刺激后Ｇαｓ 表达明显降 １ 见图 ６

安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １１１３ 图 ４ ｒ ｈｔｎｆ α体外刺激人 ＦＬＳ２４ｈＥＰ２ 珋±ｓ 受体的表达 ２ ｎ ４ ｘ Ａ 正常组 Ｂ Ｃ Ｄ ｒ ｈ ＴＮＦ ２ ２ ２μｇ Ｌ 刺激组 与正常组 α 比较 Ｐ ５ Ｐ １ ３ 讨论 ＲＡ的主要病理特点为慢性滑膜炎 血管翳形 成 侵及关节软骨和软骨下骨 使关节畸形并失去功 图 ５ Ｐａ 对 ｒ ｈｔｎｆ α体外刺激后人 ＦＬＳＥＰ２ 珋±ｓ 的表达 ２ ｎ ４ ｘ Ｌ １ Ｉ Ｌ ６ ＰＧＥ２ 高表达于 能 炎症因子如 ＴＮＦ α Ｉ Ａ 正常组 Ｂ ｒ ｈ ＴＮＦ μｇ Ｌ 刺激组 Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ ｒ ｈ ＴＮＦ α ２ α 滑膜细胞 在 ＲＡ的发生 发展中起着重要作用 Ｉ Ｌ ２ μｇ Ｌ 和 Ｐａ １ ８ １ ７ １ ６ １ ５ ｍｏ ｌ Ｌ 共同作用组 与正 １可以引起 ＲＡ骨破坏和软骨基质降解 ７ ＴＮＦ α 可刺激滑膜细胞和软骨细胞合成 ＰＧＥ２ 和胶原酶 促进 ＦＬＳ活化 破坏关节 ５ Ｐ １ ８ 子Ｉ Ｌ １ Ｉ Ｌ ６和 ＴＮＦ α分泌 ＥＰ２ 参与调节促炎因 ９ ＰＧＥ２ 参与 ＲＡ发病 的多个环节 与水肿 软骨和近关节骨的侵蚀都有关 联 ＰＧＥ２ 通过与细胞膜上相应的 ＥＰ受体结合而发 挥作用 ＥＰ２ 与 ＰＧＥ２结合后激活 Ｇαｓ并与其偶联 启动 ＰＧＥ２ ＥＰ Ｇ蛋白 ｃ ＡＭＰ信号通路来发挥其生 理和病理效应 常组比较 Ｐ １ 与 ｒ ｈ ＴＮＦ μｇ Ｌ 刺 激 组 比 较 Ｐ α ２ Ｇ蛋白由 α β γ３个亚基组成 α亚基是特异 性 ＧＴＰ ＧＤＰ结 合 位 点 具 有 ＧＴＰ酶 活 性 Ｇαｓ和 Ｇα的平衡是维持细胞正常生理功能的基础 Ｇαｓ 激活 ＡＣ 升 高 ｃ ＡＭＰ水 平 Ｇα则 抑 制 ＡＣ 降 低 ｃ ＡＭＰ水 平 Ｇαｓ Ｇα失 衡 时 会 导 致 细 胞 功 能 异 常 １ 该 课 题 组 前 期 研 究 ４ １１ 结 果 显 示 Ｇ蛋 白

1114 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 和 rhtnf α 刺 激 后 EP 2 和 Gαs 蛋 白 的 表 达, 恢 复 滑 膜 细 胞 PGE 2 EP G 蛋 白 camp 信 号 的 正 常 转 导 可 能 是 Pae 发 挥 抑 制 滑 膜 细 胞 增 殖 和 亢 进 分 泌 功 能 的 重 要 分 子 机 制 之 一 参 考 文 献 图 6 Pae 对 rhil 1α 和 rhtnf α 体 外 刺 激 后 人 FLSGαs 的 表 达 (n=4, 珋 x±s) 1: 正 常 组 ;2: 刺 激 组 ;3~6: 刺 激 剂 与 Pae(10-8 10-7 10-6 10-5 mol/l) 作 用 组 ; 与 正 常 组 比 较 : # P<0.05; 与 刺 激 组 比 较 : P< 0.05, P<0.01 AC camp 信 号 通 路 介 导 了 AA 和 CIA 大 鼠 FLS 的 异 常 增 殖 ;TGP 能 明 显 抑 制 AA 大 鼠 滑 膜 组 织 中 Gαi 的 表 达, 促 进 Gαs 的 表 达, 恢 复 Gαs/Gαi 的 平 衡 ; 促 进 EP 2 和 EP4 的 表 达 ; 提 高 细 胞 内 camp 水 平, 从 而 降 低 FLS 的 增 殖 与 分 泌 [12] 动 物 实 验 研 [4,12] 究 显 示 :TGP 可 能 是 通 过 影 响 PGE 2 EP G 蛋 白 camp 信 号 通 路 来 发 挥 治 疗 作 用 的 人 FLS 细 胞 水 [5-6] 平 的 前 期 研 究 已 经 显 示 不 同 浓 度 rhil 1α 和 rhtnf α 体 外 刺 激 可 以 促 进 人 FLS 的 异 常 增 殖, 升 高 TNF α IL 1β 和 PGE 2, 降 低 FLS 产 生 的 camp, Pae 则 能 明 显 逆 转 rhil 1α 和 rhtnf α 对 人 FLS 的 影 响 为 了 进 一 步 明 确 Pae 抑 制 人 FLS 增 殖 和 亢 进 分 泌 功 能 的 作 用 机 制, 本 实 验 以 人 FLS 为 研 究 对 象, 深 入 研 究 Pae 对 rhil 1α 和 rhtnf α 体 外 刺 激 后 人 FLSEP 2 和 G 蛋 白 表 达 的 影 响, 明 确 Pae 调 节 PGE 2 EP G 蛋 白 camp 信 号 通 路 可 能 作 用 的 靶 点 Pae 为 天 然 药 物 TGP 的 活 性 单 体, 已 经 证 明 具 有 抗 炎 抗 过 敏 免 疫 调 节 神 经 保 护 抗 肿 瘤 等 作 用 [13-15] 本 研 究 通 过 免 疫 荧 光 标 记 法 结 合 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 分 析 技 术 发 现 :rhil 1α 和 rhtnf α 体 外 刺 激 使 人 FLSEP 2 蛋 白 表 达 明 显 降 低 Pae(10-8 ~10-5 mol/l) 可 上 调 EP 2 的 表 达 Westernblot 结 果 表 明 :rhil 1α 和 rhtnf α 使 人 FLSGαs 蛋 白 表 达 明 显 降 低,Pae(10-8 ~10-5 mol/l) 可 提 升 Gαs 蛋 白 表 达, 结 合 前 期 的 实 验 结 果 可 以 提 示 ; 恢 复 rhil 1α [1] YamamotoK.Geneticsanalysesofrheumatoidarthritis[J].Nihon Rinsho,2013,71(7):1155-9. [2] FoudiN,GomezI,BenyahiaC,etal.ProstaglandinE2receptor subtypesinhumanbloodandvascularcels[j].eurjpharmacol, 2012,695(1-3):1-6. [3] 张 磊, 魏 伟, 常 艳, 等. 肿 瘤 坏 死 因 子 α 对 胶 原 性 关 节 炎 大 鼠 滑 膜 细 胞 功 能 的 影 响 及 白 芍 总 苷 的 作 用 [J]. 中 国 新 药 杂 志,2007,16(7):519-22. [4] ChangY,ZhangL,WangC,etal.Paeoniflorininhibitsfunction ofsynoviocytespretreatedbyril 1αandregulatesEP4receptorex presion[j].jethnopharmacol,2011,137(3):1275-82. [5] 郭 晓 蓉, 戴 杏, 魏 伟. 芍 药 苷 对 ril 1α 诱 导 的 人 成 纤 维 样 滑 膜 细 胞 功 能 的 影 响 [J]. 中 国 药 理 学 通 报,2009,25(4): 1261-5. [6] 戴 杏, 郭 晓 蓉, 魏 伟. 芍 药 苷 对 肿 瘤 坏 死 因 子 α 诱 导 的 人 成 纤 维 样 滑 膜 细 胞 功 能 的 影 响 [J]. 中 国 临 床 药 理 学 杂 志, 2009,25(1):58-62. [7] AlamI,DjidjikR,OuikhlefN,etal.Interleukin 1andthein terleukin 1receptorantagonistgenepolymorphismsstudyinpa tientswithrheumatoidarthritis[j].patholbiol(paris),2013, 61(6):264-8. [8] JiaT,PanY,LiJ,etal.StrategiesforactiveTNF αvaccination inrheumatoidarthritistreatment[j].vaccine,2013,31(38): 4063-8. [9] TrefkornL,ScheibeR,MaruyamaT,etal.PGE 2 exertsitsefect onthelps inducedreleaseoftnf alpha,et 1,IL 1alpha,IL 6 andil 10viatheEP 2 andep4receptorinratlivermacrophages [J].ProstaglandinsOtherLipidMediat,2004,74(1-4):113-23. [10]JohnsonEN,DrucyKM.HeterotrimericGproteinsignaling:role inasthmaandalergicinflammation[j].jalergyclinimmunol, 2002,109(4):592-602. [11] Chen Q, WeiW. Efectsand mechanismsofglucosidesof chaenomelesspeciosaoncolagen inducedarthritisinrats[j].int Immunopharmacol,2003,3(4):593-608. [12] XuHM,WeiW,JiaXY,etal.Efectsandmechanismsoftotal glucosidesofpaeonyonadjuvantarthritisinrats[j].jethnophar macol,2007,109(3):442-8. [13]KimID,HaBJ.TheefectsofPaeoniflorinonLPS inducedliver inflammatoryreactions[j].archpharmres,2010,33(6):959-66. [14]LeeB,ShinYW,BaeEA,etal.Antialergicefectoftherootof PaeonialactifloraanditsconstituentsPaeoniflorinandpaeonol [J].ArchPharmRes,2008,31(4):445-50. [15]JiangW L,ChenXG,ZhuHB,etal.Paeoniflorininhibitssys temicinflammationandimprovessurvivalinexperimentalsepsis [J].BasicClinPharmacolToxicol,2009,105(1):64-71.

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1115 临 床 医 学 研 究 CXCR4 在 急 性 髓 系 白 血 病 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 内 的 表 达 及 分 布 桂 钰, 葛 健, 夏 瑞 祥 摘 要 目 的 探 讨 CXCR4 在 初 治 急 性 髓 系 白 血 病 (AML) 患 者 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 (BM MSCs) 中 的 分 布 表 达 及 其 临 床 意 义 方 法 通 过 提 取 初 次 诊 断 的 AML 患 者 化 疗 前 后 骨 髓 单 个 核 细 胞, 进 行 BM MSCs 体 外 分 离 与 培 养 ; 用 免 疫 荧 光 共 聚 焦 的 方 法 观 察 各 组 P2 代 细 胞 中 CXCR4 的 亚 细 胞 器 定 位 以 及 在 细 胞 膜 上 的 分 布 ; 采 用 Westernblot 法 检 测 各 组 细 胞 CXCR4 的 蛋 白 表 达 量 的 变 化 结 果 在 初 治 组 AML 患 者 BM MSCs 内,CXCR4 较 缓 解 组 及 对 照 组 分 布 异 常, 未 在 高 尔 基 体 内 蓄 积, 多 分 布 在 细 胞 膜 上, 并 且 CXCR4 蛋 白 含 量 明 显 低 于 其 他 两 组 结 论 初 治 AML 患 者 BM MSCs 内 CXCR4 分 布 和 含 量 改 变 可 能 与 骨 髓 造 血 微 环 境 改 变 有 关, 并 且 对 白 血 病 细 胞 的 髓 外 浸 润 有 协 同 作 用 关 键 词 急 性 髓 系 白 血 病 ; 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 ; 高 尔 基 体 ; CXCR4 中 图 分 类 号 R733.71 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1115-05 2014-03-20 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :81200371); 高 等 学 校 博 士 学 科 点 专 项 科 研 基 金 联 合 资 助 课 题 ( 新 教 师 类 联 合 资 助 课 题, 编 号 :20123420120011); 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : 1208085QH154) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 血 液 内 科, 合 肥 230022 作 者 简 介 : 桂 钰, 女, 硕 士 研 究 生 ; 葛 健, 男, 副 教 授, 副 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者, E mail:gejian77@medmail.com.cn 夏 瑞 祥, 男, 教 授, 主 任 医 师, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:xrx2041@163.com 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 (bonemarowmesenchymal stemcels,bm MSCs) 具 有 多 向 分 化 潜 能 支 持 造 血, 促 进 干 细 胞 植 入 以 及 分 泌 各 种 细 胞 因 子 及 蛋 白, 能 够 同 时 表 达 基 质 细 胞 衍 生 因 子 1(SDF 1) 及 其 受 体 CXCR4, 二 者 特 异 性 结 合 能 够 促 进 干 细 胞 动 员, 迁 移 [1] 和 归 巢 研 究 表 明, 在 急 性 髓 系 白 血 病 (acute myeloidleukemia,aml) 患 者 骨 髓 中, 白 血 病 细 胞 表 面 CXCR4 的 表 达 量 增 加, 这 与 白 血 病 细 胞 的 增 殖 浸 润 抗 化 疗 药 物 作 用 的 形 成 有 着 重 要 的 关 系, 而 在 EfectsofpaeoniflorinonprostaglandinsE 2 receptorandgαson fibroblast likesynoviocytesofhumanunderthestimulationof rhil 1αandrhTNF α DaiXing,GuoXiaorong,WeiWei (InstituteofClinicalPharmacologyofAnhuiMedicalUniversity,KeyLaboratoryofAnti inflammatoryand ImmunopharmacologyofEducationMinistryofChina,AnhuiKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentfor ChineseMedicine,AnhuiEngineringResearchCenterofAnti inflammatoryandimmunedrugs,hefei 230032) Abstract Objective Toinvestigatetheefectsofpaeoniflorin(Pae)onexpresionofEP 2 andgαsofhumanfi broblast likesynoviocytes(fls)underthestimulationofrhil 1αandrhTNF α.methods FLSofhumanwere culturedinvitro.theexpresionofep 2 onhumanflsunderthestimulationofrhil 1αandrhTNF αandtheefect ofpaewereobservedbyimmunofluorescence,analyzedbyconfocallasermicroscopy,theexpresionofgαswasde tectedbywesternblot.results rhil 1α(0.1,1,10μg/L)andrhTNF α(0.2,2,20μg/l)significantly inhibitedtheexpresionofep 2 andgαs,pae(10-8,10-7,10-6,10-5 mol/l)couldimprovetheexpresionof EP 2 andgαs.conclusion ImprovingtheabnormalexpresionofEP 2 andgasonhumanflsunderthestimula tionofrhil 1αandrhTNF αisprobablyoneofthemostimportantmoleculemechanismsofpaepreventingra. Keywords rhil 1α;rhTNF α;fibroblast likesynoviocytes;prostaglandinse 2 recepter;gαs;paeoniflorin

1116 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) BM MSCs 中,CXCR4 在 细 胞 内 的 定 位, 分 布 及 蛋 白 定 量, 目 前 仍 不 明 确 该 研 究 通 过 免 疫 荧 光 共 聚 焦 技 术 观 察 CXCR4 在 细 胞 中 的 细 胞 器 定 位 及 分 布, 并 进 一 步 采 用 Westernblot 法 检 测 其 蛋 白 表 达 量, 观 察 AML 骨 髓 环 境 对 BM MSCs 中 CXCR4 表 达 及 分 布 的 影 响, 从 而 为 指 导 AML 的 临 床 研 究, 治 疗 和 预 后 提 供 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 标 本 来 源 15 例 骨 髓 标 本 均 来 自 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 血 液 内 科, 骨 髓 采 集 过 程 中 患 者 均 属 知 情 同 意, 经 骨 髓 细 胞 学, 骨 髓 活 检, 免 疫 分 型, 染 色 体 等 检 查 明 确 诊 断 为 AML 患 者 的 骨 髓 标 本 5 例, 确 诊 后 采 用 标 准 IA( 去 甲 氧 柔 红 霉 3d+ 阿 糖 胞 苷 7d) 方 案 化 疗 诱 导 缓 解 后 AML 患 者 骨 髓 标 本 5 例 ( 完 全 缓 解 标 准 : 白 血 病 的 症 状 和 体 征 消 失, 外 周 血 中 性 粒 细 胞 绝 对 值 1 5 10 9 /L, 血 小 板 100 10 9 /L, 白 细 胞 分 类 中 无 白 血 病 细 胞, 骨 髓 中 原 始 粒 Ⅰ 型 +Ⅱ 型 5%,M 3 型 原 粒 + 早 幼 粒 5%, 无 Auer 小 体, 红 细 胞 及 巨 核 细 胞 系 列 正 常, 无 髓 外 白 血 病 ), 正 常 骨 髓 移 植 供 者 5 例 1.2 主 要 试 剂 及 仪 器 低 糖 DMEM 培 养 液 和 胎 牛 血 清 购 自 美 国 GbcoBRL 公 司 ;Percol 淋 巴 细 胞 分 离 原 液 购 自 美 国 AmershamBioscience 公 司 ;mousean ti CXCR4antibodyIgG2b(clone44716) 购 自 美 国 R&D 公 司 ;mousemonoclonaligg1 CXCR4 (SC 5353) 购 自 美 国 SantaCruz 公 司 ;Rabbitpolyclonalto GiantinIgG(ab24586) RabbitpolyclonaltoCalnexin IgG (ab22595) RabbitpolyclonaltoLAMP2aIgG (ab18528) RabbitpolyclonaltoEEA1IgG(ab2900) 均 购 自 美 国 Abcam 公 司 ; 山 羊 抗 小 鼠 IgG/Alexa Fluor594(ZF 0513) 山 羊 抗 兔 IgG/AlexaFluor488 (ZF 0511) 均 购 自 北 京 中 杉 金 桥 ;RIPA 蛋 白 裂 解 液 (P0013B) 购 自 碧 云 天 公 司 ;LeicaTCSSP5 单 光 子 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 购 自 德 国 莱 卡 公 司 ;Bioshine ChemiQSeries 显 影 仪 购 自 上 海 欧 翔 科 学 仪 器 有 限 公 司 1.3 方 法 1.3.1 BM MSCs 的 分 离 与 培 养 髂 后 上 棘 取 骨 髓 液 5ml, 放 在 肝 素 抗 凝 管 中, 梯 度 离 心 1000r/min 5min, 弃 脂 肪 层, 与 等 量 PBS 充 分 吹 打 混 匀 将 上 述 混 匀 的 液 体 1 1 缓 慢 叠 加 到 等 量 Percol 分 离 液 上, 梯 度 离 心 2300r/min 30min, 吸 取 白 膜 层 单 个 核 细 胞,PBS 洗 涤 1~2 次, 离 心 弃 上 清 液, 加 入 含 10% FBS 的 LG DMEM 培 养 液 吹 打 悬 浮 细 胞 以 3 5 10 5 /cm 2 的 密 度 接 种 于 含 5ml 培 养 液 的 T 25 培 养 瓶 中, 置 于 37 5% CO 2 饱 和 湿 度 条 件 下 培 养, 分 别 标 记 好 初 治 组 缓 解 组 对 照 组 名 称 48 ~72h 后 全 量 换 液, 弃 去 非 贴 壁 悬 浮 细 胞 每 3d 全 量 换 液, 待 细 胞 长 至 90% 融 合 时, 用 0 25% 胰 酶 0.02% EDTA 消 化, 按 1 2 进 行 传 代 培 养 [2], 将 细 胞 悬 液 分 装 到 两 个 培 养 瓶 中, 补 足 培 养 液, 标 记 名 称 代 数 时 间, 放 入 CO 2 孵 箱 培 养 1.3.2 细 胞 爬 片 将 胰 酶 消 化 下 来 的 细 胞, 离 心 弃 上 清 液, 用 培 养 液 将 沉 淀 的 细 胞 吹 打 重 悬, 取 12 孔 板, 在 每 孔 中 滴 入 一 滴 培 养 液 可 避 免 放 入 的 爬 片 浮 起, 将 无 菌 多 聚 赖 氨 酸 爬 片 放 入 孔 中 后, 每 孔 加 1ml 培 养 液, 将 重 悬 后 的 细 胞 吹 打 混 匀 后 滴 在 爬 片 上, 盖 好 盖 子, 做 好 标 记, 放 入 培 养 箱 中 培 养 24h 1.3.3 免 疫 荧 光 共 聚 焦 观 察 CXCR4 在 细 胞 内 的 分 布 和 亚 细 胞 器 定 位 将 初 治 组 缓 解 组 对 照 组 已 培 养 24h 的 细 胞 爬 片 ( 此 时 细 胞 的 形 态 及 细 胞 间 距 适 宜 荧 光 染 料 着 色 及 在 显 微 镜 下 观 察 ) 各 取 出 4 片, 分 别 固 定 在 玻 片 上, 用 PBS 漂 洗 5min 后 加 入 4% 多 聚 甲 醛 固 定 10min, 再 用 PBS 漂 洗 5min 3 次 加 0 2% tripton+2% BSA 混 合 液 封 闭 1h,PBS 漂 洗 每 组 的 4 张 片 上 分 别 加 入 CXCR4 和 亚 细 胞 器 标 志 蛋 白 的 一 抗 ( 分 别 按 抗 体 说 明 书 配 比 ),4 孵 育 1h 后,PBS 漂 洗 再 在 每 组 4 张 片 上 分 别 加 入 荧 光 二 抗 ( 分 别 按 抗 体 说 明 书 配 比 ), 避 光 室 温 孵 育 1h, PBS 漂 洗 后 用 95% 放 入 甘 油 封 片, 放 在 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 下 观 察 1.3.4 Westernblot 测 定 CXCR4 在 细 胞 中 的 表 达 取 初 治 组 缓 解 组 对 照 组 的 P2 代 细 胞, 收 集 细 胞 后, 加 入 150μl 蛋 白 裂 解 液, 冰 上 反 复 吹 打,4 下 12000r/min, 离 心 15min, 收 集 上 清 液 即 为 目 的 蛋 白 各 取 10μl 蛋 白 样 品 按 1 1 比 例 加 入 上 样 缓 冲 液,100 煮 沸 5min 使 蛋 白 变 性, 按 预 定 顺 序 加 样 (1~3 孔 : 初 治 组,4~6 孔 : 缓 解 组,7~9 孔 : 对 照 组 ), 电 泳 并 湿 转 PVDF 膜 5% 脱 脂 奶 粉 封 闭 2h, PBS 洗 5min 3 次, 将 PVDF 膜 剪 成 所 需 分 子 量 的 条 带 (CXCR4 条 带 和 β tubulin 条 带 ), 分 别 加 入 相 应 的 一 抗, 摇 床 上 4 过 夜,PBS 洗 5min 3 次, 鼠 二 抗 室 温 下 孵 育 2h,PBS 洗 5min 3 次, 最 后 用 ECL 化 学 发 光 法 进 行 显 影 采 用 QuantityOne 软 件 对 实 验 结 果 进 行 分 析, 结 果 以 目 标 条 带 与 β tubulin 条 带 的 比 值 表 示 1.4 统 计 学 处 理 采 用 SPSS16 0 统 计 软 件 分 析,

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1117 定 量 资 料 以 x±s 珋 表 示, 以 α=0 05 为 检 验 水 准, 多 组 间 均 数 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析, 两 两 比 较 采 用 q 检 验 2 结 果 2.1 BM MSCs 的 分 离 与 培 养 初 治 组 缓 解 组 对 照 组 骨 髓 液 经 密 度 梯 度 分 离 最 先 得 到 的 单 个 核 细 胞 主 要 为 圆 形, 大 小 不 等, 经 过 48h 培 养 后, 可 以 看 到 贴 壁 生 长 的 梭 形 细 胞,3~4d 后, 细 胞 逐 渐 开 始 生 长 并 形 成 小 的 细 胞 克 隆,1 周 后 细 胞 克 隆 数 明 显 增 加, 约 10d, 细 胞 克 隆 逐 渐 连 成 一 片, 细 胞 呈 成 纤 维 状 生 长, 形 态 呈 常 梭 形, 覆 盖 面 积 较 前 更 大, 约 15 d, 细 胞 生 长 可 达 90% 融 合, 见 图 1 图 1 体 外 分 离 培 养 的 BM MSCs 细 胞 形 态 1000 A:BM MSCs 的 P1 代 细 胞 ;B:BM MSCs 的 P2 代 细 胞 2.2 免 疫 荧 光 共 聚 焦 CXCR4 的 荧 光 发 光 色 表 现 为 红 色, 细 胞 器 高 尔 基 体 内 质 网 溶 酶 体 内 体 的 标 志 蛋 白 荧 光 发 光 色 表 现 为 绿 色 共 聚 焦 观 察 显 示 缓 解 组 及 对 照 组 CXCR4 的 红 色 免 疫 荧 光 与 高 尔 基 体 标 志 蛋 白 Giantin 绿 色 免 疫 荧 光 发 生 了 明 显 重 叠, 且 在 细 胞 内 成 少 量 弥 漫 性 的 分 布 ; 初 治 组 未 见 CXCR4 的 红 色 荧 光 与 这 4 种 细 胞 器 标 志 蛋 白 的 绿 色 荧 光 重 叠 及 在 细 胞 内 的 弥 漫 分 布, 但 在 细 胞 表 面 观 察 到 CXCR4 的 红 色 荧 光, 见 图 2 2.3 Westernblot 检 测 用 Westernblot 方 法 对 CXCR4 在 初 治 组 缓 解 组 对 照 组 的 P2 代 细 胞 中 的 表 达 总 量 进 行 检 测, 多 次 重 复 实 验 后 显 示, 初 治 组 的 CXCR4 表 达 水 平 明 显 低 于 缓 解 组 及 对 照 组 (P< 0 05), 而 缓 解 组 和 对 照 组 CXCR4 的 表 达 量 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 见 图 3 3 讨 论 BM MSCs 作 为 一 种 原 始 的 骨 髓 基 质 干 细 胞, 能 够 同 时 表 达 SDF 1 及 CXCR4, 二 者 特 异 性 的 结 合, 参 与 机 体 的 多 种 生 理 及 病 理 过 程, 被 称 为 SDF 1/ CXCR4 生 物 轴 CXCR4 能 够 广 泛 表 达 在 包 括 单 核 细 胞 淋 巴 细 胞 及 BM MSCs 等 细 胞 表 面 [3], 是 7 次 跨 膜 的 G 蛋 白 偶 联 受 体 [4], 在 BM MSCs 中 经 内 质 网 高 尔 基 体 等 一 系 列 细 胞 器 合 成 后, 经 过 解 折 叠 及 在 分 子 伴 侣 和 信 号 肽 等 分 子 的 协 助 下 运 输 到 细 胞 膜 上 [5] 研 究 表 明,SDF 1 与 CXCR4 的 结 合 除 了 影 响 正 常 骨 髓 细 胞 的 归 巢 外, 同 时 与 血 液 系 统 恶 性 疾 病 的 发 生 发 展 密 不 可 分 在 病 理 情 况 下, 白 血 病 细 胞 表 面 CXCR4 表 达 的 高 低 与 其 逸 出 骨 髓 进 入 外 周 血 水 平 呈 正 相 关 [6], 在 白 血 病 细 胞 增 殖 髓 内 外 迁 移 浸 润 及 抵 抗 化 疗 药 物 作 用 的 形 成 等 方 面 起 着 重 要 作 用 [7], 其 机 制 可 能 是 SDF 1/CXCR4 的 相 互 作 用 刺 激 细 胞 的 钙 离 子 内 流 及 跨 膜 能 力, 从 而 使 白 血 病 细 [8] 胞 的 迁 移 活 性 升 高 国 外 学 者 还 发 现 CXCR4 高 表 达 的 AML 患 者 预 后 较 差, 因 此 CXCR4 是 急 性 白 血 病 髓 外 浸 润 的 重 要 调 控 因 子 目 前, 对 于 AML 患 者 骨 髓 微 环 境 骨 髓 基 质 细 胞 趋 化 因 子 及 其 受 体 表 [9] 达 的 研 究 较 少, 有 研 究 将 骨 髓 基 质 细 胞 和 NB4 细 胞 ( 急 性 早 幼 粒 细 胞 白 血 病 细 胞 ) 共 培 养 后, 基 质 细 胞 可 通 过 分 泌 某 些 细 胞 因 子 如 IL 6 保 护 白 血 病 细 胞, 增 强 白 血 病 细 胞 对 化 疗 药 物 诱 导 细 胞 凋 亡 的 抵 [10] 抗 作 用, 前 期 的 研 究 显 示 初 治 AML 患 者 骨 髓 血 浆 中 SDF 1 缺 失, 这 种 缺 失 可 能 伴 随 着 CXCR4 的 表 达 下 调, 以 达 到 SDF 1/CXCR4 生 物 轴 在 细 胞 及 骨 髓 微 环 境 中 的 平 衡 本 研 究 显 示, 体 外 培 养 初 次 诊 断 标 准 方 案 化 疗 诱 导 缓 解 后 的 AML 患 者 及 正 常 人 的 BM MSCs,CX CR4 蛋 白 表 达 量 及 在 亚 细 胞 器 的 定 位 和 分 布 有 所 区 别 从 免 疫 荧 光 共 聚 焦 的 结 果 来 看, 初 治 组 BM MSCs 的 CXCR4 分 布 主 要 在 细 胞 膜 上, 而 在 细 胞 内 及 细 胞 器 中 几 乎 见 不 到 CXCR4 的 聚 集, 对 于 缓 解 组 及 对 照 组 而 言,CXCR4 除 了 在 细 胞 膜 上 表 达, 胞 质 内 也 可 见 其 弥 漫 分 布 以 及 在 高 尔 基 体 内 的 明 显 蓄 积,Westernblot 的 结 果 也 显 示 了 初 治 组 的 CXCR4 蛋 白 总 量 明 显 低 于 缓 解 组 和 对 照 组, 差 异 有 统 计 学 意 义 对 于 正 常 者 及 治 疗 缓 解 患 者 而 言, 细 胞 表 达 正 常 含 量 的 CXCR4 及 按 照 跨 膜 蛋 白 转 运 的 顺 序, 周 期 进 行 转 运, 从 内 质 网 到 细 胞 膜, 细 胞 内 的 CXCR4 多 数 聚 集 在 高 尔 基 体 进 行 加 工, 部 分 转 移 到 细 胞 膜 上, 而 在 初 治 AML 患 者 的 BM MSCs 中,CXCR4 不 仅 表 达 量 减 少, 而 且 多 分 布 在 细 胞 膜 上, 高 尔 基 体 内 未 有 蛋 白 蓄 积 这 表 明 AML 患 者 BM MSCs 中 存 在 着 CXCR4 的 表 达 下 调 及 分 布 改 变, 经 过 化 疗 达 到 缓 解 后,CXCR4 的 表 达 量 及 分 布 异 常 明 显 改

１１１８ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ 图 ２ ＣＸＣＲ４在 ＢＭ ＭＳＣｓ内的分布及细胞器定位 免疫荧光双染 １ Ａ 初治组 Ｂ 缓解组 Ｃ 对照组 １ ＣＸＣＲ４和内质网标志蛋白 Ｃａ ｌ ｎ ｘ ｎ荧光双染 ２ ＣＸＣＲ４和高尔基体标志蛋白 Ｇ ａ ｎ ｎ荧光双染 ３ ＣＸ ＣＲ４抗体与溶酶体标志蛋白 ｌ ａ ｍｐ ２ａ荧光双染 ４ ＣＸＣＲ４和内体标志蛋白 ＥＥＡ１荧光双染 红色为 ＣＸＣＲ４蛋白 绿色为各细胞器标志蛋白 善 ＡＭＬ患 者 的 白 血 病 细 胞 表 面 ＣＸＣＲ４的 高 表 ＳＤＦ １的缺失 并且同时参与了骨髓基质细胞环境 达 细胞增殖及髓外侵犯及均与造血微环境的改变 庇护白血病细胞免于化疗药物的诱导凋亡 以及协 有关 而同时骨髓造血微环境的这一改变也影响着 同白血病细胞进行髓外迁移和浸润过程 这 ３种机 骨髓中其他基质细胞包括 ＢＭ ＭＳ Ｃｓ在内的相关细 制与白血病细胞耐药 增殖 抗凋亡密切相关 因 胞因子及受体蛋白的表达变化 如 ＣＸＣＲ４的表达下 而 ＣＸＣＲ４在 ＢＭ ＭＳＣｓ内及细胞膜上的分布改变 ＭＳＣｓ中 调 正如实验中观察的 在 ＡＭＬ患者 ＢＭ 可以作为预测急性白血病化疗疗效的指标之一 即 ＣＸＣＲ４表达量 及 分 布 发 生 改 变 这 种 改 变 伴 随 着 ＭＳＣｓ中 ＣＸＣＲ４表 达 量 减 少 初 治 的 ＡＭＬ患 者 ＢＭ

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1119 参 考 文 献 图 3 Westernblot 检 测 CXCR4 在 细 胞 内 的 表 达 量 及 各 组 表 达 水 平 变 化 1~3: 初 治 组 ;4~6: 缓 解 组 ;7~9: 对 照 组 ; 与 对 照 组 比 较 : P<0.05 并 且 分 布 改 变, 在 这 种 情 况 下, 白 血 病 细 胞 的 转 移 及 浸 润 的 机 会 较 大, 提 示 预 后 不 良, 而 化 疗 缓 解 后, 蛋 白 表 达 量 及 细 胞 内 外 的 分 布 异 常 得 以 纠 正 综 上 所 述, 认 为 CXCR4 在 AML 患 者 BM MSCs 内 及 细 胞 膜 上 分 布 异 常 与 白 血 病 的 发 病 浸 润 耐 药 参 与 体 内 残 留 病 灶 的 形 成 及 复 发 有 关, 对 于 疾 病 的 发 生 发 展, 预 后 评 估 有 着 一 定 的 意 义, 有 助 于 进 一 步 认 识 白 血 病 的 发 病 及 髓 外 浸 润 机 制, 并 为 白 血 病 的 诊 断 和 治 疗 诊 疗 提 供 新 的 思 路 [1] 李 晟, 陈 子 兴, 王 玮, 等.CXCR4 在 急 性 白 血 病 细 胞 中 的 表 达 及 其 对 髓 外 浸 润 的 意 义 [J]. 中 华 血 液 学 杂 志,2004,25(7): 405-8. [2] 马 丽 花, 赵 熠, 蔡 学 敏, 等. 绿 色 荧 光 蛋 白 标 记 成 人 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 的 超 微 结 构 特 征 [J]. 中 国 组 织 工 程 研 究 与 临 床 康 复,2011,15(6):959-62. [3] Broxmeyer.Chemokinesinhematopoiesis[J].CurOpinHematol, 2008,15(1):49-58. [4] StrieterRM,BurdickMD,MestasJ,etal.CancerCXCehemokine networksandtumourangiogeneais[j].eurjcancer,2006,42 (6):768-78. [5] MirandolaL,ApicelaL,ColomboM,etal.Anti Notchtreatment preventsmultiplemyelomacelslocalizationtothebonemarowvia thechemokinesystem CXCR4/SDF 1[J].Leukemia,2013,27 (7):1558-66. [6] PeledA,TavorS.RoleofCXCR4inthepathogenesisofacutemye loidleukemia[j].theranostics,2013,3(1):34-9. [7] SisonEA,McIntyreE,MagoonD,etal.Dynamicchemotherapy inducedupregulationofcxcr4expresion:amechanismofthera peuticresistanceinpediatricaml[j].molcancerres,2013,11 (9):1004-16. [8] Tavernier TardyE,CornilonJ,CamposL,etal.Prognosticvalueof CXCR4andFAK expresioninacutemyelogenousleukem [J]. LeukRes,2009,33(6):764-8. [9] 周 志 诚, 夏 海 龙. 骨 髓 基 质 细 胞 抵 抗 三 氧 化 二 砷 诱 导 NB4 细 胞 株 凋 亡 的 作 用 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2013,48(10):1164-6. [10]GeJ,HouR,LiuQ,etal.Stromal derivedfactor 1deficiencyin thebonemarow ofautemyeloidleukemia[j].intjhematol, 2011,93(6):750-9. ExpresionanddistributionofCXCR4inbonemarrowmesenchymal stem celsofacutemyeloidleukemia GuiYu,GeJian,XiaRuixiang (DeptofHematology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022) Abstract Objective Toexplorethedistribution,expresionofCXCR4inbonemarowmesenchymalstem cels (BM MSCs)ofuntreatedacutemyeloidleukemia(AML)patientsanditsclinicalsignificance.Methods Bone marowsamplesfromamlpatientswithinitialdiagnosiswhoweretreatedbeforeandafterchemotherapy,theniso latedandculturedbm MSCsinvitro.SubcelularlocalizationanddistributionofCXCR4onmembraneinP2celsof diferentgroupswereobservedbyusingconfocalimmunofluorescence.contentchangesofcxcr4weredetectedby usingwesternblot.results ThedistributionofCXCR4inBM MSCsofuntreatedAMLgroupwasdiferentfrom others,didnotaccumulateinthegolgiapparatus,mostofwhichwerelocatedonthecelmembraneinstead,and proteincontentwaslowerthantheothertwogroups.conclusion ThedistributionandcontentchangeofCXCR4 inbm MSCsofuntreatedAMLpatientsmaybeasociatedwiththechangeofbonemarowhematopoieticmicroenvi ronment,andcxcr4hasasynergisticefectonextramedularyinfiltrationofleukemiccels. Keywords acutemyeloidleukemia;bonemarowmesenchymalstemcels;golgiapparatus;cxcr4

1120 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 安 徽 汉 族 人 血 小 板 特 异 性 抗 原 1 17 多 态 性 分 布 调 查 朱 帮 强 1, 徐 元 宏 2, 陈 影 2 3, 周 娟 摘 要 目 的 研 究 安 徽 汉 族 人 群 人 类 血 小 板 特 异 性 抗 原 (HPA)1 17 多 态 性 分 布 特 点, 为 临 床 进 行 血 小 板 相 容 性 输 注 提 供 实 验 依 据 方 法 随 机 选 取 150 例 健 康 安 徽 汉 族 献 血 者, 分 别 采 集 2ml 全 血 提 取 DNA 后 采 用 序 列 特 异 性 引 物 聚 合 酶 链 式 反 应 (SSP PCR) 方 法 进 行 HPA1 17 基 因 分 型 结 果 安 徽 汉 族 人 HPA 1a 2a 3a 4a 5a 6a 15a 基 因 频 率 分 别 为 0 9966 0 8800 0 6267 0 9966 0 9700 0 9533 0 4833;HPA 1b 2b 3b 4b 5b 6b 15b 基 因 频 率 分 别 为 0 0034 0 1200 0 3733 0 0034 0 0300 0 0467 0 5167;HPA 7a 8a 9a 10a 11a 12a 13a 14 a 16a 17a 基 因 频 率 为 1 0000;HPA 7b 8b 9b 10b 11 b 12b 13b 14b 16b 17b 未 在 本 次 调 查 中 检 出 结 论 安 徽 汉 族 人 群 HPA1 17 多 态 性 分 布 显 示 出 自 身 特 点,HPA 2 HPA 3 HPA 15 具 有 较 高 的 遗 传 多 态 性 关 键 词 人 类 血 小 板 特 异 性 抗 原 ; 基 因 分 型 ; 多 态 性 中 图 分 类 号 R457.1 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1120-04 人 类 血 小 板 特 异 性 抗 原 (humanplateletanti gens,hpa) 位 于 血 小 板 膜 的 糖 蛋 白 分 子 上,HPA 不 相 容 可 引 起 血 小 板 同 种 免 疫 反 应, 产 生 血 小 板 同 种 抗 体, 导 致 同 种 免 疫 性 血 小 板 减 少, 诱 发 如 血 小 板 输 注 无 效 (platelettransfusionrefractorines,ptr) 输 血 后 血 小 板 减 少 性 紫 癜 (posttransfusionthrombocy topenicpurpura,ptp) 及 新 生 儿 同 种 免 疫 性 血 小 板 减 少 性 紫 癜 (neonatalaloimmunethrombocytopenicpur pura,naitp) 等 疾 病, 在 临 床 移 植 中 还 会 引 起 移 植 排 斥 等 [1], 因 此 鉴 定 HPA 对 临 床 医 学 及 输 血 实 践 具 有 重 要 意 义 [2] 研 究 安 徽 地 区 汉 族 人 群 HPA1 17 多 态 性 分 布 情 况, 可 预 测 血 小 板 特 异 性 同 种 免 疫 发 2014-04-18 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :81171606) 1 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 输 血 科 2 检 验 科, 合 肥 230022 3 安 徽 医 科 大 学 公 共 卫 生 学 院, 合 肥 230032 作 者 简 介 : 朱 帮 强, 男, 硕 士 研 究 生, 主 管 技 师 ; 徐 元 宏, 男, 教 授, 主 任 技 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:xyhong1964@163.com 生 的 可 能 性, 为 临 床 进 行 血 小 板 相 容 性 输 注 提 供 实 验 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 标 本 来 源 从 2012 年 8 月 ~2013 年 1 月 在 安 徽 省 血 液 中 心 献 血 的 5834 例 安 徽 汉 族 合 格 献 血 者 中, 用 MicrosoftExcel2003 软 件 中 的 随 机 函 数 RAND() 对 此 5834 例 献 血 者 编 码 各 加 上 一 个 随 机 数 标 签, 然 后 按 照 此 随 机 数 进 行 排 序, 选 取 前 150 例 献 血 者, 其 中 男 78 例, 女 72 例 ; 年 龄 18~56 岁, 中 位 年 龄 37 岁, 分 别 采 集 静 脉 血 液 2ml 于 EDTA 抗 凝 管 中 备 用 1.2 实 验 器 材 台 式 高 速 离 心 机 ( 上 海 力 申 科 学 仪 器 有 限 公 司, 型 号 :Neofuge13); 涡 旋 混 匀 器 ( 上 海 医 科 大 学 仪 器 厂, 型 号 :XW 80A); 纯 水 仪 ( 上 海 摩 勒 科 学 仪 器 有 限 公 司, 型 号 :1010a); 数 字 恒 温 水 浴 锅 ( 江 苏 金 坛 市 江 南 仪 器 厂, 型 号 :HH W); 电 子 天 平 ( 上 海 良 平 仪 器 仪 表 有 限 公 司, 型 号 :JY 2002);PCR 仪 ( 德 国 BIOMETRA, 型 号 :BIOMETRA 梯 度 PCR 仪 ); 电 泳 仪 ( 北 京 市 六 一 仪 器 厂, 型 号 : DYY 10C); 电 泳 槽 ( 上 海 天 能 科 技 有 限 公 司, 型 号 : HE 90); 紫 外 凝 胶 成 像 系 统 ( 美 国 伯 乐, 型 号 :BIO RADGelDoc2000); 紫 外 分 光 光 度 计 ( 上 海 光 谱 仪 器 有 限 公 司, 型 号 :sp 754) 1.3 实 验 试 剂 TIANampBloodDNAKit 血 液 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 ( 天 根 生 化 北 京 科 技 有 限 公 司, 批 号 :L0628);Taq 酶 ( 普 洛 麦 格 生 物 技 术 有 限 公 司, 批 号 :20020105); 琼 脂 糖 溴 化 乙 锭 溶 液 ( 批 号 : 130121002) TBEpowder( 批 号 :130227001) HPA1 17 基 因 分 型 试 剂 盒 ( 批 号 :1207A)( 天 津 市 秀 鹏 生 物 技 术 开 发 有 限 公 司 );DNAMarker B:100bp,200 bp,300bp,400bp,500bp,600bp( 上 海 生 工, 批 号 : 081012); 无 水 乙 醇 ( 安 徽 安 特 食 品 股 份 有 限 公 司, 批 号 :1205073601); 液 体 石 蜡 ( 天 津 市 赢 达 稀 贵 化 学 试 剂 厂, 批 号 :20120904) 等 1.4 全 血 DNA 提 取 采 用 DNA 提 取 试 剂 盒 按 照 操 作 说 明 提 取 所 采 集 的 血 液 标 本 DNA 提 取 的

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1121 DNA 用 紫 外 分 光 光 度 计 检 测 DNA 浓 度 及 纯 度, DNA 产 物 浓 度 为 25~30ng/μl,OD 260 /OD 280 比 值 在 1 8~2.0 之 间 符 合 实 验 要 求 1.5 PCR 扩 增 采 用 序 列 特 异 性 引 物 聚 合 酶 链 式 反 应 (sequencespecificprimerpolymerasechainreac tion,ssp PCR) 方 法 扩 增 根 据 GenBank 序 列 信 息 [3-4] 和 公 开 序 列 数 据 设 计 引 物 ( 天 津 市 秀 鹏 生 物 技 术 开 发 有 限 公 司, 批 号 :1207A), 将 34 对 HPA1 17 正 反 向 特 异 性 干 燥 引 物 和 人 类 生 长 激 素 保 守 片 段 引 物 按 顺 序 预 先 包 被 在 96 孔 PCR 反 应 板 的 34 孔 内, 然 后 向 反 应 板 中 的 每 孔 加 入 如 下 物 质 :35~42ng DNA 样 本,0 5UTaq 酶,8μlPCR 混 合 缓 冲 液, 最 后 向 每 孔 加 入 石 蜡 油 PCR 循 环 程 序 设 定 为 :1 96 变 性 3min;2 96 变 性 25s,68 退 火 45s,72 延 伸 30s,5 个 循 环 ;3 96 变 性 25s,61 退 火 45s,72 延 伸 30s,22 个 循 环 ;4 96 变 性 20s, 55 退 火 45s,72 延 伸 60s,8 个 循 环 ;5 72 延 伸 3min,6 降 温 至 25, 完 成 PCR 扩 增 1.6 电 泳 及 凝 胶 成 像 将 6μlPCR 产 物 按 序 转 移 于 2 5% 琼 脂 糖 凝 胶 孔 中, 于 148V 下 电 泳 20min 后 将 凝 胶 置 于 凝 胶 成 像 系 统 中 成 像 并 保 存 实 验 结 果 1.7 统 计 学 处 理 按 群 体 遗 传 基 因 计 数 法 计 算 基 因 频 率, 用 SPSS17.0 进 行 统 计 分 析, 计 算 χ 2 值 后 比 较 基 因 型 期 望 值 与 观 察 值, 验 证 是 否 符 合 Hardy Weinberg 遗 传 平 衡 法 则 按 照 血 小 板 随 机 输 注 错 配 概 率 (mismatchprobabilityinrandomtransfusion,mp) 公 式 MP=a 2 (1-a 2 )+b 2 (1-b 2 )=2ab(1-ab) 计 算 得 出 血 小 板 随 机 输 注 错 配 概 率 [4] (a,b 为 对 偶 抗 原 等 位 基 因 频 率 ) 13b(-),HPA 14a(+),HPA 14b(-),HPA 16a (+),HPA 16b(-),HPA 17a(+),HPA 17b(-) HPA 1a,1b 特 异 性 条 带 为 196bp,HPA 2a,2b 特 异 性 条 带 为 241bp,HPA 3a,3b 特 异 性 条 带 为 267 bp,hpa 4a,4b 特 异 性 条 带 为 252bp,HPA 5a,5b 特 异 性 条 带 为 249bp,HPA 6a,6b 特 异 性 条 带 为 169bp,HPA 15b,15a 特 异 性 条 带 为 278bp,HPA 7a,7b 特 异 性 条 带 为 160 162bp,HPA 8a,8b 特 异 性 条 带 为 190 188bp,HPA 9a,9b 特 异 性 条 带 为 212bp,HPA 10a,10b 特 异 性 条 带 为 216bp,HPA 11a,11b 特 异 性 条 带 为 184bp,HPA 12a,12b 特 异 性 条 带 为 194bp,HPA 13a,13b 特 异 性 条 带 为 156 154bp,HPA 14a,14b 特 异 性 条 带 为 200 197bp, HPA 16a,16b 特 异 性 条 带 为 165 164bp,HPA 17a, 17b 特 异 性 条 带 为 210 212bp 图 1 1 号 样 本 HPA 1 2 3 4 5 6 15 7 分 型 结 果 M:Marker;1~16:HPA 1a 1b 2a 2b 3a 3b 4a 4b 5a 5b 6a 6b 15b 15a 7a 7b 基 因 分 型 结 果 图 2 1 号 样 本 HPA 8 9 10 11 12 13 14 16 分 型 结 果 M:Marker;1~16:HPA 8a 8b 9a 9b 10a 10b 11a 11b 12a 12b 13a 13b 14a 14b 16a 16b 基 因 型 结 果 2 结 果 2.1 HPA1 17 等 位 基 因 分 型 结 果 凝 胶 成 像 图 ( 以 1 号 样 本 为 例 ) 图 1~3 所 示 HPA1 17 分 型 结 果 为 :HPA 1a(+),HPA 1b(-),HPA 2a(+), HPA 2b(+),HPA 3a(+),HPA 3b(+),HPA 4a (+),HPA 4b(-),HPA 5a(+),HPA 5b(-), HPA 6a(+),HPA 6b(+),HPA 15b(+),HPA 15a (-)HPA 7a(+),HPA 7b(-),HPA 8a(+), HPA 8b(-),HPA 9a(+),HPA 9b(-),HPA 10a (+),HPA 10b(-),HPA 11a(+),HPA 11b(-), HPA 12a(+),HPA 12b(-),HPA 13a(+),HPA 图 3 1 号 样 本 HPA 17 分 型 结 果 M:Marker;1~2:HPA 17a 17b 基 因 分 型 结 果 2.2 HPA 基 因 型 及 等 位 基 因 频 率 分 布 根 据 计 算 和 统 计 分 析,150 例 安 徽 汉 族 人 群 HPA1 17 基 因 型 等 位 基 因 频 率 及 血 小 板 MP 见 表 1 检 测 出 多 态 性 的 HPA 1 2 3 4 5 6 15 经 χ 2 检 验 P 值 均 大 于 0 05, 符 合 Hardy Weinberg 遗 传 平 衡 法 则

1122 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 1 安 徽 汉 族 人 HPA1 17 基 因 型 及 等 位 基 因 频 率 分 布 表 抗 原 基 因 型 人 数 及 频 率 基 因 频 率 aa ab bb aa(%) ab(%) bb(%) a b χ 2 值 P 值 MP 值 HPA 1 149 1 0 99.33 0.67 0 0.9966 0.0034 0.002 >0.05 0.01 HPA 2 114 36 0 76.00 24.00 0 0.8800 0.1200 2.789 >0.05 0.19 HPA 3 58 72 20 38.67 48.00 13.33 0.6267 0.3733 0.100 >0.05 0.36 HPA 4 149 1 0 99.33 0.67 0 0.9966 0.0034 0.002 >0.05 0.01 HPA 5 141 9 0 94.00 6.00 0 0.9700 0.0300 0.143 >0.05 0.06 HPA 6 137 12 1 91.33 8.00 0.67 0.9533 0.0467 1.527 >0.05 0.09 HPA 7 150 0 0 100.00 0 0 1.0000 0 NA 0 HPA 8 150 0 0 100.00 0 0 1.0000 0 NA 0 HPA 9 150 0 0 100.00 0 0 1.0000 0 NA 0 HPA 10 150 0 0 100.00 0 0 1.0000 0 NA 0 HPA 11 150 0 0 100.00 0 0 1.0000 0 NA 0 HPA 12 150 0 0 100.00 0 0 1.0000 0 NA 0 HPA 13 150 0 0 100.00 0 0 1.0000 0 NA 0 HPA 14 150 0 0 100.00 0 0 1.0000 0 NA 0 HPA 15 35 75 40 23.33 50.00 26.67 0.4833 0.5167 0.0001 >0.05 0.37 HPA 16 150 0 0 100.00 0 0 1.0000 0 NA 0 HPA 17 150 0 0 100.00 0 0 1.0000 0 NA 0 NA: 无 法 评 估 3 讨 论 血 小 板 表 面 具 有 复 杂 的 血 型 抗 原, 除 与 其 他 细 胞 组 织 共 有 抗 原 如 红 细 胞 血 型 系 统 和 人 类 白 细 胞 抗 原 Ⅰ(humanleucocyteantigen Ⅰ,HLA Ⅰ) 类 抗 原 等 外, 还 存 在 HPA [1] 截 至 目 前 经 血 清 学 鉴 定 的 24 个 HPA 抗 原 中 有 23 个 HPA 抗 原 的 基 因 多 态 性 的 遗 传 基 础 已 经 阐 明 [5],HPA 基 因 位 于 第 5 6 17 和 22 号 染 色 体 上, 为 双 等 位 共 显 性 遗 传, 除 HPA 14bw 是 由 核 苷 酸 1909~1911 位 上 的 碱 基 序 列 AAG 3 个 碱 基 缺 失 外, 其 余 HPA 系 统 均 是 由 于 血 小 板 膜 糖 蛋 白 结 构 基 因 中 的 单 核 苷 酸 多 态 性 (singlenucle otidepolymorphisms,snp) 引 起 [6] HPA 抗 原 都 存 在 于 血 小 板 糖 蛋 白 上 [7], 其 抗 原 分 布 在 血 小 板 糖 蛋 白 GPⅠa(HPA 5,13) GPⅠbα(HPA 2) GPⅠbβ (HPA 12) GPⅡb(HPA 3,9) GPⅢa(HPA 1,4,6, 7,8,10,11,14,16,17) 和 CD109(HPA 15) 上 [8], 每 种 HPA 抗 原 由 于 碱 基 改 变 引 起 氨 基 酸 的 置 换 导 致 表 达 的 血 小 板 膜 糖 蛋 白 质 结 构 改 变, 产 生 了 不 同 的 肽, 从 而 导 致 同 种 免 疫 应 答 [7], 引 起 同 种 免 疫 性 血 小 板 减 少 国 际 输 血 协 会 和 国 际 血 栓 和 止 血 协 会 在 2003 年 建 立 的 国 际 血 小 板 命 名 委 员 会 对 人 类 血 小 板 特 异 性 抗 原 设 定 的 命 名 原 则 为 HPA 加 数 字 表 示, a 表 示 基 因 频 率 大 于 50% 的 等 位 基 因,b 表 示 基 因 频 率 小 于 50% 的 另 一 相 应 等 位 基 因 [6] 由 血 小 板 特 有 抗 原 决 定 簇 组 成 的 HPA 表 现 出 血 小 板 独 特 的 遗 传 多 态 性, 其 多 态 性 分 布 研 究 对 临 床 及 输 血 实 践 具 有 重 要 意 义 [2] HPA 不 相 容 的 血 小 板 输 注 易 诱 发 血 小 板 输 注 无 效 (platelettransfu sionrefractorines,ptr) 等 疾 病, 根 据 HPA 多 态 性 分 布 情 况 可 以 预 测 本 地 区 血 小 板 特 异 性 同 种 免 疫 发 生 的 可 能 性, 确 定 在 临 床 上 进 行 血 小 板 输 注 时 具 有 重 要 性 的 HPA, 进 行 HPA 相 容 性 的 血 小 板 输 注, 可 以 提 高 临 床 输 血 的 安 全 和 有 效 性 传 统 HPA 血 清 学 分 型 方 法 由 于 受 到 难 以 获 得 高 质 量 和 高 特 异 性 抗 血 清 等 因 素 制 约, 限 制 了 HPA 分 型 工 作 的 开 展, 而 基 于 HPA 基 因 分 子 生 物 学 特 点 设 计 的 SSP PCR 技 术 可 以 对 HPA 进 行 准 确 的 基 因 分 型 [8] 本 研 究 通 过 SSP PCR 技 术 对 150 例 安 徽 汉 族 人 HPA1 17 进 行 了 基 因 分 型, 结 果 显 示 安 徽 汉 族 人 HPA1 17 多 态 性 分 布 具 有 如 下 特 点 :1 HPA2a/2b HPA3a/3b HPA15a/15b 具 有 较 高 的 遗 传 多 态 性 ;2 HPA 1b HPA 4b HPA 5b HPA 6b 基 因 频 率 较 低 ;3 HPA 7b HPA 8b HPA 9b HPA 10b HPA 11b HPA 12b HPA 13b HPA 14b HPA 16b HPA 17b 未 在 本 次 调 查 中 检 出 分 析 本 研 究 结 果 可 以 发 现 安 徽 地 区 汉 族 人 HPA 系 统 引 起 的 血 小 板 MP 从 高 到 低 前 3 位 依 次 由 HPA 15 HPA 3 HPA 2 系 统 引 起, 提 示 在 临 床 输 血 实 践 中 进 行 HPA 2 3 15 基 因 分 型 对 预 防 由 HPA 引 起 PTR 具 有 重 要 意 义

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1123 HPA 作 为 人 类 遗 传 多 态 性 标 记,HPA 基 因 分 型 研 究 可 为 群 体 遗 传 学 和 人 类 学 研 究 提 供 重 要 数 据, 应 用 于 人 类 进 化 与 迁 徙 的 研 究, 同 时 还 应 用 于 某 些 疾 病 的 相 关 性 研 究 [9-11] 安 徽 汉 族 人 HPA1 17 多 态 性 分 布 研 究 不 仅 为 进 一 步 进 行 相 关 研 究 提 供 了 重 要 资 料, 利 用 本 研 究 掌 握 的 部 分 HPA 型 别 已 知 的 献 血 者 信 息 亦 为 临 床 上 由 HPA 不 合 引 起 的 疾 病 患 者 需 要 输 注 血 小 板 时 寻 找 HPA 相 容 的 供 者 提 供 了 便 利 参 考 文 献 [1] 李 勇, 马 学 严. 实 用 血 液 免 疫 学 血 型 理 论 和 实 验 技 术 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社,2006:283-311. [2] ThomasJ,Kunicki,DianeJ,etal.HumanplateletAntigens[M]// Hilyer,Silberstein,Nes,etal.BloodBankingandTransfusion Medicine.2nd.Philadephia:ChurchilLivingstone,2006:112-24. [3] LyouJY,ChenYJ,HuH Y,etal.PCRwithsequence specific primer basedsimultaneousgenotypingofhumanplateletantigen 1 to 13w[J].Transfusion,2002,42(8):1089-95. [4] FengML,LiuDZ,ShenW,etal.EstablishmentofanHPA 1 to 16 typedplateletdonorregistryinchina[j].transfusionmed, 2006,16(5):369-74. [5] StafordP,GarnerSF,RankinA,etal.Asingle nucleotidepoly morphisminthehumanitgb3geneisasociatedwiththeplatelet specificaloantigenva(hpa 17bw)involvedinfetalmaternalal loimmunethrombocytopenia[j].transfusion,2008,48(7):1432-8. [6] MetcalfeP,WatkinsNA,OuwehandW H,etal.Nomenclatureof humanplateletantigens[j].voxsang,2003,85(3):240-5. [7] MetcalfeP.Plateletantigensandantibodydetection[J].Vox Sang,2004,87Suppl1:82-6. [8] 赵 桐 茂. 人 类 血 小 板 抗 原 研 究 概 况 [J]. 中 国 输 血 杂 志,2004, 17(2):129-32. [9] ReinerAP,KumarPN,SchwartzSM,etal.Geneticvariantsof plateletglycoproteinreceptorsandriskofstrokeinyoungwomen [J].Stroke,2000,31(7):1628-33. [10] WiwanitkitV.PIA1/A2polymorphismoftheplateletglycoprotein receptorib/ Iaanditscorelationwithmyocardialinfarction:an appraisal[j].clinapplthrombhemost,2006,12(1):93-5. [11] 梁 晓 浏, 王 保 龙, 上 官 志 敏, 等. 特 发 性 血 小 板 减 少 性 紫 癜 与 HPA 等 位 基 因 相 关 性 研 究 [J]. 中 国 输 血 杂 志,2009,22(3): 207-10. Geneticpolymorphism ofhumanplateletantigens1 17 inanhuihanpopulation ZhuBangqiang 1,XuYuanhong 2,ChenYing 2,etal ( 1 DeptofBloodTransfusion, 2 DeptofClinicalLaboratory,TheFirstAfiliatedHospitalof AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022) Abstract Objective ToinvestigatethegeneticpolymorphismofHPA 1to 17antigensinAnhuiHanpopulation, soastoprovideexperimentalbasistoscreencompatibleplateletsforclinical.methods Atotalof150samples fromanhuihanblooddonorswererandomlyselectedandcolected2mlwholebloodrespectively,dnawasextrac tedfromwholebloodandthengenotypedhpa1 17bysequencespecificprimerpolymerasechainreaction(SSP PCR).Results ThegenefrequenciesofHPA 1a,2a,3a,4a,5a,6a,15awere0 9966,0 8800,0 6267, 0 9966,0 9700,0 9533and0 4833respectivelyinAnhuiHanpopulation.HPA 1b,2b,3b,4b,5b,6b,15 bwere0 0034,0 1200,0 3733,0 0034,0 0300,0 0467,0 5167.ThegenefrequenciesofHPA 7a,8a,9 a,10a,11a,12a,13a,14a,16a,17awere1 0000.HPA 7b,8b,9b,10b,11b,12b,13b,14b,16b,17b aleleswerenotdetected.conclusion HPA1 17inAnhuiHanpopulationshowsitsowncharacteristics,HPA 2, HPA 3,HPA 15arehighlypolymorphic Keywords humanplateletantigens;genomictyping;polymorphic

1124 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 脑 胶 质 瘤 中 ppenk EDNRB 和 CLDN 7 基 因 甲 基 化 状 态 的 研 究 徐 培 坤 1, 邓 鹏 程 1, 朱 立 新 2, 王 斌 1 1, 成 金 民 摘 要 目 的 了 解 脑 胶 质 瘤 中 ppenk EDNRB 和 CLDN 73 种 基 因 的 甲 基 化 状 况 方 法 应 用 巢 式 聚 合 链 式 反 应 (npcr) 方 法 和 亚 硫 酸 氢 盐 修 饰 后 测 序 (BSP) 方 法, 分 别 检 测 46 例 脑 胶 质 瘤 标 本 和 10 例 正 常 脑 组 织 标 本 的 3 种 基 因 启 动 子 区 CpG 岛 的 甲 基 化 状 态, 并 分 析 各 基 因 甲 基 化 程 度 与 临 床 资 料 的 关 系 结 果 正 常 脑 组 织 标 本 中 该 3 种 基 因 无 甲 基 化 脑 胶 质 瘤 中 ppenk EDNRB 和 CLDN 73 种 基 因 启 动 子 甲 基 化 率 分 别 为 44.2%(19/43) 22.5%(9/40) 和 0%(0/5) 在 低 级 别 (Ⅰ ~Ⅱ 级 ) 脑 胶 质 瘤 组 中 ppenk 基 因 启 动 子 甲 基 化 率 (33.3%) 低 于 高 级 别 (Ⅲ ~Ⅳ 级 ) 脑 胶 质 瘤 组 中 ppenk 基 因 启 动 子 甲 基 化 率 (69.2%), 两 者 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 结 论 脑 胶 质 瘤 中 ppenk 和 EDNRB 基 因 启 动 子 区 CpG 岛 有 甲 基 化 现 象, 与 脑 胶 质 瘤 发 生 发 展 有 关 关 键 词 CpG 岛 ; 甲 基 化 ; 胶 质 瘤 中 图 分 类 号 R739.41 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1124-04 脑 胶 质 瘤 至 今 仍 是 颅 脑 内 预 后 最 差 的 肿 瘤, 近 30 年 来 国 内 外 对 脑 胶 质 瘤 的 治 疗 没 有 显 著 的 突 破 脑 胶 质 瘤 的 发 病 机 制 的 不 详 治 疗 方 案 的 不 合 理 是 导 致 其 疗 效 不 佳 的 重 要 原 因 随 着 表 观 遗 传 学 的 研 究 发 展 : 基 因 甲 基 化 在 脑 胶 质 瘤 的 发 生 发 展 过 程 中 起 到 了 非 常 重 要 的 作 用, 某 些 基 因 的 甲 基 化 与 脑 胶 质 瘤 的 关 系 也 已 得 到 证 实 但 脑 胶 质 瘤 的 发 生 发 展 可 能 受 控 于 多 个 基 因 共 同 影 响, 发 现 和 检 测 尽 可 能 多 的 影 响 基 因 并 在 此 基 础 上 建 立 脑 胶 质 瘤 的 基 因 甲 基 化 谱 可 以 有 效 的 指 导 改 进 脑 胶 质 瘤 的 治 疗 目 前 在 除 脑 胶 质 瘤 外 的 很 多 其 他 恶 性 肿 瘤 中 发 现 ppenk EDNRB 和 CLDN 7 基 因 启 动 子 区 高 甲 基 化 的 现 象 [1-4] 该 实 验 采 取 巢 式 聚 合 链 式 反 应 (nested poly merasechainreaction,npcr) 方 法 和 亚 硫 酸 氢 盐 修 饰 后 测 序 (bisulfitesequencepolymerasechainreac tion,bsp) 方 法 研 究 脑 胶 质 瘤 中 ppenk EDNRB 和 CLDN 73 种 基 因 启 动 子 区 的 甲 基 化 状 态, 并 分 析 2014-04-18 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 卫 生 厅 基 金 ( 编 号 :2010B013) 1 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 神 经 外 科 2 中 心 实 验 室, 合 肥 230022 作 者 简 介 : 徐 培 坤, 男, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:xp kayfy@163.com 该 3 种 基 因 的 甲 基 化 与 脑 胶 质 瘤 患 者 的 年 龄 性 别 及 肿 瘤 病 理 分 型 分 级 等 临 床 资 料 之 间 的 关 系, 以 探 索 基 因 甲 基 化 在 脑 胶 质 瘤 发 生 发 展 中 的 作 用 1 材 料 与 方 法 1.1 标 本 收 集 和 病 理 资 料 本 组 56 例 标 本 均 于 2010 年 11 月 ~2012 年 11 月 来 自 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 神 经 外 科 手 术 中 脑 胶 质 瘤 标 本 46 例, 其 中 男 21 例, 女 25 例, 年 龄 19~76 岁, 中 位 年 龄 48 岁 按 照 世 界 卫 生 组 织 (WorldHealthOrganiza tion,who) 神 经 系 统 的 肿 瘤 分 级 标 准 进 行 病 理 分 级,Ⅰ ~Ⅱ 级 31 例,Ⅲ ~Ⅳ 级 15 例 其 中 胶 质 母 细 胞 瘤 13 例, 星 型 细 胞 瘤 为 25 例, 少 突 胶 质 细 胞 瘤 5 例, 室 管 膜 瘤 3 例 肿 瘤 组 织 标 本 均 由 经 验 丰 富 的 神 经 外 科 主 任 医 师 手 术 提 取, 并 都 由 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 的 病 理 科 检 验 确 诊 患 者 手 术 前 未 进 行 放 化 疗 等 前 期 治 疗, 可 排 除 其 他 治 疗 对 本 次 实 验 的 干 扰 另 提 取 10 例 因 脑 外 伤 进 行 开 颅 内 减 压 手 术 的 患 者 的 脑 组 织 标 本 作 为 实 验 对 照 组, 其 中 男 6 例, 女 4 例, 年 龄 25~56 岁, 中 位 年 龄 41 岁 提 取 标 本 均 快 速 放 入 液 氮 罐 并 转 入 -80 冰 箱 中 冷 冻 备 用 1.2 方 法 1.2.1 组 织 DNA 提 取 和 测 定 DNA 浓 度 采 用 Qi ampdnaminikit 试 剂 盒 ( 按 说 明 书 操 作 ):1 分 离 溶 解 标 本 : 从 -80 冰 箱 中 取 出 组 织 标 本 10~20 mg, 剪 碎 标 本 后 加 入 裂 解 液 并 充 分 研 磨 后 离 心 (4000r/min,10min), 弃 上 清 液, 打 散 混 匀 后 加 入 蛋 白 酶 k 混 匀 并 水 浴 ;2 清 洗 纯 化 标 本 DNA: 弃 上 清 液, 打 散 混 匀 后 加 入 无 水 乙 醇 并 混 匀, 加 入 Bufer Awl 并 离 心 (12000r/min,30s)( 重 复 一 次 充 分 清 洗 标 本 DNA);3 提 取 标 本 DNA: 弃 上 清 液 ; 加 入 BuferAE 并 水 浴 5min;4 验 证 提 取 标 本 DNA: 电 泳 验 证 DNA 存 在 与 否, 用 分 光 光 度 计 计 算 提 取 的 DNA 的 浓 度 及 纯 度 ;5 保 存 DNA: 将 提 取 标 本 的 DNA 置 于 -20 冰 箱 保 存 1.2.2 组 织 DNA 甲 基 化 修 饰 按 EpiGENETEK onestepdnamodificationkit 方 法 修 饰 :1 取 90% 乙 醇 1ml 加 入 10μlG3( 平 衡 液 ) 混 匀, 取 混 合 液 体

安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １１２５ ５ μｌ加入 ２ μｌｇ１ Ｇ２ Ｇ３洗涤前面步骤提取的 ＤＮＡ 振荡水浴 ８ｍ ｎ后离心 ２ｒ ｍ ｎ １ｍ ｎ ｒ ｍ ｎ １ｍ ｎ ② 加入 ３μｌＧ４修饰 离心 ２ 乙醇充分洗涤 反 并混匀 ③ 向混匀液中加入 ９ 复 ２次 ④ 向充分洗涤后的混匀液中加入 １８μｌ Ｇ６ １ ２ ３ ｎｐｃｒ法检测 ｎ ＰＣＲ即通过 ２轮的 ＰＣＲ反 应 使用的是两套引物来扩增特异性的 ＤＮＡ片段 引物序列见表 １ 其中第 ２对引物的功能是特异性 图 １ ｎｐｃｒ扩增后对扩增产物进行检测电泳图 １ １ １ 标本组织 Ｎ Ｈ２Ｏ阴性对照 Ｍ ＤＮＡ片段 Ｍａ ｒ ｋ ｒ 的扩增位于首轮 ＰＣＲ产物内的一段 ＤＮＡ片断 这 种 ＰＣＲ可以提高 ＤＮＡ扩增的特异性 避免扩增出 中的 Ｃ未发生甲基化 那么测序结果会显示 Ｃ经过 错误的 ＤＮＡ片段 试验处理后转变成胸腺嘧啶 Ｔ 见图 ２Ｂ Ｄ 表 １ ３种基因的引物序列及产物长度 基因 引物序列 ５ ３ ｐｐｅｎｋ 外引物 Ｆ１ ＧＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＴＴＡＧＡＡＧ 产物长度 ｂｐ ３８５ Ｒ１ ＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＣＡＣＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＣ 内引物 Ｆ２ ＴＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＴＴＴＴＧＧＧＴ ２３９ Ｒ２ ＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＣＡＣＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＣ ＥＤＮＲＢ 外引物 Ｆ１ ＧＡＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴ １５５ Ｒ１ ＴＡＴＡＴＣＡＡＡＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＣＣＣ 内引物 Ｆ２ ＡＡＴＴＡＴＴＧＡＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＧＧ ２４７ Ｒ２ ＣＴＧＧＣＣＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＴ ＣＬＤＮ ７ 外引物 Ｆ１ ＴＴＴＡＴＴＴＧＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴ ３１４ Ｒ１ ＡＣＣＣＴＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡ 内引物 Ｆ２ ＴＴＴＡＴＴＴＧＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴ ３７７ Ｒ２ ＡＡＴＡＡＴＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＣ 首轮 ＰＣＲ 反应体系总共为 ２ ５μｌ 其中以蒸馏 水代替 ＤＮＡ模板作对照组 包括 ＤＮＡ模板 ４μｌ １ ＰＣＲＢｕｆ ｆ ｒ２ ５μｌ ｄｎｔｐ ５μｌ Ｍｇ Ｃｌ ５ ２２ ｑ酶 ２μｌ 内 外引物各 １ ５μｌ 再加双 μｌ Ｔａ 蒸水至 ２５μｌ 反应体系经过 ９５ １ ｍ ｎ预变性 再经过 ＰＣＲ循环 ９ ９ ６ｍ ｎ ６ ５ １ ２ ｍ ｎ ７ ２ ３ ３ｍ ｎ 首轮 ＤＮＡ的 ＰＣＲ为 ３个循环 ２μｌ首轮产物 经双蒸水稀释 首轮产物 双蒸水 １ ４ 后作为 目标物加入次轮反应 重复首轮 ＰＣＲ的过程 扩增 后的目标物用 ２ 琼脂糖凝胶电泳检测 见图 １ １ ２ ４ ＰＣＲ产物的测序 本次实验采用 ＢＳ Ｐ法 其测序工作由上海生物芯片公司完成 该法是检测 基因甲基化的有效手段 根据测序的结果 可确定扩 增的 ＰＣＲ产物目标片段中每个 Ｃｐ Ｇ岛中的胞嘧啶 Ｃ 的甲基化状态 如果目的片段的 ＣｐＧ岛中的 Ｃ 发生甲基化 那么测序结果会显示 Ｃ经过亚硫酸氢 盐修饰后无改变 见图 ２Ａ Ｃ 若目的片段的 ＣｐＧ岛 图 ２ ｐｐｅｎｋ Ａ Ｂ 和 ＥＤＮＲＢ Ｃ Ｄ 甲基化测序图 Ａ Ｃ 基因发生甲基化现象 Ｂ Ｄ 基因未发生甲基化现象

1126 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS13.0 统 计 软 件 分 析, 甲 基 化 率 与 标 本 的 病 理 级 别 患 者 的 性 别 年 龄 的 相 关 性 分 析 采 用 χ 2 检 验, 两 率 的 比 较 采 用 χ 2 检 验 2 结 果 2.1 ppenk EDNRB 和 CLDN 7 基 因 甲 基 化 情 况 本 组 46 例 脑 胶 质 瘤 标 本, 经 初 步 检 测 有 44 例 DNA 质 量 合 格, 经 npcr 扩 增 后 检 测 3 种 基 因 对 应 的 扩 增 产 物, 扩 增 成 功 的 例 数 分 别 为 43 例 40 例 5 例 对 扩 增 产 物 进 行 甲 基 化 测 序, 检 测 出 ppenk 基 因 甲 基 化 率 为 44.2%(19/43),EDNRB 基 因 甲 基 化 率 为 22 5%(9/40),CLDN 7 基 因 甲 基 化 率 为 0% (0/5) 10 例 正 常 脑 组 织 作 为 对 照 组, 均 未 发 现 基 因 甲 基 化 现 象 2.2 基 因 甲 基 化 与 临 床 资 料 的 相 关 性 脑 胶 质 瘤 组 织 中 ppenk EDNRB 基 因 甲 基 化 率 与 研 究 对 象 的 年 龄 性 别 病 理 分 型 病 理 级 别 之 间 相 关 性 的 统 计 学 分 析 见 表 2 其 中 在 低 级 别 (Ⅰ ~Ⅱ 级 ) 脑 胶 质 瘤 和 高 级 别 (Ⅲ ~Ⅳ 级 ) 脑 胶 质 瘤 中 ppenk 基 因 CpG 岛 的 甲 基 化 率 分 别 为 33 3% 和 69 2%, 两 者 之 间 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) CLDN 7 基 因 对 应 npcr 扩 增 产 物 仅 为 5 例, 所 以 其 与 临 床 资 料 之 间 的 关 系 未 进 行 统 计 学 分 析 表 2 ppenk EDNRB 基 因 启 动 子 甲 基 化 与 临 床 病 理 特 征 关 系 ppenk EDNRB 项 目 甲 基 甲 基 例 数 P 值 χ 2 值 例 数 P 值 χ 2 值 化 数 化 数 性 别 0.708 0.140 0.248 0.175 男 19 9 18 3 女 24 10 22 6 年 龄 ( 岁 ) 0.462 0.164 0.905 0.014 <40 15 6 14 3 40 28 13 26 6 肿 瘤 类 型 0.648 0.846 星 性 型 细 胞 瘤 23 10 21 5 少 枝 胶 质 细 胞 瘤 5 2 5 1 室 管 膜 瘤 3 1 2 0 胶 质 母 细 胞 瘤 12 6 12 3 病 理 分 级 0.029 4.739 0.952 0.118 低 级 别 30 10 27 6 高 级 别 13 9 13 3 3 讨 论 肿 瘤 的 发 生 发 展 常 涉 及 到 多 基 因 的 异 常, 导 致 基 因 异 常 的 原 因 有 很 多 如 基 因 突 变 启 动 子 甲 基 化 等 基 因 组 DNA 甲 基 化 修 饰 与 肿 瘤 的 发 生 侵 袭 转 移 耐 药 等 有 着 密 切 关 系, 其 机 制 可 能 与 DNA 修 复 基 因 抑 癌 基 因 细 胞 周 期 调 控 基 因 肿 瘤 侵 袭 基 因 等 甲 基 化 修 饰 致 其 异 常 表 达 有 关 近 年 来 恶 性 肿 [6-7] 瘤 研 究 显 示 hmlh1 hmsh2 MGMT APC 和 FHIT 等 基 因 存 在 甲 基 化 现 象 随 着 研 究 的 深 入, 一 [8] 些 学 者 认 为 基 因 甲 基 化 可 能 成 为 肿 瘤 预 后 预 测 标 记 物, 其 对 于 肿 瘤 的 分 子 诊 断 个 性 化 治 疗 有 着 重 要 的 意 义 同 样, 脑 胶 质 瘤 中 寻 找 基 因 甲 基 化 证 据, 为 研 究 脑 胶 质 瘤 的 发 病 机 制 诊 断 治 疗 提 供 新 的 方 向 ppenk 基 因 位 于 8q23 q24, 是 控 制 神 经 肽 分 泌 的 基 因, 其 编 码 的 甲 硫 脑 啡 肽, 与 阿 片 生 长 因 子 受 体 相 结 合 发 挥 作 用, 是 一 种 肿 瘤 抑 制 剂 Yangetal [9] 研 究 发 现 胰 腺 癌 组 织 中 ppenk 基 因 甲 基 化 率 为 90.3%, 正 常 胰 腺 中 却 未 发 现, 而 在 胰 腺 癌 细 胞 株 中 均 发 现 该 现 象 本 实 验 同 样 显 示 标 本 中 ppenk 基 因 存 在 高 甲 基 化 现 象,ppENK 基 因 的 甲 基 化 率 在 脑 胶 质 瘤 高 级 别 组 (Ⅲ ~Ⅳ 级 ) 与 低 级 别 组 (Ⅰ ~Ⅱ [10] 级 ) 存 在 显 著 差 异 研 究 表 明 胆 汁 中 ppenk 等 6 种 特 定 基 因 甲 基 化 可 能 作 为 生 物 标 志 物 用 于 鉴 别 诊 断 恶 性 和 良 性 胆 道 狭 窄 由 此 推 断 该 基 因 是 脑 胶 质 瘤 病 理 分 级 的 潜 在 生 物 标 志 物, 有 助 于 判 断 肿 瘤 预 后, 该 基 因 也 可 能 成 为 恶 性 程 度 高 的 胶 质 瘤 治 疗 靶 点 EDNRB 基 因 位 于 13q22.3, 其 编 码 的 ETBre ceotor 是 一 种 G 蛋 白 偶 联 跨 膜 蛋 白 EDNRB 基 因 甲 基 化 在 恶 性 肿 瘤 中 广 泛 存 在,Chenetal [11] 研 究 发 现 大 肠 癌 中 EDNRB 基 因 甲 基 化 现 象 较 正 常 组 织 更 为 频 繁 本 实 验 也 显 示 肿 瘤 中 存 在 EDNRB 基 因 [12] 甲 基 化 现 象 研 究 表 明 食 管 鳞 状 细 胞 癌 细 胞 株 在 去 甲 基 化 药 物 5 氮 杂 2 脱 氧 胞 苷 作 用 下 EDNRB 基 因 又 可 重 新 表 达, 正 常 细 胞 株 中 则 不 存 在 该 现 象, 从 另 一 面 显 示 肿 瘤 与 EDNRB 基 因 甲 基 化 是 有 关 系 的 同 时, 本 实 验 分 析 EDNRB 基 因 甲 基 化 与 相 关 临 床 资 料 并 无 显 著 相 关 性, 该 现 象 可 能 普 遍 存 在 胶 质 瘤 中, 由 此 推 断 该 基 因 甲 基 化 在 胶 质 瘤 的 发 生 发 展 中 是 一 个 重 要 事 件 CLDN 7 基 因 由 4 个 跨 膜 蛋 白 亚 型 组 成 及 2 个 [13] 细 胞 外 环 组 成 的 紧 密 连 接 蛋 白 有 研 究 表 明 大 肠 癌 组 织 中 CLDN 7 基 因 存 在 高 甲 基 化 状 态, 使 用 去 甲 基 化 药 物 处 理 后,CLDN 7 基 因 又 得 以 重 新 表 达, 并 通 过 实 验 数 据 分 析 得 出 大 肠 癌 的 病 理 等 级 与 CLDN 7 基 因 甲 基 化 存 在 相 关 性 本 实 验 并 未 显 示 该 基 因 甲 基 化 现 象 ( 实 验 仅 扩 增 出 5 例 目 的 基 因 ),

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1127 考 虑 实 验 室 引 物 设 计 或 是 酶 引 起 的 假 阴 性 现 象 的 可 能 课 题 组 之 后 的 实 验 可 进 一 步 验 证 综 上 所 述,ppENK 基 因 甲 基 化 水 平 与 胶 质 瘤 的 病 理 分 级 呈 正 相 关, 其 在 诊 断 胶 质 瘤 的 病 理 分 级 中 可 能 有 重 要 的 意 义, 可 能 成 为 恶 性 程 度 高 的 胶 质 瘤 治 疗 靶 点 ;EDNRB 基 因 甲 基 化 与 胶 质 瘤 发 生 发 展 密 切 相 关, 其 可 能 普 遍 存 在 于 胶 质 瘤 中, 可 能 是 脑 胶 质 瘤 发 生 发 展 过 程 中 的 一 个 重 要 事 件 本 实 验 显 示 胶 质 瘤 发 生 发 展 与 多 基 因 甲 基 化 相 关, 而 非 某 一 基 因 总 之, 随 着 更 多 的 基 因 甲 基 化 的 发 现, 寻 找 到 胶 质 瘤 的 DNA 甲 基 化 谱 成 为 可 能, 其 建 立 将 在 胶 质 瘤 的 分 类 诊 断 复 发 监 测 疗 效 评 价 和 预 后 判 断 等 方 面 有 着 深 远 的 意 义 参 考 文 献 [1] UekiT,ToyotaM,SkinnerH,etal.Identificationandcharacter izationofdiferentialymethylatedcpgislandsinpancreaticcarci noma[j].cancerres,2001,61(23):8540-6. [2] KaurJ,DemokanS,TripathiSC,etal.Promoterhypermethyla tioninindianprimaryoralsquamouscelcarcinoma[j].intj Cancer,2010,127(10):2367-73. [3] YatesDR,RehmanI,AbbodMF,etal.Promoterhypermethyla tionidentifiesprogresionriskinbladdercancer[j].clincancer Res,2007,13(7):2046-53. [4] KojimaT,SawadaN.Regulationoftightjunctionsinhumannor malpancreaticductepithelialcelsandcancercels[j].annny AcadSci,2012,1257(10):85-92. [5] LeeKH,LeeJS,NamJH,etal.Promotermethylationstatusof hmlh1,hmsh2,andmgmtgenesincolorectalcancerasociat edwithadenoma carcinomasequence[j].langenbecksarch Surg,2011,396(7):1017-26. [6] BeradaN,AmzaziS,AmezianeElHasaniR,etal.Epigenetic alterationsofadenomatouspolyposiscoli(apc),retinoicacidre ceptorbeta(rarβ)andsurvivingenesintumortisuesandvoid edurineofbladdercancerpatients[j].celmolbiol(noisy le grand),2012,suppl58:ol1744-51. [7] PaluszczakJ,MisiakP,WierzbickaM,etal.Frequenthyperm ethylationofdapk,rarbeta,mgmt,rassf1aandfhitin laryngealsquamouscelcarcinomasandadjacentnormalmucosa [J].OralOncol,2011,47(2):104-7. [8] NalejskaE,M aczyńskae,lewandowskam A.Prognosticand predictivebiomarkers:toolsinpersonalizedoncology[j].moldi agnther,2014,18(3):273-84. [9] YangL,YangH,LiJ,etal.ppENKgenemethylationstatusin thedevelopmentofpancreaticcarcinoma[j].gastroenterolres Pract,2013,2013:130927. [10] ZhangY,YangB,DuZ,etal.Identificationandvalidationof specificmethylationprofileinbilefordiferentialdiagnosisofma lignantbiliarystricture[j].clinbiochem,2010,43(16-17): 1340-4. [11] ChenC,WangL,LiaoQ,etal.HypermethylationofEDNRB promotercontributestotheriskofcolorectalcancer[j].diagn Pathol,2013,8(1):199. [12] ZhaoBJ,SunDG,ZhangM,etal.Identificationofaberant promotermethylationofednrbgeneinesophagealsquamouscel carcinoma[j].disesophagus,2009,22(1):55-61. [13]NakayamaF,SembaS,UsamiY,etal.Hypermethylation modu lateddownregulationofclaudin 7expresionpromotestheprogres sionofcolorectalcarcinoma[j].pathobiology,2008,75(3): 177-85. MethylationofppENK,EDNRBandCLDN 7geneinglioma XuPeikun 1,DengPengcheng 1,ZhuLixin 2,etal ( 1 DeptofNeurosurgery, 2 DeptofCentralLab,TheFirstAfiliatedHospitalof AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022) Abstract Objective TostudythemethylationofppENK,EDNRBandCLDN 7inglioma.Methods npcrand BSPwereadoptedtoinvestigatethepromoterfrequencyofthesegenesin46casesofgliomaand10normalbrain tisue.therelationshipbetweenfrequencyofmethylationofthesegenesandclinicaldiseasematerialwasanalyzed. Results Normalbraintisuehadnogenesmethylation.Inpatientionswithglioma,thefrequencyofmethylationin ppenk,ednrbandcldn 7was44.2%(19/43),22.5%(9/40)and0%(0/5).Therate(33.3%)ofppENK promotermethylationingradesⅠ ~Ⅱ gliomaswassignificantlylowerthanthat(69.2%)ingradesⅢ ~Ⅳ glio mas(p<0 05).Conclusion ppenk andednrbpromoter(cpg island)hypermethylationexistsinglioma, whichmaycorelatewiththeoccurenceofglioma. Keywords CpG;Methylation;glioma

1128 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 胆 碱 能 抗 炎 通 路 对 胃 癌 癌 前 病 变 炎 症 反 应 的 调 节 作 用 喻 大 军 1,2, 顾 康 生 1 2, 钱 军 摘 要 目 的 探 讨 胆 碱 能 抗 炎 通 路 (CAP) 对 胃 癌 癌 前 病 变 (PLGC) 炎 症 反 应 的 调 节 作 用 方 法 将 56 只 Wistar 大 鼠 随 机 分 为 正 常 对 照 组 10 只, 模 型 组 46 只 模 型 组 采 用 N 甲 基 N 硝 基 N 亚 硝 基 胍 (MNNG) 为 主 的 复 合 造 模 法 制 备 PL GC 大 鼠 模 型 将 造 模 成 功 的 大 鼠 随 机 抽 取 40 只 分 为 模 型 组 PNU282987 低 剂 量 组 (1 6mg/kg) PNU282987 中 剂 量 组 (2.0mg/kg) PNU282987 高 剂 量 组 (2 4mg/kg), 每 组 10 只 正 常 对 照 组 与 模 型 组 正 常 饲 养,PNU282987 组 每 日 按 以 上 剂 量 腹 腔 注 射 1 次, 给 药 3 周 检 测 各 组 大 鼠 血 清 和 病 变 组 织 中 肿 瘤 坏 死 因 子 α(tnf α) 白 细 胞 介 素 6(IL 6) 促 炎 因 子 的 表 达 结 果 PLGC 造 模 成 功 的 各 组 大 鼠 血 清 及 病 变 组 织 中 TNF α IL 6 的 含 量 明 显 高 于 正 常 对 照 组 (P<0 05), PNU282987 高 剂 量 组 (2.4mg/kg) 大 鼠 血 清 及 病 变 组 织 中 TNF α IL 6 的 含 量 低 于 中 低 剂 量 组 及 模 型 组, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P <0 05) 结 论 α7 烟 碱 乙 酰 胆 碱 受 体 (α7nachrs) 激 动 剂 PNU282987 可 能 通 过 CAP 下 调 TNF α 和 IL 6 等 促 炎 因 子 的 水 平 关 键 词 中 图 分 类 号 胆 碱 能 抗 炎 通 路 ; 胃 癌 ; 炎 症 反 应 R735.2;R364.5;R363.27 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1128-04 胃 癌 癌 前 病 变 (precancerouslesionsofgastric cancer,plgc) 被 认 为 是 胃 癌 发 病 前 一 定 存 在 的 一 个 缓 慢 渐 进 的 病 理 过 程, 有 向 胃 癌 转 变 的 趋 势 胃 癌 的 发 生 发 展 及 治 疗 还 存 在 不 少 有 待 解 决 的 问 题, 而 从 肿 瘤 预 防 角 度, 关 注 PLGC 的 转 化 与 逆 转 显 得 尤 为 重 要 PLGC 可 激 发 机 体 自 身 的 免 疫 炎 症 反 应, 激 活 巨 噬 细 胞 参 与 免 疫 炎 症 反 应, 释 放 各 种 促 炎 细 胞 因 子 如 肿 瘤 坏 死 因 子 α(tumornecrosisfactor α, TNF α) 白 细 胞 介 素 6(interleukin 6,IL 6) 等, 造 成 自 身 炎 症 反 应 的 加 重, 促 进 病 理 状 态 的 恶 化 多 种 促 炎 细 胞 因 子 可 通 过 调 控 不 同 系 统 和 局 部 炎 症 反 应, 最 终 导 致 胃 癌 的 发 生 发 展 [1-2] PLGC 被 认 为 是 一 个 复 杂 的 多 种 致 病 因 素 相 互 结 合 共 同 致 病 的 过 2014-04-10 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :81173386) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 肿 瘤 内 科, 合 肥 230022 2 蚌 埠 医 学 院 第 一 附 属 医 院 肿 瘤 外 科, 蚌 埠 233000 作 者 简 介 : 喻 大 军, 男, 主 治 医 师 ; 顾 康 生, 男, 教 授, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:gks63@tom.com 程 虽 然 学 术 界 认 为 幽 门 螺 旋 杆 菌 是 PLGC 进 程 中 [3] 最 为 重 要 的 一 个 因 素, 但 研 究 显 示 抗 幽 门 螺 旋 杆 菌 也 未 必 可 以 逆 转 PLGC 的 病 理 进 程, 其 主 要 原 因 是 幽 门 螺 旋 杆 菌 感 染 还 可 以 激 发 体 内 的 免 疫 反 应, 造 成 各 种 促 炎 和 抗 炎 因 子 的 释 放, 即 使 根 除 了 幽 门 螺 旋 杆 菌 感 染, 因 为 免 疫 反 应 被 激 活, 各 种 炎 症 恶 性 循 环 的 刺 激 依 然 会 造 成 机 体 的 损 伤, 所 以 抑 制 免 疫 炎 症 反 应 的 恶 化 被 认 为 是 PLGC 治 疗 过 程 中 亦 较 为 重 要 的 一 个 部 分 PLGC 时 期 的 治 疗 存 在 着 逆 转 胃 癌 发 生 的 可 能 性 胆 碱 能 抗 炎 通 路 (cholinergican ti inflammatorypathway,cap) 是 近 10 年 来 研 究 较 为 热 点 的 神 经 抗 炎 通 路 [4], 被 认 为 是 体 内 最 有 效, 且 完 全 没 有 任 何 毒 副 作 用 的 神 经 抗 炎 通 路, 更 重 要 的 是 CAP 主 要 依 赖 迷 走 神 经 的 胆 碱 能 神 经 纤 维 支 配 各 个 效 应 器 官, 而 在 胃 部 存 在 体 内 最 多 的 迷 走 神 经 分 布 [5] 因 此 该 研 究 通 过 N 甲 基 N 硝 基 N 亚 硝 基 胍 (MNNG) 为 主 的 复 合 造 模 法 制 备 PLGC 大 鼠 模 型, 给 予 α7 烟 碱 乙 酰 胆 碱 受 体 (α7nicotinicacetyl cholinereceptors,α7nachr) 激 动 剂 PNU282987 干 预, 探 讨 CAP 对 PLGC 炎 症 反 应 的 调 节 作 用 1 材 料 与 方 法 1.1 主 要 材 料 MNNG PNU282987 购 自 美 国 Sig ma 公 司 ;TNF α 及 IL 6ELISA 试 剂 盒 购 自 上 海 美 轩 生 物 科 技 有 限 公 司 1.2 实 验 动 物 及 分 组 8~10 周 龄 雄 性 Wistar 大 鼠 56 只 ( 蚌 埠 医 学 院 实 验 动 物 中 心 ), 清 洁 级, 体 重 175~200g, 随 机 分 为 正 常 对 照 组 10 只, 模 型 组 46 只, 模 型 组 造 模 成 功 后 大 鼠 随 机 抽 取 40 只 分 为 模 型 组 PNU282987 低 剂 量 组 (1 6mg/kg) PNU282987 中 剂 量 组 (2.0mg/kg) PNU282987 高 剂 量 组 (2.4 mg/kg), 每 组 10 只 分 笼 饲 养 1.3 大 鼠 PLGC 动 物 模 型 的 建 立 采 用 MNNG 饮 用 液 自 由 饮 用 法 配 合 模 拟 幽 门 螺 杆 菌 感 染 状 态 下 高 氨 对 胃 黏 膜 的 毒 性 损 害 法 造 模 [6] 用 去 离 子 水 将 MNNG 配 成 1g/L 的 储 备 液 ( 每 周 配 制 1 次 ), 避 光 冷 藏 保 存 大 鼠 正 常 饮 食 适 应 喂 养 1 周 后, 临 用 时 将 其 配 成 200μg/ml 的 饮 用 液, 装 入 外 贴 黑 色 避 光

安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １１２９ 纸的 ５ ｍｌ饮水瓶中 整个配制过程避光操作 饮 大 异形 增生活跃 腺体拥挤 形态稍不规则 可见 水瓶内给大鼠自由引用 每 ２４ｈ更换 １次药液 用 复层及背靠背现象 间质有少量淋巴细胞浸润 大 ７ 乙醇 ３ｍｌ 每 ３ｄ１次 以及 １ 氨水 １ｍｌ 鼠 发 生 ＰＬＧＣ 炎 症 反 应 模 型 构 建 成 功 每周 １次 加入饮水液中 造模期间不再给予其 ＰＮＵ２８ ２ ９ ８７低剂量组黏膜完整度与模型组类似 脱 他饮水 连续 １１周 正常对照组常规喂养 于第 落变性 坏死的上皮细胞 伴有中 重度炎症表现 ８周末从造模组随机抽出 ６只大鼠 正常对照组抽 中 高剂量组则表现为黏膜完整度较模型组高 表面 出 ６只大鼠 采用戊巴比妥钠过量麻醉处死 取出 可见少许脱落的变性 坏死的上皮细胞 肠化生程度 胃黏膜组织 肉眼观察了解胃黏膜变化情况后 用 较轻 伴有轻 中度炎症表现 见图 １ ４ 多聚甲醛固定 于胃窦部剪取组织一块 石蜡包 埋 做常规病理切片 与正常对照组比较 模型组大 鼠胃黏膜呈现散落状 胃壁变薄 弹性变差等 色泽 苍白 黏液分泌减少 色泽晦暗等特点 光镜下显示 上皮细胞排列紊乱 异型增生 变性坏死的上皮细胞 随处可见 可见核分裂 肠化生程度每只程度接近 据此可以认为本次实验模型建立成功 １ ４ 实验方法 造模开始第 ９周开始给药 将造模 成功的大鼠随机分为模型组 ＰＮＵ２ ８２ ９８７低剂量组 １ ６ｍｇ ｋｇ ＰＮＵ２ ８２９８ ７中剂量组 ２ ｍｇ ｋｇ ＰＮＵ２８２９８７高剂量组 ２ ４ｍｇ ｋｇ 每组 １ 只 正 常对照组与模型组大鼠腹腔注射等体积生理盐水 低 剂 量 组 ＭＮＮＧ 造 模 后 腹 腔 注 射 １ ６ ｍｇ ｋｇ ＰＮＵ２８２９８７ 中剂量组 ＭＮＮＧ造模后腹腔注射 ２ 图 １ 各组大鼠胃黏膜病理形 ｍｇ ｋ ｇｐｎｕ２８２ ９８７ 高剂量组 ＭＮＮＧ造模后腹腔注 态 ＨＥ ４ 射２ ４ｍｇ ｋ ｇｐｎｕ２ ８２９８ ７ 每日腹腔注射 １次 给药 Ａ 正 常 对 照 组 Ｂ 模 型 ３周 组 Ｃ 中 剂 量 组 Ｄ 低 剂 量 １ ５ 标本收集及检测指标 于第 １１周末 禁食禁 组 Ｅ 高剂量组 水１ ２ｈ后脱颈椎处死大鼠取血检测各项指标 取 大鼠心脏血 离心分离血清 立即开腹 取下大鼠 胃部组织 经生理盐水冲洗漂净 然后取小块胃组 织以生理盐水 ｐ Ｈ７ ４ 制备成匀浆 ４ ３ ｒ 正常对照组 模型组以及 ＰＮＵ２８ ２９８ ７低 中 高 ｍ ｎ １５ｍ ｎ 离心 取匀浆上清液分装 ８ 保 ３ ２ １ １只 随着喂 剂量组大鼠死亡数目分别为 存 用 ＥＬＩ ＳＡ法检测大鼠血清及胃部组织中 ＴＮＦ α 养时间的延长 正常对照组大鼠皮毛光泽 精神佳 Ｉ Ｌ ６水平 于胃窦部剪取一块组织 使用 ４ 多聚 灵活喜动 饮食正常 模型组大鼠的皮毛疏松不齐 甲醛固定 石蜡包埋用于 ＨＥ染色并作病理切片 精神萎 靡 不 振 食 量 下 降 反 应 迟 钝 体 重 减 轻 １ ６ 统计学处理 采用 Ｓ ＰＳＳ１７ 统计软件进行 珋 分析 数据以 ｘ±ｓ表示 先对所有数据做正态分布 ＰＮＵ２８ ２ ９ ８７低 中 高剂量组大鼠均有不同程度皮 毛欠光泽 反应迟钝 精神欠佳 体重减轻等 而与模 检验 如果属于正态分布则组间比较采用单因素方 型组比较较正常 差分析 方差齐时用 检验 方差不齐采用 ＬＳ Ｄ法 ２ ２ α７ｎａｃｈｒ激动剂对 ＰＬＧＣ大鼠血清 ＴＮＦ α 非正态分布采用中位数表示 Ｉ Ｌ ６含量的影响 模型组以及 ＰＮＵ２８２９ ８７低 中 ２ 结果 高剂量组血清 ＴＮＦ Ｌ ６含量高于正常对照组 α和 Ｉ 差异有统计学意义 Ｐ ５ Ｐ １ 与模型组 ２ １ 大鼠一般情况 大鼠 ＰＬＧＣ动物模型建立后 相比 ＰＮＵ２８２ ９８７中 高剂量组血清 ＴＮＦ Ｌ ６ α和 Ｉ 经组织学检测 模型组大鼠胃部组织细胞核深染 增 含量降低 尤以高剂量组显著 差异有统计学意义

1130 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) (P<0 05,P<0 01); 低 剂 量 组 与 模 型 组 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 见 表 1 表 1 大 鼠 血 清 TNF α IL 6 含 量 比 较 ( 珋 x±s) 组 别 n TNF α(ng/l) IL 6(ng/L) 正 常 对 照 10 60.9±15.9 22.2±3.7 模 型 7 183.3±28.8 ## 64.8±3.9 ## PNU282987 低 剂 量 8 173.6±19.4 ## 59.6±3.8 # PNU282987 中 剂 量 9 131.7±23.5 ## 47.5±3.5 # PNU282987 高 剂 量 9 93.8±26.9 # 30.9±3.2 # 与 模 型 组 比 较 : P<0.05, P<0 01; 与 正 常 对 照 组 比 较 : # P <0.05, ## P<0.01 2.3 α7nachr 激 动 剂 对 PLGC 大 鼠 胃 组 织 TNF α IL 6 含 量 的 影 响 模 型 组 以 及 PNU282987 低 中 高 剂 量 组 胃 组 织 TNF α 和 IL 6 含 量 高 于 正 常 对 照 组, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05,P<0 01); 与 模 型 组 相 比,PNU282987 中 高 剂 量 组 TNF α 和 IL 6 含 量 降 低, 尤 以 高 剂 量 组 显 著, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05,P<0 01); 低 剂 量 组 与 模 型 组 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 见 表 2 表 2 大 鼠 胃 组 织 TNF α IL 6 含 量 比 较 ( 珋 x±s) 组 别 n TNF α(ng/g) IL 6(ng/g) 正 常 对 照 10 80.7±10.3 127.7±14.1 模 型 7 283.8±33.6 ## 515.1±77.1 ## PNU282987 低 剂 量 8 200.0±20.5 ## 305.6±16.5 ## PNU282987 中 剂 量 9 186.3±17.5 ## 262.1±30.2 ## PNU282987 高 剂 量 9 135.6±11.6 # 166.9±44.3 # 与 模 型 组 比 较 : P<0.05, P<0.01; 与 正 常 对 照 组 比 较 : # P <0.05, ## P<0.01 3 讨 论 PLGC 包 括 慢 性 萎 缩 性 胃 炎 的 中 重 度 肠 上 皮 化 生 以 及 上 皮 内 瘤 变 浅 表 性 胃 炎 在 胃 黏 膜 长 期 慢 性 炎 症 浸 润 的 基 础 上, 经 过 伴 有 肠 化 生 的 多 灶 性 胃 炎 后 由 于 干 细 胞 不 稳 定 DNA 复 制 错 误 或 超 甲 基 化 导 致 基 因 突 变 积 累 或 杂 合 型 丢 失, 可 发 生 上 皮 内 瘤 变, 胃 癌 发 生 [7] 炎 性 微 环 境 在 肿 瘤 的 发 生 发 展 中 发 挥 着 重 要 的 促 进 作 用 CAP 是 一 条 中 枢 神 经 系 统 与 免 疫 系 统 之 间 的 具 有 拮 抗 炎 症 反 应 作 用 的 通 路, 其 作 用 在 内 毒 素 血 症 失 血 性 休 克 心 肌 缺 血 再 灌 注 [8] 实 验 性 关 节 炎 [9] [10] 溃 疡 性 结 肠 炎 和 胰 腺 炎 等 多 种 动 物 模 型 中 均 已 得 到 证 实, 但 其 是 否 参 与 PLGC 的 调 控, 目 前 国 内 外 尚 未 见 文 献 报 道 使 用 胆 碱 能 受 体 激 动 剂 可 活 化 CAP, 产 生 抗 炎 效 应,α7nAChR 激 动 剂 PNU282987 是 一 种 强 力 拟 胆 碱 药, 与 巨 噬 细 胞 表 面 的 烟 碱 受 体 α7nachr 结 合, 阻 止 炎 症 细 胞 因 子 的 释 放 [9,11] TNF α 是 由 巨 噬 细 胞 / 单 核 细 胞 活 化 产 生 的 一 种 细 胞 因 子, 在 炎 症 反 应 细 胞 免 疫 肿 瘤 免 疫 等 多 种 生 理 和 病 理 过 程 中 发 挥 关 键 作 用 TNF α 作 为 一 种 重 要 的 炎 性 细 胞 因 子, 其 慢 性 刺 激 也 可 促 进 肿 瘤 的 发 生 [12] IL 6 是 一 个 生 物 学 效 应 极 其 复 杂 的 白 介 素 类 细 胞 因 子, 其 可 以 促 进 T 细 胞 表 面 IL 2 受 体 的 表 达, 增 强 IL 1 和 TNF α 对 Th1 细 胞 的 致 有 丝 分 裂 作 用 ; 在 外 伤 感 染 的 时 候, 引 起 急 性 炎 症 反 应, 诱 导 急 性 期 反 应 中 反 应 蛋 白 的 合 成, 以 淀 粉 状 蛋 白 a 和 C 反 应 蛋 白 增 加 为 主 ; 促 进 B 细 胞 增 殖, 分 化 并 产 生 抗 体 ;IL 6 还 能 有 效 地 促 进 TNF α 和 IL 1 诱 导 恶 病 质, 促 进 糖 皮 质 激 素 合 成 [13] ; 刺 激 破 坏 骨 细 胞 活 性 和 角 质 细 胞 生 长, 其 主 要 作 用 并 非 直 接 作 用 形 成 炎 症, 而 是 加 强 各 种 促 炎 细 胞 因 子 的 致 炎 效 果 [14] 两 者 介 导 炎 症 反 应 和 肿 瘤 免 疫 等 方 面 发 挥 关 键 作 用 [15], 其 在 血 浆 的 含 量 也 是 测 量 细 胞 免 疫 和 体 液 免 疫 功 能 的 重 要 指 标 本 研 究 通 过 构 建 MNNG 为 主 的 复 合 造 模 法 制 备 PL GC 大 鼠 模 型, 给 予 α7nachr 激 动 剂 PNU282987 干 预, 结 果 PLGC 大 鼠 血 清 及 病 变 组 织 中 TNF α IL 6 的 含 量 降 低, 尤 以 高 剂 量 组 (2.4mg/kg) 显 著, 表 明 其 可 能 通 过 CAP 下 调 TNF α 和 IL 6 等 促 炎 因 子 的 水 平 综 上 所 述, 采 用 MNNG 可 以 有 效 的 造 成 大 鼠 PLGC 的 病 理 状 态, 而 且 还 激 活 了 体 内 免 疫 炎 症 反 应, 造 成 了 大 鼠 自 身 的 免 疫 炎 症 表 现 基 于 CAP 的 假 说, 使 用 药 物 干 预 的 方 式, 发 现 激 活 CAP 可 以 有 效 的 对 抗 炎 症 反 应, 可 通 过 下 调 TNF α 和 IL 6 等 促 炎 因 子 的 水 平, 以 2.4mg/kg 剂 量 疗 效 最 佳, 使 癌 变 的 胃 黏 膜 上 皮 得 到 一 定 的 修 复, 表 明 了 炎 症 反 应 对 胃 黏 膜 上 皮 也 存 在 一 定 的 影 响, 控 制 炎 症 对 其 存 在 疗 效 本 研 究 提 出 了 一 种 逆 转 PLGC 炎 症 发 展 的 方 法, 对 胃 癌 的 早 期 预 防, 早 期 干 预 有 一 定 的 应 用 价 值 但 CAP 对 炎 症 的 调 节 方 式 究 竟 是 否 是 通 过 α7nachr 或 毒 蕈 碱 受 体 来 实 现 的, 以 及 是 通 过 何 种 方 式 或 途 径 实 现 的 需 要 进 一 步 研 究 证 实 相 信 随 着 对 迷 走 神 经 及 其 递 质 Ach 抗 炎 作 用 的 深 入 研 究, 人 们 可 能 会 从 新 的 角 度 对 炎 症 反 应 有 一 个 新 的 认 识, 并 将 CAP 作 为 一 种 替 代 疗 法 或 潜 在 疗 法 用 于 治 疗

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1131 参 考 文 献 [1] SichererSH,SampsonHA.Foodalergy[J].AlergyClinImmu nol,2010,125(2):116-25. [2] Abraham SN,StJohnAL.Mastcel orchestratedimmunityto pathogens[j].natrevimmunol,2010,10(6):440-52. [3] ZorzetoV,MaddaloG,BasoD,etal.Immunotherapyforgastric premalignantlesionsandcancer[j].immunotherapy,2012,4(6): 587-99. [4] MacDonaldTT,DiSabatinoA.Theimmunologicbasisforgastro intestinalfoodalergy[j].curopingastroenterol,2009,25 (6):521-6. [5] TongW D,RidolfiTJ,KosinskiL,etal.Efectsofautonomic nervestimulationoncolorectalmotilityinrats[j].neurogastroen terolmotil,2010,22(6):688-93. [6] NguyenTL,DipaoloRJ.Anewmousemodelofinflammation andgastriccancer[j].oncoimmunology,2013,2(10):e25911. [7] PaulW E,ZhuJ.HowareT(H)2 typeimmuneresponsesinitia tedandamplified[j].natrevimmunol,2010,10(4):225-35. [8] XiongJ, YunaY J, XueF S, etal. Postconditioningwith α7nachragonistatenuatessystemicinflammatoryresponsetomy ocardialischemia reperfusioninjuryin rats[j].inflammation, 2012,35(4):1357-64. [9] WangH,YuM,OchaniM,etal.Nicotinicacetylcholinereceptor alpha7subunitisanesentialregulatorofinflammation[j].na ture,2003,421(6921):384-8. [10] LunneyPC,LeongR W.Review article:ulcerativecolitis, smokingandnicotinetherapy[j].alimentpharmacolther,2012, 36(11-12):997-1008. [11]StuckenholzV,BacherM,Balzer GeldsetzerM,etal.Theα7 nachragonistpnu 282987reducesinflammationandMPTP in ducednigraldopaminergiccellosinmice[j].jparkinsonsdis, 2013,3(2):161-72. [12]McleanM H,El OmarEM.Geneticsofinflammationinthegas trointestinaltractandhowitcancausecancer[j].recentresults CancerRes,2011,185:173-83. [13]SugimotoM,YamaokaY,FurutaT.Influenceofinterleukinpoly morphismsondevelopmentofgastriccancerandpepticulcer[j]. WorldJGastroenterol2010,16(10):1188-200. [14] HowletM,MenheniotTR,JuddLM,etal.Cytokinesignaling viagp130ingastriccancer[j].biochim BiophysActa,2009, 1793(11):1623-33. [15]SzlachcicA,Krzysiek MaczkaG,PajdoR,etal.Theimpactof asymmetricdimethylarginine(adama),theendogenousnitric oxide(no)synthaseinhibitor,tothepathogenesisofgastricmu cosaldamage[j].curpharmdes,2013,19(1):90-7. Regulationofcholinergicanti inflammatorypathwayof inflammationongastricprecancerouslesions YuDajun 1,2,GuKangsheng 1,QianJun 2 ( 1 DeptofMedicalOncology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022; 2 DeptofSurgicalOncology,TheFirstAfiliatedHospitalofBengbuMedicalColege,Bengbu 233000) Abstract Objective Toinvestigatetheregulationofcholinergicanti inflammatorypathwayongastricprecancer ouslesionsandinflammatoryreaction.methods 56Wistarratswererandomlydividedintonormalgroup(n=10) andmodelinggroup(n=46)whichwerepreparedintoplgcratsmodelbythen methyl N nitro N nitrosogua nidine(mnng)basedcompositemodeling.then40ratsselectedfromthesuccesfulymodelingratswererandom lydividedintomodelgroup,pnu282987lowdosegroup(1.6mg/kg),pnu282987dosegroup(2.0mg/kg), PNU282987highdosesgroup(2.4mg/kg),(n=10).Thecontrolgroupandmodelgroupwerefednormaly. PNU282987groupsweregivenabovedailydosesofPNU282987byintraperitonealinjectionforthreeweeks.Then theexpresionsoftnf α,il 6inserumandstomachtisueweredetected.Results ThecontentsofTNF α,il 6 inserumandstomachtisueofplgcgroupsweresignificantlyhigherthanthoseofcontrolgroup(p<0 05).The contentsoftnf α,il 6inserumandstomachtisueofPNU282987highdosegroup(2.4mg/kg)werelowerthan thelow dosegroup,dosegroupandmodelgroup(p<0 05).Thediferencewassignificant.Conclusion The α7nachragonistpnu282987candown regulatetheleveloftnf αandil 6throughthecholinergicanti inflam matorypathway. Keywords cholinergicanti inflammatorypathway;gastriccancer;inflammatoryreaction

1132 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 减 阻 牵 张 远 移 上 颌 尖 牙 的 三 维 有 限 元 分 析 梁 志 红 1, 薛 俊 杰 2,3 1, 王 洪 军 摘 要 目 的 模 拟 不 同 术 式 远 移 上 颌 尖 牙, 分 别 建 立 其 三 维 有 限 元 模 型, 分 析 尖 牙 和 牙 周 组 织 的 生 物 力 学 状 况 方 法 分 别 建 立 常 规 状 态 下 移 动 尖 牙 ( 模 型 1) 牙 周 膜 减 阻 牵 张 成 骨 术 移 动 尖 牙 ( 模 型 2) 牙 槽 骨 减 阻 牵 张 成 骨 术 移 动 尖 牙 ( 模 型 3) 的 三 维 有 限 元 模 型, 在 颊 腭 双 侧 力 的 加 载 后 观 察 牙 及 周 围 组 织 应 力 分 布 和 位 移 情 况 结 果 尖 牙 最 大 瞬 时 位 移 值 模 型 2> 模 型 3> 模 型 1, 最 大 等 效 应 力 值 模 型 2< 模 型 1< 模 型 3, 最 大 主 应 力 模 型 1< 模 型 2< 模 型 3, 最 大 剪 切 应 力 模 型 2< 模 型 1< 模 型 3 结 论 牙 周 膜 减 阻 牵 张 成 骨 和 牙 槽 骨 减 阻 牵 张 成 骨 可 有 效 减 小 牙 移 动 阻 力, 加 大 尖 牙 瞬 时 位 移, 且 去 除 尖 牙 远 中 骨 质 效 果 较 去 除 颊 侧 骨 皮 质 更 为 显 著 两 种 方 法 均 成 功 避 免 了 支 抗 丧 失, 但 尖 牙 存 在 远 中 倾 斜 趋 势, 在 临 床 工 作 中 应 加 以 控 制 关 键 词 牵 张 成 骨 ; 三 维 有 限 元 法 ; 错 颌 畸 形 ; 牙 齿 移 动 中 图 分 类 号 R783.5 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1132-05 错 颌 畸 形 对 广 大 患 者 的 身 心 健 康 存 在 巨 大 危 害, 然 而, 常 规 牙 移 动 速 度 平 均 仅 1mm/ 月, 使 得 错 颌 畸 形 治 疗 时 间 长 达 约 2 年 [1] 且 拉 尖 牙 向 远 中 移 动 的 过 程 中, 支 抗 磨 牙 受 反 作 用 力 前 移, 从 而 引 起 支 抗 丧 失 为 加 快 牙 移 动 速 度, 控 制 支 抗,Liouetal [2] 出 了 牙 周 膜 牵 张 成 骨 的 概 念 随 后 Kisnisciet al [3] 进 一 步 提 出 了 牙 槽 骨 牵 张 成 骨 的 技 术 两 种 方 法 因 大 大 加 快 正 畸 牙 移 动 速 度 引 起 了 人 们 的 广 泛 关 注 [4-10] 目 前 对 这 两 种 术 后 生 物 力 学 特 性 的 报 道 甚 少 为 深 入 了 解 减 阻 牵 张 成 骨 术 所 引 起 的 牙 及 牙 周 组 织 的 生 物 力 学 特 点, 该 文 将 螺 旋 CT 与 多 种 软 件 相 结 合, 对 不 同 术 式 远 移 尖 牙 进 行 三 维 有 限 元 模 拟, 借 助 Ansys11.0 精 确 求 解, 客 观 准 确 地 反 映 瞬 时 位 移 应 力 分 布 情 况, 为 临 床 工 作 提 供 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 选 择 建 模 对 象 成 年 男 性 志 愿 者 1 例, 安 氏 Ⅰ 类 磨 牙 关 系, 无 正 畸 治 疗 史, 无 牙 体 缺 损, 无 牙 周 疾 病, 无 颞 下 颌 关 节 疾 病 1.2 CT 扫 描 美 国 通 用 公 司 GElightspeedVCT 64 排 螺 旋 CT 机 平 行 于 眶 耳 平 面 进 行 扫 描, 从 眶 下 缘 至 颏 部 下 缘 连 续 扫 描, 扫 描 层 厚 为 0 5mm, 将 数 据 以 医 学 图 像 通 讯 标 准 (digitalimagingandcommu nicationsinmedicine,dicom) 格 式 输 出 共 选 取 196 个 横 截 面 二 维 图 像 为 原 始 建 模 数 据 [11] 1.3 三 维 几 何 模 型 建 立 利 用 交 互 式 医 学 图 像 控 制 系 统 (Mimics) 软 件 调 整 图 像 的 阈 值, 从 而 区 分 下 颌 骨 牙 齿 牙 周 膜 以 多 面 体 方 式 重 构 出 下 颌 骨 牙 齿 牙 周 膜 的 三 维 几 何 实 体, 以 STL 格 式 转 入 GeomagicStudio8.0 软 件 中, 对 模 型 进 行 精 炼 和 细 化, 获 得 3D 模 型 最 后 将 模 型 以 STP 格 式 文 件 导 入 UnigraphicsNX 软 件 中, 分 别 模 拟 不 同 状 态 下 尖 牙 移 动 的 过 程 [11] 1.4 手 术 模 拟 模 型 1: 模 拟 常 规 状 态 下 远 移 尖 牙, 拔 除 第 一 前 磨 牙, 见 图 1 模 型 2: 模 拟 牙 周 膜 减 阻 牵 张 成 骨 术 快 速 移 动 尖 牙,1 第 一 前 磨 牙 被 拔 除 国 ;2 将 垂 直 切 口 由 尖 牙 远 中 牙 槽 嵴 顶 向 根 尖 做 起 ;3 将 斜 形 切 口 由 第 1 前 磨 牙 近 根 尖 处 向 尖 牙 根 尖 方 向 做 起, 见 图 2 模 型 3: 模 拟 牙 槽 骨 减 阻 牵 张 成 骨 术 快 速 移 动 尖 牙,1 拔 除 第 1 前 磨 牙 ;2 去 除 第 1 前 磨 牙 颊 侧 骨 板 ;3 围 绕 尖 牙 垂 直 切 开 骨 皮 质, 见 图 3 2014-04-14 接 收 基 金 项 目 : 新 疆 维 吾 尔 自 治 区 自 然 科 学 基 金 青 年 基 金 ( 编 号 : 2011211B35) 作 者 单 位 : 1 上 海 市 虹 口 区 牙 病 防 治 所 口 腔 修 复 科, 上 海 200081 2 四 川 大 学 华 西 口 腔 医 学 院 正 畸 科, 成 都 610041 3 新 疆 医 科 大 学 附 属 第 一 医 院 口 腔 正 畸 科, 乌 鲁 木 齐 830000 作 简 介 者 : 梁 志 红, 女, 主 治 医 师 ; 薛 俊 杰, 男, 住 院 医 师, 责 任 作 者,E mail:kevinjmj2011@ gmail.com 图 1 常 规 状 态 下 移 动 尖 牙 示 意 图 采 用 Ansys 软 件 分 别 对 3 种 三 维 几 何 模 型 进 行

安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ 四方体单元格划分 见表 １ 并分别对各部分赋予相 应的材料属性 １ ２ １ ３ 见表 ２ １１３３ １ ６ 统计学处理 任意加载条件下的全部节点计 算通过 Ａｎｓ ｙ ｓ１ １ 有限元软件来完成 ２ 结果 ２ １ 不同工况下瞬时位移比较 ３种模型瞬时位 移尖牙总体瞬时位移都是向远中方向 尖牙的最大 瞬时位移位于尖牙牙冠颊侧和腭侧切 １ ３区 从牙 冠向牙根逐渐减小 各模型尖牙牙根中 １ ３ 第一 前磨牙和第一磨牙牙根均未有可见位移 不同之处 在于 尖牙在模型 １的最大瞬时位移为 １ ８９２５ 图 ２ 模拟牙周膜减阻牵张成骨手术去骨的平面示意图 １ ３ ｍｍ 模型 ２为 １ ９ ８１２ １ ３ ｍｍ 模 型 ３为 １ ９４ ２６ １ ３ ｍｍ 见图 ５ ７ 图 ３ 模拟牙槽骨减阻牵张成骨手术去骨示意图 表 １ 三维有限元模型网格划分信息 信息 模型 １ 模型 ２ 模型 ３ 节点数 ８２１ ３ ８ ８ ３５７７ ８ ３１４ ９ 单元数 ４２９ ６ ６ ４ ３４７７ ４ ３４２ ７ 图 ５ 模型 １常规状态下尖牙移动时瞬时位移分布情况 表 ２ 材料力学参数 材料 弹性模量 ｋｇ ｍｍ２ 泊松比 牙齿 １ ８６ １ ３ ３１ 皮质骨 ２ ３７ １ ３ ３ 松质骨 ２ ３ ２ ４５ 牙周膜 ８ １ ７ ３ １ １ ５ 力的加载 在模型 １沿近远中方向在尖牙牙 冠中心处以磨牙为支抗向远中施加 １ ５Ｎ的牵引力 颊腭侧各 ７ ５Ｎ 时长为 １ｓ 见图 ４ 模型 ２ ３ 力的加载与模型 １相同 图 ６ 模型 ２模拟牙周膜减阻牵张成骨手术后尖牙 移动时瞬时位移分布情况 图 ７ 模型 ３模拟牙槽骨减阻牵张成骨术后尖牙 图 ４ 力的加载示意图 移动时瞬时位移分布情况

1134 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 2.2 不 同 工 况 下 等 效 应 力 比 较 3 种 模 型 最 大 等 效 应 力 集 中 区 都 位 于 尖 牙 远 中 牙 槽 嵴 处 其 值 于 模 型 1 为 2 6929MPa, 模 型 2 为 1 7942MPa, 模 型 3 为 2 7183MPa 见 图 8~10 2.4 3 种 模 型 剪 切 应 力 比 较 应 力 相 切 于 截 面 的 分 量 为 剪 切 应 力 3 种 模 型 最 大 剪 切 应 力 均 位 于 尖 牙 远 中 牙 槽 嵴 处, 在 尖 牙 和 第 一 磨 牙 腭 侧 中 1/3 第 一 前 磨 牙 牙 根 尖 1/3 处 均 受 到 了 较 强 的 剪 切 应 力 模 型 1 最 大 剪 切 应 力 为 1.4733MPa, 模 型 2 最 大 剪 切 应 力 为 1 4743MPa, 模 型 3 最 大 剪 切 应 力 为 0 99462MPa 3 讨 论 图 8 模 型 1 常 规 状 态 下 尖 牙 移 动 时 等 效 应 力 分 布 情 况 图 9 模 型 2 模 拟 牙 周 膜 减 阻 牵 张 成 骨 手 术 后 尖 牙 移 动 时 等 效 应 力 分 布 情 况 图 10 模 型 3 模 拟 牙 槽 骨 减 阻 牵 张 成 骨 术 后 尖 牙 移 动 时 等 效 应 力 分 布 情 况 2.3 不 同 工 况 下 最 大 主 应 力 比 较 最 大 主 应 力 反 映 材 料 内 部 各 点 的 最 大 可 拉 伸 应 力 3 种 模 型 最 大 主 应 力 均 位 于 第 一 磨 牙 腭 面 中 1/3 处, 模 型 1 最 大 主 应 力 为 0 91927MPa, 模 型 2 为 0.93568MPa, 模 型 3 为 1.6052MPa 1998 年 Liouetal [2] 在 临 床 治 疗 中 首 次 将 骨 牵 张 和 骨 缝 牵 张 成 骨 技 术 的 原 理 应 用 到 了 牙 周 膜 中, 此 次 试 验 首 次 提 出 了 牙 周 膜 牵 张 成 骨 的 概 念 2002 年 Kisniscietal [3] 在 Liou 的 基 础 上 提 出 了 牙 槽 骨 牵 张 (dentoalveolardistraction,dad) 快 速 移 动 尖 牙 的 技 术 为 深 入 剖 析 3 种 方 法 后 远 移 尖 牙 的 生 物 力 学 特 点, 本 文 引 入 了 三 维 有 限 元 分 析 法 进 行 分 析 本 实 验 研 究 显 示 在 力 的 加 载 下,3 种 模 型 尖 牙 的 最 大 等 效 应 力 和 剪 切 应 力 集 中 区 都 在 尖 牙 远 中 牙 槽 嵴 处, 此 处 产 生 牙 槽 骨 的 吸 收 沉 积 改 建, 从 而 产 生 远 中 移 位 模 型 2 和 模 型 3 尖 牙 最 大 瞬 时 位 移 量 均 大 于 模 型 1, 提 示 在 相 同 的 大 小 相 同 作 用 时 间 的 力 作 用 下, 牙 周 膜 牵 张 与 DAD 方 法 都 可 加 大 尖 牙 移 动 量, 且 牙 周 膜 牵 张 效 果 更 佳, 这 与 国 内 外 [2,14-15] 的 研 究 相 一 致 需 要 移 动 的 牙 齿 被 施 加 矫 治 力 的 时 候, 一 个 大 小 相 等, 方 向 相 反 的 反 作 用 力 就 会 同 时 产 生, 而 承 受 这 些 反 作 用 力 的 结 构 就 称 为 支 抗 支 抗 磨 牙 在 远 移 尖 牙 过 程 中 容 易 前 移, 这 是 临 床 中 应 尽 可 能 避 免 的 情 况, 本 研 究 模 拟 减 阻 牵 张 技 术 过 程 中 的 牙 移 动 情 况, 发 现 应 用 该 技 术 可 有 效 避 免 远 移 尖 牙 过 程 中 的 磨 牙 前 移, 即 在 治 疗 过 程 中 可 以 有 效 保 护 支 抗, 这 与 临 床 研 究 动 物 模 型 一 致 [2,14] Algayeret al [16] 对 牙 周 膜 牵 张 成 骨 术 后 的 1 例 患 者 进 行 了 2 年 随 访, 结 果 显 示 美 学 效 果 和 咬 合 稳 定 性 俱 佳 马 [15] 文 盛 研 究 发 现, 对 动 物 模 型 进 行 牙 槽 隔 减 阻 牙 周 膜 牵 张 DAD 拔 牙 固 定 矫 治 三 者 间 差 异 无 统 计 学 意 义 而 3 种 模 型 最 大 瞬 时 位 移 量 从 尖 牙 牙 冠 到 根 尖 均 逐 渐 减 少, 提 示 尖 牙 受 力 初 牙 冠 远 中 移 动 量 更 大, 尖 牙 有 远 中 倾 斜 趋 势 ; 在 尖 牙 牙 颈 部 牙 槽 骨 存 在 应 力 集 中 区, 从 而 引 起 不 良 的 牙 槽 骨 吸 收 在 临 床 研

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1135 究 中 也 发 现 此 类 现 象 : 牙 周 膜 牵 张 成 骨 术 后,Liouet al [2] 从 临 床 和 影 像 分 析 认 为 部 分 尖 牙 出 现 轻 度 倾 斜 ;Sayinetal [4] 测 量 发 现 尖 牙 远 中 倾 斜 11.47 牙 槽 骨 牵 张 后,Sukuricaetal [6] 报 道 尖 牙 倾 斜 为 9 1 ; [15] 马 文 盛 报 道 为 12.2 为 了 防 止 尖 牙 因 为 支 点 的 存 在 而 倾 斜, 在 临 床 手 术 的 过 程 中 应 充 分 去 除 牙 槽 间 隔 的 阻 力 ; 同 时 为 了 防 止 或 减 少 尖 牙 的 倾 斜 移 动, 临 床 上 应 尽 量 使 连 接 杆 的 高 度 接 近 移 动 牙 的 阻 力 中 心 [15] 云 图 显 示 3 种 模 型 第 二 前 磨 牙 根 尖 1/3 尖 牙 [17] 根 中 1/3 均 出 现 应 力 集 中 区 吕 涛 等 在 观 察 研 究 犬 科 动 物 模 型 的 时 候 发 现 : 牙 周 膜 牵 张 牙 根 吸 收 程 度 比 传 统 牙 移 动 要 严 重 很 多, 不 过 在 停 止 加 力 后 [11] 牙 根 吸 收 会 进 行 牙 骨 质 修 复 赵 玺 等 在 研 究 减 阻 牵 张 成 骨 术 后 下 颌 牙 的 等 效 应 力 时 发 现, 尖 牙 向 [15] 远 中 移 动 的 同 时 有 舌 向 旋 转 的 趋 势 ; 马 文 盛 于 临 床 研 究 中 发 现 尖 牙 有 18.53 的 近 中 颊 向 旋 转 本 研 究 中 未 发 现 类 似 现 象 综 上 所 述, 牙 周 膜 减 阻 和 牙 槽 骨 减 阻 具 有 牙 移 动 速 度 快 和 支 抗 丧 失 少 等 优 点, 但 在 临 床 应 用 中 应 注 意 控 制 牙 倾 斜 移 动, 严 格 把 握 适 应 症, 结 合 患 者 实 际 情 况 选 择 最 佳 诊 疗 方 式 但 本 研 究 存 在 部 分 局 限 性 在 研 究 对 象 方 面, 骨 骼 牙 齿 和 牙 周 组 织 都 是 各 向 异 性 的 非 线 性 材 料, 本 研 究 将 各 种 材 料 均 视 为 各 向 同 性 的 均 质 弹 性 体 ; 在 模 拟 受 力 方 面, 三 维 有 限 元 加 载 于 尖 牙 处 是 瞬 时 作 用 力, 而 在 实 际 治 疗 中, 牙 齿 移 动 所 受 的 是 一 个 持 续 的 力 为 使 得 三 维 有 限 元 法 能 更 好 地 模 拟 生 物 状 况, 得 出 更 为 准 确 的 数 据, 还 有 待 进 一 步 研 究 参 考 文 献 [1] HaslerR,SchmidG,IngervalB,etal.Aclinicalcomparisonof therateofmaxilarycanineretractionintohealedandrecentex tractionsites apilotstudy[j].eurjorthod,1997,19(6):711-9. [2] LiouEJ,HuangCS.Rapidcanineretractionthroughdistraction oftheperiodontalligament[j].amjorthoddentofacialorthop, 1998,114(4):372-82. [3] KisnisciRS,IseriH,TuzHH,etal.Dentoalveolardistractionos teogenesisforrapidorthodonticcanineretraction[j].joralmax ilofacsurg,2002,60(4):389-94. [4] SayinS,BengiAO,GurtonAU,etal.Rapidcaninedistalization usingdistractionoftheperiodontalligament:apreliminaryclinical validationoftheoriginaltechnique[j].angleorthod,2004,74 (3):304-15. [5] IseriH,KisnisciR,BziziN,etal.Rapidcanineretractionandor thodontictreatmentwithdentoalveolardistractionosteogenesis[j]. AmJOrthodDentofacialOrthop,2005,127(5):533-41,625. [6] SukuricaY,KaramanA,GurelH G,etal.Rapidcaninedistal izationthroughsegmentalalveolardistractionosteogenesis[j].an gleorthod,2007,77(2):226-36. [7] KurtG,IseriH,KisnisciR.Rapidtoothmovementandorthodon tictreatmentusingdentoalveolardistraction(dad).long term (5years)folow upofaclasicase[j].angleorthod,2010, 80(3):597-606. [8] KharkarVR,KotrashetiSM.Transportdentoalveolardistraction osteogenesis asistedrapidorthodonticcanineretraction[j].oral SurgOralMedOralPatholOralRadiolEndod,2010,109(5): 687-93. [9] PrabhatKC,MaheshwariS,GuptaND,etal.Periodontalliga mentdistraction:asimplifiedapproachforrapidcanineretraction [J].JIndianSocPeriodontol,2012,16(1):123-5. [10] LongH,PyakurelU,WangY,etal.Interventionsforaccelerating orthodonticotoothmovement:asystematicreview[j].angleorth od,2013,83(1):164-71. [11] 赵 玺, 薛 俊 杰, 米 丛 波. 减 阻 牵 张 成 骨 术 快 速 移 动 尖 牙 的 三 维 有 限 元 分 析 [J]. 中 华 医 学 美 学 美 容 杂 志,2012,18(4): 294-7. [12]WagnerA,KrachW,SchichoK,etal.A3 dimensionalfinite- elementanalysisinvestigatingthebiomechanicalbehaviorofthe mandibleandplateosteosynthesisincasesoffracturesofthecon dylarproces[j].oralsurgoralmedoralpatholoralradiol Endod,2002,94(6):678-86. [13]ChangYI,ShinSJ,BaekSH.Three dimensionalfiniteelement analysisindistalenmasemovementofthemaxilarydentitionwith themultiloopedgewisearchwire[j].eurjorthod,2004,26 (3):339-45. [14] 龚 昕, 袁 晓, 稽 国 平, 等. 牙 间 隔 骨 外 科 改 建 加 速 尖 牙 移 动 的 临 床 效 果 评 价 [J]. 口 腔 医 学,2004,24(3):151-4. [15] 马 文 盛. 牵 张 成 骨 快 速 正 畸 牙 齿 移 动 的 实 验 与 应 用 研 究 [D]. 河 北 医 科 大 学,2009. [16]AlgayerS,RosenbachG,TavaresCA,etal.Periodontalliga mentdistraction:estheticsandocclusalstabilityatthe2 yearfol low up[j].amjorthoddentofacialorthop,2013,143(4):535-46. [17] 吕 涛. 牙 周 膜 牵 张 快 速 牙 移 动 的 实 验 研 究 [D]. 四 川 大 学, 2006.

1136 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) CHOP/GADD153 在 食 管 鳞 状 细 胞 癌 中 的 表 达 及 临 床 意 义 陈 海 1, 吴 勇 2, 于 在 诚 1 3, 汪 渊 摘 要 目 的 探 讨 内 质 网 应 激 相 关 蛋 白 CHOP/GADD153 在 食 管 鳞 状 细 胞 癌 中 的 表 达 及 临 床 意 义, 并 分 析 其 与 临 床 病 理 特 征 的 关 系 方 法 食 管 鳞 状 细 胞 癌 组 织 及 距 癌 组 织 5cm 以 上 的 手 术 远 端 切 缘 的 食 管 鳞 状 上 皮 组 织 各 87 例, 应 用 组 织 芯 片 免 疫 组 化 法 及 Westernblot 法 检 测 CHOP/GADD153 蛋 白 的 表 达, 并 分 析 其 表 达 与 患 者 性 别 年 龄 分 化 程 度 浸 润 深 度 病 理 分 期 及 淋 巴 转 移 等 临 床 病 理 特 征 之 间 的 关 系 结 果 食 管 鳞 状 细 胞 癌 组 织 中 CHOP/GADD153 的 表 达 在 蛋 2014-03-20 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :812772399) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 普 胸 外 科, 合 肥 230022 2 淮 南 新 华 医 疗 集 团 北 方 医 院 普 胸 外 科, 淮 南 232082 3 安 徽 医 科 大 学 分 子 生 物 学 实 验 室, 省 部 共 建 重 要 遗 传 病 基 因 资 源 利 用 重 点 实 验 室, 合 肥 230032 作 者 简 介 : 陈 海, 男, 医 师, 硕 士 研 究 生 ; 于 在 诚, 男, 主 任 医 师, 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:yuzaicheng@tom.com; 汪 渊, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:aydesm 1 @163.com 白 水 平 明 显 高 于 食 管 正 常 鳞 状 上 皮 组 织 (P<0 01), 且 其 高 表 达 与 食 管 鳞 状 细 胞 癌 的 浸 润 深 度 分 化 程 度 病 理 分 期 及 淋 巴 转 移 密 切 相 关 (P<0 01), 而 与 患 者 性 别 及 年 龄 无 关 结 论 CHOP/GADD153 参 与 食 管 鳞 状 细 胞 癌 的 发 生 发 展, 其 表 达 水 平 随 着 食 管 鳞 状 细 胞 癌 组 织 恶 性 程 度 的 增 高 而 增 高, 可 能 作 为 衡 量 食 管 鳞 状 细 胞 癌 恶 性 程 度 的 一 种 有 潜 在 价 值 的 分 子 标 志 物 关 键 词 内 质 网 应 激 ;CCAAT 增 加 子 结 合 蛋 白 ; 食 管 肿 瘤 ; 鳞 状 细 胞 癌 中 图 分 类 号 R735.1 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1136-05 食 管 癌 是 我 国 常 见 的 恶 性 肿 瘤 之 一, 尽 管 内 镜 检 查 能 够 发 现 部 分 早 期 病 变 患 者, 但 是 大 部 分 患 者 确 诊 即 是 中 晚 期, 预 后 差 [1] CHOP/GADD153, 又 称 CCAAT 增 强 子 结 合 蛋 白 (CCAATenhancerbind ingprotein,c/ebpξ) DNA 损 伤 诱 导 转 录 因 子 3 (DNA damageinducibletranscript3,ddit3), 属 于 Three dimensionalfiniteelementanalysisofrapidtoothmovement throughreducingresistanceanddistraction LiangZhihong 1,XueJunjie 2,3,WangHongjun 1 ( 1 Prophylactico therapeticinstitutionofhongkoudistrict,shanghai 200081; 2 DeptofOrthodontics, StateKeyLaboratoryofOralDisease,WestChinaHospitalofStomatology,Chengdu 610041; 3 Deptof Orthodontics,TheFirstAfiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi 830000) Abstract Objective Thisresearchusedthree dimensionalfiniteelementanalysistocomparethecaninedistal movementandforceddistributionofteethandperiodontaltisueinthreeways.methods Thisresearchestablished three dimensionalfiniteelementmodelsundertheconventionalconditiontomovethecanine(model1),rapidca ninemovementthroughdistractingosteogenesisoftheperiodontalligament(model2),rapidcaninemovement throughreducingresistanceanddistractingmethod(model3),thencariedstrengthonbuccalandpalatalsidesof teeth.results Thebiggestdisplacementquantityoncanine:model2>model3>model1;thebiggestequivalent stres:model2<model1<model3;thebiggestprincipalstres:model1<model2<model3;thebiggestshear stres:model2<model1<model3.conclusion Intheprocesofcaninedistalmovement,reducingboneresist ance,especialydistalalveolarcrestofcanine,canacceleratethetoothmovingspeedefectively.andthetwoways succesfulyavoidthelosofanchorage.while,thecaninehasdistalmotiontendencyundertheactionofforce, doctorsshouldtakeappropriatemeasurestocontrolitinclinicalwork. Keywords distractionosteogenesis;three dimensionalfiniteelement;malocclusion;toothmovement

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1137 C/EBP 家 族 成 员, 是 内 质 网 应 激 (endoplasmicreticu lumstres,ers) 特 异 的 转 录 因 子, 在 生 理 状 态 下 表 达 量 较 低, 但 当 各 种 损 伤 引 起 未 折 叠 蛋 白 或 错 误 折 叠 蛋 白 增 多 胞 内 Ca 2+ 稳 态 失 衡 而 导 致 ERS 反 应 时,CHOP 会 被 激 活 而 呈 现 高 表 达 [2] ERS 中 CHOP 介 导 的 凋 亡 与 许 多 疾 病 相 关, 如 糖 尿 病 病 毒 感 染 脑 缺 血 眼 科 疾 病 肝 病 和 帕 金 森 病 等 [3-4], 尤 其 是 其 与 肿 瘤 发 生 发 展 浸 润 及 转 移 的 相 互 关 系 备 受 各 国 研 究 者 的 关 注 近 来 国 内 外 对 CHOP 在 人 [5] 类 肿 瘤 中 的 研 究 颇 多, 陈 俊 榕 等 发 现 CHOP 在 伴 高 级 别 上 皮 内 瘤 变 和 恶 变 的 腺 瘤 和 腺 癌 组 织 阳 性 表 达 率 均 显 著 高 于 正 常 肠 黏 膜 和 早 期 腺 瘤 ;Mertani etal [6] 发 现 乳 腺 癌 细 胞 株 中 CHOPmRNA 呈 高 表 达, 但 有 关 CHOP 在 人 类 食 管 癌 中 的 研 究 尚 未 见 报 道 该 研 究 选 取 食 管 鳞 状 细 胞 癌 组 织 及 正 常 食 管 鳞 状 上 皮 组 织 各 87 例, 分 别 应 用 组 织 芯 片 免 疫 组 化 法 及 Westernblot 法 检 测 CHOP/GADD153 蛋 白 水 平 的 表 达, 分 析 CHOP/GADD153 的 表 达 与 临 床 病 理 特 征 的 关 系 1 材 料 与 方 法 1.1 研 究 对 象 收 集 2011 年 11 月 ~2012 年 4 月 在 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 普 胸 外 科 Ⅰ Ⅱ 病 区 手 术 切 除 的 食 管 鳞 状 细 胞 癌 标 本 以 及 距 癌 组 织 5 cm 以 上 的 手 术 远 端 切 缘 的 正 常 食 管 鳞 状 上 皮 组 织 标 本 各 87 例 患 者 术 前 均 未 接 受 放 化 疗 治 疗, 且 术 后 全 部 病 理 切 片 均 由 我 院 病 理 科 2 位 以 上 病 理 专 家 确 诊 将 所 取 标 本 迅 速 置 于 我 院 输 血 科 -80 保 存 备 用 87 例 患 者 中, 男 68 例, 女 19 例, 年 龄 43~80(62 0±7 2) 岁 经 术 后 病 理 检 查 确 诊, 其 中 分 化 程 度 Ⅰ 级 ( 高 分 化 )23 例 Ⅱ 级 ( 中 分 化 )53 例 Ⅲ 级 ( 低 分 化 )11 例 ; 浸 润 深 度 : 侵 及 黏 膜 层 5 例 侵 及 肌 层 19 例 侵 及 纤 维 膜 63 例 ; 食 管 癌 分 期 标 准 采 用 国 际 抗 癌 联 盟 (UnionforInternational CancerControl,UICC)2009 年 第 7 版 制 定 的 TNM 分 期 :Ⅰ ~Ⅱ 期 51 例 Ⅲ ~Ⅳ 期 37 例 ; 有 淋 巴 结 转 移 45 例 无 淋 巴 结 转 移 42 例 1.2 主 要 试 剂 兔 抗 人 CHOP 多 克 隆 抗 体 (sc 575) 鼠 抗 人 多 克 隆 抗 体 β actin 购 自 美 国 Santa CruzBiotechnology 公 司 ;PV 6000 免 疫 组 化 检 测 试 剂 盒 浓 缩 型 DAB 试 剂 盒 HRP 标 记 的 羊 抗 兔 及 羊 抗 鼠 IgG 购 于 北 京 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 预 染 蛋 白 质 分 子 质 量 标 准 购 自 加 拿 大 Fermentas 公 司 ; SuperSignal WestPicoTrialKit(ECL 显 色 试 剂 盒 ) 购 自 美 国 PIERCE 公 司 ;RIPA 裂 解 液 ( 强 ) PVDF 膜 BCA 试 剂 盒 及 一 抗 稀 释 液 购 自 上 海 碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所 1.3 方 法 1.3.1 组 织 芯 片 的 制 备 食 管 癌 标 本 手 术 离 体 后 立 即 置 于 10% 甲 醛 溶 液 固 定, 常 规 石 蜡 包 埋 切 片 及 组 织 病 理 诊 断 阅 片 在 HE 染 色 切 片 的 指 引 下 通 过 显 微 镜 对 目 标 组 织 定 位 标 记, 每 块 蜡 块 与 一 个 目 标 组 织 相 对 应, 共 计 175 个 位 点 利 用 组 织 芯 片 仪 依 次 从 原 始 蜡 块 上 穿 取 直 径 1.0mm 的 组 织 柱, 插 入 每 块 具 有 45 个 点 阵 的 受 体 蜡 块 中, 经 过 融 蜡 冷 却 之 后 制 成 组 织 芯 片 所 得 组 织 芯 片 常 规 切 片, 并 行 HE 染 色, 以 4μm 厚 连 续 切 片 备 用 1.3.2 免 疫 组 化 检 测 CHOP/GADD153 蛋 白 的 表 达 切 片 常 规 脱 蜡 水 化 抗 原 修 复 等, 滴 加 抗 CHOP/GADD153 抗 体 孵 育 过 夜 ( 兔 抗 人,1 100), 滴 加 通 用 型 IgG 抗 体 HRP 多 聚 体 30min( 羊 抗 兔 / 小 鼠 IgG 多 聚 体 ), 滴 加 DAB 染 色, 自 来 水 冲 洗, 苏 木 精 复 染, 盐 酸 酒 精 分 化, 自 来 水 反 蓝, 梯 度 酒 精 脱 水, 二 甲 苯 透 明 树 脂 封 片, 显 微 镜 下 阅 片, 用 已 知 CHOP 阳 性 乳 腺 癌 组 织 作 阳 性 对 照 相 应 癌 旁 正 常 食 管 鳞 状 上 皮 组 织 作 阴 性 对 照, 一 抗 予 PBS 代 替 作 阴 性 对 照 阳 性 结 果 表 现 为 棕 黄 色 细 颗 粒 分 布 于 细 胞 核 内, 采 用 ImageProPlus 分 析 软 件 测 定 阳 性 细 胞 的 平 均 吸 光 度 值 (averageabsorbancevalue,a) 每 张 切 片 随 机 测 定 5 个 区 域 的 阳 性 细 胞 平 均 光 密 度 (average opticaldensity,aod), 以 其 均 值 反 映 CHOP/GADD153 蛋 白 的 表 达 水 平 1.3.3 Westernblot 法 检 测 CHOP/GADD153 蛋 白 的 表 达 根 据 免 疫 组 化 的 实 验 结 果, 选 取 典 型 病 例 13 例, 其 中 正 常 食 管 鳞 状 上 皮 1 例, 食 管 鳞 状 细 胞 癌 12 例, 各 取 少 量, 匀 浆 器 研 碎, 加 入 蛋 白 裂 解 液, 提 取 浓 缩 得 到 蛋 白 样 本, 具 体 步 骤 严 格 按 说 明 书 进 行 蛋 白 样 本 电 泳 后, 转 到 聚 偏 二 氟 乙 烯 膜 (PVDF 膜 ) 上, 加 入 5% 脱 脂 奶 粉 封 闭 液, 室 温 下 孵 育 2h, 在 水 平 摇 床 上 振 摇 放 置 2h,PBST 漂 洗 PVDF 膜 3 遍, 加 入 1 100 抗 CHOP/GADD153 抗 体 ( 兔 抗 人 ),4 孵 育 过 夜 弃 去 一 抗,PBST 洗 涤 3 遍 加 入 1 1000 的 通 用 型 IgG 抗 体 HRP 多 聚 体 ( 羊 抗 兔 / 小 鼠 IgG 多 聚 体 ), 室 温 振 摇 孵 育 2~3h 后, 弃 去 二 抗,PBST 洗 涤 3 遍, 不 含 0.05% Tween 20 的 PBS 洗 涤 1 遍, 增 强 化 学 荧 光 发 光 法 (ECL) 显 影, 曝 光 以 β actin 作 为 内 参 照, 结 果 以 灰 度 扫 描, 用 相 对 吸 光 度 值 ( 即 CHOP/GADD153 条 带 吸 光 度 值 /β

１１３８ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ 图 １ 免疫组化 ＣＨＯＰ ＧＡＤＤ１ ５３在正常食管鳞状上皮及食管鳞状细胞癌组织中的表达 Ａ 正常食管鳞状上皮 Ｂ 高分化食管鳞状细胞癌组织 Ｃ 中分化食管鳞状细胞癌组织 Ｄ 低分化食管鳞状细胞癌组织 １ Ｓ Ｐ ２ ２ Ｓ Ｐ ４ 表 １ ＣＨＯＰ ＧＡＤＤ１５ ３的表达与食管鳞状细胞癌 ａ ｃ ｎ条带吸光度值 表示 ＣＨＯＰ ＧＡＤＤ１５ ３蛋白的 患者临床病理特征的关系 相对表达强度 １ ４ 统计学处理 采用 Ｓ ＰＳＳ１７ 统计软件进行 珋±ｓ表示 组间比较采用 检验 分析 数据以 ｘ ２ 结果 ２ １ 免疫组化法比较两组 ＣＨＯＰ ＧＡＤＤ１ ５ ３蛋白 项目 值 Ｐ值 １ ６４２４３ １４２７６ ７６８５５１ ４５４９３ １１ ４８４５５± ３１８２６ ３ ２３５８ ２１３３ 中 ５３ ３８１１４± ２８６７４ ６ ８９３９４ ４２ 高 ２３ ３１１± ２３２ ３ ３５４７８ １６４３ 男 ６８ ３８８± ５６１９２ １９ ３５８８１± ６５４７３ 年龄 岁 ６ １５ ３８１３３± ４４５４８ ６ ７２ ３７９７２± ５９４４３ 分化程度 染色阳性 ８７例对照组出现弱阳性结果 食管鳞状 低 ３ ７ ５４ ３± ５ ８６ 较对照组 ２ ８ ２３ ５± ６６７ ＡＯＤ 女 表达 ８７例食管鳞状细胞癌组织均存在核 ＣＨＯＰ 细 胞 癌 组 织 ＣＨＯＰ ＧＡＤＤ１５ ３蛋 白 表 达 水 平 例数 性别 淋巴结转移 明显升高 Ｐ １ 见图 １ 在 ８ ７例食管鳞状细 阳性 ４５ ３４６２５± ４５５４５ ９ 例 女 性 ＣＨＯＰ 胞 癌 患 者 中 ６８ 例 男 性 及 １ 阴性 ４２ ４６７± ５５１６９ ３ ８ ８± ＧＡＤＤ１５３蛋 白 表 达 水 平 分 别 为 侵及深度 黏膜层 ５ ２７４９８± ２７７ ５ ６１９ 和 ３ ５８８１± ６ ５４７ 年龄 ６ 岁者 ６ ５３３７４ ２８３５ 肌层 １９ ３２１２± １２２２ ６ １７５６ ３６３７ １ ５例 ６岁 者 ７２例 蛋 白 表 达 水 平 分 别 为 纤维膜 ６３ ３９９７６± ４８７６１ ３８１３３± ４ ４５５ ３ ８９７ ２± ５９４ ４ 但 ＴＮＭ分期 ３ ６５７１２ ３４６４ 蛋白表达水平在性别和年龄分组比较上差异均无统 Ⅰ Ⅱ ５１ ３５７８± ４５２２４ Ⅲ Ⅳ ３６ ４１３５± ５８１３５ 计学意义 当按肿瘤侵及深度 黏膜层 肌层 纤维 中分化与低分化比较 高分化与低分化比较!侵及肌层与侵及黏膜层 膜 分化程度 高分化 中分化 低分化 淋巴结转 比较 侵及纤维膜与侵及黏膜层比较 移 阳性 阴性 及 ＴＮＭ分期进行分层分析时 发现 两组蛋白表达水平在各亚组比较差异均具有统计学 率和死亡率均较高 目前普遍认为食管癌变是一个 意义 Ｐ １ 见表 １ 涉及多因素 多阶段 多基因变异积累及相互作用的 ２ ２ Ｗ ｓ ｒ ｎｂｌ ｏ法 Ｗ ｓ ｒ ｎｂｌ ｏ 结果显示 食管 复杂过程 食管癌的发生 发展过程涉及大量基因表 鳞状细胞癌组织与正常食管鳞状上皮组织中均可检 达水平的 改 变 如 癌 基 因 的 激 活 和 抑 癌 基 因 的 失 测到 ＣＨＯＰ ＧＡＤＤ１５ ３的表达 见图 ２ 活 ７ 随着医疗水平的迅猛发展 食管癌的手术切 ３ 讨论 食管癌是我国常见的上消化道恶性肿瘤 发病 除率明显提高 手术死亡率明显下降 但是食管癌患 者的长期预后仍不容乐观 目前食管癌患者的 ５年 生 存率仍难以超过３５ 造成这一现象的主要原

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1139 CHOP/ β -actin 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 CHOP β-actin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 图 2 Westernblot 法 检 测 CHOP/GADD153 在 正 常 食 管 鳞 状 上 皮 与 食 管 鳞 状 细 胞 癌 组 织 中 的 表 达 1: 正 常 鳞 状 上 皮 ;2~13: 食 管 鳞 状 细 胞 癌 (2: 男 性 ;3: 女 性 ;4:> 60 岁 ;5: 60 岁 ;6: 肿 瘤 侵 犯 黏 膜 层 ;7: 肿 瘤 侵 犯 肌 层 ;8: 肿 瘤 侵 犯 纤 维 层 ;9: 低 分 化 鳞 癌 ;10: 中 分 化 鳞 癌 ;11: 高 分 化 鳞 癌 ;12: 有 淋 巴 结 转 移 ;13: 无 淋 巴 结 转 移 ) 因 是 食 管 癌 患 者 早 期 无 明 显 的 特 异 性 症 状, 大 多 数 首 次 就 诊 的 食 管 癌 患 者 已 经 为 进 展 期 患 者, 临 床 治 疗 效 果 往 往 较 差 近 年 来, 随 着 分 子 生 物 学 的 迅 速 发 展, 研 究 者 发 现 一 些 与 食 管 癌 发 生 发 展 的 分 子 生 物 学 指 标, 如 鳞 状 上 皮 细 胞 癌 抗 原 (squamouscel carcinomaantigen,scca) 癌 胚 抗 原 (carcinoembry onicantigen,cea) 神 经 元 特 异 性 烯 醇 化 酶 (neuron specificenolase,nse) 细 胞 角 蛋 白 片 段 抗 原 21 1 (cytokeratinfragmentantigen21 1,Cyfra21 1) 糖 类 抗 原 19 9(carbohydrateantigen19 9,CA19 9) 组 织 多 肽 特 异 抗 原 (tisuepolypeptidespecificantigen,tps) 细 胞 质 胸 苷 激 酶 1(thymidinekinase1,TK1) 等, 可 用 于 食 管 癌 的 辅 助 诊 断 疗 效 检 测, 但 尚 不 能 用 于 食 管 癌 的 早 期 诊 断 [8-11] CHOP/GADD153 是 ERS 特 异 的 转 录 因 子 [12-13], 与 各 种 细 胞 活 动 如 增 殖 分 化 能 量 代 谢 凋 亡 相 关 正 常 情 况 下,CHOP 主 要 存 在 于 细 胞 质 内, 表 达 甚 微, 当 细 胞 处 于 应 激 状 态 下 时 被 活 化 并 转 位 到 细 胞 核 内 [14], 削 弱 Bcl 2 的 抗 凋 亡 功 能, 从 而 导 致 ER 膜 上 Bax 和 Bak 构 象 变 化 并 寡 聚 化, 破 坏 膜 的 完 整 性, 导 致 内 钙 外 流, 从 而 使 细 胞 质 内 Ca 2+ 浓 度 升 高, 诱 发 细 胞 凋 亡 本 实 验 通 过 对 食 管 鳞 状 细 胞 癌 组 织 和 正 常 食 管 鳞 状 上 皮 组 织 CHOP/ GADD153 蛋 白 的 检 测 显 示, 食 管 鳞 状 细 胞 癌 中 CHOP/GADD153 的 表 达 明 显 高 于 食 管 正 常 鳞 状 上 皮, 提 示 在 正 常 黏 膜 癌 变 过 程 中 ERS 被 激 活 本 研 究 显 示 CHOP/GADD153 的 表 达 与 肿 瘤 的 浸 润 深 度 分 化 程 度 病 理 分 期 及 有 无 淋 巴 结 转 移 相 关, 而 与 患 者 的 性 别 及 年 龄 无 关 CHOP/GADD153 的 表 达 程 度 随 着 浸 润 深 度 的 增 加 而 增 高 ; 随 着 分 化 程 度 的 降 低 而 增 高 ; 病 理 分 期 晚 的 表 达 高 于 病 理 分 期 早 的 ; 有 淋 巴 结 转 移 的 明 显 高 于 无 淋 巴 结 转 移 以 上 结 果 均 显 示,CHOP/GADD153 参 与 了 食 管 鳞 状 细 胞 癌 的 发 生 发 展, 表 达 水 平 随 着 食 管 鳞 状 细 胞 癌 组 织 恶 性 程 度 的 增 高 而 增 高, 其 作 用 贯 穿 于 肿 瘤 的 生 长 进 展 侵 袭 及 转 移 过 程 中, 因 此 可 能 成 为 衡 量 食 管 鳞 状 细 胞 癌 恶 性 程 度 的 一 种 有 潜 在 价 值 的 分 子 标 [15] 志 物 王 苏 美 等 发 现 鼻 咽 癌 组 织 中 CHOP 高 表 达 于 胞 质 及 细 胞 核, 鼻 咽 炎 组 织 中 CHOP 仅 弱 阳 性 低 表 达 于 胞 质 ;Connetal [16] 发 现 神 经 母 细 胞 瘤 中 CHOP 亦 有 表 达 [17-18] 另 外, 研 究 显 示 抗 肿 瘤 药 物 可 通 过 上 调 CHOP 基 因 的 表 达 来 诱 导 肿 瘤 细 胞 凋 亡 ; 同 时 CHOP 的 过 表 达 在 增 敏 化 疗 药 物 中 也 起 到 了 关 键 作 用 如 芬 维 A 胺 和 前 列 腺 素 A 类 似 物 clavulone 可 诱 导 神 经 母 细 胞 瘤 和 人 类 肝 癌 细 胞 血 癌 细 胞 凋 亡, 均 与 激 活 CHOP 介 导 的 ERS 相 关 凋 亡 途 径 有 关 [19] ;CHOP 基 因 沉 默 能 明 显 降 低 肿 瘤 细 胞 对 化 疗 药 的 敏 感 性, 甲 基 硒 酸 作 为 ERS 的 诱 导 剂 能 将 紫 杉 烷 类 化 疗 药 的 抗 癌 活 性 提 高, 实 验 中 观 察 到 了 CHOP 的 高 表 达 这 也 进 一 步 揭 示 了 CHOP/GADD153 在 恶 性 肿 瘤 发 生 发 展 过 程 中 发 挥 重 要 作 用, 然 而 提 高 CHOP 的 表 达 对 治 疗 食 管 癌 的 影 响 尚 有 待 进 一 步 的 研 究 参 考 文 献 [1] Lao SirieixP,FitzgeraldRC.Screeningforoesphagealcancer[J]. NatRevClinOncol,2012,9(5):278-87. [2] ZhaL,FanL,SunG,etal.Melatoninsensitizeshumanhepatoma celstoendoplasmicreticulumstres inducedapoptosis[j].jpine alres,2012,52(3):322-31. [3] OyadomariS,KoizumiA,TakedaK,etal.Targeteddisruptionof thechopgenedelaysendoplasmicreticulumstres mediateddiabe tes[j].jclininvest,2002,109(4):525-32. [4] SilvaRM,RiesV,OoTF,etal.CHOP/GADD153isamediator ofapoptoticdeathinsubstantianigradopamineneuronsinaninvi voneurotoxinmodelofparkinsonism[j].jneurochem,2005,95 (4):974-86. [5] 陈 俊 榕, 李 初 俊, 杨 惠 玲, 等. 结 直 肠 腺 瘤 及 癌 变 组 织 CHOP 蛋 白 表 达 与 细 胞 凋 亡 的 相 关 性 研 究 [J]. 中 国 病 理 生 理 杂 志, 2011,27(5):875-82. [6] MertaniHC,ZhuT,GohEL,etal.Autocrinehumangrowthhor mone(hgh)regulationofhumanmammarycarcinomacelgene expresion.identificationofchopasamediatorofhgh stimulated

1140 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) humanmammarycarcinomacelsurvival[j].jbiolchem,2001, 276(24):21464-75. [7] ZhangXM,GuoM Z.Thevalueofepigeneticmarkersinesopha gealcancer[j].frontmedchina,2010,4(4):378-84. [8] 高 鼎 亮, 范 钟 麟, 王 学 红. 鳞 状 细 胞 癌 抗 原 癌 胚 抗 原 糖 类 相 关 抗 原 19-9 在 食 管 癌 中 的 表 达 及 意 义 [J]. 社 区 医 学 杂 志, 2011,9(6):36-8. [9] 曹 红, 江 华. 血 清 鳞 状 上 皮 细 胞 癌 相 关 抗 原 癌 胚 抗 原 神 经 元 特 异 性 烯 醇 化 酶 及 细 胞 角 蛋 白 19 片 段 抗 原 检 测 在 食 管 癌 诊 断 中 的 价 值 [J]. 医 学 检 验,2013,10(14):96-100. [10] 陈 俊 强, 陈 明 强, 李 云 英, 等. 食 管 癌 患 者 血 清 中 组 织 多 肽 特 异 抗 原 的 表 达 及 临 床 意 义 [J]. 肿 瘤 研 究 与 临 床,2005,17(5):33-4. [11]LiZ,WangY,HeJ,etal.Serologicalthymidinekinase1isaprog nosticfactorinoesophageal,cardialandlungcarcinomas[j].eurj CancerPrev,2010,19(4):313-8. [12] SzegezdiE,LogueSE,GormanAM,etal.Mediatorsofendoplas micreticulum stresinducedapoptosis[j].embo Rep,2006,7 (9):880-5. [13] YokouchiM,HiramatsuN,HayakawaK,etal.Atypicalbidirec tionalregulationofcadmium inducedapoptosisviadistinctsigna lingofunfoldedproteinresponse[j].celdeathdifer,2007,14 (8):1467-74. [14] RonD,HabenerJF.CHOP,anoveldevelopmentalyregulated nuclearproteinthatdimerizeswithtranscriptionfactorsc/ebpand LAPandfunctionsasadominant negativeinhibitorofgenetran scription[j].genesdev,1992,6(3):439-53. [15] 王 苏 美, 张 惠 忠, 马 志 建, 等.CHOP 在 鼻 咽 癌 中 的 表 达 及 其 意 义 [J]. 分 子 诊 断 与 治 疗 杂 志,2012,4(2):84-8. [16]ConnKJ,GaoW W,UlmanM D,etal.Specificup regulationof GADD153/CHOP in 1 methyl 4 phenyl pyridinium treated SH SY5Ycels[J].JNeurosciRes,2002,68(6):755-60. [17] MaJ,QiuY,YangL,etal.Desipramineinducesapoptosisinrat gliomacelsviaendoplasmicreticulum stres dependentchop pathway[j].jneurooncol,2011,101(1):41-8. [18] Akatsu Y,SaikawaY,KubotaT,etal.Predictive value of GADD153,p21andc Junforchemotherapyresponseingastric cancer[j].cancersci,2007,98(5):707-15. [19] ChiangPC,ChienCL,PanSL,etal.Inductionofendoplasmic reticulumstresandapoptosisbyamarineprostanoidinhuman hepatocelularcarcinoma[j].jhepatol,2005,43(4):679-86. ExpresionandclinicalsignificanceofCHOP/GADD153in humanesophagealsquamouscelcarcinoma ChenHai 1,WuYong 2,YuZaicheng 1,etal ( 1 DeptofThoracicSurgery,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022; 2 DeptofThoracicSurgery,NorthernHospitalofHuainanXinhuaMedicalGroup,Huainan 232082) Abstract Objective ToinvestigatetheexpresionandclinicalsignificanceofC/EBP homologousproteinor growtharestanddna damage induciblegene153(chop/gadd153)relatedtoendoplasmicreticulum stres (ERS)inhumanesophagealsquamouscelcarcinoma(ESCC),andtoevaluateitscorelationwithclinicalpatholog icalcharacteristicsofescc.methods Eighty sevenspecimensofhumanesccandeighty sevenadjacentnormal specimensofabove5cmfromthedistaledgeofthetumorwereincluded.chop/gadd153proteinexpresionwas examinedbytisuemicroaray,immunohistochemicaltechniquesandwesternblotrespectively.therelationshipbe tweenchop/gadd153expresionwithclinicalparametersofpatients,suchasgender,age,tumordiferentiation, tumorinfiltration depth,tumorpathologicalstage,and lymphaticmetastasiswasanalyzed.results CHOP/ GADD153proteinexpresionlevelsinhumanESCCweresignificantlyhigherthanthoseinthenormalesophageal tisues(p<0 01).CHOP/GADD153expresioninESCCtisueswascorelatedwiththeinfiltrationdepth,grade ofdiferentiation,pathologicalstageoftumors,andlymphaticmetastasis(p<0 01),butnotwithgenderorage. Conclusion CHOP/GADD153participatesinthedevelopment,progresofESCC,anditsexpresionispositively asociatedwiththemalignancyofcarcinoma.chop/gadd153maybetakenasapotentialbiomarkerinevaluating themalignancyofescc. Keywords endoplasmicreticulum stres;ccaatenhancerbindingprotein;esophagusneoplasms;esophageal squamouscelcarcinoma

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1141 Syk PI3K Akt 在 外 周 T 细 胞 淋 巴 瘤 中 的 表 达 及 其 意 义 代 群 1,2, 詹 鹤 琴 1,2, 曹 立 宇 1,2, 陈 聪 1,2 1,2, 陈 顺 华 摘 要 目 的 探 讨 脾 酪 氨 酸 激 酶 (Syk) 磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶 (PI3K) 蛋 白 激 酶 B(Akt) 在 外 周 T 细 胞 淋 巴 瘤 (PTCL) 组 织 中 的 表 达 及 意 义 方 法 应 用 免 疫 组 织 化 学 法 检 测 84 例 PTCL 组 织 及 30 例 反 应 性 淋 巴 组 织 增 生 (RLH) 中 的 表 达 结 果 Syk PI3K Akt 在 84 例 PTCL 组 织 中 阳 性 表 达 率 分 别 是 73 81% 41 67% 和 36 90%, 在 30 例 RLH 中 的 阳 性 表 达 率 是 13 33% 33 33% 和 23 33%,Syk 蛋 白 在 PTCL 中 的 表 达 明 显 高 于 RLH(P<0 05),PI3K 与 Akt 蛋 白 在 PTCL 及 RLH 中 的 表 达 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) Syk 表 达 与 血 清 乳 酸 脱 氢 酶 (LDH) 水 平 临 床 分 期 相 关 (P<0 05), 与 患 者 性 别 年 龄 肿 块 大 小 B 症 状 一 般 状 况 (PS) 评 分 和 国 际 预 后 指 数 (IPI) 评 分 无 关 (P>0 05);PI3K 及 Akt 表 达 与 患 者 性 别 年 龄 肿 块 大 小 B 症 状 PS 评 分 临 床 分 期 LDH 水 平 和 IPI 指 数 均 无 关 (P>0 05) Syk 与 PI3K 在 PTCL 中 的 表 达 有 相 关 性 (r=0 229,P<0 05) 结 论 Syk 在 PTCL 的 发 生 发 展 中 具 有 重 要 作 用, 可 能 与 PI3K 信 号 通 路 有 关, 与 Akt 的 表 达 无 直 接 关 系 关 键 词 外 周 T 细 胞 淋 巴 瘤 ;Syk;PI3K;Akt; 免 疫 组 织 化 学 中 图 分 类 号 R733.4 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1141-05 外 周 T 细 胞 淋 巴 瘤 (peripheralt cellymphoma, PTCL) 来 源 于 成 熟 T 细 胞 或 胸 腺 后 T 细 胞 及 自 然 杀 伤 (naturalkiler,nk) 细 胞, 其 生 物 学 行 为 及 临 床 表 现 具 有 明 显 异 质 性, 是 最 具 侵 袭 性 的 非 霍 奇 金 淋 巴 瘤, 其 发 病 机 制 尚 未 明 确, 现 无 标 准 的 治 疗 方 案, 治 疗 反 应 差, 易 复 发 探 讨 新 的 基 因 功 能 改 变 与 PTCL 发 生 发 展 的 关 系, 有 助 于 研 究 其 发 病 机 制, 为 治 疗 及 预 后 判 断 提 供 理 论 依 据 脾 酪 氨 酸 激 酶 (spleen 2014-03-20 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目 ( 编 号 :1208085MH175); 安 徽 医 科 大 学 博 士 科 研 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 :XJ201101); 国 家 自 然 科 学 基 金 青 年 科 学 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 : 81202006) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 病 理 学 教 研 室, 合 肥 230032 2 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 病 理 科, 合 肥 230022 作 者 简 介 : 代 群, 女, 硕 士 研 究 生 ; 詹 鹤 琴, 女, 副 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail: heqinzh@163.com; 曹 立 宇, 男, 副 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:ca oliyuhf@163.com tyrosinekinase,syk) 是 一 种 非 受 体 型 酪 氨 酸 激 酶, 参 与 许 多 信 号 转 导 途 径 [1-2], 能 催 化 底 物 蛋 白 酪 氨 酸 残 基 磷 酸 化, 控 制 细 胞 分 化 增 殖 和 扩 散, 与 人 类 多 种 肿 瘤 密 切 相 关 [2-4] Syk 在 磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶 (phosphatidylinositol3 kinase,pi3k) 激 活 的 过 程 中 起 关 键 的 作 用 [5] 蛋 白 激 酶 B(proteinkinaseB, PKB,Akt) 是 一 种 丝 氨 酸 / 苏 氨 酸 蛋 白 激 酶, 与 T 细 胞 淋 巴 瘤 中 的 逆 转 录 病 毒 癌 基 因 V Akt 高 度 同 源, 与 蛋 白 激 酶 A 和 蛋 白 激 酶 C 在 结 构 上 相 似, 其 PH 结 构 域 可 与 被 激 活 的 PI3K 结 合, 活 化 的 Akt 由 细 胞 膜 释 放 到 细 胞 质 内, 参 与 细 胞 的 分 化 增 殖 和 凋 亡 等 功 能 [6] 该 实 验 采 用 免 疫 组 织 化 学 方 法 检 测 Syk PI3K Akt 在 PTCL 组 织 中 的 表 达, 探 讨 其 在 PTCL 组 织 中 的 表 达 意 义 及 相 互 关 系 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 1.1.1 标 本 来 源 收 集 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 病 理 科 2001 年 1 月 ~2010 年 12 月 诊 断 及 分 型 均 明 确 的 PTCL84 例, 其 中 男 63 例, 女 21 例, 发 病 年 龄 在 14~85 岁, 中 位 年 龄 为 52 岁 切 片 均 经 2 位 以 上 病 理 专 家 重 新 阅 读, 并 按 照 2008 版 WHOclas sificationoftumoursofhaematopoieticandlymphoid tisues [7] 进 行 组 织 形 态 学 分 型, 其 中 外 周 T 细 胞 淋 巴 瘤, 非 特 指 型 (peripheralt cellymphoma,nototh erwisespecified,ptcl NOS)34 例, 血 管 免 疫 母 细 胞 性 T 细 胞 淋 巴 瘤 (angioimmunoblastict cellympho ma,aitl)21 例, 间 变 性 大 细 胞 淋 巴 瘤 (anaplastic largecellymphoma,alcl)7 例, 结 外 NK/T 细 胞 淋 巴 瘤, 鼻 型 (extranodalnk/t cellymphoma,nasal type,enktl)22 例 另 选 30 例 反 应 性 淋 巴 组 织 增 生 (reactivelymphoidhyperplasia,rlh) 作 为 对 照 标 本 均 经 10% 中 性 福 尔 马 林 液 固 定, 石 蜡 包 埋,3 μm 连 续 切 片, 分 别 作 HE 染 色 和 免 疫 组 化 染 色 1.1.2 主 要 试 剂 兔 抗 人 Syk(C 20) 多 克 隆 抗 体 购 自 美 国 SantaCruz 公 司 ; 兔 抗 人 PI3K(C73F8) 单 克 隆 抗 体 及 兔 抗 人 Akt(C67E7) 单 克 隆 抗 体 购 自 美 国 CelSignaling 公 司 ; 免 疫 组 织 化 学 二 步 法 染 色 试 剂 盒 EDTA 修 复 液 (1mmol,pH8.0) 及 柠 檬 酸 修 复

１１４２ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ 液 ｐｈ６ 购自北京中杉金桥生物技术有限公司 ＤＡＢ显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司 １ ２ 实验方法 免疫组织化学染色 ＥｎＶ ｓ ｏ ｎ二步 采用 Ｐ ａ ｒ ｓ ｏ ｎ检验 设检验水平 α ５ ２ 结果 法 按试剂盒说明书操作 用已知阳性切片作阳性 ２ １ Ｓｙ ｋ ＰＩ ３Ｋ Ａｋ蛋白在 ＰＴＣＬ和 ＲＬＨ中的表 对照 用 ＰＢＳ代替一抗作阴性对照 达 Ｓ ｙ ｋ ＰＩ ３Ｋ Ａｋ主要着色部位在细胞质 部分可 １ ３ 结果判定标准 Ｓｙ ｋ ＰＩ ３Ｋ Ａｋ免疫组化染色 伴有细胞核着色 三者在 ８４例 ＰＴＣＬ中的阳性表达 表达主要定位于细胞质 部分定位于细胞核 细胞质 率 分 别 是 ７３ ８１ ４１ ６ ７ ３６ ９ 在 ３ ４例 ｙ ｋ按在 １ ４倍 及细胞核呈棕黄色者为阳性 Ｓ ＰＴＣＬ ＮＯＳ中 的 阳 性 表 达 率 分 别 是 ７９ ４１ 镜下肿瘤区域随机选取 １个视野 计算 １ 个肿 ５ ３８ ２４ 在 ２ １例 ＡＩ ＴＬ中的阳性表达率分 ３ 以上的肿瘤细胞 瘤细胞中的阳性细胞数 １ ４３ ４７ ６ ２ ３３ ３３ 在 ２２例 ＥＮＫＴＬ中 别是 ７ 出现阳性染色判为阳性 采用半定量方法 ８ ＰＩ ３Ｋ Ａｋ 的结果判读 ９ 的阳性 表 达 率 分 别 是 ６ ３ ６４ ２２ ７３ ２７ ２７ 在 ７例 ＡＬＣＬ中 的 阳 性 表 达 率 分 别 是 ８５ ７１ ① 按细胞染色强弱评分 分 不着色 １分 浅黄色 ２分 棕黄色 ３分 棕褐色 ② ４２ ８ ６ ７１ ４３ 在 ３ 例 ＲＬＨ中的阳性表达率分 选取 ５个高倍视野 １ ４ 计数阳性细胞百分 别是 １３ ３３ ３３ ３３ ２３ ３３ Ｓｙ ｋ蛋白在 ＰＴＣＬ 分 ２ ５ １分 ２ ６ ５ ２分 ５ １ 比 及各类型中的表达明显高于 ＲＬＨ 差异有统计学意 ７ ５ ３分 ７５ 按① ②相加判断结果 １为阴 义 Ｐ ５ ＰＩ ３Ｋ蛋白在各类型 ＰＴＣＬ及 ＲＬＨ中 性 ２为阳性 表达差 异 无 统 计 学 意 义 Ｐ ５ Ａｋ蛋 白 在 １ ４ 统计学处理 应用 Ｓ ＰＳ Ｓ１９ 软件进行统计 ２ ２ 分析 计 数 资 料 采 用 χ 检 验 或 校 正 的 χ 检 验 及 Ｆ ｓ ｈ ｒ精确概率法比较各组间的差异 相关性分析 ＡＬＣＬ中的表达明显高于 ＲＬＨ Ｐ ５ 见图 １ 表 １ ２ ２ ＰＴＣＬ中Ｓｙ ｋ ＰＩ ３Ｋ Ａｋ 蛋白表达与临床病 图 １ Ｓｙ ｋ ＰＩ ３ｋ Ａｋ在 ＰＴＣＬ中的表达 ４ １ ＨＥ染色 ２ ４ ＥｎＶ ｓ ｏ ｎ染色 ２ Ｓｙ ｋ ３ ＰＩ ３Ｋ ４ Ａｋ Ａ ＰＴＣＬ ＮＯＳ Ｂ ＡＩ ＴＬ Ｃ ＥＮＫＴＬ Ｄ ＡＬＣＬ

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1143 表 1 Syk PI3K Akt 在 PTCL 及 RLH 中 的 表 达 类 型 n Syk PI3K Akt + 阳 性 率 (%) P 值 + 阳 性 率 (%) P 值 + 阳 性 率 (%) P 值 PTCL 84 62 73.81 0.000 35 41.67 0.423 31 36.90 0.176 PTCL NOS 34 27 79.41 0.000 17 50.00 0.178 13 38.24 0.199 AITL 21 15 71.43 0.000 10 47.62 0.304 7 33.33 0.431 ENKTL 22 14 63.64 0.000 5 22.73 0.404 6 27.27 0.746 ALCL 7 6 85.71 0.001 3 42.86 0.678 5 71.43 0.025 RLH 30 4 13.33 10 33.33 7 23.33 理 因 素 间 的 关 系 Syk 表 达 与 临 床 分 期 血 清 乳 酸 脱 氢 酶 (lacticdehydrogenase,ldh) 水 平 有 关 (P< 0 05), 与 患 者 性 别 年 龄 肿 块 大 小 B 症 状 一 般 状 况 (performancestatus,ps) 评 分 国 际 预 后 指 数 (in ternationalprognosticindex,ipi) 评 分 无 关 (P > 0 05);PI3K 和 Akt 表 达 与 临 床 病 理 因 素 均 无 关 (P >0 05), 见 表 2 PTCL 中 的 表 达 未 见 相 关 关 系 (r=0 154,P > 0 05), 见 表 5 表 3 PTCL 中 Syk 和 PI3K 蛋 白 表 达 之 间 的 关 系 Syk n PI3K - + - 22 17 5 + 62 32 30 表 2 PTCL 中 Syk PI3K Akt 的 表 达 与 临 床 病 理 因 素 之 间 的 关 系 项 目 性 别 n Syk - + P 值 PI3K - + P 值 Akt - + P 值 男 63 18 45 0.390 38 25 0.523 40 23 0.896 女 21 4 17 11 10 13 8 年 龄 ( 岁 ) <52 40 11 29 0.795 25 15 0.460 22 18 0.143 52 44 11 33 24 20 31 13 肿 块 大 小 (cm) <7 81 21 60 1.000 46 35 0.371 52 29 0.632 7 3 1 2 3 0 1 2 B 症 状 无 11 2 9 0.994 5 6 0.596 7 4 1.000 有 46 11 35 25 21 29 17 AnnArbor 分 期 Ⅰ ~Ⅱ 10 5 5 0.019 7 3 0.194 7 3 1.000 Ⅲ ~Ⅳ 37 4 33 15 22 25 12 LDH(U/L) <250 11 5 6 0.018 4 7 0.976 4 7 0.052 250 35 3 32 15 20 26 9 PS 评 分 0~1 30 7 23 0.380 13 17 0.679 17 13 0.121 2 14 1 13 7 7 12 2 IPI 指 数 0~1 12 2 10 1.000 6 6 0.488 6 6 0.274 2~5 25 5 20 9 16 18 7 有 部 分 相 关 资 料 缺 失 2.3 PTCL 中 Syk 蛋 白 的 表 达 与 PI3K Akt 蛋 白 表 达 的 相 关 性 Pearson 检 验 结 果 显 示,Syk PI3K 在 PTCL 中 的 表 达 有 相 关 关 系 (r=0 229,P< 0 05), 见 表 3;Syk Akt 在 PTCL 中 的 表 达 未 见 相 关 关 系 (r=-0 049,P>0 05), 见 表 4;PI3K Akt 在 Syk 表 4 PTCL 中 Syk 和 Akt 蛋 白 表 达 之 间 的 关 系 n - Akt - 22 13 9 + 62 40 22 PI3K 表 5 PTCL 中 PI3K 和 Akt 蛋 白 表 达 之 间 的 关 系 n - Akt - 49 34 15 + 35 19 16 3 讨 论 PTCL 是 我 国 常 见 的 淋 巴 瘤 类 型 之 一, 恶 性 程 度 高, 治 疗 效 果 不 理 想, 预 后 较 差, 其 发 生 发 展 是 一 个 涉 及 多 基 因 和 多 步 骤 的 复 杂 过 程, 其 中 癌 基 因 的 激 活 和 ( 或 ) 抑 癌 基 因 的 失 活 起 着 关 键 作 用 Syk 最 早 由 日 本 学 者 [10] 1991 年 从 猪 脾 cdna 中 克 隆 出 来 的, 该 基 因 位 于 人 类 染 色 体 9q22, 分 子 量 为 72 10 3, 由 629 个 氨 基 酸 组 成, 含 1 个 内 含 子 和 2 个 外 显 子, 与 猪 Syk 基 因 具 有 最 大 的 同 源 性,93% 的 氨 基 酸 序 列 相 同 Syk 基 因 在 正 常 的 乳 腺 上 皮 细 胞 消 化 道 上 皮 细 胞 肝 细 胞 等 部 位 广 泛 表 达 近 年 来 一 些 研 [2-4] 究 表 明,Syk 是 控 制 多 种 细 胞 生 理 功 能 的 关 键 分 子, 与 肿 瘤 的 生 长 转 移 复 发 等 有 关, 在 人 类 肿 瘤 的 发 病 机 制 和 治 疗 等 方 面 的 研 究 中 起 着 重 要 的 作 用 2000 年 Coopmanetal [2] 首 次 研 究 发 现, 在 侵 袭 性 的 乳 腺 癌 细 胞 中 Syk 是 低 表 达 或 不 表 达 的, 在 正 + +

1144 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 常 乳 腺 组 织 和 非 侵 袭 性 的 乳 腺 癌 组 织 中 是 高 表 达 的, 其 表 达 的 缺 失 与 乳 腺 癌 细 胞 的 侵 袭 性 呈 负 相 关 [2-4] 后 来 的 一 些 研 究 也 显 示 Syk 在 乳 腺 癌 胃 癌 胰 腺 癌 等 的 表 达 是 降 低 或 缺 失,Syk 在 上 皮 性 肿 瘤 中 [11] 可 能 起 抑 癌 基 因 的 作 用 研 究 显 示 Syk 在 B 细 胞 淋 巴 瘤 中 高 表 达, 通 过 选 择 性 的 抑 制 阻 断 Syk 的 表 达, 可 以 抑 制 小 鼠 和 人 B 细 胞 淋 巴 瘤 的 生 长 Chenetal [12] 研 究 发 现,Syk 抑 制 剂 R406 可 以 抑 制 B 细 胞 淋 巴 瘤 细 胞 株 中 肿 瘤 细 胞 的 增 殖 和 凋 亡 Fruchonetal [13] 实 验 得 出 在 滤 泡 性 淋 巴 瘤 中 基 质 金 属 蛋 白 酶 9(matrixmetaloproteinase 9,MMP 9) 和 血 管 内 皮 生 长 因 子 (vascularendothelialgrowthfac tor,vegf) 为 高 表 达,Syk 可 以 通 过 PI3K 的 介 导 参 与 MMP 9 和 VEGF 的 表 达, 应 用 Syk 抑 制 剂 R788 (fostamatinib) 可 以 抑 制 MMP 9 表 达 抗 血 管 的 生 成, 从 而 对 抗 肿 瘤 的 侵 袭 口 服 Syk 抑 制 剂 已 经 投 入 了 治 疗 B 细 胞 淋 巴 瘤 Ⅰ /Ⅱ 期 临 床 实 验, 治 疗 效 果 显 著 [14] 目 前 关 于 Syk 在 PTCL 中 表 达 的 研 究 较 少 ; Syk PI3K 及 Akt 在 PTCL 中 的 表 达 及 与 临 床 病 理 因 素 的 关 系, 国 内 外 未 见 报 道 Feldmanetal [8] 应 用 免 疫 组 化 Westernblot 和 流 式 细 胞 术 方 法 发 现 Syk 在 PTCL 中 呈 高 表 达, 阳 性 率 为 93%(133/144), 后 应 用 流 式 细 胞 仪 检 测 部 分 PTCL 病 例 发 现 Syk 表 达 在 肿 瘤 细 胞 和 反 应 性 增 生 的 B 细 胞 中, 在 外 周 血 淋 巴 结 和 脾 反 应 性 增 生 的 T 细 胞 中 不 表 达 这 与 上 述 上 皮 性 肿 瘤 中 的 抑 癌 作 用 相 反 本 研 究 采 用 免 疫 组 织 化 学 方 法 检 测 Syk PI3K Akt 在 PTCL 组 织 中 的 表 达, 本 实 验 数 据 显 示 Syk 在 84 例 PTCL 组 中 阳 性 表 达 显 著 高 于 对 照 组, 提 示 Syk 在 PTCL 的 发 生 发 展 中 可 能 起 重 要 作 用, 与 Feldmanetal [8] 报 道 结 果 一 致 Syk 在 PTCL 中 的 表 达 与 临 床 因 素 的 关 系 还 不 清 楚, 本 研 究 结 果 显 示 Syk 的 表 达 与 临 床 分 期 及 LDH 水 平 有 关, 与 患 者 性 别 年 龄 肿 块 大 小 B 症 状 PS 评 分 IPI 指 数 无 关, 提 示 Syk 可 能 与 PTCL [15] 的 预 后 有 关 近 期 研 究 显 示 抑 制 T 细 胞 淋 巴 瘤 细 胞 株 中 的 Syk 的 表 达 可 以 诱 导 细 胞 的 凋 亡 并 阻 滞 细 胞 的 增 殖, 推 测 可 能 是 通 过 下 游 的 丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 (mitogen activatedproteinkinases,mapk) PI3K 磷 脂 酶 C γ(phospholipasec γ,plc γ) 起 作 用 的 本 研 究 中 PI3K Akt 在 PTCL 和 RLH 中 的 表 达 差 异 均 无 统 计 学 意 义,Syk 与 PI3K 在 PTCL 中 的 表 达 呈 正 相 关, 提 示 Syk 在 PTCL 的 发 生 发 展 中 可 能 与 PI3K 的 表 达 有 关 ;Syk 和 PI3K 在 PTCL 中 的 表 达 与 Akt 均 无 明 显 相 关 性,Syk 在 PTCL 中 的 作 用 机 制 还 需 进 一 步 深 入 研 究 参 考 文 献 [1] TurnerM,MeePJ,CosteloPS,etal.Perinatallethalityand blockedb celdevelopmentinmicelackingthetyrosinekinasesyk [J].Nature,1995,378(6554):298-302. [2] CoopmanPJ,DoM T,BarthM,etal.TheSyktyrosinekinase suppresesmalignantgrowthofhumanbreastcancercels[j].na ture,2000,406(6797):742-7. [3] ZouXP,ZhangB,ZhangXQ,etal.Promoterhypermethylation ofmultiplegenesinearlygastricadenocarcinomaandprecancerous lesions[j].humpathol,2009,40(11):1534-42. [4] LaytonT,StalensC,GundersonF,etal.Syktyrosinekinaseacts asapancreaticadenocarcinomatumorsuppresorbyregulatingcel lulargrowthandinvasion[j].amjpathol,2009,175(6):2625-36. [5] MoonKD,PostCB,DurdenDL,etal.Molecularbasisforadi rectinteractionbetweenthesykprotein tyrosinekinaseandphos phoinositide3 kinase[j].jbiolchem,2005,280(2):1543-51. [6] VivancoI,SawyersCL.Thephosphatidylinositol3 kinase AKT pathwayinhumancancer[j].natrevcancer,2002,2(7): 489-501. [7] SwerdlowSH,CampoE,HarisNL,etal.WHOclasification oftumoursofhaematopoieticandlymphoidtisues[m].lyon: IARCPres,2008:269-319. [8] FeldmanAL,SunDX,LawM E,etal.OverexpresionofSyk tyrosinekinaseinperipheralt cellymphomas[j].leukemia, 2008,22(6):1139-43. [9] 邢 传 平, 刘 斌, 董 亮. 免 疫 组 织 化 学 标 记 结 果 的 判 断 方 法 [J]. 中 华 病 理 学 杂 志,2001,30(4):318. [10] TaniguchiT,KobayashiT,KondoJ,etal.Molecularcloningofa porcinegenesykthatencodesa72 kdaprotein tyrosinekinase showinghighsusceptibilitytoproteolysis[j].jbiolchem,1991, 266(24):15790-6. [11]GururajanM,JenningsCD,BondadaS.Cutingedge:constitu tivebcelreceptorsignalingiscriticalforbasalgrowthofblym phoma[j].jimmunol,2006,176(10):5715-9. [12]ChenL,MontiS,JuszczynskiP,etal.SYK dependenttonicb celreceptorsignalingisarationaltreatmenttargetindifuselarge B cellymphoma[j].blood,2008,111(4):2230-7. [13] FruchonS,KheiralahS,AlSaatiT,etal.Involvementofthe Syk mtorpathwayinfolicularlymphomacelinvasionandangio genesis[j].leukemia,2012,26(4):795-805. [14] FriedbergJW,SharmanJ,SweetenhamJ,etal.InhibitionofSyk withfostamatinibdisodiumhassignificantclinicalactivityinnon Hodgkinlymphomaandchroniclymphocyticleukemia[J].Blood, 2010,115(13):2578-85. [15] WilcoxRA,SunDX,NovakA,etal.InhibitionofSykprotein tyrosinekinaseinducesapoptosisandblocksproliferationint cel non Hodgkin slymphomacellines[j].leukemia,2010,24 (1):229-32.

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1145 慢 性 淋 巴 细 胞 性 甲 状 腺 炎 与 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 临 床 相 关 性 张 懿, 邓 福 生, 刘 政 溶, 韦 后 清, 王 锡 宏, 马 小 鹏, 陈 浩 摘 要 目 的 探 讨 慢 性 淋 巴 细 胞 性 甲 状 腺 炎 (CLT) 与 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 之 间 的 临 床 相 关 性 方 法 回 顾 性 分 析 647 例 进 行 手 术 的 甲 状 腺 患 者, 研 究 CLT 与 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 关 系, 分 析 44 例 合 并 有 CLT 的 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 患 者 的 临 床 资 料 结 果 CLT 患 者 中 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 发 病 率 为 40.7%, 非 CLT 患 者 中 发 病 率 为 18 7%, 两 者 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 中 CLT 和 非 CLT 患 者 TNM 分 期 无 明 显 差 异 结 论 CLT 合 并 甲 状 腺 癌 的 比 例 较 高, 当 B 超 提 示 甲 状 腺 肿 块 有 微 小 钙 化 边 界 不 清 或 颈 部 淋 巴 结 肿 大 时, 应 积 极 诊 治 并 谨 慎 评 估 恶 性 的 可 能 性 CLT 对 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 分 期 无 影 响 关 键 词 甲 状 腺 炎 ; 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 ; 相 关 性 2014-04-18 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 卫 生 厅 科 研 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 :13ZC007) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 附 属 省 立 医 院 普 通 外 科, 合 肥 230001 作 者 简 介 : 张 懿, 男, 硕 士 研 究 生, 主 治 医 师 ; 邓 福 生, 男, 主 任 医 师, 责 任 作 者,E mail:dengfusheng2010 @163.com 中 图 分 类 号 R581.4;R736.1 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1145-03 慢 性 淋 巴 细 胞 性 甲 状 腺 炎 (chroniclymphocytic thyroiditis,clt) 是 一 种 甲 状 腺 自 身 免 疫 性 疾 病, 近 年 来 发 病 率 明 显 增 高, 且 临 床 上 许 多 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 常 合 并 CLT Pearceetal [1] 发 现 CLT 与 许 多 甲 状 腺 其 他 自 身 免 疫 性 疾 病 以 及 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 共 存, CLT 可 增 加 原 发 性 甲 状 腺 淋 巴 瘤 的 发 病 概 率 [2], CLT 是 否 有 转 化 为 其 他 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 倾 向 目 前 尚 有 争 议 该 研 究 将 调 查 CLT 和 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 之 间 的 关 系, 并 评 估 CLT 对 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 影 响 1 材 料 与 方 法 1.1 病 例 资 料 回 顾 性 分 析 2012 年 在 安 徽 医 科 大 学 附 属 省 立 医 院 甲 乳 外 科 进 行 手 术 的 647 例 甲 状 腺 ExpresionandrelationshipofSyk,PI3K andakt inperipheralt cellymphoma DaiQun 1,2,ZhanHeqin 1,2,CaoLiyu 1,2,etal ( 1 DeptofPathology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230032; 2 DeptofPathology,TheFirst AfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022) Abstract Objective Toinvestigatetheexpresionofspleentyrosinekinase(Syk),phosphatidylinositol3 kinase (PI3K)andproteinkinaseB(Akt)inpatientswithperipheralT cellymphoma(ptcl)andtheirclinicalsignifi cance.methods ImmunohistochemicalstainingforSyk,PI3KandAktproteinwasusedin84PTCLand30reac tivelymphoidhyperplasia(rlh).results ThepositiveratesofSyk,PI3KandAktwere73 81%,41 67%, 36 90% in84ptcl,and13 33%,33 33%,2 33% in30rlh.theexpresionofsykproteininptclwas significantlyhigherthanthatinrlh(p<0 05).TheexpresionofPI3KandAkthadnosignificantdiferencein PTCLandRLH (P>0 05).Sykexpresionwascorelatedwithserum lacticdehydrogenaselevel(ldh)and clinicstage.pi3kandaktexpresionshowednosignificantcorelationwithsex,age,bulkydisease,bsymptom, performancestatus(ps)score,clinicstage,serum LDH level,andinternationalprognosticindex(ipi)score. SykproteinwaspositivelycorelatedwiththeexpresionofPI3KproteininPTCL.Conclusion TheSykprotein playsanimportantroleinthecarcinogenesisofptcl.itmaybeasociatedwithpi3ksignalingpathway,butnot directlyrelatedtotheexpresionofakt. Keywords peripheralt cellymphoma;syk;pi3k;akt;immunohistochemistry

1146 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 患 者, 探 讨 108 例 CLT 患 者 与 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 关 系, 其 中 44 例 合 并 有 CLT 的 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 被 纳 入 研 究 依 据 年 龄 性 别 抗 甲 状 腺 抗 体 抗 甲 状 腺 球 蛋 白 抗 体 术 前 甲 状 腺 B 超 检 查 手 术 方 式, 对 患 者 进 行 评 价 CLT 诊 断 须 符 合 严 格 的 形 态 学 标 准, 如 弥 漫 性 淋 巴 细 胞 浸 润 多 发 淋 巴 滤 泡 小 叶 状 增 生 小 叶 间 纤 维 化 及 嗜 酸 细 胞 化 生 排 除 伴 局 灶 淋 巴 细 胞 浸 润 的 甲 状 腺 炎 患 者 1.2 统 计 学 处 理 使 用 SPSS11 5 统 计 软 件 进 行 分 析, 计 量 数 据 的 统 计 学 分 析 使 用 t 检 验, 计 数 数 据 使 用 χ 2 检 验 2 结 果 2.1 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 在 组 间 的 分 布 及 一 般 特 点 647 例 甲 状 腺 患 者 中, 女 509 例, 男 138 例, 女 / 男 比 例 为 3 70 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 患 者 共 144 例, 年 龄 20 ~82(46 9±13 9) 岁, 女 / 男 比 例 为 2 82 108 例 被 诊 断 为 CLT, 女 101 例, 男 7 例, 女 / 男 比 例 为 14 43 44 例 同 时 患 有 CLT 和 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤, 女 41 例, 男 3 例, 年 龄 15~71(43 3±13 2) 岁 44 例 当 中 乳 头 状 癌 41 例 (93 2%), 髓 样 癌 2 例 (4 4%), 淋 巴 瘤 1 例 (2 3%) 2.2 CLT 和 非 CLT 患 者 中 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 发 病 率 CLT 患 者 中 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 发 病 率 为 40 7%, 而 非 CLT 患 者 中 发 病 率 为 18 6%, 差 异 有 统 计 学 意 义 (χ 2 =25 599,P=0 000) 见 表 1 表 1 CLT 及 非 CLT 患 者 中 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 百 分 比 [n(%)] 项 目 甲 状 腺 恶 性 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 (+) 肿 瘤 (-) 合 计 CLT(+) 44(40.7) 64(59.3) 108(16.9) CLT(-) 100(18.6) 439(81.4) 539(83.1) 合 计 144(22.4) 503(77.6) 647(100.0) 2.3 CLT 和 非 CLT 患 者 中 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 TNM 分 期 在 CLT(+) 和 CLT(-) 的 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 中, 主 要 为 Ⅰ 期 和 Ⅱ 期 患 者, 肿 瘤 分 期 差 异 无 统 计 学 意 义 (χ 2 =0 365,P>0 05), 见 表 2 2.4 44 例 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 合 并 CLT 患 者 的 辅 助 检 查 结 果 及 手 术 方 式 37 例 患 者 行 血 清 学 检 查, 其 中 甲 状 腺 过 氧 化 酶 抗 体 升 高 23 例 (62 2%), 甲 状 腺 球 蛋 白 抗 体 升 高 32 例 (86 5%) 44 例 患 者 术 前 超 声 检 查 均 发 现 结 节 样 增 生, 单 发 结 节 15 例 (34 1%), 多 发 结 节 29 例 (65 9%),25 例 伴 有 点 状 钙 化 (56 8%),18 例 边 界 欠 清 不 规 则 (40 9%),23 表 2 甲 状 腺 CLT(+) 和 CLT(-) 的 恶 性 肿 瘤 的 TNM 分 期 [n(%)] 甲 状 腺 恶 性 甲 状 腺 恶 性 TNM 分 期 肿 瘤 (+)CLT(44) 肿 瘤 (-)CLT(100) Ⅰ 期 26(31.3) 57(68.7) P 值 Ⅱ 期 11(32.4) 23(67.6) 0.947 Ⅲ 期 4(26.7) 11(73.3) ⅣA 期 3(25.0) 9(75.0) 例 伴 颈 部 淋 巴 结 肿 大 (52 3%) 44 例 同 时 患 CLT 的 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 患 者 中, 行 单 侧 腺 叶 切 除 及 中 央 区 淋 巴 结 清 扫 13 例, 单 侧 腺 叶 对 侧 腺 叶 次 全 切 除 中 央 区 淋 巴 结 清 扫 10 例, 双 侧 全 切 及 中 央 区 淋 巴 结 清 扫 4 例, 单 侧 腺 叶 切 除 及 单 侧 颈 部 淋 巴 结 清 扫 3 例, 单 侧 腺 叶 对 侧 次 全 切 除 单 侧 颈 部 淋 巴 结 清 扫 6 例, 双 侧 腺 叶 切 除 及 单 侧 颈 部 淋 巴 结 清 扫 4 例, 双 侧 全 切 及 双 侧 颈 部 淋 巴 结 清 扫 4 例 术 后 8 例 接 受 碘 131 治 疗, 所 有 患 者 术 后 口 服 左 旋 甲 状 腺 素 钠 片 行 内 分 泌 治 疗, 并 定 期 复 查 随 访 10~22 个 月, 平 均 15 个 月, 无 复 发 及 死 亡 病 例 3 讨 论 CLT 和 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 关 系 在 1955 年 由 Daileyetal [3] [4] 首 次 提 出, 不 同 研 究 表 明,CLT 患 者 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 发 病 率 为 0 5% ~23.0%,Pezola etal [5] 报 道 CLT 患 者 中 甲 状 腺 癌 患 病 率 明 显 高 于 无 合 并 甲 状 腺 炎 患 者 Repplingeretal [6] 发 现 CLT 患 者 中 甲 状 腺 乳 头 状 癌 患 病 率 显 著 升 高 本 研 究 显 示 CLT 患 者 中 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 发 病 率 为 40 7%, 而 非 CLT 患 者 中 发 病 率 为 18 6%, 差 异 有 统 计 学 意 义 这 提 示 当 有 甲 状 腺 结 节 怀 疑 合 并 CLT 时, 合 并 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 可 能 性 明 显 增 加 至 于 甲 状 腺 炎 是 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 原 因 或 是 结 果 目 前 尚 不 明 确, 可 能 原 因 为 CLT 通 过 慢 性 淋 巴 细 胞 浸 润 和 甲 状 腺 激 素 刺 激, 致 使 细 胞 坏 死 有 丝 分 裂 加 强 和 滤 泡 上 皮 增 生, 或 伴 有 自 身 抗 肿 瘤 免 疫 监 督 机 制 紊 乱, 致 使 向 恶 [7] 性 肿 瘤 转 化 而 有 报 道 认 为 CLT 不 是 一 种 癌 前 病 变, 淋 巴 细 胞 浸 润 是 一 种 良 好 征 象, 是 针 对 甲 状 腺 肿 瘤 启 动 的 自 身 免 疫 机 制 而 本 组 中 CLT 患 者 甲 [4] 状 腺 恶 性 肿 瘤 发 病 率 为 40 7%, 高 于 文 献 报 道, 其 原 因 可 能 为 我 科 手 术 指 征 把 握 较 严 格, 主 要 是 术 前 有 甲 状 腺 结 节 并 怀 疑 为 恶 性 患 者 在 乳 腺 和 肾 脏 恶 性 肿 瘤 中, 淋 巴 细 胞 浸 润 被 认 为 肿 瘤 具 有 更 大 的 侵 袭 性 的 标 志, 但 在 肝 癌 和 恶 性 黑 色 素 瘤 中, 伴 淋 巴 细 胞 浸 润 却 被 认 为 具 有 较 为 良 好 的 预 后 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤, 特 别 是 甲 状 腺 乳 头 状

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1147 癌, 经 常 会 伴 有 淋 巴 细 胞 浸 润 Jeongetal [8] 发 现 淋 巴 细 胞 浸 润 不 是 一 个 影 响 预 后 的 独 立 因 素, 并 不 能 降 低 肿 瘤 复 发 和 远 处 转 移 的 机 率 本 研 究 结 果 显 示 CLT(+) 和 CLT(-) 组 中 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 TNM 分 期 差 异 无 统 计 学 意 义, 提 示 CLT 可 能 对 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 分 期 无 影 响 CLT 对 甲 状 腺 预 后 的 影 响 尚 需 大 样 本 的 前 瞻 性 对 照 研 究 [9] 研 究 表 明 并 发 CLT 的 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 主 要 为 甲 状 腺 乳 头 状 癌 44 例 患 者 中 有 41 例 为 甲 状 腺 乳 头 状 癌,2 例 为 髓 样 癌,1 例 为 淋 巴 瘤 144 例 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 患 者 中, 另 2 例 髓 样 癌 未 合 并 CLT, 共 有 2 例 甲 状 腺 滤 泡 癌 及 3 例 未 分 化 癌 均 不 伴 有 CLT 本 组 研 究 中,CLT 及 CLT 合 并 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 患 者 中 女 性 发 病 率 均 远 高 于 男 性 40~50 岁 患 [10] 者 发 病 率 升 高, 与 文 献 结 果 一 致 B 超 可 探 及 大 于 3mm 的 甲 状 腺 肿 块, 可 判 断 肿 块 是 囊 性 或 实 性, 帮 助 颈 部 淋 巴 结 定 位 及 辅 助 甲 状 腺 穿 刺, 并 广 泛 运 用 于 甲 状 腺 疾 病 随 访 中 当 B 超 表 现 甲 状 腺 肿 块 有 微 小 钙 化 边 界 不 清 或 颈 部 淋 巴 结 肿 大 时, 均 提 示 肿 块 恶 性 可 能 参 考 文 献 [1] PearceEN,FarwelAP,BravermanLE.Thyroiditis[J].NEn gljmed,2003,348(26):2646-55. [2] KatoI,TajimaK,SuchiT,etal.Chronicthyroiditisasariskfac torofb cellymphomainthethyroidgland[j].jpnjcancer Res,1985,76(11):1085-90. [3] DaileyM,LindsayS,SkahenR.Relationofthyroidneoplasmsto Hashi motodiseaseofthethyroidgland[j].ama ArchSurg, 1955,70(2):291-7. [4] Matesa AnicD,MatesaN,DabelicN,etal.Coexistenceofpapil larycarcinomaandhashimoto sthyroiditis[j].actaclincroat, 2009,48(1):9-12. [5] PezolaA,LataruloS,MilelaM,etal.Theasociationbetween diferentiatedthyroidcarcinomaandchroniclymphocyticthyroiditis [J].AmSurg,2012,78(12):1408-11. [6] RepplingerD,BargrenA,ZhangYW,etal.IsHashimoto sthy roiditisariskfactorforpapilarythyroidcancer?[j].jsurgres, 2008,150(1):49-52. [7] ChuiM H,CasolCA,AsaSL,etal.Folicularepithelialdyspla siaofthethyroid:morphologicalandimmunohistochemicalcharac terizationofaputativepreneoplasticlesiontopapilarythyroidcar cinomainchroniclymphocyticthyroiditis[j].virchowsarch, 2013,462(5):557-63. [8] JeongJS,KimHK,LeeCR,etal.Coexistenceofchroniclym phocyticthyroiditiswithpapilarythyroidcarcinoma:clinicalmani festationandprognosticoutcome[j].jkoreanmedsci,2012,27 (8):883-9. [9] JaraSM,CarsonKA,PaiSI,etal.Therelationshipbetweenchro niclymphocyticthyroiditisandcentralnecklymphnodemetastasis innorthamericanpatientswithpapilarythyroidcarcinoma[j]. Surgery,2013,154(6):1272-80. [10]YoonYH,KimHJ,LeeJW,etal.Theclinicopathologicdifer encesinpapilarythyroidcarcinomawithorwithoutco existing chroniclymphocyticthyroiditis[j].eurarchotorhinolaryngol, 2012,269(3):1013-7. ClinicalcorrelationalresearchbetweenCLTand malignanttumoursofthethyroid ZhangYi,DengFusheng,LiuZhengrong,etal (DeptofGeneralSurgery,TheAfiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230001) Abstract Objective TodiscustheclinicalcorelationbetweenCLTandmalignanttumoursofthethyroid. Methods Inthisstudy,patientsoperatedonforthyroiddiseasesinAnhuiProvincialHospitalin2012wereinvesti gatedretrospectively.patientsdiagnosedashavingcltwereinvestigatedforanyconcurentmalignantneoplasm. 44patientsinwhomCLTandthyroidmalignancywerecoexistingwererecruitedinthestudy.Results Inourstud y,therateofmalignancyagainstthebackgroundofcltwas40.7%,whiletherateinthegroupswithoutcltwas 18.7%,withastatisticalysignificantdiferencebetweenthegroups(P<0 05).Therewasnostatisticaldiference intnm clasificationbetweenthegroupswithandwithoutclt.conclusion Therateofthroiditiscoexistentwith thyroidcarcinomaishigher.thepatientswithmicrocalcifications,irgularborderorcervicallymphadenectasisin preoperativesonogramshouldbeevaluatedmorecarefulyintermsofmalignancy.clthasnoefectonclinicaltnm clasificationofmalignanttumoursofthyroid. Keywords thyroiditis;malignantneoplasmofthyroidgland;corelation

１１４８ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ 经验与体会 琼脂石蜡双包埋法在小血管光镜制片中的优势 宾业健１ 黄华冰１ 洪燕语１ 伍 源２ 程盼盼１ 卢明科３ 齐忠权１ 摘要 预先将固定好的小血管包埋到 １ ５ 琼脂中 调整好 见图 ２ 其位置和管腔 采用自制的琼脂包埋模子可以方便快捷的 获得结构完整大小适中的组织琼脂块 再按照常规的的脱 水包埋程序做石蜡包埋 最后切片染色 结果显示 琼脂石 蜡双包埋法保持了小血管管腔的完整性和规则性 内膜等组 织结构几乎没有损坏和丢失 最终得到较为理想的光镜切 片 关键词 小血管 琼脂 石蜡 双包埋法 光镜切片 中图分类号 Ｒ３ ３ １ 图 １ 包埋用小血管 文献标志码 Ａ 文章编号 １ １ ４ ９ ２ ２ １ ４ ８ １ １ ４ ８ ３ Ａ 小动脉直径约 １ｍｍ Ｂ 长度约 １ ３ｃ ｍ 小血管因其体积微小 组织薄弱 按照常规的石 蜡包埋方法 在脱水透明浸蜡等过程中 由于器械夹 持 加热等因素 很容易塌陷变形甚至损坏 最终得 不到管腔较为规则和完整的血管光镜切片 为了解 决这一困难 该研究采用琼脂预先包埋小血管再进 行常规石蜡包埋制作光镜切片的方法和效果 １ ２ 并与单纯石蜡包埋法得到的结果进行了比较 现报 道如下 图 ２ 小血管预处理 １ 材料与方法 Ａ 将小动脉均分成两段 Ｂ 预先用伊红染色便于观察 １ １ 材料与试剂 以 ４ 多聚甲醛固定好的昆明 ３ 鼠胸主动脉为例 其血管管径约 １ｍｍ 长度约 １ ｃ ｍ 见图 １ 普通琼脂粉 规格为 １ｍｌ的一次性普 通医用注射器 眼科剪 眼科镊 大头针 常规脱水包 埋及 ＨＥ染色所用试剂等 １ ２ ２ 琼脂预包埋 准备１ｍｌ 注射器 切去注射器 乳头靠后部分 将普通琼脂粉预先配成 １ ５ 琼脂 粉悬浊液 再放入微波炉中低火加热至 ５ 左右成 液体状态 再将处理过的注射器活塞往外拉出 １ ５ ２ ｍｌ距离作为模子 用移液枪将熔化的琼脂液 １ ２ 操作步骤 １ ２ １ 小血管预处理 将固定好的小血管分割成 ５ １ ｃ ｍ若干段 或根据需要选 择 包 埋 长 度 为了便于观察血管的位置 预先用伊红将血管染红 加入注射器前端空缺处 并迅速将小血管段放入琼 脂中 用缝衣针或大头针调整血管在琼脂中的位置 尽量使血管段居中 并用针尖小心探入血管管腔内 将其塌陷的部分挑起来使管腔成为规则的圆形腔 待琼脂冷却凝固后 将注射器活塞往前推出获得琼 ２１ ４ ３ ２ 接收 基金项目 国家重点基础研究发展规划项目资助 ９ ７３计划项目 编 １ ２ ３ 脱水再包埋 包含有血管段的琼脂柱作为 ２ １ ２ＣＢＡ１ ３ ３ 号 １ 脂柱 见图 ３ ３ 作者单位 厦 门 大 学 器 官 移 植 研 究 所 生 命 科 学 学 院 厦 门 ３ ６ １１ ２ 一个整体再按照常规的脱水包埋程序做石蜡包埋 最后一步石蜡包埋时将琼脂柱竖立放于石蜡包埋模 ２ 厦门大学附属中山医院心外科 厦门 ３６ １ １ ４ 作者简介 宾业健 男 本科 齐忠权 男 博士后 教授 博士生导师 责任作者 Ｅ ｍａ ｌ ｚ ｑｑ ｘ ｍｕ ｄ ｕ ｃ ｎ 子中 并在其周围充满熔化的石蜡 便于后期切片 １ ２ ４ 切片和染色 包埋完毕后切片 石蜡切片厚 度为 ３μｍ 染色采用常规 ＨＥ染色 ３ ４

安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １１４９ ３ 讨论 研究 ５ ７ 表明琼脂石蜡双埋法在制作一些精细 组织的光镜切片上有着很大优势 该研究应用在小 血管的包埋和制片上也证实了这一点 采用琼脂石 蜡双包埋法可保持小血管的管腔完整性和规则性 小血管内膜等组织结构保存较完好 几乎没有损坏 和丢失 切片得到较为理想的结果 然而采用单纯 石蜡包埋法包埋的小血管 在脱水包埋等操作过程 中 血管的管壁容易贴在一起 且容易变形甚至破 裂 最终得不到令人满意的光镜切片 琼脂块脱水浸蜡加热之后体积会固缩一半以 上 然而为了保证脱水完全 琼脂包埋块又不能过 大 本实验证明课题组自制的 １ｍｌ注射器琼脂包埋 模子较为适合管径为 １ ３ｍｍ的小血管包埋所用 体积大小适中 且可以极为方便的将包埋琼脂块从 模子中取出 避免了用器械从其他类型的琼脂包埋 模子中取出琼脂块时 容易将已经包好组织的琼脂 块夹烂碰损的情况发生 图 ３ 琼脂包埋步骤 Ａ 自制琼脂包埋模子 Ｂ 血管包埋入琼脂中 调整好血管在琼 脂块中的位置和管腔形状 Ｃ 将琼脂块从模子中推出 Ｄ 得到琼脂 组织块 包埋所用琼脂浓度不宜过高也不宜过低 高浓 度琼脂 ３ 以上 使用相同剂量的脱水剂不能完 全脱水 最终琼脂和石蜡不能很好的融合在一起 无 法正常切片 推测原因可能是琼脂液密度过高导致 ２ 结果 琼脂块内部分子间隙过窄 脱水剂等不易浸入其内 琼脂石蜡双包埋法包埋的小血管组织块切片染 部 经过浓度梯度对照试验表明质量分数为 １ ５ 色后 可观察到管腔完整和规则的血管横断面 血管 琼脂用于包埋较为合适 琼脂浓度过低则不能很好 内膜等组织结构保存较完好 几乎没有损坏和丢失 的凝固 而且脱水之后严重固缩亦不能获得良好的 见图 ４Ａ 而单纯石蜡包埋法包埋的小血管组织块 效果 切片染色后 可观察到血管管壁打折和贴附在一起 变形甚至破裂的现象 见图 ４Ｂ Ｃ 用琼脂预包埋小血管最大的优势是在琼脂包埋 血管时可以调整和恢复在取用或固定等操作时发生 塌陷变形的血管原有的圆形管腔 且在整个脱水包 埋过程中都起到一个很好的支撑和保护作用 使血 管在其中不易被器械夹损 也不容易因加热等因素 而变形和损坏 更为重要的一点是切片时遗留的琼 脂具有黏附作用 染色洗片时不易掉片 琼脂石蜡双包埋法还可适用于组织工程血管的 包埋 因为血管脱细胞后失去弹性支撑会变得更加 图 ４ 琼脂石 蜡双 包埋法 与常规 柔软 管腔更容易塌陷 本课题组用该方法包埋组 石蜡包埋法得到的血管切片对比 织工程血管亦获得良好的效果 ＨＥ ４ Ａ 双 包 埋 法 得 到 的 血 管 切 片 Ｂ Ｃ 单纯石蜡包埋得到的血 管切片 琼脂石蜡双包埋法弥补了单纯石蜡包埋小血管 时易损坏血管以致难以获得管腔完整和规则的血管 光镜切片的不足 在小血管的光镜制片上具有明显的 优势 该方法操作简便快捷 使用材料价格低廉 对 条件一般的实验室开展动物实验有一定的实用价值

1150 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 应 用 E&Q 热 牙 胶 连 续 波 一 次 性 充 填 感 染 根 管 的 疗 效 分 析 律 娜, 孙 明, 韩 晓 兰 摘 要 选 取 临 床 诊 断 为 牙 髓 坏 死 急 性 或 慢 性 根 尖 周 炎 的 单 根 管 患 牙 105 颗 作 为 研 究 对 象 一 次 组 51 颗, 应 用 E&Q 热 牙 胶 连 续 波 一 次 性 充 填 二 次 组 54 颗, 两 次 疗 程 间 使 用 氢 氧 化 钙 封 药 7d, 常 规 冷 侧 压 法 行 根 管 充 填 术 后 6 个 月 1 年 一 次 组 的 治 愈 率 为 66 67% 94 12%, 二 次 组 分 别 为 59 26% 77 78%, 两 组 患 牙 在 术 后 6 个 月 治 愈 率 差 异 无 统 计 学 意 义, 术 后 1 年 治 愈 率 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 在 感 染 根 管 中 应 用 E&Q 热 牙 胶 连 续 波 一 次 性 充 填 的 远 期 治 愈 效 果 较 好, 具 有 一 定 的 临 床 可 行 性 关 键 词 热 牙 胶 ; 一 次 性 根 管 充 填 ; 感 染 根 管 ; 疼 痛 2014-04-02 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 院 内 青 年 基 金 ( 编 号 : 2010KJ20) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 口 腔 科, 合 肥 230022 作 者 简 介 : 律 娜, 女, 主 治 医 师 ; 韩 晓 兰, 女, 副 教 授, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:656443500@qq.com 中 图 分 类 号 R781.05 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1150-04 根 管 治 疗 术 通 常 包 括 根 管 预 备 根 管 消 毒 和 根 管 充 填 3 个 步 骤 将 以 上 3 个 步 骤 在 一 次 诊 疗 内 完 成, 称 为 一 次 性 根 管 治 疗 术 其 优 点 包 括 : 减 少 患 者 就 诊 次 数, 缩 短 治 疗 过 程, 减 少 治 疗 过 程 间 细 菌 感 染 的 机 会, 提 高 患 者 依 从 性 对 于 非 感 染 性 根 管 采 用 一 次 法 治 疗 临 床 异 议 较 少, 但 对 于 感 染 性 根 管 的 临 床 应 用 尚 存 在 争 议 E&Q 根 管 充 填 系 统 是 热 牙 胶 垂 直 加 压 充 填 系 统, 该 系 统 包 含 了 热 牙 胶 连 续 波 充 填 和 热 牙 胶 高 温 注 射 的 功 能, 可 以 准 确 的 控 制 器 械 尖 端 温 度 和 加 热 时 间, 达 到 精 确 三 维 根 管 充 填, 能 够 有 效 消 灭 死 腔, 防 治 感 染 该 研 究 的 目 的 旨 在 感 染 根 管 中 评 价 E&Q 充 填 系 统 一 次 性 根 管 治 疗 的 临 床 应 用 价 值, 为 新 技 术 的 应 用 提 供 临 床 资 料 和 经 验 参 考 文 献 [1] 曾 晓 蓓, 张 立 新, 甄 亚 平, 等. 制 备 组 织 石 蜡 切 片 琼 脂 预 包 埋 法 的 应 用 性 探 讨 [J]. 实 验 技 术 与 管 理,2008,25(12):52-3, 57. [2] 吴 中 华. 动 物 组 织 石 蜡 切 片 的 琼 脂 预 包 埋 法 [J]. 黄 冈 师 专 学 报,1998,18(4):66-8. [3] 刘 岩, 吴 秉 铨, 钟 镐 镐, 等. 琼 脂 石 蜡 双 包 埋 和 免 疫 细 胞 化 学 染 色 的 细 胞 学 应 用 [J]. 诊 断 病 理 学 杂 志,2013,20(3):184-6. [4] 王 可 耕, 曾 庆 仁, 张 愉 快, 等. 日 本 血 吸 虫 琼 脂 - 石 蜡 双 包 埋 纵 向 切 片 的 制 备 [J]. 中 国 寄 生 虫 学 与 寄 生 虫 病 杂 志,2012,30 (5):415-7. [5] 张 月, 康 健. 琼 脂 石 蜡 双 包 埋 切 片 在 胸 水 细 胞 学 诊 断 中 的 应 用 [J]. 解 剖 科 学 进 展,2008,14(4):395-7. [6] 吴 庚 利, 周 伊, 白 高 玉, 等. 学 生 完 成 石 蜡 切 片 及 HE 染 色 操 作 对 形 态 实 验 教 学 的 作 用 分 析 [J]. 吉 林 医 学,2013,34 (5):999-1000. [7] 蔡 晓 雯, 沈 武 成. 石 蜡 切 片 HE 染 色 的 体 会 [J]. 医 药 论 坛 杂 志,2011,32(1):167-9. Advantagesofdouble embeddingwithagarandparafin inmakinglightmicroscopeslicesofsmalvesels BinYejian,HuangHuabing,HongYanyu,etal (OrganTransplantationInstituteofXiamenUniversity,Xiamen 361102) Abstract Thefixedsmalveselswerepre embeddedinto1 5% agarinadvance,anditspositionandlumenwere adjustedwel.byusingself madeagarembeddingmould,theagarblockincompletestructureandrightsizecould beobtainedconveniently.thenparafinembeddingwasdoneaccordingtotheconventionaldehydrationandembed dingprocedure,andstainingwasthelaststep.theresultsindicatedthat,byusingthedoubleembeddingmethod, theintegrityoflumenwaskept,theintimaandothertisuesofveselwerenotdamagedandlost,theideallightmi croscopeslicesweregotenultimately. Keywords smalvesels;agar;parafin;doubleembeddingmethod;lightmicroscopeslices

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1151 1 材 料 与 方 法 1.1 病 例 选 择 2011 年 1 月 ~2011 年 12 月 在 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 口 腔 科 就 诊 的 患 者 将 明 确 诊 断 的 患 牙 按 照 首 次 就 诊 时 间 分 为 两 组, 将 第 1 2 周 的 病 例 纳 入 一 次 根 管 治 疗 组 ( 简 称 一 次 组 ), 第 3 4 周 的 病 例 纳 入 二 次 根 管 治 疗 组 ( 疗 程 间 使 用 氢 氧 化 钙 封 药 7d, 简 称 二 次 组 ), 依 此 类 推,4 周 1 次 循 环 一 次 组 患 牙 51 颗, 男 20 例, 女 31 例, 年 龄 17 ~67(43 0±11 6) 岁 ; 二 次 组 患 牙 54 颗, 男 22 例, 女 32 例, 年 龄 20~68(44 6±12 2) 岁 患 牙 纳 入 标 准 : 临 床 诊 断 为 牙 髓 坏 死 急 性 或 慢 性 根 尖 周 炎 的 单 根 管 患 牙 排 除 标 准 : 患 者 伴 有 全 身 系 统 性 疾 病, 不 能 长 时 间 耐 受 椅 位 时 间 ; 根 管 内 炎 性 渗 出 物 无 法 有 效 控 制, 急 性 根 尖 周 炎 伴 有 颌 面 部 间 隙 感 染, 根 管 再 治 疗 的 患 牙 术 前 向 患 者 交 待 根 管 治 疗 过 程 及 术 中 术 后 可 能 出 现 的 并 发 症, 取 得 患 者 知 情 同 意 1.2 临 床 检 查 记 录 问 诊 望 诊 探 诊 叩 诊 触 诊 嗅 诊 咬 诊 松 动 度 及 牙 髓 状 态 判 定 结 果 [1] 1.3 疼 痛 评 定 1.3.1 疼 痛 自 评 标 准 患 者 根 据 自 身 疼 痛 感 受 打 分, 在 记 录 卡 上 记 录 疼 痛 情 况 采 用 VAS 疼 痛 标 尺 法 [2], 分 为 以 下 4 类 :0 分 记 为 无 疼 痛 ;1~3 分 记 为 轻 度 疼 痛 ;4~7 分 记 为 中 度 疼 痛 ;8~10 分 记 为 重 度 疼 痛 统 计 分 析 结 果 位 于 2 个 分 值 之 间 的, 记 录 较 高 的 分 值 一 次 组 记 录 术 前 术 后 即 刻 到 术 后 第 7 天 复 诊 时 的 疼 痛 情 况 二 次 组 分 别 记 录 术 前 每 次 治 疗 后 即 刻 至 第 7 天 复 诊 时 的 疼 痛 情 况 1.3.2 临 床 评 定 由 同 一 名 有 临 床 经 验 的 专 业 医 师 对 牙 齿 进 行 检 查, 记 录 患 牙 的 疼 痛 情 况 无 痛 : 临 床 检 查 无 明 显 不 适 (-); 轻 度 疼 痛 : 叩 扪 咬 诊 略 有 不 适 或 疼 痛 (+); 中 度 疼 痛 : 叩 诊 疼 痛, 或 扪 咬 诊 疼 痛 ( ); 重 度 疼 痛 : 叩 诊 疼 痛 ( ), 或 不 能 咬 合 1.4 治 疗 步 骤 通 过 病 史 采 集 以 及 相 关 的 术 前 检 查, 由 患 者 根 据 自 身 感 受 在 疼 痛 记 录 卡 上 记 录 术 前 疼 痛 分 值 术 前 拍 摄 X 线 牙 片, 上 橡 皮 障, 根 尖 定 位 仪 确 定 工 作 长 度, 采 用 ProTaper 机 用 镍 钛 器 械 和 冠 根 向 预 备 技 术 进 行 根 管 预 备 预 备 过 程 中 配 合 使 用 17%EDTA 凝 胶,4% 次 氯 酸 钠 和 3% 过 氧 化 氢 进 行 根 管 交 替 冲 洗 一 次 组 根 管 应 用 E&Q 热 牙 胶 连 续 波 垂 直 加 压 充 填 根 管 二 次 组 在 根 管 预 备 后 使 用 氢 氧 化 钙 封 药 7d, 根 管 充 填 采 用 常 规 冷 侧 压 法, 充 填 材 料 为 AHPlus 根 充 糊 剂 和 牙 胶 尖 术 后 拍 摄 X 线 片, 要 求 充 填 严 致 密 且 为 恰 填 均 由 同 一 名 临 床 医 师 对 所 有 患 者 进 行 根 管 治 疗 1.5 疗 效 评 定 1.5.1 X 线 牙 片 评 定 根 尖 周 指 数 (periapicalindex, PAI) 术 前 和 术 后 6 个 月 1 年 的 X 线 片 经 编 号 后 盲 法 评 片, 均 由 同 一 名 口 腔 放 射 医 师 评 定 将 PAI 按 5 个 等 级 分 类 标 准 记 分 [3] 每 张 X 线 片 均 读 3 次, 取 两 次 相 同 的 结 果 作 为 评 定 结 果 1.5.2 综 合 疗 效 评 估 术 前 术 后 6 个 月 术 后 1 年 采 用 X 线 牙 片 结 合 临 床 检 查 结 果 进 行 综 合 评 估 综 合 疗 效 评 估 分 为 3 级 : 治 愈 有 效 和 失 败 治 愈 : 无 不 适 主 诉,PAI 降 为 1 级 ~2 级 有 效 : 无 不 适 主 诉,PAI 数 值 维 持 不 变 或 下 降 失 败 : 有 不 适 主 诉, 临 床 检 查 窦 道 未 愈 或 复 发, 牙 齿 松 动,PAI 上 升 1.6 统 计 学 处 理 采 用 SPSS19 0 统 计 软 件 进 行 分 析 秩 和 检 验 比 较 两 组 术 前 和 术 后 疼 痛 的 组 间 差 异,χ 2 检 验 比 较 两 组 术 后 6 个 月 1 年 治 愈 率 的 组 间 差 异 2 结 果 2.1 疼 痛 评 估 2.1.1 疼 痛 自 我 评 定 术 前 两 组 患 牙 各 级 疼 痛 的 构 成 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P=0 601), 一 次 组 术 后 第 7 天 分 别 和 二 次 组 第 1 次 第 2 次 术 后 第 7 天 各 级 疼 痛 的 构 成 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P=0 324;P= 0 383) 见 表 1 表 1 两 组 根 管 治 疗 患 者 术 前 和 术 后 自 我 评 定 疼 痛 情 况 [n(%)] 时 间 一 次 组 二 次 组 术 前 术 后 术 前 第 1 次 术 后 第 2 次 术 后 无 痛 18(35.29) 44(86.28) 23(42.59) 40(74.08) 48(88.89) 轻 度 疼 痛 15(29.41) 4(7.84) 12(22.22) 8(14.81) 2(3.70) 中 度 疼 痛 13(25.49) 2(3.92) 15(27.78) 5(9.26) 3(5.56) 重 度 疼 痛 5(9.81) 1(1.96) 4(7.41) 1(1.85) 1(1.85) 2.1.2 疼 痛 临 床 评 定 术 前 两 组 患 牙 各 级 疼 痛 的 构 成 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P=0 947), 一 次 组 术 后 第 7 天 分 别 和 二 次 组 第 1 次 第 2 次 治 疗 术 后 第 7 天 各 级 疼 痛 的 构 成 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P= 0 320,P=0 108) 见 表 2 2.2 综 合 疗 效 评 估 两 组 患 牙 在 术 后 6 个 月 治 愈 率 比 较 差 异 无 统 计 学 意 义 (χ 2 =0 616,P=0 432) 术 后 1 年 的 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 (χ 2 =4 462,P =0 035) 见 表 3 2.3 典 型 病 例 1 患 者, 男,54 岁 主 诉 : 右 下 颌 后 牙 不 适 数 月 余 临 床 检 查 :45 颈 部 充 填 物, 叩 痛

1152 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 2 两 组 根 管 治 疗 患 者 术 前 和 术 后 临 床 评 定 疼 痛 情 况 [n(%)] 疼 痛 级 别 一 次 组 二 次 组 术 前 术 后 术 前 第 1 次 术 后 第 2 次 术 后 无 痛 15(29.41) 42(82.35) 19(35.19) 40(74.08) 50(92.59) 轻 度 疼 痛 19(37.25) 8(15.69) 13(24.07) 13(24.07) 4(7.41) 中 度 疼 痛 10(19.61) 1(1.96) 14(25.93) 1(1.85) 0 重 度 疼 痛 7(13.73) 0 8(14.81) 0 0 表 3 两 组 根 管 治 疗 术 后 6 个 月 1 年 的 疗 效 比 较 [n(%)] 时 间 一 次 组 二 次 组 治 愈 有 效 治 愈 有 效 6 个 月 34(66.67) 17(33.33) 32(59.26) 22(40.74) 1 年 48(94.12) 3(5.88) 42(77.78) 12(22.22) ( ), 松 动 Ⅰ 度,X 线 片 显 示 根 尖 区 阴 影 ( 图 1A) 临 床 诊 断 : 慢 性 根 尖 周 炎 治 疗 方 法 :45 纳 入 一 次 组, 机 用 镍 钛 根 管 预 备,E&Q 热 牙 胶 连 续 波 充 填 ( 图 1B) 术 后 6 个 月 和 1 年 复 查, 疗 效 良 好,X 线 片 显 示 已 治 愈 ( 图 1C D) 2 患 者, 男,17 岁 前 牙 外 伤 两 年 余 术 前 PAI 为 5 级 ( 图 2A), 一 次 性 根 管 充 填 后,X 线 片 结 果 显 示 根 管 糊 剂 超 填 ( 图 2B) 术 后 1 年 间 的 临 床 随 访 显 示, 患 者 无 不 适 主 诉,PAI 由 5 级 变 为 1 级, 疗 效 评 估 为 治 愈 ( 图 2C D) 图 1 病 例 术 前 和 术 后 X 线 片 A:45 术 前 PAI3 级 ;B: 一 次 性 充 填 ;C: 术 后 6 个 月 PAI3 级 ; D: 术 后 1 年 PAI2 级 3 讨 论 感 染 根 管 残 留 的 微 生 物 清 除 不 彻 底 将 对 根 管 治 疗 的 预 后 产 生 显 著 的 影 响, 彻 底 清 除 根 管 系 统 内 的 感 染 物 质, 是 保 证 根 管 治 疗 成 功 的 关 键 所 在 [4-5] 一 次 性 根 管 治 疗 术 用 于 治 疗 非 感 染 根 管 的 少 有 争 议, 但 对 于 感 染 性 根 管 的 治 疗 目 前 仍 存 在 争 议 为 了 保 证 一 次 性 根 管 治 疗 的 疗 效, 本 研 究 在 临 图 2 病 例 术 前 和 术 后 X 线 片 A:11 术 前 PAI5 级 ;B: 一 次 性 充 填 ;C: 术 后 6 个 月 PAI3 级 ;D: 术 后 1 年 PAI1 级 床 上 采 用 规 范 化 的 治 疗 步 骤 加 强 感 染 根 管 的 控 制 : 橡 皮 障 的 使 用, 机 用 镍 钛 冠 根 向 预 备 以 及 EDTA 与 次 氯 酸 钠 联 合 应 用 结 果 表 明 两 种 方 法 在 术 后 各 级 疼 痛 的 比 较 差 异 均 无 统 计 学 意 义 Figinietal [6] 研 究 发 现 一 次 法 术 后 疼 痛 率 为 3% ~40%, 与 多 次 法 [7] 对 比 中 争 论 较 大 为 此 孙 玉 亮 等 将 一 次 法 与 多 次 法 进 行 了 Cochrane 系 统 评 价, 多 次 法 术 后 1 周 出 现 疼 痛 几 率 比 一 次 法 要 低, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 以 上 表 明 在 控 制 感 染 扩 散 的 条 件 下, 对 于 单 根 管 患 牙 采 用 一 次 性 根 管 治 疗 是 可 行 的 但 由 于 二 次 法 需 要 再 次 进 入 根 管, 出 现 二 次 刺 激, 反 而 增 加 了 其 激 惹 疼 痛 的 机 会 根 管 充 填 能 够 严 密 封 闭 根 管 系 统, 消 灭 死 腔, 杜 绝 来 自 冠 方 或 根 尖 的 各 种 微 渗 漏, 促 进 根 尖 周 组 织 的 愈 合 传 统 的 侧 方 加 压 充 填 不 能 严 密 充 填 主 根 管 副 根 管 及 其 峡 部 [8] 本 研 究 追 踪 观 察 了 两 组 术 后 6 个 月 及 1 年 治 愈 情 况, 结 果 显 示 术 后 6 个 月 两 组 治 愈 率 差 异 无 统 计 学 意 义, 而 术 后 1 年 的 两 组 治 愈 率 差 异 有 统 计 学 意 义 考 虑 其 中 的 因 素 可 能 有 : 1 所 有 根 管 预 备 均 采 用 ProTaper 机 用 镍 钛 预 备, 敞 开 根 管 口, 能 够 较 好 清 理 根 管 上 段 以 及 根 尖 部 的 感 染 物, 根 管 成 形 效 果 好, 有 利 于 根 充 的 严 密, 提 高 了 常 规 冷 牙 胶 侧 方 加 压 充 填 的 短 期 临 床 治 愈 率 (6 个 月 内 ) 2 E&Q 热 牙 胶 连 续 波 充 填 能 够 使 根 管 中

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1153 的 根 充 材 料 加 热 软 化, 促 使 其 更 为 致 密 地 充 填 根 管 各 解 剖 区 域, 包 括 充 填 主 根 管 侧 副 根 管 根 管 峡 部 根 尖 分 歧 等 [9], 达 到 根 管 的 三 维 充 填 相 对 于 冷 牙 胶 侧 方 加 压 充 填, 热 牙 胶 连 续 波 充 填 法 在 充 填 单 根 管 前 磨 牙 根 管 的 中 上 部 更 具 优 势 [10] 有 学 者 对 根 管 治 疗 的 患 牙 进 行 1 年 随 访 观 察, 结 果 发 现 病 变 的 根 尖 周 组 织 的 治 愈 率 在 术 后 1 年 达 到 最 高 [11] 本 研 究 显 示 两 组 根 尖 周 病 变 的 治 愈 率 在 根 管 治 疗 1 年 后 才 出 现 较 为 显 著 的 差 异, 提 示 E&Q 连 续 波 热 牙 胶 充 填 系 统 在 根 管 治 疗 的 远 期 疗 效 中 具 有 一 定 的 优 势 根 管 治 疗 失 败 原 因 很 多, 包 括 根 管 超 充, 是 导 致 治 疗 失 败 的 一 个 重 要 原 因 本 研 究 中 发 现 1 例 患 者 术 前 PAI 为 5 级, 一 次 性 根 管 充 填 后,X 线 片 显 示 根 管 超 填 1 年 后 复 查 X 线 片 显 示 PAI 变 为 1 级, 根 尖 部 根 尖 周 投 射 区 消 失, 骨 密 度 增 加, 牙 周 膜 间 隙 均 匀 一 致, 骨 质 结 构 正 常 分 析 其 原 因 可 能 包 括 : 根 充 使 用 E&Q 热 牙 胶 连 续 波 充 填 系 统, 能 够 严 密 的 封 闭 根 管, 杜 绝 了 根 管 内 的 再 感 染 ;AHPlus 树 脂 根 充 糊 剂, 具 有 较 好 流 动 性, 能 够 更 好 的 渗 透 进 牙 本 质 小 管, 增 强 封 闭 性, 从 而 提 高 抑 菌 作 用 提 示 临 床 上 E&Q 热 牙 胶 连 续 波 充 填 系 统 在 根 管 超 填 的 病 例 也 可 能 会 有 较 好 的 远 期 疗 效 参 考 文 献 [1] 樊 明 文, 周 学 东. 牙 体 牙 髓 病 学 [M].4 版. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社,2012:370-3. [2] WilershausenB,WilershausenI,EhlersV,etal.Aprospective clinicaltrialontheinfluenceofatriamcinolone/demeclocycline andacalciumhydroxidebasedtemporarycementonpainpercep tion[j].headfacemed,2012,5(13):8-9. [3] HuumonenS,OrstavikD.Radiographicfolow upofperiapicalsta tusafterendodontictreatmentofteethwithandwithoutapicalperi odontitis[j].clinoralinvestig,2013,17(9):2099-104. [4] VeraJ,SiqueiraJF,RicucciD,etal.One versustwo visitendo dontictreatmentofteethwithapicalperiodontitis:ahistobacterio logicstudy[j].jendod,2012,38(8):1040-52. [5] BacaP,Mendoza LlamasM L,Arias MolizM T,etal.Residual efectivenesoffinalirigationregimensonenteroccusfaecalis in fectedrootcanals[j].jendod,2011,37(8):1121-3. [6] FiginiL,LodiG,GorniF,etal.Singleversusmultiplevisitsfor endodontictreatmentofpermanentteeth:acochranesystematicre view[j].jendod,2008,34(9):1041-7. [7] 孙 玉 亮, 梁 学 萍, 赵 今. 比 较 一 次 法 与 多 次 法 根 管 治 疗 术 治 疗 慢 性 牙 髓 炎 根 尖 周 炎 疗 效 的 系 统 评 价 [J]. 牙 体 牙 髓 牙 周 病 学 杂 志,2011,21(8):452-7. [8] RechenbergDK,De DeusG,ZehnderM.Potentialsystematicer rorinlaboratoryexperimentsonmicrobialleakagethroughfiled rootcanals:reviewofpublishedarticles[j].intendodj,2011,44 (3):183-94. [9]?zcanE,EldenizAU,AnH.Bacterialkilingbyseveralrootfil ingmaterialsandmethodsinanexvivoinfectedrootcanalmodel [J].IntEndodJ,2011,44(12):1102-9. [10] 王 艳 平, 李 颂, 吴 光 远.13~22 岁 单 根 管 前 磨 牙 充 填 效 果 的 比 较 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2011,46(12):1288-91. [11]PatelS,WilsonR,DawoodA,etal.Thedetectionofperiapicalpa thosisusingdigitalperiapicalradiographyandconebeamcomputed tomography part2:a1 yearpost treatmentfolow up[j].int EndodJ,2012,45(8):711-3. Clinicalevaluationofone visitendodontictreatmentwith E&Q continuouswavegutaforinfectedrootcanals LvNa,SunMing,HanXiaolan (DeptofStomatology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022) Abstract 105casesofsinglerootcanalteethwithaclinicaldiagnosisofpulpnecrosis,acuteorchronicperiapical periodontitiswereselected.51caseswereincludedinone visitrootcanaltherapygroupand54casesintwo visit groupusingcalciumhydroxideasaninterappointmentmedicament.aftersixmonthsandoneyear,thecureratesof one visitgroupwere66.67% and94.12%,whilethoseoftwo visitgroupwere59.26% and77.78%,respective ly.therewasnostatisticalsignificancebetweenthegroupsincurerateaftersixmonths,butstatisticalysignificant diferencewasfoundafteroneyear(p<0 05).One visitendodontictreatmentwithe&qcontinuouswavegutafor infectedrootcanalshasthebeterclinicaleficacythantwo visitinlong termhealing. Keywords warmguta;one visitendodonticstreatment;infectedrootcanals;pain

1154 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 经 阴 道 超 声 联 合 宫 腔 声 学 造 影 在 宫 腔 病 变 中 的 诊 断 价 值 吴 静 1,2, 蔡 传 兰 3, 魏 清 4, 周 群 英 5 1, 王 静 摘 要 采 用 阴 道 超 声 (TVS) 联 合 宫 腔 声 学 造 影 (SHG) 检 查 诊 断 出 宫 腔 内 病 变 130 例, 并 以 病 理 检 查 结 果 为 金 标 准 计 算 其 诊 断 敏 感 性 及 准 确 性 TVS 联 合 SHG 诊 断 子 宫 内 膜 增 生 子 宫 内 膜 息 肉 子 宫 黏 膜 下 肌 瘤 子 宫 内 膜 炎 不 全 流 产 的 灵 敏 度 分 别 为 94 1% 72 7% 88 9% 83 3% 81 8%, 准 确 性 分 别 为 76 2% 88 9% 80 0% 87 0% 81 8% 关 键 词 阴 道 超 声 ; 宫 腔 声 学 造 影 ; 病 理 诊 断 中 图 分 类 号 O426.9 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1154-03 目 前 经 阴 道 超 声 (transvaginalsonography,tvs) 检 查 在 临 床 中 已 经 广 泛 应 用, 对 于 可 疑 的 宫 腔 病 变 是 首 选 的 检 查 手 段 宫 腔 病 变 最 常 见 的 表 现 为 子 宫 异 常 出 血 在 这 些 患 者 中, 虽 然 大 部 分 都 是 良 性 病 变, 但 也 有 少 数 患 者 可 能 是 恶 性 疾 病, 因 此 彻 底 的 检 查 以 明 确 诊 断 是 必 要 的, 特 别 是 在 围 绝 经 期 前 后 的 女 性 虽 然 宫 腔 镜 与 病 理 活 检 是 对 可 疑 病 变 确 诊 的 金 标 准, 但 毕 竟 是 侵 入 性 的 创 伤 检 查 [1] [2] 研 究 表 明, 宫 腔 声 学 造 影 (sonohysterography,shg) 是 一 种 成 本 较 低 的 微 创 手 术, 有 类 似 宫 腔 镜 诊 断 的 准 确 性, 并 能 有 效 评 估 功 能 失 调 性 子 宫 出 血 不 孕 症 子 宫 内 膜 病 变 如 息 肉 和 黏 膜 下 肌 瘤 SHG 可 以 成 为 一 个 有 用 的 术 前 评 估 肌 层 浸 润 方 式, 不 影 响 国 际 妇 产 科 协 会 (FederationInternationalofGynecologyandOb stetrics,figo) 制 订 的 肿 瘤 分 期 因 此, 该 研 究 回 顾 性 分 析 130 例 病 例, 评 价 TVS 联 合 SHG 检 查 对 宫 腔 病 变 的 诊 断 价 值 1 材 料 与 方 法 1.1 研 究 对 象 2012 年 1 月 ~2013 年 4 月 在 我 院 2014-04-02 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 教 育 厅 自 然 科 研 重 点 项 目 ( 编 号 :KJ2012A165); 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :1308085MH169) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 公 共 卫 生 学 院 流 行 病 与 卫 生 统 计 学 系, 合 肥 230032 2 六 安 市 金 安 区 妇 幼 保 健 院 超 声 科 3 儿 保 科, 六 安 237001 4 六 安 市 第 二 人 民 医 院 病 理 科 5 妇 产 科, 六 安 237001 作 者 简 介 : 吴 静, 女, 副 主 任 医 师, 硕 士 研 究 生 ; 王 静, 女, 教 授, 博 士, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail: aydgwwangjing@163.com 就 诊,TVS 检 查 怀 疑 有 宫 腔 病 变 者 共 130 例, 年 龄 32~72(46 7±9 2) 岁 因 不 规 则 出 血 拟 诊 宫 腔 内 病 变 的 患 者, 病 理 检 查 诊 断 结 果 包 括 子 宫 内 膜 增 生 子 宫 内 膜 息 肉 子 宫 黏 膜 下 肌 瘤 子 宫 内 膜 炎 退 变 的 绒 毛 及 蜕 膜 组 织 等 SHG 检 查 前 排 除 内 外 生 殖 器 官 炎 症 或 亚 急 性 炎 症, 各 种 疾 病 的 急 性 期 或 严 重 的 全 身 病 变, 不 能 耐 受 手 术, 可 疑 妊 娠 及 滋 养 细 胞 疾 病 等 禁 忌 证 1.2 方 法 1.2.1 TVS 检 查 采 用 德 国 产 西 门 子 G50 彩 色 超 声 诊 断 仪, 使 用 7.5MHz 阴 道 探 头 检 查 时 间 定 为 : 无 症 状 者 于 月 经 干 净 后 3~7d 进 行 TVS 检 查, 有 不 规 则 阴 道 出 血 者 在 出 血 量 明 显 减 少 时 进 行 TVS 检 查, 如 果 出 血 量 持 续 较 多 的 患 者 则 行 经 直 肠 超 声 检 查 经 阴 道 ( 或 经 直 肠 ) 检 查 前 常 规 外 阴 消 毒 后 以 一 次 性 避 孕 套 隔 离 探 头 超 声 下 观 察 子 宫 及 内 膜 的 形 态 厚 度 回 声 强 度 宫 腔 线 回 声 及 子 宫 内 膜 的 血 流 显 示 情 况 有 异 常 病 变 时, 则 记 录 病 变 的 大 小 范 围 位 置 血 流 显 示 情 况, 是 否 有 其 他 合 并 病 变, 并 常 规 观 察 双 侧 附 件 区 1.2.2 SHG 经 TVS 检 查 宫 腔 线 显 示 不 清 晰 或 者 宫 腔 内 有 边 界 清 晰 的 异 常 回 声 者, 于 出 血 量 明 显 减 少 时, 行 SHG 检 查, 采 用 双 腔 囊 管, 注 入 5% 生 理 盐 水 5~10ml, 进 一 步 观 察 内 膜 形 态 前 后 壁 内 膜 的 回 声 宫 腔 内 异 常 回 声 的 部 位 大 小, 有 无 蒂 等 并 记 录 1.2.3 病 理 检 查 对 可 疑 病 变, 在 超 声 引 导 下 取 材 行 病 理 细 胞 学 检 查 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS11 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 对 TVS 联 合 SHG 诊 断 结 果 与 病 理 结 果 进 行 一 致 性 检 验, 计 算 其 诊 断 灵 敏 度 准 确 性 2 结 果 2.1 TVS 联 合 SHG 诊 断 结 果 与 病 理 结 果 对 比 130 例 患 者 行 TVS 检 查, 其 中 23 例 宫 腔 线 显 示 不 清 晰 或 者 宫 腔 内 有 边 界 清 晰 的 异 常 回 声, 进 一 步 行 SHG 检 查 TVS 联 合 SHG 诊 断 结 果 与 病 理 结 果 对 比, 前 者 诊 断 子 宫 内 膜 增 生 子 宫 内 膜 息 肉 子 宫 黏 膜 下 肌 瘤 子 宫 内 膜 炎 不 全 流 产 的 灵 敏 度 分 别 为 94 1% 72 7% 88 9% 83 3% 81 8%, 准 确 性 分

安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １１５５ 表 １ ＴＶＳ联合 ＳＨＧ诊断结果与病理结果对比 ｎ ＴＶＳ联合 Ｓ ＨＧ检查 病理结果 子宫内膜增生 子宫内膜息肉 子宫黏膜下肌瘤 子宫内膜炎 不全流产 其他 合计 子宫内膜增生 ４８ １ １ １ ５ １ 子宫内膜息肉 ２ ８ １ １ １ 子宫黏膜下肌瘤 ８ １ ９ 子宫内膜炎 ３ ２ １ ２ ４ 退变的绒毛及蜕膜组织 ２ ９ １ １ 其他 １ １ １ ３ ２ ４ 合计 ６３ ９ １ ２３ １ １ １ ４ １ ３ 别为 ７６ ２ ８８ ９ ８ ８ ７ ８ １ ８ 见 表 １ ２ ２ 部分典型病例的 ＴＶＳ和 ＳＨＧ 声像图 子宫 内膜炎在 ＴＶＳ下显示 宫腔中上段呈扩张状 范围 约２ ７ｍｍ １ ４ｍｍ 内可见少许密集的点状回声浮 ｏ ｌ ｏ ｒｄｏ ｐｐ ｌ ｒｆ ｌ ｏ ｗ ｍａ 动 彩 色 多 普 勒 血 流 显 像 ｃ ＣＤＦＩ 和脉冲多普勒 ｐ ｕ ｌ ｓ ｄ ｗａ ｖ Ｄｏ ｐ ｐ ｌ ｒ ＰＷ ｇ ｎｇ 显示其内未见明显彩色血流信号 子宫内膜增生在 ＴＶＳ下显示 宫腔线显示清晰 双层内膜厚约 ２ ８ｍｍ 图 ３ 子宫黏膜下肌瘤 内可见蜂窝样的小囊回声 ＣＤＦＩ ＰＷ 显示其内未探 及明显彩色血流信号 子宫黏膜下肌瘤在 Ｓ ＨＧ下显 示 宫腔注入生理盐水后 于后壁内膜扫见一 １ ２ｍｍ ８ｍｍ的中等回声 边界清晰 位置固定 子宫内膜 ＨＧ下显示 宫腔注入生理盐水后 息肉 多发性 在 Ｓ 于子宫内膜前 后壁可清晰显示多个大小不等的中等 回声 边界光滑 内部回声均匀 见图 １ ４ 图 ４ 子宫内膜息肉 多发性 ３ 讨论 ３ １ ＳＨＧ有助于提高宫腔病变的诊断准确率 本 图 １ 子宫内膜炎 文研究结果表明 ＴＶＳ联合 ＳＨＧ检查对宫腔病变的 诊断具有较高的灵敏度和准确性 在 ＴＶＳ和 ＳＨＧ下 的声像 图 显 示 清 晰 这 与 研 究 ３ 结 果 一 致 有 研 究 ４ 结果表明 经 ＴＶＳ评估宫腔病变是一个相当敏 感的方 法 具 有 较 高 的 灵 敏 度 和 准 确 性 Ｒｙ ｕ ５ ａ ｌ 研究发现 Ｓ ＨＧ对子宫内膜病变的评估是比阴 道超声更好的工具 能准确的区分内膜病变是局部 的还是弥漫性的 有利于宫腔镜检查和病理定向活 ２ 检 Ｃｈａ ｎ ｇ ａ ｌ 比较了 ＳＨＧ和 ＭＲＩ在子宫内膜 癌患者肌层浸润程度的诊断价值进行了比较 结果 图 ２ 子宫内膜增生 显示 ＳＨＧ对子宫肌层浸润程度鉴别的敏感度 特

1156 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 异 度 阳 性 预 测 值 阴 性 预 测 值 分 别 为 64 7% 87 7% 61 1% 和 89 3%,MRI 对 子 宫 肌 层 浸 润 程 度 鉴 别 的 敏 感 度 特 异 度 阳 性 预 测 值 阴 性 预 测 值 分 别 为 70 6% 84 2% 57 1% 90 6%, 两 者 诊 断 一 致 性 分 别 为 82 4% 和 81 1% 因 此, 建 议 SHG 应 该 作 为 在 子 宫 异 常 出 血 的 病 例 中 的 一 个 初 步 的 检 查 3.2 TVS SHG 和 病 理 检 查 三 者 联 合 是 宫 腔 病 变 诊 断 的 有 力 依 据 TVS 检 查 是 诊 刮 前 初 筛 的 重 要 手 段, 可 以 选 择 在 子 宫 内 膜 增 生 早 期 检 查, 此 时 内 膜 较 薄 且 呈 低 回 声, 易 与 强 回 声 的 息 肉 辨 别, 有 助 提 高 较 小 内 膜 息 肉 的 检 出 率, 也 有 利 于 避 免 将 内 膜 增 生 误 诊 为 息 肉 [6] 在 实 际 工 作 中, 对 于 高 度 怀 疑 宫 腔 有 病 变 而 普 通 的 TVS 又 不 能 识 别 的 病 例, 可 选 择 SHG 以 进 一 步 了 解 病 变 的 详 细 情 况, 这 是 基 于 生 理 盐 水 注 入 后 宫 腔 的 边 界 与 子 宫 肌 层 之 间 形 成 了 良 好 的 对 比 界 面, 提 高 了 宫 腔 微 小 病 变 的 检 出 率 在 SHG 下, 可 以 更 加 清 晰 的 观 察 到 宫 腔 内 和 宫 颈 管 的 形 态 与 结 构, 了 解 病 变 的 位 置 范 围 和 外 形, 可 以 清 晰 地 观 察 到 病 变 是 单 性 发 还 是 多 性 发, 是 局 部 性 还 是 弥 漫 性 的, 并 可 准 确 定 位 以 帮 助 病 例 取 材 和 活 检, 提 高 诊 断 的 准 确 性 在 子 宫 内 膜 癌 的 患 者 中, 经 TVS 可 见 宫 腔 内 有 增 强 或 减 弱 的 回 声, 官 腔 线 紊 乱, 形 态 不 规 则, 血 管 走 形 紊 乱, 阻 力 指 数 (resistanceindex,ri) 明 显 降 低 子 宫 内 膜 良 性 病 变 和 恶 性 病 变 之 间 的 RI 值 差 异 有 统 计 学 意 义 [7] 超 声 下 诊 断 性 刮 宫 方 法 简 便, 在 一 定 程 度 上 降 低 了 盲 目 刮 宫 的 漏 诊 率, 还 可 起 到 止 血 作 用, 但 对 一 些 微 小 病 变 及 位 于 宫 角 宫 底 处 的 局 限 性 病 灶, 不 能 刮 出 组 织 送 检, 易 引 起 漏 诊 [8] 参 考 文 献 [1] HunterDC,McClureN.Abnormaluterinebleeding:anevalua tionendometrialbiopsy,vaginalultrasoundandoutpatienthyste roscopy[j].ulstermedj,2001,70(1):25-30. [2] ChangSJ,LeeEJ,KimW Y,etal.Valueofsonohysterography inpreoperativeasesmentofmyometrialinvasionforpatientswith endometrialcancer[j].jultrasoundmed,2010,29(6):923-9. [3] AslamM,IjazL,TariqS,etal.Comparisonoftransvaginalsonog raphyandsalinecontrastsonohysterographyinwomenwithabnor maluterinebleeding:corelationwithhysteroscopyandhistopa thology[j].intjhealthsci(qasim),2007,1(1):17-24. [4] 朱 颖, 曹 云 霞. 经 阴 道 超 声 与 宫 腔 镜 检 查 对 不 孕 症 及 复 发 性 流 产 患 者 宫 腔 病 变 的 诊 断 价 值 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报, 2010,45(6):819-21. [5] RyuJA,KimB,LeeJ,etal.Comparisonoftransvaginalultra sonographywithhysterosonographyasascreeningmethodinpa tientswithabnormaluterinebleeding[j].koreanjradiol,2004, 5(1):39-46. [6] 龚 先 莲. 经 过 阴 道 超 声 诊 断 子 宫 内 膜 息 肉 的 82 例 分 析 [J]. 中 国 民 族 民 间 医 药,2012,21(8):68. [7] 洪 琼. 经 阴 道 超 声 检 测 子 宫 内 膜 病 变 的 临 床 价 值 [J]. 中 国 实 用 医 药,2012,7(18):54-5. [8] 张 克 群. 超 声 下 诊 断 性 刮 宫 与 宫 腔 镜 检 查 对 绝 经 后 子 宫 出 血 的 诊 断 价 值 [J]. 中 华 实 用 诊 断 与 治 疗 杂 志,2011,25(5): 488-9. Thediagnosticvalueoftransvaginalsonographywith sonohysterographyinuterinecavitylesions WuJing 1,2,CaiChuanlan 3,WeiQing 4,etal ( 1 DeptofEpidemiologyandHealthStatistics,AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230032; 2 Deptof Ultrasound, 3 DeptofChildHealth,Jin anmaternalandchildhealthcarehospital,lu an 237001; 4 DeptofPathology,TheSecondPeople shospitaloflu an,lu an 237001) Abstract 130casesofsuspecteduterineabnormalitiesunderwenttransvaginalsonography(TVS)andsonohyster ography(shg),andcalculatedsensitivityandaccuracycomparedwithpathologicalresults.comparedwithpatho logicalresults,thesensitivityofintimahyperplasia,intimapolypus,mucousmembranetumor,intimainflammation andplacentaresiduewere94 1%,72 7%,88 9%,83 3%,81 8%,indiagnosinguterinecavitylesionsbyTVS combinedwithshg,respectively Theaccuraterateswere76 2%,88 9%,80 0%,87 0%,81 8%,respec tively. Keywords transvaginalsonography;sonohysterography;pathologicaldiagnosis

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1157 成 年 裸 鼠 和 成 人 体 表 皮 肤 的 比 较 组 织 形 态 学 研 究 王 溯, 陈 晓 蓉 摘 要 取 成 年 裸 鼠 及 成 人 体 表 皮 肤, 用 HE 染 色 Mason Fontana 染 色 及 透 射 电 镜 等 方 法, 观 察 二 者 全 层 皮 肤 组 织 学 结 构 及 黑 色 素 分 布 情 况 提 示 二 者 皮 肤 的 组 织 学 结 构 在 光 镜 水 平 存 在 差 异, 裸 鼠 无 汗 腺, 皮 下 有 横 纹 肌 层 ;Mason Fon tana 染 色 在 裸 鼠 显 示 为 阴 性 结 果 然 而 在 电 镜 水 平 可 以 发 现 裸 鼠 皮 肤 基 底 层 存 在 黑 色 素 细 胞 关 键 词 黑 色 素 细 胞 ; 裸 鼠 ; 皮 肤 ; 比 较 组 织 学 中 图 分 类 号 R329.499 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1157-04 裸 鼠 作 为 一 种 特 殊 的 模 式 动 物 广 泛 用 于 免 疫 肿 瘤 移 植 等 研 究 领 域 裸 鼠 胸 腺 免 疫 缺 陷, 体 表 无 毛, 类 似 人 体 皮 肤 外 观, 是 异 种 异 体 皮 肤 移 植 的 理 想 受 体 但 是 裸 鼠 皮 肤 又 有 其 自 身 组 织 学 特 点 因 此, 将 裸 鼠 与 人 的 体 表 皮 肤 的 组 织 学 异 同 作 一 比 较 显 得 必 要, 为 受 试 前 后 的 研 究 结 果 提 供 可 靠 参 照, 以 促 使 其 向 临 床 转 化 然 而, 既 往 研 究 多 从 纯 生 物 学 角 度 出 发, 侧 重 不 同 纲 目 间 的 横 向 比 较, 忽 略 了 比 较 组 织 学 在 转 化 医 学 方 面 的 价 值, 涉 及 鼠 与 人 皮 肤 形 态 学 差 异 的 描 述 较 为 笼 统 [1-3], 更 缺 乏 专 门 以 裸 鼠 皮 肤 为 比 较 对 象 的 报 道 该 研 究 选 取 正 常 成 年 裸 鼠 皮 肤 与 正 常 成 人 体 表 皮 肤 作 一 组 织 学 比 较, 为 皮 肤 病 学 和 肿 瘤 学 领 域 的 研 究 提 供 可 靠 的 形 态 学 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 动 物 健 康 裸 鼠,SPF 级,8 周,Balb/c nu, 雌 雄 不 限, 体 重 19~21g, 购 于 湖 南 斯 莱 克 景 达 实 验 动 物 有 限 公 司, 以 裸 鼠 专 用 标 准 饲 料 灭 菌 水, 25 室 温 无 菌 条 件 喂 养, 自 由 取 食 饮 水,1 周 后 取 用 动 物 合 格 证 号 :SCXK( 湘 )2011-0003 在 本 实 验 全 过 程 中, 动 物 处 置 方 法 确 保 符 合 动 物 伦 理 学 要 2014-05-29 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 教 育 厅 基 金 项 目 ( 编 号 :KJ2007A034) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 基 础 医 学 院 组 织 胚 胎 学 教 研 室, 合 肥 230032 作 者 简 介 : 王 溯, 女, 硕 士 研 究 生 ; 陈 晓 蓉, 女, 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:chenxrzp @163.com 求 1.2 方 法 取 裸 鼠 背 部 全 层 皮 肤, 用 4% 甲 醛 固 定 24h, 常 规 脱 水 透 明 石 蜡 包 埋 成 人 皮 肤 由 徐 州 医 学 院 第 二 附 属 医 院 病 理 科 惠 赠, 取 自 胸 部 正 常 皮 肤 将 上 述 材 料 制 成 4μm 切 片, 脱 蜡 至 水 后 行 HE 染 色 或 Mason Fontana 染 色, 光 镜 (ECLIPSE80i 高 级 研 究 用 生 物 显 微 镜,Nikon, 日 本 ) 观 察 基 本 组 织 结 构 及 黑 色 素 染 色 情 况 另 取 裸 鼠 新 鲜 皮 肤 置 于 2 5% 戊 二 醛 溶 液 固 定 12h 常 规 用 丙 酮 / 环 氧 树 脂 包 埋 制 成 500? 的 切 片, 醋 酸 铀 和 柠 檬 酸 铅 染 色, 透 射 电 镜 (JEM 1230, 电 子 株 式 会 社, 日 本 ) 观 察 黑 色 素 细 胞 2 结 果 2.1 HE 染 色 HE 染 色 显 示 裸 鼠 和 成 人 体 皮 均 由 表 皮 及 真 皮 构 成, 真 皮 下 为 皮 下 组 织 观 察 比 较 二 者 显 微 结 构 可 见 低 倍 镜 下 人 全 层 皮 肤 明 显 厚 于 裸 鼠, 尤 其 是 人 皮 肤 的 真 皮 层 明 显 较 裸 鼠 发 达 裸 鼠 的 表 皮 与 真 皮 接 壤 处 较 平 整, 成 人 的 表 皮 与 真 皮 相 结 合 处 常 呈 波 浪 形, 二 者 犬 牙 交 错, 形 成 表 皮 嵴 及 真 皮 乳 头 裸 鼠 皮 下 组 织 中 可 见 一 肌 层, 这 在 人 皮 下 组 织 中 未 见 见 图 1A B, 图 2A 高 倍 镜 下 可 见 裸 鼠 表 皮 薄 于 成 人 ( 裸 鼠 表 皮 2 ~5 层 角 质 形 成 细 胞, 成 人 5~8 层 ), 二 者 均 具 有 典 型 复 层 结 构, 表 皮 最 外 方 为 角 质 层 裸 鼠 和 人 表 皮 的 颗 粒 层 和 基 底 层 细 胞 在 形 态 上 存 在 差 异 裸 鼠 表 皮 颗 粒 层 细 胞 轮 廓 不 清 晰, 可 见 浓 染 颗 粒 成 人 表 皮 颗 粒 层 由 1~2 层 颗 粒 细 胞 构 成, 细 胞 切 面 呈 长 梭 形, 细 胞 轮 廓 较 清 晰, 细 胞 核 扁 圆 居 中, 胞 质 内 可 见 均 匀 细 密 深 染 的 颗 粒 成 人 表 皮 基 底 层 细 胞 排 列 规 整 紧 密, 胞 质 少, 细 胞 核 小 圆, 深 染, 居 中 个 别 细 胞 胞 质 区 可 见 浅 棕 色 颗 粒, 且 颗 粒 多 富 集 在 细 胞 核 上 方 的 胞 质 区 裸 鼠 基 底 层 细 胞 排 列 较 紧 密, 细 胞 核 小 圆, 深 染, 胞 质 少, 未 见 有 如 在 成 人 表 皮 基 底 层 细 胞 间 所 见 的 含 浅 棕 褐 色 颗 粒 的 细 胞 见 图 1A1 B1 裸 鼠 真 皮 明 显 薄 于 成 人, 高 倍 镜 下 可 见 染 成 浅 红 呈 波 浪 状 的 胶 原 纤 维 交 织, 梭 形 细 胞 散 布 其 间

１１５８ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ 图 １ ＨＥ染色示裸鼠及成人皮肤 Ａ Ａ１ ３ 成人皮肤 Ｂ Ｂ１ ２ 裸鼠皮肤 Ａ 成人皮肤 低倍镜 Ａ１ 成人表皮及真皮 Ａ２ 成人皮脂腺 其右侧为毛囊 Ａ３ 成人汗腺 Ｂ 裸 鼠皮肤 低倍镜 Ｂ１ 裸鼠表皮及真皮 Ｂ２ 裸鼠皮脂腺 其下方为毛囊 Ｃ 成人毛囊 皮脂腺及其一侧的立毛肌 Ａ Ｃ １ Ａ１ ３ Ｂ１ ２ ４ 成人真皮基质发达 在高倍镜下可见均质红染 粗宽 的胶原纤维断面 细胞散布其间 见图 １Ａ１ Ｂ１ 成人真皮中可见毛囊 皮脂腺 汗腺等皮肤附属 结构 皮脂腺一侧常见立毛肌附着 见图 １Ａ２ Ａ３ Ｃ 而裸鼠真皮中仅见毛囊和皮脂腺 汗腺缺如 未 见明显立毛肌结构 见图 １Ｂ２ 与成人相比 裸鼠毛 囊狭长 深入皮下 与裸鼠皮脂腺相比 成人皮脂腺 显著发达 低倍镜下 成人皮脂腺的细胞数量明显 多于裸鼠 高倍镜下 成人皮脂腺细胞体积大 细胞 质染色浅 充满脂滴 细胞核小 近腺体中心细胞的 细胞核趋小 裸鼠皮脂腺细胞的细胞质染色较深 细胞核较大 腺体中心与周边细胞的细胞核差别不 大 可见双核 成人皮下组织由脂肪组织及疏松结缔组织构 成 裸鼠皮下组织中还可见一层肌纤维 见图 ２Ａ Ｂ Ｃ 高倍镜下 肌纤维纵切面成带状 可见基本处于 图 ２ ＨＥ染色示裸鼠皮下肌层及成人皮下组织 Ａ 成人皮下组织 无肌层 Ｂ Ｃ Ｂ１ Ｃ１ 裸鼠皮下肌层 Ｂ Ｂ１ 同一水平的清晰横纹 细胞核多个 呈长卵圆形 沿 裸鼠皮下肌层纵切面 Ｃ Ｃ１ 裸鼠皮下肌层横切面 Ａ Ｃ １ 肌膜下分布 横切面可见肌纤维呈多边形 细胞核 Ｂ１ Ｃ１ ４ 分布于外周 见图 ２Ｂ１ Ｃ１ ２ ２ Ｍａｓ ｓ ｏｎ Ｆｏ ｎ ａｎａ染色 Ｍａ ｓ ｓ ｏ ｎ Ｆｏ ｎ ａ ｎ ａ染色 浓集 见图 ３Ａ Ａ１ Ｍａ ｓ ｓ ｏ ｎ Ｆｏ ｎ ａ ｎａ染色显示裸鼠 利用黑素可将氨银溶液中的银离子还原的原理显示 基底层细胞淡染 其间无棕黑色带状颗粒分布 为阴 黑色素细胞 经本方法处理的裸鼠和成人皮肤显示 性结果 见图 ３Ｂ Ｂ１ 了很大的差异 低倍镜下可见成人皮肤基底层棕黑 ２ ３ 透射电镜观察 透射电镜观察表明 裸鼠皮肤 色颗粒带 高倍镜下可见基底层间细胞的胞质中富 基底层可见黑色素细胞 见图 ４ 胞质内可见以 Ⅲ 含 黑色颗粒 且颗粒在细胞的近棘细胞侧的胞质中 Ⅳ期为主的黑素小体 数量不多 呈高电子密度颗

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1159 粒 核 糖 体 线 粒 体 丰 富, 粗 面 内 质 网 高 尔 基 复 合 体 发 达, 张 力 微 丝 少, 与 相 邻 细 胞 间 无 桥 粒 连 接, 见 图 4 图 3 Mason Fontana 银 染 法 示 裸 鼠 及 成 人 皮 肤 黑 色 素 分 布 A A1: 成 人 皮 肤 ;B B1: 裸 鼠 皮 肤 ;A B: 100;A1 B1: 400 图 4 电 子 透 射 显 微 镜 示 裸 鼠 皮 肤 基 底 层 的 黑 素 细 胞 15000 Nu 示 细 胞 核 ;( ) 示 高 电 子 密 度 黑 素 小 体 3 讨 论 [2-3] 研 究 显 示, 体 表 毛 发 丰 密 的 哺 乳 动 物 表 皮 薄 且 平 坦 ( 如 普 通 鼠 类 ), 无 毛 发 的 哺 乳 动 物 表 皮 厚 且 不 平 坦 ( 如 人 类 ), 而 真 皮 厚 度 由 表 皮 厚 度 决 定 [2-3] 这 一 组 织 学 特 点 有 其 功 能 意 义 : 一 方 面, 缺 乏 毛 发 保 护 的 表 皮 易 磨 损, 需 要 获 得 更 丰 富 的 细 胞 来 源, 以 保 证 表 皮 更 新 所 需 另 一 方 面, 厚 的 表 皮 需 要 获 得 更 丰 富 的 营 养 支 持 [3] 本 研 究 表 明, 光 镜 下 HE 染 色 显 示 裸 鼠 的 表 皮 及 真 皮 均 较 成 人 为 薄, 且 裸 鼠 表 皮 基 部 较 平 整, 未 见 形 成 表 皮 嵴 及 真 皮 乳 头 说 明 裸 鼠 虽 然 体 表 无 毛, 但 依 然 承 袭 了 鼠 类 表 皮 的 结 构 特 点 ; 且 裸 鼠 优 越 的 饲 养 环 境 大 大 减 弱 了 表 皮 [2] 磨 损 报 道 指 出, 成 人 角 质 层 薄 部 位 的 皮 肤 颗 粒 层 仅 含 1~3 层 细 胞, 实 验 动 物 表 皮 颗 粒 层 常 缺 如 或 不 连 续 本 研 究 显 示 成 人 皮 肤 颗 粒 层 含 1 层 细 胞, 裸 鼠 表 皮 颗 粒 层 不 清 晰, 证 实 了 这 一 观 点 [2-3] 有 研 究 表 明, 哺 乳 类 有 汗 腺 的 现 象 几 乎 仅 见 于 较 高 等 的 灵 长 类, 啮 齿 类 汗 腺 仅 存 在 于 趾 垫 本 研 究 表 明, 裸 鼠 体 皮 汗 腺 缺 如, 成 人 具 备 汗 腺, 证 实 了 这 一 观 点 [2-3] 研 究 显 示 不 同 动 物 皮 脂 腺 结 构 和 腺 细 胞 形 态 差 别 不 大 而 本 研 究 显 示 : 成 人 皮 脂 腺 明 显 比 裸 鼠 发 达, 腺 细 胞 成 熟, 而 裸 鼠 皮 脂 腺 不 发 达, 成 熟 程 [2-3] 度 较 低 研 究 显 示, 不 同 物 种 的 皮 脂 腺 合 成 的 酶 有 所 不 同, 灵 长 类 合 成 的 酶 种 类 更 复 杂 由 此 可 见, 人 的 皮 脂 腺 细 胞 较 其 他 物 种 行 使 更 成 熟 的 分 泌 功 能 皮 脂 腺 具 有 分 泌 皮 脂, 滋 润 体 表 的 作 用, 而 裸 鼠 生 活 环 境 单 一, 湿 度 温 度 恒 定, 这 也 或 可 解 释 本 研 究 中 人 和 裸 鼠 皮 脂 腺 细 胞 的 组 织 学 差 异 [2-3] 研 究 显 示, 立 毛 肌 维 持 毛 囊 与 表 皮 的 成 角, 维 持 毛 发 趋 向 走 形 本 研 究 显 示,HE 染 色 未 见 裸 鼠 具 有 立 毛 肌 结 构, 成 人 立 毛 肌 明 显 近 年 一 项 研 [4] 究 显 示, 对 立 毛 肌 进 行 免 疫 组 织 化 学 检 测 可 见 裸 鼠 立 毛 肌 表 明 虽 然 裸 鼠 体 表 几 乎 无 毛, 但 立 毛 肌 结 构 并 未 完 全 退 化 消 失 近 年 在 涉 及 皮 下 组 织 的 移 植 研 究 中, 啮 齿 动 物 的 皮 下 肌 层 被 用 作 定 位 标 志 [5] 并 用 于 微 循 环 缺 血 再 灌 注 对 横 纹 肌 影 响 的 研 究 [6] 但 未 见 文 献 指 明 裸 鼠 皮 下 该 肌 层 及 其 组 织 学 性 质 本 研 究 表 明, 裸 鼠 皮 下 具 有 连 续 的 菲 薄 肌 层, 且 为 骨 骼 肌 是 否 该 层 肌 肉 能 自 主 收 缩, 或 是 否 可 通 过 非 自 主 的 收 缩 调 节 微 循 环 的 血 量 进 而 参 与 体 温 调 节, 其 生 理 学 意 义 及 胚 胎 来 源 有 待 进 一 步 研 究 [2-3] 有 研 究 指 出, 鼠 类 的 皮 肤 色 素 仅 存 于 毛 发, 躯 干 部 缺 失 有 活 性 的 黑 色 素 细 胞 [7] [8] 有 研 究 显 示, 裸 鼠 为 黑 色 素 细 胞 标 志 物 S 100 的 阴 性 对 照 Mason Fontana 染 色 是 检 测 皮 肤 黑 色 素 分 布 情 况 的 简 便 方 法 [9] 在 本 研 究 中, 裸 鼠 同 样 表 现 为 阴 性 结 果 但 经 透 射 电 镜 检 查, 可 以 在 裸 鼠 表 皮 基 底 层 观 察 到 含 有 黑 色 素 细 胞 及 黑 素 小 体 ( 黑 素 小 体 分 期 参 见 文 献 [7,10] ) 鉴 于 黑 色 素 细 胞 对 调 节 皮 肤 色 泽 以 及 防 止 紫 外 线 照 射 引 起 的 细 胞 损 伤 起 着 重 要 作 用 [7,11-12] 结 合 成 人 皮 肤 黑 色 素 细 胞 相 关 研 究, 可 见 裸 鼠 黑 素 细 胞 的 颗 粒 数 量 少 于 成 人 [11,13] 表 明 裸 鼠 虽 然 缺 少 毛 发 保 护, 貌 似 承 袭 了 鼠 类 皮 肤 黑 色 素 分 布 的 一 般 特 点, 却 并 非 完 全 缺 失 黑 色 素 细 胞

1160 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 皮 肤 作 为 人 体 最 大 的 器 官, 具 有 屏 障 黑 色 素 代 谢 分 泌 汗 液 体 温 调 节 等 重 要 功 能 皮 肤 结 构 作 为 其 功 能 的 基 础, 值 得 对 其 深 入 研 究 尤 其 随 着 近 年 来 皮 肤 移 植 领 域 的 发 展, 裸 鼠 在 动 物 实 验 中 被 广 泛 应 用, 这 些 研 究 后 续 不 可 避 免 地 需 要 对 新 生 的 皮 肤 结 构 及 功 能 进 行 观 察 评 估 因 此 对 正 常 成 年 裸 鼠 皮 肤 和 正 常 成 人 体 表 皮 肤 的 组 织 学 结 构 的 异 同 进 行 比 较 显 得 尤 为 必 要, 以 更 好 地 对 研 究 结 果 进 行 对 照 评 估 另 外, 在 使 用 裸 鼠 模 型 的 皮 肤 病 学 研 究 中, 动 物 实 验 也 要 求 研 究 者 知 悉 正 常 裸 鼠 的 皮 肤 组 织 学 结 构 及 其 与 人 体 皮 肤 的 组 织 学 结 构 异 同, 以 促 进 其 向 临 床 转 化 [14-15] 参 考 文 献 [1] LucyDLeake.Clasmammalia[M]//LucyDLeake.Compara tivehistology.london:academicpres,1975:676-81. [2] MontagnaW.Comparativeanatomyandphysiologyoftheskin [J].ArchDermatol,1967,96(4):357-63. [3] MontagnaW.Cutaneouscomparativebiology[J].ArchDermatol, 1971,104(6):577-91. [4] SatoA,ToyoshimaKE,TokiH,etal.Singlefolicularunittrans plantationreconstructsarectorpilimuscleandnerveconnections andrestoresfunctionalhairfoliclepiloerection[j].jdermatol, 2012,39(8):682-7. [5] IwasakiT,ImadoT,KitanoS,etal.Hepatocytegrowthfactora melioratesdermalsclerosisinthetight skinmousemodelofsclero derma[j].arthritisresther,2006,8(6):r161. [6] LindenblatN,CalcagniM,ContaldoC,etal.Anewmodelfor studyingtherevascularizationofskingraftsinvivo:theroleofan giogenesis[j].plastreconstrsurg,2008,122(6):1669-80. [7] SlominskiA,TobinDJ,ShibaharaS,etal.Melaninpigmentation inmammalianskinanditshormonalregulation[j].physiolrev, 2004,84(4):1155-228. [8] 宋 可 新, 乔 群, 王 晓 军. 黑 色 素 细 胞 与 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 复 合 构 建 组 织 工 程 化 皮 肤 [J]. 中 国 医 学 科 学 院 学 报,2011,33 (4):402-7. [9] JungE,LeeJA,ShinS,etal.Madecasosideinhibitsmelanin synthesisbyblockingultraviolet inducedinflammation[j].mole cules,2013,18(12):15724-36. [10] CichorekM,WachulskaM,StasiewiczA,etal.Skinmelanocytes: biologyanddevelopment[j].postepydermatolalergol,2013,30 (1):30-41. [11] AndoH,NikiY,ItoM,etal.Melanosomesaretransferedfrom melanocytestokeratinocytesthroughtheprocesesofpackaging, release,uptake,anddispersion[j].jinvestdermatol,2012,132 (4):1222-9. [12] VideiraIF,MouraDF,MaginaS,etal.Mechanismsregulating melanogenesis[j].anbrasdermatol,2013,88(1):76-83. [13] 人 体 皮 肤 电 镜 图 谱 编 写 组. 正 常 人 体 皮 肤 超 微 结 构 [M]. 南 京 : 东 南 大 学 出 版 社,1990:4. [14]HuangSP,HsuCC,ChangSC,etal.Adipose derivedstemcels seededonacelulardermalmatrixgraftsenhancewoundhealingin amurinemodelofaful thicknesdefect[j].annplastsurg, 2012,69(6):656-62. [15]Martínez SantamaríaL,Guerero AspizuaS,DelRíoM.Skinbio engineering:preclinicalandclinicalapplications[j].actasder mosifiliogr,2012,103(1):5-11. Thehistologicalcomparasionoftheadultnude miceskin totheadulthumanskin WangSu,ChenXiaorong (DeptofHistologyandEmbryology,TheBasicMedicalColegeofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230032) Abstract Afterskinflapswereharvestedfromtheadultnude miceandtheadulthuman,theyweremadeintosec tionsandstainedbyhestainormason Fontanastain.Thustheskinstructuresandthedistributionofmelanin wereobservedunderthelightmicroscopy.theultra structureofmelanocyteswasdetailedbytransmisionelec tromicroscopy.underthelight microscopicobservation,sweatglandswerefoundagenesisinnudemice,witha thinlayerofstraitedmuscleshowninthesubcutaneouslayer.mason Fontanastainshowednegativeresultsinnude mice,butundertransmisionelectromicroscopy,melanocyteswereprominentinthebasallayer. Keywords melanocytes;nudemice;skin;comparativehistology

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1161 声 触 诊 组 织 定 量 技 术 在 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 中 的 应 用 价 值 章 生 龙 1, 邓 克 学 2, 隋 秀 芳 1 1, 刘 卫 勇 摘 要 99 例 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 患 者 分 为 两 组 :Graves 病 (GD) 组 45 例 ; 桥 本 甲 状 腺 炎 (HT) 组 54 例 另 选 取 甲 状 腺 功 能 及 超 声 图 像 正 常 者 64 例 进 行 对 照 比 较, 对 病 变 组 及 正 常 对 照 组 甲 状 腺 组 织 行 声 触 诊 组 织 定 量 (VTQ) 技 术 检 查, 记 录 各 甲 状 腺 组 织 的 剪 切 波 传 播 速 度 (SWV) 比 较 3 组 甲 状 腺 组 织 的 SWV GD 组 正 常 对 照 组 HT 组 SWV 值 依 次 增 大, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 对 病 变 组 绘 制 受 试 者 工 作 特 征 曲 线 (ROC), 当 SWV 2 20m/s 时, 诊 断 HT 的 敏 感 性 和 特 异 性 分 别 为 90 7% 和 84 4%, 阳 性 似 然 比 和 阴 性 似 然 比 分 别 为 5 81 和 0 11, 约 登 指 数 为 75 1% 结 果 表 明 VTQ 技 术 在 常 规 超 声 的 基 础 上 能 对 甲 状 腺 组 织 的 硬 度 进 行 定 量 测 算, 有 助 于 临 床 鉴 别 GD 及 HT 关 键 词 中 图 分 类 号 声 触 诊 组 织 定 量 技 术 ; 超 声 检 查 ; 甲 状 腺 R445.1;R581 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1161-03 Graves 病 (GD) 及 桥 本 甲 状 腺 炎 (hashimoto s thyroiditis,ht) 是 较 为 常 见 的 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变, 属 于 自 身 免 疫 性 疾 病, 发 病 年 龄 多 在 30~50 岁, 且 近 年 来 发 病 率 逐 渐 升 高 临 床 上 较 为 常 见 的 诊 断 及 鉴 别 诊 断 的 方 法 以 实 验 室 检 查 为 主 穿 刺 活 检 是 诊 断 的 金 标 准, 但 因 其 有 创 而 存 在 一 定 的 风 险, 往 往 不 为 患 者 所 接 受 因 此, 需 要 寻 找 一 种 无 创 且 能 较 为 准 确 的 鉴 别 此 两 种 疾 病 的 方 法 该 文 运 用 声 触 诊 组 织 定 量 (virtualtouchtisuequantification,vtq) 技 术 定 量 测 量 GD 组 HT 组 及 正 常 对 照 组 甲 状 腺 组 织 的 剪 切 波 传 播 速 度 (shearwavevelocities,swv), 探 讨 其 在 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 中 的 应 用 价 值 1 材 料 与 方 法 1.1 病 例 资 料 2013 年 3 月 ~12 月 在 我 院 就 诊 的 2014-04-10 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 高 等 学 校 省 级 自 然 科 学 研 究 项 目 ( 编 号 : KJ2013Z151) 1 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 附 属 省 立 医 院 超 声 科 2 影 像 科, 合 肥 230001 作 者 简 介 : 章 生 龙, 男, 主 治 医 师 ; 邓 克 学, 男, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail: dengkexue anhui@163.com; 隋 秀 芳, 女, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail: suixf306@163.com 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 的 患 者 99 例 及 甲 状 腺 正 常 者 志 愿 者 64 例, 年 龄 23~60(41 23±12 52) 岁 患 者 均 有 详 细 的 临 床 及 实 验 室 检 查 资 料, 部 分 患 者 有 病 理 结 果 病 变 组 纳 入 标 准 :1 GD 组 患 者 及 HT 组 患 者 均 符 合 全 国 高 等 学 校 教 材 内 科 学 第 7 版 诊 断 标 准 [1] ;2 患 者 均 为 初 诊, 未 经 药 物 手 术 等 临 床 治 疗 ;3 常 规 超 声 检 查 甲 状 腺 内 无 明 显 占 位 性 病 变 1.2 仪 器 与 方 法 1.2.1 仪 器 采 用 德 国 西 门 子 公 司 AcusonS2000 超 声 诊 断 仪,9L4 高 频 线 阵 探 头, 频 率 4~9MHz, 探 头 配 有 VTQ 技 术 成 像 软 件 1.2.2 检 查 方 法 嘱 受 试 者 取 仰 卧 位, 充 分 暴 露 颈 部 首 先 用 常 规 超 声 横 轴 及 纵 轴 各 切 面 扫 查 甲 状 腺 组 织, 观 察 其 大 小 内 部 回 声 血 流 情 况 等 资 料 并 记 录 然 后 切 换 至 VTQ 测 量 模 式, 将 取 样 框 移 至 合 适 位 置 ( 尽 量 避 开 甲 状 腺 组 织 内 的 血 管 并 远 离 颈 动 脉 ) 嘱 患 者 屏 气 并 暂 停 吞 咽 动 作, 图 像 稳 定 后, 按 下 update 键, 即 获 得 一 个 SWV 值, 计 算 机 以 Vs 的 形 式 显 示, 单 位 以 (m/s) 表 示 当 出 现 X.XXm/s 时, 认 为 该 数 据 无 效, 重 新 测 量 并 纳 入 每 位 患 者 甲 状 腺 左 右 叶 分 别 测 量 8 次, 分 别 去 除 1 个 最 大 值 和 最 小 值, 剩 余 的 12 个 值 取 平 均 值, 以 该 平 均 值 作 为 此 患 者 甲 状 腺 组 织 的 SWV 值 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS18.0 统 计 软 件 进 行 分 析, 分 析 各 组 甲 状 腺 组 织 的 SWV 值, 计 量 资 料 均 以 x±s 珋 表 示 采 用 方 差 分 析 比 较 正 常 对 照 组 GD 组 及 HT 组 之 间 SWV 差 异, 进 一 步 采 用 LSD 检 验 进 行 组 间 两 两 比 较 对 两 病 变 组 绘 制 受 试 者 工 作 特 征 曲 线 (receiveroperatingcharacteristiccurve,roc), 确 定 最 佳 临 界 点, 计 算 在 最 佳 临 界 点 处 的 敏 感 性 特 异 性 阳 性 似 然 比 阴 性 似 然 比 及 约 登 指 数 2 结 果 2.1 病 例 资 料 正 常 对 照 组 64 例, 年 龄 21~45 (30 82±14 28) 岁 ;GD 组 45 例, 年 龄 24~56 (39 13±15 02) 岁 ;HT 组 54 例, 年 龄 19~55 (39 62±12 38) 岁 2.2 SWV 测 值 GD 组 正 常 对 照 组 及 HT 组 3 组 之 间 SWV 值 依 次 增 大, 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=

1162 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 71 67,P<0 05), 见 图 1~3, 表 1 进 一 步 进 行 两 两 比 较,GD 组 正 常 对 照 组 HT 组 各 组 间 SWV 值 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05,P<0 01) 图 1 GD 患 者 甲 状 腺 组 织 A: 彩 色 多 普 勒 声 像 图 ;B:SWV=1.62m/s 图 4 SWV 值 的 ROC 曲 线 图 2 正 常 对 照 组 甲 状 腺 组 织 A: 彩 色 多 普 勒 声 像 图 ;B:SWV=2.02m/s 图 3 HT 患 者 甲 状 腺 组 织 A: 彩 色 多 普 勒 声 像 图 ;B:SWV=2.47m/s 表 1 各 组 SWV 值 测 量 情 况 ( x±s) 珋 组 别 例 数 SWV(m/s) 95%CI GD 45 1.86±0.29 1.77~1.94 正 常 对 照 64 2.00±0.24 ## 1.94~2.06 HT 54 2.61±0.46 2.48~2.73 与 GD 组 比 较 : P<0 05, P<0 01; 与 HT 组 比 较 : ## P< 0 01 2.3 ROC 曲 线 根 据 ROC 曲 线 可 知,ROC 曲 线 下 最 大 面 积 为 0 94(P<0 01), 选 取 约 登 指 数 ( 敏 感 性 + 特 异 性 -1) 最 大 值 所 对 应 的 点 为 最 佳 临 界 点, 确 定 SWV 值 =2 20m/s 即 在 病 变 组 中 当 SWV 值 2 20m/s 时, 其 诊 断 HT 的 敏 感 性 为 90 7%, 特 异 性 为 84 4%, 阳 性 似 然 比 为 5 81, 阴 性 似 然 比 为 0 11, 约 登 指 数 为 75 1% 见 图 4 3 讨 论 常 规 超 声 在 诊 断 甲 状 腺 弥 漫 性 疾 病 时 有 一 定 价 值, 但 对 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 的 鉴 别 诊 断 存 在 一 定 困 难 超 声 弹 性 成 像 技 术 可 以 反 映 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 的 硬 度 特 征, 对 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 的 鉴 别 诊 断 及 指 导 治 疗 有 临 床 意 义 [2-3] VTQ 技 术 作 为 无 创 性 量 化 组 织 硬 度 的 技 术, 其 原 理 是 通 过 超 声 探 头 向 感 兴 趣 区 域 组 织 发 射 低 频 振 动 或 低 频 脉 冲, 感 兴 趣 区 域 组 织 受 到 脉 冲 波 作 用 后, 发 生 形 变, 产 生 横 向 运 动 的 剪 切 波, 利 用 探 头 对 剪 切 波 进 行 检 测, 从 而 得 出 被 测 组 织 的 弹 性 量 化 值, 这 个 值 反 应 组 织 弹 性 的 大 小 此 技 术 在 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 方 面 的 报 道 较 少, 此 前 在 甲 状 腺 方 面 的 应 用 主 要 集 中 在 甲 状 腺 占 位 性 病 变 良 恶 性 鉴 别 诊 断 上 [4-8] 病 理 学 上 GD 病 患 者 甲 状 腺 弥 漫 性 对 称 性 增 大, 血 管 充 血, 间 质 血 管 丰 富, 质 地 较 柔 软 正 常 的 甲 状 腺 组 织 细 胞 功 能 正 常, 无 明 显 的 纤 维 化 及 增 生 HT 患 者 甲 状 腺 组 织 的 病 变 通 常 分 为 3 期 [9], 可 表 现 为 甲 状 腺 功 能 亢 进 甲 状 腺 功 能 正 常 或 甲 状 腺 功 能 低 下, 但 最 终 均 发 展 为 甲 状 腺 功 能 低 下 由 于 HT 甲 状 腺 多 呈 弥 漫 性 肿 大 ( 以 峡 部 锥 体 叶 肿 大 明 显 ), 有 中 重 度 的 结 缔 组 织 增 生 及 纤 维 化, 故 甲 状 腺 组 织 质 地 坚 硬 VTQ 技 术 所 测 得 的 SWV 值, 定 量 反 应 出 组 织 的 弹 性 特 征,SWV 值 越 低, 反 应 该 组 织 质 地 [10] 越 软, 反 之 说 明 该 组 织 质 地 越 硬 有 文 献 报 道 甲 状 腺 组 织 硬 度 : 甲 亢 组 < 正 常 对 照 组 < 桥 本 组, 差 异 有 统 计 学 意 义 本 研 究 测 得 3 组 之 间 SWV 值 依 次 增 大, 差 异 有 统 计 学 意 义, 与 组 织 的 SWV 与 其 弹 性 系 数 呈 反 比 的 结 论 相 符 [11] 由 于 部 分 HT 患 者 在 早 期 因 炎 症 破 坏 滤 泡 甲 状 腺 激 素 过 多 释 放 入 血, 也 可 出 现 一 过 性 甲 状 腺 功 能 亢 进 表 现 常 规 超 声 表 现 为 甲 状 腺 内 彩 色 血 流 信 号 极 其 丰 富, 呈 火 海 征, 甲 状 腺 上 动 脉 增 宽, 收 缩 期 峰 值 流 速 增 快 此 类 超 声 表 现 则 与 大 部 分 GD 患

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1163 者 声 像 图 相 似 因 此 常 规 超 声 通 过 二 维 图 像 彩 色 多 普 勒 及 频 谱 多 普 勒 对 HT 患 者 及 GD 患 者 的 鉴 别 诊 断 存 在 一 定 的 困 难 本 文 运 用 VTQ 技 术, 正 是 基 于 GD 患 者 和 HT 患 者 的 组 织 病 理 学 特 点 的 不 同 所 造 成 的 组 织 的 硬 度 不 同, 根 据 所 测 SWV 值 的 大 小 对 甲 状 腺 组 织 的 硬 度 进 行 量 化 分 析 利 用 ROC 曲 线 试 图 寻 找 鉴 别 两 种 疾 病 的 最 佳 临 界 值 根 据 ROC 曲 线 可 知, 当 曲 线 下 最 大 面 积 为 0.94 时,SWV 最 佳 [12-13] 临 界 值 为 2.20m/s, 与 文 献 报 道 相 类 似 统 计 学 中, 当 ROC 曲 线 下 面 积 在 0.9 以 上 时 表 示 诊 断 准 确 性 较 高, 本 研 究 中 曲 线 下 面 积 为 0.94, 说 明 VTQ 技 术 对 鉴 别 HT 患 者 和 GD 患 者 具 有 很 大 意 义, 可 以 为 临 床 鉴 别 此 两 种 病 变 提 供 帮 助 总 之, 与 其 他 检 测 手 段 相 比, 常 规 超 声 具 有 无 创 价 格 低 廉 操 作 简 单 等 优 势, 并 可 随 时 观 察 病 情 发 展 而 VTQ 技 术 在 提 供 临 床 医 师 所 需 要 的 超 声 声 像 图 及 测 量 结 果 基 础 上, 更 能 定 量 反 应 出 甲 状 腺 弥 漫 性 疾 病 与 正 常 甲 状 腺 组 织 的 弹 性 特 征, 弥 补 以 往 传 统 弹 性 成 像 技 术 对 甲 状 腺 组 织 评 判 标 准 不 客 观 缺 乏 定 量 指 标 等 不 足 有 助 于 临 床 提 高 鉴 别 HT 和 GD 的 准 确 性, 为 临 床 医 师 在 治 疗 方 法 的 选 择 上 提 供 参 考 依 据 参 考 文 献 [1] 陆 再 英, 钟 南 山. 内 科 学 [M].7 版. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社, 2008:712-28. [2] 谢 萍, 肖 萤, 刘 芳, 等. 实 时 超 声 弹 性 成 像 在 亚 急 性 甲 状 腺 炎 中 的 初 步 应 用 [J]. 中 国 超 声 医 学 杂 志,2010,26(5):404-6. [3] 熊 毅, 欧 国 成. 实 时 超 声 弹 性 成 像 在 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 中 的 初 步 应 用 [J]. 中 国 血 液 流 变 学 杂 志,2010,20(2):331-3. [4] LuoS,KimEH,DigheM,etal.Thyroidnoduleclasificationusing ultrasoundelastographyvialineardiscriminantanalysis[j].ultra sonics,2011,51(4):425-31. [5] VorlanderC,WolfJ,SaalabianS,etal.Real timeultrasoundelas tography anoninvasivediagnosticprocedureforevaluatingdomi nantthyroidnodules[j].langenbecksarchsurg,2010,395(7): 865-71. [6] DingJ,ChengH,NingC,etal.Quantitativemeasurementforthy roidcancercharacterizationbasedonelastography[j].jultra soundmed,2011,30(9):1259-66. [7] BhatiaKS,RasalkarDP,LeeYP,etal.Cysticchangeinthyroid nodules:aconfoundingfactorforreal timequalitativethyroidultra soundelastography[j].clinradiol,2011,66(9):799-807. [8] 甘 科 红, 丛 淑 珍, 冯 占 武, 等. 甲 状 腺 结 节 性 疾 病 超 声 弹 性 成 像 误 诊 原 因 分 析 [J]. 中 国 超 声 医 学 杂 志,2011,27(6):505-7. [9] ZhangY,GaoY,LiM,etal.Avidityofthyroglobulinantibodyin setafrompatientswithhashimoto sthyroiditiswithdiferentthy roidfunctionalstatus[j].clinexpimmunol,2010,161(1):65-70. [10] 刘 凤 菊, 勇 强, 陶 虹. 超 声 实 时 组 织 弹 性 成 像 技 术 在 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 中 的 应 用 [J]. 临 床 超 声 医 学 杂 志,2012,14 (11):727-30. [11] OsakiA,KubotaT,SudaT,etal.Shearwavevelocityisauseful markerformanagingnonalcoholicsteatohepatitis[j].worldjgas troenterol,2010,16(23):2918-25. [12] 张 凤 娟, 纪 晓 惠, 孟 洁, 等. 声 触 诊 组 织 量 化 技 术 在 桥 本 氏 甲 状 腺 炎 诊 断 中 的 应 用 价 值 [J]. 中 华 超 声 影 像 学 杂 志,2011,20 (9):764-7. [13] 张 毅, 张 超, 杨 琰, 等. 声 辐 射 力 脉 冲 成 像 技 术 初 步 评 价 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 [J]. 医 学 研 究 杂 志,2012,4(16):25-7. Evaluationtheapplicationvalueofvirtualtouchfordifusethyroiddiseases ZhangShenglong 1,DengKexue 2,SuiXiufang 1,etal ( 1 DeptofDiagnosticUltrasound, 2 DeptofImaging,TheAfiliatedProvincialHospitalof AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230001) Abstract Atotalof99patientswithdifusethyroiddiseasesweredividedintotwogroups:onegroupincluded45 caseswithgrave sdisease(gd),theothergroupincluded54caseswithhashimoto sthyroiditis(ht).virtual touchtisuequantification(vtq)techniquewasusedtomeasuretheshearwavevelocities(smv)ofthyroidlobes ofthetwogroups,andthecontrolgroupincluded64peoplewhohadnormalthyroidfunctionandultrasonoscopy. Theresultsofthethreegroupswerecompared.ThevalueofSMVamongtheGDgroup,thecontrolgroupandthe HTgroup,inturn,increased,withstatisticalysignificantdiferences(P<0 05).Receiveroperatingcharacteris tic(roc)curvewasdrawntoasesthediagnosticaccuracy.thesensitivityandspecificityofsmv(cut ofvalue =2.20m/s)indiagnosingGDandHTwas90.7% and84.4% respectively.thepositivelikelihoodratio(lr+) andnegativelikelihoodratio(lr-)was5.81and0.11respectively.theyoudenindexwas75.1%.inconclu sion,vtqtechnologyonthebasisofconventionaldopplerultrasoundcanasesthethyroidtisuequantitatively, andhelpclinicalidentificationofgdandht. Keywords virtualtouchtisuequantification;ultrasonography;thyroid

1164 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 鼻 咽 癌 静 态 IMRT 与 VMAT 同 步 加 量 放 疗 剂 量 学 比 较 唐 正 中, 吴 爱 东, 钱 立 庭, 刘 磊, 周 解 平 摘 要 选 择 21 例 同 步 加 量 调 强 放 射 治 疗 (SMART) 鼻 咽 癌 患 者, 在 计 划 系 统 中 以 相 同 处 方 剂 量 和 目 标 限 量 要 求 分 别 设 计 9 野 静 态 调 强 (simrt) 和 双 弧 容 积 旋 转 调 强 放 射 治 疗 (VMAT) 计 划, 满 足 95% 靶 体 积 达 到 处 方 剂 量 要 求 的 前 提 下, 比 较 两 种 计 划 的 靶 区 剂 量 危 及 器 官 和 正 常 组 织 的 受 照 剂 量 以 及 机 器 跳 数 (MU) 和 治 疗 时 间 的 差 异 结 果 显 示 两 种 计 划 靶 区 最 大 最 小 剂 量 以 及 均 匀 性 指 数 差 异 均 无 统 计 学 意 义, 但 VMAT 靶 区 的 适 形 指 数 (CI) 显 著 提 高 (t=-3.86, P<0.05), 转 移 淋 巴 结 计 划 靶 体 积 (PGTVnd) 高 危 淋 巴 引 流 区 计 划 靶 体 积 (PTV1) 和 预 防 照 射 淋 巴 引 流 区 计 划 靶 体 积 (PTV2) 的 平 均 剂 量 降 低, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) VMAT 计 划 的 脑 干 脊 髓 和 视 交 叉 最 大 剂 量 以 及 双 侧 腮 腺 的 60% 体 积 受 到 的 剂 量 (D 60% ) 都 小 于 simrt 计 划 相 应 剂 量, 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) VMAT 计 划 正 常 组 织 受 照 5Gy 体 积 (V 5 ),V 10 和 V 15 略 高 于 simrt 计 划 值 (P>0 05), 但 V 20 V 25 V 30 V 35 V 40 V 45 V 50 和 平 均 剂 量 统 计 明 显 小 于 simrt 计 划 相 应 剂 量 (P<0 05,P<0 01);VMAT 计 划 平 均 总 MU 和 治 疗 时 间 分 别 减 少 约 14 2% 和 68 8% 关 键 词 鼻 咽 癌 / 放 射 治 疗 ; 同 步 加 量 调 强 放 射 治 疗 ; 容 积 旋 转 调 强 放 疗 ; 静 态 调 强 放 射 治 疗 ; 剂 量 学 中 图 分 类 号 R739.63;R730.55 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1164-04 目 前, 鼻 咽 癌 放 疗 已 广 泛 采 用 同 步 加 量 调 强 放 射 治 疗 (simultaneousmodulatedacceleratedradiother apy,smart) 技 术, 该 技 术 在 不 降 低 鼻 咽 肿 瘤 剂 量 的 前 提 下, 可 有 效 降 低 腮 腺 等 正 常 组 织 的 受 照 体 积 和 剂 量, 降 低 口 干 的 发 生 率, 提 高 放 疗 疗 效 及 患 者 的 生 活 质 量 [1] 但 以 静 态 或 动 态 调 强 放 疗 为 代 表 的 常 规 调 强 放 疗 (intensitymodulatedradiationtherapy, IMRT) 实 际 治 疗 时 间 较 长, 增 加 了 治 疗 中 不 确 定 影 响 因 素, 亦 增 加 了 患 者 不 适 感 [2] 近 年 来, 容 积 旋 转 调 强 放 射 治 疗 (volumetricmodulatedarctherapy, VMAT) 已 逐 渐 应 用 于 临 床, 与 常 规 IMRT 相 比, 2014-03-20 接 收 基 金 项 目 : 高 校 省 级 自 然 科 学 研 究 项 目 ( 编 号 :KJ2010B380) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 附 属 省 立 医 院 放 疗 科, 合 肥 230001 作 者 简 介 : 唐 正 中, 女, 硕 士 研 究 生 ; 吴 爱 东, 男, 副 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:aid ongwu@21cn.com VMAT 有 相 近 或 更 好 的 剂 量 分 布, 并 可 减 少 机 器 跳 数 (monitorunit,mu) 以 及 患 者 的 治 疗 时 间 [3] 该 研 究 通 过 比 较 21 例 鼻 咽 癌 同 步 加 量 静 态 调 强 (step andshootimrt,simrt) 与 VMAT 计 划, 分 析 两 种 技 术 在 靶 区 剂 量 分 布 和 正 常 组 织 受 照 剂 量 上 的 差 异, 以 期 为 临 床 工 作 提 供 一 定 的 参 考 1 材 料 与 方 法 1.1 病 例 资 料 选 择 21 例 经 病 理 检 查 证 实 为 低 分 化 鳞 癌 的 鼻 咽 癌 放 疗 患 者, 且 无 放 疗 禁 忌 证 男 15 例, 女 6 例, 年 龄 31~71 岁, 中 位 年 龄 49 5 岁 其 中 T1 期 2 例 T2 期 3 例 T3 期 12 例 T4 期 4 例 患 者 均 签 署 放 疗 知 情 同 意 书, 在 kv 级 图 像 引 导 加 速 器 上 按 医 师 要 求 的 时 间 行 锥 形 束 CT 图 像 引 导, 确 认 摆 位 误 差 <3mm 后 实 施 调 强 放 疗 1.2 体 位 固 定 和 CT 扫 描 所 有 患 者 取 仰 卧 位, 采 用 头 枕 加 头 颈 肩 热 塑 面 膜 固 定, 做 好 体 表 标 记 并 行 螺 旋 CT 扫 描, 扫 描 范 围 从 头 顶 至 胸 骨 切 迹 下 2 cm, 层 厚 3mm, 扫 描 的 CT 图 像 经 网 络 传 输 到 ADAC Pinnacle310.0 治 疗 计 划 系 统 1.3 靶 区 和 危 及 器 官 的 勾 画 参 照 2010 年 鼻 咽 调 强 放 疗 专 家 共 识, 医 师 在 三 维 重 建 后 的 CT 图 像 或 CT 与 MRI 融 合 图 像 上 逐 层 勾 画 鼻 咽 部 和 颈 部 转 移 淋 巴 结 大 体 肿 瘤 靶 体 积 (grostargetvolume,gtvnx GTVnd) 临 床 靶 体 积 与 高 危 淋 巴 引 流 区 的 临 床 靶 体 积 (clinicaltargetvolume,ctv1) 以 及 需 预 防 照 射 的 淋 巴 结 引 流 区 (CTV2) 依 照 本 单 位 的 摆 位 误 差 数 据 相 应 外 扩 得 到 各 部 分 的 计 划 靶 体 积 (planningtar getvolume,ptv) 并 分 别 定 义 为 PGTV PGTVnd PTV1 PTV2 危 及 器 官 (organatrisk,oar) 参 照 ICRU83 号 报 告 进 行 定 义 和 勾 画 OAR 主 要 包 括 脑 干 脊 髓 颞 叶 视 神 经 视 交 叉 垂 体 颞 颌 关 节 腮 腺 等 1.4 治 疗 计 划 设 计 患 者 计 划 均 采 用 6MV X 线 同 步 加 量 调 强 照 射 技 术, 计 划 靶 体 积 的 处 方 剂 量 PGTV 为 2.27Gy/ 次 PGTVnd 为 2.2Gy/ 次 PTV1 为 2Gy/ 次 PTV2 为 1.8Gy/ 次, 共 分 30 次 同 期 完 成, 总 剂 量 分 别 为 68 66 60 54Gy 在 计 划 系 统 上 对 21 例 患 者 分 别 设 计 9 个 固 定 野 simrt 和 双 弧

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1165 VMAT 计 划,sIMRT 计 划 的 9 个 照 射 野 在 360 内 等 角 布 野, 相 邻 射 野 间 隔 为 40, 治 疗 床 及 准 直 器 角 度 均 为 0 ; 双 弧 VMAT 计 划 治 疗 床 角 度 为 0, 机 架 先 逆 时 针 从 179 旋 转 至 181, 准 直 器 为 350 ; 再 顺 时 针 自 181 旋 转 至 179, 准 直 器 为 10 两 种 计 划 的 剂 量 约 束 条 件 和 优 化 参 数 相 同, 并 采 用 靶 区 平 均 剂 量 归 一 方 式, 要 求 所 有 95% 计 划 靶 体 积 不 低 于 相 应 处 方 剂 量 要 求 正 常 组 织 剂 量 限 值 : 脊 髓 <45Gy; 脑 干 <54Gy; 腮 腺 V 30 <50%; 晶 状 体 <8Gy; 视 交 叉 <54Gy; 颞 颌 关 节 <70Gy; 颞 叶 <60Gy, 眼 球 < 50Gy 1.5 治 疗 计 划 评 估 利 用 剂 量 体 积 直 方 图 (dose volumehistogram,dvh) 对 两 种 计 划 的 计 划 靶 区 OAR 和 正 常 组 织 的 受 照 射 剂 量 进 行 统 计 学 分 析, 如 下 : 1 所 有 计 划 靶 区 (PGTV PGTVnd PTV1 PTV2) 剂 量 和 体 积 参 数 : 靶 区 最 大 剂 量 D max 最 小 剂 量 D min 平 均 剂 量 D mean 以 及 95% 等 剂 量 曲 线 所 包 围 PTV 体 积 V 95%,5% 和 95%PTV 体 积 所 受 的 照 射 剂 量 D 5% 和 D 95% 2 PTV 靶 区 剂 量 均 匀 性 指 数 (homogeneityindex, HI) [4] : 验 图 1 IMRT 与 VMAT 治 疗 计 划 的 DVH 比 较 2 结 果 2.1 DVH 图 和 等 剂 量 线 分 布 比 较 21 例 患 者 两 种 计 划 的 剂 量 分 布 及 计 划 参 数 都 能 达 到 临 床 处 方 剂 量 要 求 DVH 图 显 示 VMAT 计 划 的 计 划 靶 区 剂 量 统 计 优 于 simrt 计 划, 见 图 1;VMAT 靶 区 剂 量 覆 盖 和 适 形 性 也 好 于 simrt 计 划 结 果, 图 2 为 1 例 患 者 两 种 计 划 的 横 断 面 等 剂 量 分 布 比 较 图 HI= D 5% D 95% HI 值 越 低 ( 即 越 接 近 1), 表 示 靶 区 剂 量 均 匀 性 越 好, 反 之,HI 值 越 大 表 明 剂 量 不 均 匀 性 较 大 3 PTV 靶 区 剂 量 适 形 指 数 (comfomityindex,ci) [5] : CI= V T,ref V T,ref V T V ref 其 中,V T,ref 为 参 考 等 剂 量 线 所 覆 盖 的 所 有 PTV 体 积 ;V T 为 PTV 体 积 ;V ref 为 参 考 等 剂 量 线 所 包 围 的 所 有 体 积,CI 值 为 0~1,CI 值 越 大, 表 示 适 形 度 越 好, 等 于 1 时 最 理 想, 等 于 0 时 最 差 4 主 要 OAR 受 量 : 脊 髓 和 晶 体 的 最 大 剂 量 ; 脑 干 神 交 叉 和 视 神 经 的 最 大 剂 量 及 平 均 剂 量, 腮 腺 平 均 剂 量 及 33% 体 积 受 到 的 剂 量 (D 33 ) 以 及 D 50 和 D 60, 扣 除 所 有 PTV 后 靶 区 外 正 常 组 织 体 积 [ 本 文 定 义 为 全 身 (body,b) 减 去 PTV 后 体 积, 即 [B-P] 受 照 平 均 剂 量 及 受 照 5Gy 体 积 (V 5 ) 以 及 V 10 V 15 V 20 V 25 V 30 V 35 V 40 V 45 V 50 占 总 B-P 体 积 百 分 比 5 两 种 计 划 的 平 均 MU 和 治 疗 时 间 1.6 统 计 学 处 理 采 用 SPSS17 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 数 据 进 行 参 数 间 配 对 t 检 图 2 两 种 计 划 横 断 面 等 剂 量 线 分 布 比 较 图 A:sIMRT;B:VMAT 2.2 计 划 靶 区 剂 量 学 参 数 比 较 VMAT 和 simrt 计 划 所 有 计 划 靶 区 (PGTV PGTVnd PTV1 PTV2) 的 最 大 最 小 剂 量 以 及 HI 相 差 不 大, 但 VMAT 计 划 的 PGTVnd PTV1 和 PTV2 平 均 剂 量 D mean 较 低, 所 有 计 划 靶 区 的 靶 区 CI 较 高, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P< 0 05), 见 表 1 2.3 OAR 剂 量 比 较 VMAT 计 划 的 脑 干 脊 髓 最 大 剂 量 以 及 双 侧 腮 腺 D 60% 小 于 simrt 计 划 相 应 剂 量, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 晶 体 最 大 剂 量 视 神 经 与 脑 干 平 均 剂 量 双 侧 腮 腺 平 均 剂 量 D 33% 和 D 50% 两 种 计 划 的 结 果 相 似, 见 表 2

1166 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 1 两 种 计 划 间 靶 区 的 剂 量 学 指 标 ( 珋 x±s) 参 数 simrt VMAT t 值 P 值 PGTV D max (Gy) 74.85±2.04 74.09±1.91 1.78 0.09 D min (Gy) 60.03±4.80 59.84±5.49 0.52 0.61 D mean (Gy) 71.15±0.92 71.03±1.77 0.46 0.65 HI 1.08±0.04 1.06±0.02 2.08 0.06 CI 0.36±0.15 0.41±0.16-3.86 0.00 PGTVnd D max (Gy) 70.76±2.34 70.26±1.99 0.69 0.50 D min (Gy) 64.30±3.44 63.46±2.34 1.79 0.09 D mean (Gy) 68.80±1.18 68.11±1.05 2.22 0.04 HI 1.04±0.01 1.04±0.03 1.58 0.13 CI 0.08±0.05 0.09±0.05-3.96 0.00 PTV1 D max (Gy) 74.86±2.02 74.09±1.91 1.81 0.09 D min (Gy) 47.33±5.23 48.35±4.61-1.71 0.10 D mean (Gy) 67.16±1.14 66.63±1.24 2.90 0.01 HI 1.17±0.10 1.18±0.12-0.30 0.77 CI 0.31±0.12 0.37±0.14-3.58 0.00 PTV2 D max (Gy) 74.87±2.01 74.10±1.92 1.83 0.08 D min (Gy) 33.96±9.14 34.21±9.14-0.14 0.90 D mean (Gy) 61.28±2.18 60.37±1.60 2.25 0.04 HI 1.29±0.04 1.29±0.04 0.68 0.51 CI 0.62±0.07 0.68±0.06-6.80 0.00 表 2 两 种 计 划 间 OAR 的 剂 量 学 指 标 ( 珋 x±s) 参 数 (Gy) simrt VMAT t 值 P 值 脑 干 D max 53.76±3.57 52.55±2.48 2.81 0.01 D mean 29.59±5.58 29.90±5.23-0.61 0.55 脊 髓 D max 39.02±1.42 38.04±1.41 3.76 0.00 晶 体 D max ( 左 ) 6.18±1.10 6.22±0.84-0.22 0.83 D max ( 右 ) 6.16±0.97 6.04±0.65 0.89 0.38 视 神 经 D max ( 左 ) 31.40±18.12 31.91±15.82-0.40 0.69 D mean ( 左 ) 22.6±18.3 22.88±15.18-0.24 0.81 D max ( 右 ) 25.64±12.62 27.57±12.53-2.38 0.08 D mean ( 右 ) 24.18±20.69 21.00±13.57 0.76 0.46 腮 腺 D mean ( 左 ) 34.27±6.76 33.14±5.11 1.38 0.18 D 33% ( 左 ) 36.27±5.90 36.57±5.10-0.37 0.71 D 50% ( 左 ) 29.98±6.23 28.56±2.89 1.44 0.16 D 60% ( 左 ) 28.13±6.03 25.55±2.29 2.19 0.04 D mean ( 右 ) 34.01±6.92 32.96±5.85 1.00 0.33 D 33% ( 右 ) 36.06±5.41 35.40±2.90 0.70 0.49 D 50% ( 右 ) 30.14±5.17 27.86±1.65 1.93 0.07 D 60% ( 右 ) 28.05±4.97 25.32±1.52 2.34 0.03 2.4 靶 区 外 正 常 组 织 受 照 剂 量 VMAT 计 划 靶 区 外 正 常 组 织 (B-P) 低 剂 量 区 受 照 体 积 V 5,V 10 高 于 simrt 计 划 值, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 ; 而 V 15 V 20 V 25 V 30 V 35 V 40 V 45 V 50 和 V mean 明 显 小 于 simrt 计 划 相 应 剂 量, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 05,P< 0 01), 见 表 3 表 3 两 种 计 划 间 正 常 组 织 的 剂 量 学 指 标 ( x±s) 珋 参 数 (Gy) simrt VMAT t 值 P 值 V 5 57.55±14.71 57.94±14.75-1.43 0.17 V 10 48.72±14.44 49.06±14.44-1.56 0.14 V 15 43.19±13.37 42.73±13.42 2.11 0.05 V 20 37.88±12.11 37.18±12.08 4.02 0.00 V 25 32.80±11.2 31.61±10.53 5.86 0.00 V 30 27.72±10.26 25.65±8.70 5.44 0.00 V 35 21.98±9.05 19.59±7.09 5.06 0.00 V 40 15.98±7.40 13.86±5.37 4.35 0.00 V 45 10.69±4.94 9.01±3.41 4.39 0.00 V 50 6.04±2.82 4.80±1.76 4.35 0.00 V mean 17.25±5.16 16.65±4.73 5.07 0.00 MU 值 740±91 635±62 6.14 0.00 2.5 MU 和 治 疗 时 间 比 较 VMAT 和 simrt 计 划 的 平 均 MU 差 异 显 著, 其 值 分 别 为 635±62 和 740± 91(t=6.14,P=0 00),VMAT 的 平 均 MU 减 少 105 (14 2%) VMAT 双 弧 计 划 平 均 治 疗 时 间 是 2~3 min,simrt 计 划 平 均 治 疗 时 间 是 7~9min,VMAT 比 simrt 治 疗 时 间 平 均 减 少 约 68.8% 3 讨 论 Vanetietal [6] 比 较 29 例 头 颈 部 肿 瘤 单 双 弧 VMAT 以 及 7~9 野 IMRT 计 划, 结 果 表 明 两 组 计 划 的 PTV 剂 量 线 覆 盖 范 围 和 适 形 性 相 似,VMAT 计 划 的 OAR 照 射 量 减 少, 平 均 剂 量 较 低 而 Oliveret al [7] 利 用 模 体 对 VMAT 和 IMRT 计 划 质 量 进 行 了 比 较,VMAT 计 划 在 靶 区 适 形 度 靶 区 均 匀 性 以 及 对 模 拟 OAR 的 保 护 方 面 均 优 于 IMRT 计 划 这 些 不 同 可 能 与 很 多 因 素 有 关, 包 括 用 于 VMAT 计 划 弧 的 数 量 ( 一 般 双 弧 计 划 好 于 单 弧 计 划 ) VMAT 优 化 方 法 的 类 型 和 静 态 子 野 调 强 的 最 大 子 野 数 有 关, 一 般 来 说,IMRT 可 以 通 过 增 加 更 多 的 子 野 数 来 得 到 更 高 质 量 的 治 疗 计 划 本 研 究 21 例 鼻 咽 癌 simrt 与 VMAT 计 划 比 较 结 果 显 示 两 种 计 划 的 靶 区 剂 量 分 布 均 能 满 足 临 床 治 疗 要 求, 但 VMAT 计 划 的 靶 区 剂 量 的 适 形 性 优 于 simrt 计 划,VMAT 计 划 可 降 低 患 者 脑 干 脊 髓 和 视 交 叉 的 最 大 照 射 剂 量, 对 这 些 重 要 OAR 具 有 一 定 保 护 作 用, 但 对 晶 体 和 视 神 经 等 其 他 [8] 重 要 器 官 保 护 优 势 不 明 显 一 些 研 究 报 道, 由 于 VMAT 是 360 的 弧 形 治 疗, 在 降 低 靶 区 外 正 常 组 织 的 平 均 受 照 剂 量 的 同 时, 低 剂 量 辐 射 区 域 也 将 增 加

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1167 本 组 VMAT 计 划 靶 区 外 正 常 组 织 在 5~15Gy 的 低 剂 量 辐 射 区 平 均 体 积 稍 大 于 IMRT 计 划, 但 高 于 20 Gy 的 高 剂 量 区 照 射 体 积 和 总 平 均 剂 量 却 明 显 降 低 与 常 规 IMRT 相 比,VMAT 最 大 的 优 势 是 可 提 高 工 作 效 率, 表 现 在 加 速 器 总 MU 及 总 治 疗 时 间 的 减 少 本 研 究 21 例 患 者 VMAT 计 划 的 平 均 MU 比 simrt 减 少 14.2%, 平 均 总 治 疗 时 间 减 少 约 68 8%, 患 者 可 在 2~4min 内 完 成 治 疗 VMAT 照 射 过 程 中 的 每 个 瞬 间 射 野 面 积 一 般 都 大 于 simrt 的 子 野 面 积, 所 以 前 者 的 射 线 利 用 率 高, 加 速 器 所 需 的 总 输 出 量 ( 总 MU) 减 少 VMAT 总 治 疗 时 间 的 缩 短 不 仅 可 提 高 设 备 使 用 率, 也 可 减 轻 患 者 不 舒 适 度, 减 小 患 者 分 次 治 疗 内 体 位 移 动 器 官 体 积 变 化 和 运 动 等 不 确 定 性 因 素 对 放 疗 精 度 的 影 响, 更 重 要 的 是 治 疗 时 间 的 缩 短 也 可 增 加 肿 瘤 的 相 对 生 物 学 效 应, 并 对 开 展 图 像 引 导 下 的 调 强 放 射 治 疗 也 具 有 重 要 的 意 义 参 考 文 献 [1] KoomW S,KimTH,ShinKH,etal.SMART(simultaneous modulatedacceleratedradiotherapy)forlocalyadvanced,naso pharyngealcarcinomas[j].headneck,2007,30(2):159-69. [2] 陈 进 琥, 尹 勇, 刘 同 海, 等, 颈 段 食 管 癌 固 定 野 调 强 与 旋 转 调 强 放 疗 计 划 比 较 研 究 [J]. 中 华 放 射 肿 瘤 学 杂 志,2010,19(5): 429-33. [3] VanBenthuysenL,HalesL,PodgorsakMB.Volumetricmodula tedarctherapyvs.imrtfortreatmentofdistalesophagealcancer [J].MedicalDosimetry,2011,36(4):404-9. [4] BraggCM,ConwayJ,RobinsonMH.Theroleofintensity modu latedradiotherapyinthetreatmentofparotidtumors[j].intjra diatoncolbiolphys,2002,53(3):729-38. [5] Van trieta,maka C,MoerlandM A,etal.A conformation numbertoquantifythedegreeofconformalityinbrachytherapyand externalbeamiradiation:applicationtotheprostate[j].intjra diatoncolbiolphys,1997,37(3):731-6. [6] VanetiE,ClivioA,NicoliniG,etal.Volumetricmodulatedarc radiotherapyforcarcinomasoftheoropharynx,hypopharynxand larynx:atreatmentplanningcomparisonwithfixedfieldimrt [J].RadiotherOncol,2009,92(1):111-7. [7] OliverM,AnsbacherW,Beckham W A.Comparingplanning time,deliverytimeandplanqualityforimrt,rapidarcandtomo therapy[j].japplclinmedphys,2009,10(4):117-31. [8] ZhangP,HappersetL,HuntM,etal.Volumetricmodulatedarc therapy:planningandevaluationforprostatecancercases[j].int JRadiatOncolBiolPhys,2010,76(5):1456-62. Dosimetriccomparisonofintensitymodulatedradiotherapywith volumetricmodulatedarctherapyforsimultaneousmodulated acceleratedradiotherapyofnasopharyngealcarcinoma TangZhengzhong,WuAidong,QianLiting,etal (DeptofRadiationOncology,TheAfiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230001) Abstract 21patientsforNPCtreatedwithsimultaneousmodulatedacceleratedradiotherapy(SMART)werese lectedrandomly.botha9 fieldstepandshootimrt(simrt)planandadouble arcvolumetricmodulatedarc therapy(vmat)weredesignedforeachpatientusingthesameprescribeddoseandoptimizationconstraints.al planswereoptimizedtomeettherequirementof95% planningtargetvolume(ptv)coveredbyprescribeddose. ThedosimetricparametersofPTVandorganatrisk(OAR),themonitorunits(MU)andmeandeliverytimewere compared.theptvmaximumdose(d max ),PTVminimumdose(D min ),andhomogeneityindex(hi)werestatis ticalysimilarbetweenthesimrtandvmatplans,respectively.however,theconformalityindex(ci)ofvmat planhadastatisticalysignificantincrease(t=-3 86,P<0 05).ThemeandosetoPGTVnd,PTV1andPTV2of VMATplanwasalsolowerthanthatofthesIMRTplanandthereweresignificantdiferences.Themaximumdoseof brain stem,spinalcord,opticchiasmandparotidd 60% byvmatplanningweresignificantlylowerthanthoseby simrtplanning(p<0 05).ThenormaltisueV 5,V 15 andv 20 invmatplanwasslightlyhigherthanthoseof simrtplan(p>0 05),however,theVMATplanswerestatisticalysignificantreductionintermsofV 20,V 25, V 30,V 35,V 40,V 45,V 50 andmeandoseofthenormaltisue(p<0 05,P<0 01).Thetotalmonitorunitsand meandeliverytimeofvmatweresignificantlylowerbyabout14.2% and68.8% incomparisonwiththatbythe simrtrespectively. Keywords nasopharyngealneoplasm/radiotherapy;simultaneousmodulatedacceleratedradiotherapy;volumetric modulatedarctherapyradiotherapy;stepandshootimrt;dosimetry

1168 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 右 美 托 咪 定 对 Supreme 喉 罩 置 入 丙 泊 酚 EC 50 的 影 响 李 云 1, 王 斌 1,2, 张 野 1, 胡 宪 文 1 1, 翁 立 军 摘 要 择 期 全 麻 妇 科 手 术 患 者 64 例 (ASAⅠ ~Ⅱ 级 ), 随 机 分 为 两 组 : 对 照 组 和 右 美 托 咪 定 (Dex) 组 Dex 组 麻 醉 诱 导 前 静 脉 泵 注 Dex1.0μg/kg(15min), 对 照 组 给 予 等 量 生 理 盐 水 麻 醉 诱 导 予 以 瑞 芬 太 尼 2μg/kg 复 合 丙 泊 酚 靶 控 输 注 (TCI), 按 Dixon 序 贯 法 调 节 丙 泊 酚 的 效 应 室 靶 浓 度, 初 始 浓 度 为 3.0μg/ml, 如 果 出 现 插 喉 罩 阳 性 反 应, 则 使 用 上 一 级 浓 度 ; 如 果 出 现 阴 性 反 应, 则 使 用 下 一 级 浓 度 计 算 Supreme 喉 罩 置 入 时 丙 泊 酚 半 数 有 效 浓 度 (EC 50 ) 和 95% 可 信 区 间 (95% CI) 结 果 显 示 对 照 组 Supreme 喉 罩 置 入 时 丙 泊 酚 的 EC 50 为 2.27μg/ml,95%CI 为 2 20~2 33μg/ml Dex 组 Supreme 喉 罩 置 入 时 丙 泊 酚 的 EC 50 为 1 57μg/ml,95%CI 为 1 47~1 68μg/ml 关 键 词 度 中 图 分 类 号 右 美 托 咪 定 ; 丙 泊 酚 ; 靶 控 输 注 ; 喉 罩 ; 半 数 有 效 浓 R614.2;R971.2 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1168-04 右 美 托 咪 定 (dexmedetomidine,dex) 是 一 种 高 选 择 性 α 2 肾 上 腺 素 受 体 激 动 剂, 具 有 抗 交 感 镇 静 遗 忘 抗 焦 虑 抗 应 激 反 应 的 作 用, 可 以 减 少 麻 醉 剂 的 用 量 并 减 轻 气 管 插 管 反 应, 在 临 床 实 践 中 具 有 重 要 价 值 [1] 丙 泊 酚 把 控 输 注 技 术 已 在 临 床 中 广 泛 应 用 [2], 然 而 目 前 研 究 Dex 对 麻 醉 诱 导 时 瑞 芬 太 尼 联 合 靶 控 输 注 丙 泊 酚 抑 制 插 入 喉 罩 反 应 的 半 数 有 效 浓 度 影 响 尚 鲜 有 报 道 该 研 究 旨 在 观 察 Dex 对 瑞 芬 太 尼 复 合 丙 泊 酚 靶 控 输 注 (target controledinfusion, TCI) 麻 醉 Supreme 喉 罩 (SLMA) 置 入 时 丙 泊 酚 半 数 有 效 浓 度 (medianefectiveconcentration,ec 50 ) 的 影 响, 为 临 床 应 用 提 供 参 考 1 材 料 与 方 法 1.1 病 例 资 料 选 择 择 期 全 麻 下 妇 科 手 术 患 者 64 例,ASAⅠ 或 Ⅱ 级, 年 龄 18~45(37 5±8 3) 岁, 体 重 45~65kg 排 除 标 准 : 有 循 环 神 经 系 统 肝 肾 2014-03-20 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 教 育 厅 基 金 ( 编 号 :KJ20132117) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 第 二 附 属 医 院 麻 醉 科, 合 肥 230601 2 皖 南 医 学 院 弋 矶 山 医 院 麻 醉 科, 芜 湖 241001 作 者 简 介 : 李 云, 男, 副 主 任 医 师 ; 张 野, 男, 教 授, 主 任 医 师, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:zhangye_hasan@sina.com 等 重 要 脏 器 功 能 障 碍 ;Malampati 分 级 Ⅲ 或 Ⅳ 级, 头 颈 活 动 受 限, 张 口 度 <2 5cm; 体 重 指 数 30kg/ m 2 ; 术 前 长 期 服 用 镇 痛 或 镇 静 药 物 史 患 者 随 机 分 为 Dex 组 和 对 照 组 本 研 究 经 患 者 知 情 同 意 及 本 院 医 学 伦 理 委 员 会 批 准 1.2 主 要 药 物 与 仪 器 Dex( 批 号 :13011434, 江 苏 恒 瑞 医 药 股 份 有 限 公 司 ); 丙 泊 酚 ( 批 号 :JT943, 阿 斯 利 康 公 司 ); 瑞 芬 太 尼 ( 批 号 :6130105, 宜 昌 人 福 药 业 有 限 公 司 ); 多 功 能 生 命 体 征 监 护 仪 (Philips MP50, 美 国 Philips 公 司 ); 多 功 能 麻 醉 机 (Ohmeda, 美 国 Ohmeda 公 司 ) 1.3 麻 醉 方 法 患 者 未 用 术 前 药, 入 室 后 开 放 上 肢 静 脉, 多 功 能 生 命 体 征 监 护 仪 连 续 监 测 平 均 动 脉 压 (mean arterialpresure,map) 心 率 (heartrate, HR) 脉 搏 氧 饱 和 度 (pulseoxygensaturation,spo 2 ) 呼 气 末 二 氧 化 碳 分 压 (end tidalcarbondioxidepartial presure,p ET CO 2 ) 和 脑 电 双 频 指 数 (bispectralindex, BIS) 麻 醉 开 始 前 两 组 均 预 输 注 6ml/kg 乳 酸 钠 林 格 氏 液, 随 后 持 续 输 注 10ml/(kg h) 乳 酸 钠 林 格 氏 液 Dex 组 给 予 Dex1.0μg/kg( 原 液 2mg 用 生 理 盐 水 稀 释 至 50ml, 即 4μg/ml) 静 脉 泵 注 15min, 对 照 组 给 予 同 等 量 的 生 理 盐 水 静 脉 泵 注 丙 泊 酚 采 用 靶 控 输 注 (Marsh 药 代 动 力 学 模 型 ), 达 效 应 室 浓 度 后 且 BIS<60 时, 缓 慢 静 推 瑞 芬 太 尼 2μg/kg,2 min 后 置 入 SLMA 丙 泊 酚 的 初 始 靶 浓 度 为 3 0μg/ ml, 依 次 降 低 丙 泊 酚 靶 浓 度, 每 次 降 低 0 2μg/ml 以 出 现 SLMA 阳 性 反 应 ( 置 入 失 败 ) 的 上 一 级 为 入 选 本 研 究 的 第 1 例, 共 56 例 患 者 纳 入 本 研 究 进 行 统 计 分 析 按 Dixon 序 贯 法 调 节 丙 泊 酚 的 靶 控 浓 度 : 如 果 SLMA 阳 性 反 应, 则 后 一 例 患 者 靶 浓 度 增 加 0 2μg/ml; 如 果 SLMA 阴 性 反 应 ( 置 入 成 功 ), 则 后 一 例 患 者 靶 浓 度 降 低 0 2μg/ml 采 用 改 良 Muzi 评 分 ( 下 颌 活 动 度 : 完 全 松 弛 1 分, 轻 度 抵 抗 2 分, 紧 但 能 张 开 3 分, 关 闭 4 分 ; 咳 嗽 和 体 动 : 均 为 1 分,1 次 或 2 次 咳 嗽 为 2 分,3 次 或 多 次 咳 嗽 为 3 分, 呛 咳 / 体 动 4 分 ) 和 SLMA 置 入 后 MAP HR 的 变 化 评 价 SLMA 置 入 情 况, 一 次 操 作 不 能 满 足 SLMA 置 入 成 功 标 准 者 均 视 为 置 入 失 败 ( 通 过 加 深 麻 醉 再 次 行 SLMA 置 入 或 更 换 为 气 管 导 管 ) 丙 泊 酚 TCI SLMA

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1169 置 入 和 SLMA 置 入 情 况 的 评 估 分 别 由 不 同 麻 醉 医 师 独 立 执 行 SLMA 阴 性 反 应 的 标 准 为 :Muzi 评 分 中 2 项 评 价 指 标 即 下 颌 活 动 度 和 咳 嗽 体 动 的 评 价 均 2 及 SLMA 置 入 后 3min 内 MAP 和 HR 增 加 不 超 过 基 础 值 20% 当 MAP<7.3kPa 或 下 降 幅 度 > 基 础 值 30% 时 给 予 麻 黄 碱 5~10mg 静 脉 注 射, 若 HR <50 次 /min, 给 予 阿 托 品 0 3~0 5mg 静 脉 注 射 1.4 观 察 指 标 患 者 常 规 监 测 MAP HR SPO 2 P ET CO 2, 记 录 注 药 前 (T 1 ) 麻 醉 诱 导 前 (T 2 ) SLMA 置 入 前 (T 3 ) 和 置 入 后 1min(T 4 ) 3min(T 5 ) 的 血 流 动 力 学 参 数 记 录 每 个 靶 浓 度 的 有 效 病 例 数 无 效 病 例 数 及 置 入 SLMA 成 功 率 采 用 Dixon 序 贯 法 计 算 两 组 50% 患 者 置 入 SL MA 时 所 需 的 丙 泊 酚 EC 50 和 EC 50 的 95% 可 信 区 间 (95% CI), 具 体 计 算 过 程 如 下 : 记 录 各 组 各 靶 浓 度 下 SLMA 阳 性 反 应 的 例 数 (s) 和 阴 性 反 应 的 例 数 (r), 计 算 各 靶 浓 度 的 对 数 (LogX) 及 该 浓 度 下 SLMA 阳 性 反 应 和 阴 性 反 应 的 例 数 之 和 (n),slma 置 入 成 功 率 (p), 两 相 邻 靶 浓 度 对 数 的 差 值 (d),ec 50 的 标 准 误 记 为 Sm EC 50 的 对 数 值 :logec 50 = nlogx/ n EC 50 的 95% CI 的 对 数 值 :(logec 50-1.96 SmlogEC 50,logEC 50 +1 96 SmlogEC 50 ), 其 中 SmlogEC 50 =d 槡 p(1-p)/(n-1 ) 1.5 统 计 学 处 理 采 用 SPSS13.0 统 计 软 件 进 行 分 析 计 量 资 料 用 x±s 珋 表 示 组 内 比 较 采 用 重 复 测 量 数 据 的 方 差 分 析 ; 组 间 比 较 采 用 t 检 验 两 组 丙 泊 酚 EC 50 比 较 采 用 两 组 独 立 样 本 的 μ 检 验 2.2 喉 罩 置 入 前 后 的 血 流 动 力 学 比 较 与 T 1 时 比 较, 对 照 组 T 4~5 时 MAP 均 明 显 降 低 (t=3 054 2 482;P<0 05,P<0 01) T 3~5 时 HR 明 显 减 慢 (t =5 820 3 583 2 572;P<0 05,P<0 01),Dex 组 T 4~5 时 MAP 明 显 降 低 (t=3 054 2 482;P<0 05,P <0 01) T 2~5 时 HR 明 显 减 慢 (t=5 905 6 690 6 029 4 238;P<0 01); 与 对 照 组 比 较,Dex 组 T 3 时 MAP 明 显 升 高 T 2 时 HR 明 显 减 慢 (t=-2 138 5 745;P<0 05,P<0 01) 见 表 2 2.3 丙 泊 酚 的 EC 50 对 照 组 31 例 患 者 中 从 SLMA 阴 性 反 应 与 阳 性 反 应 交 叉 出 现 时 的 病 例 开 始 计 算, 共 28 例 纳 入 序 贯 法 中 进 行 结 果 的 计 算,SLMA 阴 性 反 应 和 阳 性 反 应 的 例 数 均 为 14 例, 见 图 1 Dex 组 33 例 患 者 中 从 SLMA 阴 性 反 应 与 阳 性 反 应 交 叉 出 现 时 的 病 例 开 始 计 算, 共 28 例 纳 入 序 贯 法 中 进 行 结 果 的 计 算,SLMA 阴 性 反 应 和 阳 性 反 应 的 例 数 分 别 为 15 例 和 13 例, 见 图 2 采 用 序 贯 法 计 算 对 照 组 丙 泊 酚 EC 50 为 2 27μg/ml(95% 的 可 信 区 间 为 2 20 ~2 33μg/ml),Dex 组 丙 泊 酚 EC 50 为 1.57μg/ml (95% 的 可 信 区 间 为 1 47~1 68μg/ml),Dex 组 明 显 低 于 对 照 组 (P<0 05) 2 结 果 2.1 一 般 情 况 两 组 患 者 年 龄 体 重 身 高 等 差 异 无 统 计 学 意 义 (t=0 865 0 688 0 777;P>0.05), 见 表 1 表 1 两 组 患 者 的 一 般 资 料 比 较 (n=28, x±s) 珋 组 别 年 龄 ( 岁 ) 体 重 (kg) 身 高 (cm) 对 照 36.5±7.1 56.7±8.5 160.1±6.6 Dex 38.4±9.2 55.3±6.6 158.8±5.9 图 1 对 照 组 不 同 丙 泊 酚 靶 浓 度 SLMA 置 入 反 应 序 贯 图 3 讨 论 选 择 合 适 的 麻 醉 方 法 和 药 物 剂 量 是 减 少 麻 醉 不 表 2 两 组 患 者 喉 罩 置 入 前 后 的 MAP 和 HR 的 比 较 (n=28, x±s) 珋 指 标 T 1 T 2 T 3 T 4 T 5 MAP(kPa) 对 照 11.5±0.9 11.2±1.0 9.8±0.9 9.5±1.2 ## 9.7±1.7 # Dex 11.1±1.1 11.3±1.1 10.4±1.2 10.1±1.3 ## 10.3±1.1 # HR( 次 /min) 对 照 78.7±11.2 77.5±10.6 62.2±10.0 ## 66.7±13.7 ## 69.1±16.3 # Dex 75.6±9.2 63.0±8.1 ## 60.6±8.7 ## 61.5±9.6 ## 64.0±13.3 ## 与 T 1 时 比 较 : # P<0.05, ## P<0.01; 与 对 照 组 比 较 : P<0.05, P<0.01

1170 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 现 时 的 病 例 开 始 计 算, 依 次 降 低 丙 泊 酚 浓 度, 浓 度 梯 度 为 0.2μg/ml, 观 察 SLMA 置 入 时 的 反 应 如 出 现 阳 性 反 应, 则 增 加 丙 泊 酚 浓 度 直 至 反 应 消 失 ; 反 之, 若 出 现 阴 性 反 应, 则 降 低 丙 泊 酚 浓 度, 观 察 连 续 的 置 入 反 应 阳 性 阴 性 拐 点 单 独 靶 控 输 注 丙 泊 酚 行 麻 醉 诱 导 时, 丙 泊 酚 抑 制 喉 罩 插 管 反 应 的 EC 50 为 3 25 μg/ml [11], 而 本 研 究 结 果 表 明, 瑞 芬 太 尼 2μg/kg 联 合 靶 控 输 注 丙 泊 酚 抑 制 插 入 SLMA 反 应 的 丙 泊 酚 EC 50 降 低 为 2.27μg/ml, 而 给 予 Dex 后 丙 泊 酚 EC 50 降 低 为 1 57μg/ml 图 2 Dex 组 不 同 丙 泊 酚 靶 浓 度 SLMA 置 入 反 应 序 贯 图 良 反 应 降 低 麻 醉 风 险 的 关 键 喉 罩 不 插 入 声 门 和 气 管 不 使 用 咽 喉 镜 对 咽 喉 部 刺 激 小, 故 已 广 泛 应 用 于 临 床 SLMA 是 根 据 食 管 引 流 型 喉 罩 的 原 理 而 研 制 出 的 新 型 一 次 性 喉 罩, 不 仅 避 免 了 交 叉 感 染, 而 且 SLMA 引 导 柄 的 弯 曲 度 符 合 口 咽 喉 部 的 生 理 解 剖 曲 度, 使 得 置 入 喉 罩 易 于 操 作, 且 对 位 更 加 精 准 [3] 丙 泊 酚 是 短 效 的 静 脉 麻 醉 药, 可 有 效 降 低 咽 喉 部 反 射, 广 泛 应 用 于 全 麻 诱 导 期 喉 罩 的 置 入, 然 而 若 单 独 应 用 丙 泊 酚, 常 需 要 较 大 剂 量 才 能 完 成 此 操 作 [4] 瑞 芬 太 尼 镇 痛 效 果 强, 起 效 迅 速, 作 用 时 间 短, 无 蓄 积 作 用, 与 丙 泊 酚 复 合 应 用 于 喉 罩 插 入 是 理 想 的 配 伍 [5] [6-7], 研 究 表 明 瑞 芬 太 尼 能 够 减 少 丙 泊 酚 置 入 喉 罩 的 用 量 Dex 是 一 种 高 选 择 性 的 α 2 肾 上 腺 素 受 体 激 动 剂, 通 过 降 低 交 感 神 经 活 性 和 镇 静 作 用, 有 效 抑 制 手 术 应 激 状 态 下 异 常 增 高 的 血 压 和 HR, 保 持 血 流 动 力 学 稳 定, 联 合 使 用 Dex 可 明 显 减 少 其 他 麻 醉 药 的 用 量 [8-9] Dex 复 合 丙 泊 酚 喉 罩 置 入 时 更 能 有 效 地 保 持 自 主 呼 吸, 但 目 前 Dex 对 麻 醉 诱 导 时 瑞 芬 太 尼 联 合 靶 控 输 注 丙 泊 酚 抑 制 插 入 SLMA 反 应 的 EC 50 影 响 研 究 较 少 Dex 对 血 流 动 力 学 的 影 响, 受 剂 量 和 给 药 速 率 的 影 响, 大 剂 量 使 用 时 可 以 直 接 收 缩 血 管 导 致 血 压 升 高 HR 下 降 明 显, 因 此 本 研 究 选 择 缓 慢 泵 注 Dixon 序 贯 法 也 称 上 下 法 或 阶 梯 法, 是 将 研 究 对 象 序 贯 地 进 行 实 验, 其 优 点 是 可 以 由 尽 量 少 的 病 例 得 出 结 论, 不 仅 可 以 节 省 时 间 和 人 力, 而 且 可 以 避 免 用 欠 佳 的 方 法 治 疗 过 多 的 病 例, 使 用 Dixon 序 贯 法 需 具 备 条 件 是 所 采 用 剂 量 便 于 更 换 且 实 验 结 果 快 速 出 现 [10] 采 用 序 贯 法 计 算 EC 50 时, 应 选 择 一 个 接 近 50% 反 应 率 的 剂 量 或 浓 度 作 为 起 始 剂 量 或 浓 度, 因 此, 本 研 究 从 SLMA 阴 性 反 应 与 阳 性 反 应 交 叉 出 参 考 文 献 [1] CaroloDS,NosamanBD,RamadhyaniU.Dexmedetomidine: areview ofclinicalapplications[j].curopinanaesthesiol, 2008,21(4):457-61. [2] YangW H,GuHB,ChenB,etal.EvaluationofSLOG/TCI I pediatricsystemontargetcontrolinfusionofpropofol[j].jtransl Med,2011,9:187. [3] EschertzhuberS,BrimacombeJ,HohlriederM,etal.TheLaryn gealmaskairwaysupreme TM asingleuselaryngealmaskairway withanoesophagealvent.arandomised,cros overstudywiththe LaryngealMaskAirwayProSeal TM inparalysed,anaesthetisedpa tients[j].anaesthesia,2009,64(1):79-83. [4] RichebéP,RivalanB,BaudouinL,etal.Comparisonofthean aestheticrequirementwithtarget controledinfusionofpropofolto insertthelaryngealtubevs.thelaryngealmask[j].eurjanaes thesiol,2005,22(11):858-63. [5] KimM K,LeeJW,JangDJ,etal.Efect siteconcentrationof remifentanilforlaryngealmaskairwayinsertionduringtarget con troledinfusionofpropofol[j].anaesthesia,2009,64(2):136-40. [6] ParkHJ,LeeJR,KimCS,etal.RemifentanilhalvestheEC 50 ofpropofolforsuccesfulinsertionofthelaryngealmaskairwayand laryngealtubeinpediatricpatients[j].anesthanalg,2007,105 (1):57-61. [7] KimHS,ParkHJ,KimCS,etal.Combinationofpropofoland remifentaniltarget controledinfusionforlaryngealmaskairwayin sertioninchildren[j].minervaanestesiol,2011,77(7):687-92. [8] RamadhyaniU,ParkJL,CaroloDS,etal.Dexmedetomidine: clinicalapplicationasanadjunctforintravenousregionalanesthe sia[j].anesthesiolclin,2010,28(4):709-22. [9] GerlachAT,MurphyCV,DastaJF.Anupdatedfocusedreview ofdexmedetomidineinadults[j].annpharmacother,2009,43 (12):2064-74. [10] GooEK,OhAY,ChoSJ,etal.Optimalremifentanildosagefor intubationwithoutmusclerelaxantsinelderlypatients[j].drugs Aging,2012,29(11):905-9. [11]KodakaM,OkamotoY,HandaF,etal.Relationbetweenfenta nyldoseandpredictedec 50 ofpropofolforlaryngealmaskinsertion [J].BrJAnaesth,2004,92(2):238-41.

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1171 影 响 神 经 胶 质 瘤 术 后 生 存 的 相 关 因 素 分 析 程 毅 飞, 张 晓 东, 万 强, 洪 文 清, 张 昊 摘 要 回 顾 性 分 析 119 例 脑 胶 质 瘤 术 后 患 者 临 床 资 料, 以 选 定 的 10 项 因 素 为 变 量, 生 存 状 况 为 结 局 进 行 Kaplan Meier 法 分 析,Log Rank 检 验, 以 P<0 05 为 统 计 学 有 意 义 的 参 数 应 用 多 因 素 COX 回 归 模 型 分 析 单 因 素 分 析 表 明, 患 者 发 病 年 龄 50 岁 低 KPS 评 分 高 级 别 肿 瘤 病 理 分 级 肿 瘤 组 织 高 Ki 67 指 数 及 术 后 不 进 行 放 疗 患 者 预 后 较 差 (P< 0 05); 多 因 素 分 析 表 明,KPS 评 分 病 理 分 级 Ki 67 指 数 及 术 后 放 疗 对 胶 质 瘤 患 者 预 后 有 影 响 (P<0 05,P<0 01) 关 键 词 胶 质 瘤 ; 手 术 ; 生 存 分 析 ; 预 后 ; 生 存 率 中 图 分 类 号 R730.264 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1171-03 2014-02-17 接 收 基 金 项 目 : 卫 生 部 课 题 项 目 ( 编 号 :W200601024) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 神 经 外 科, 合 肥 230022 作 者 简 介 : 程 毅 飞, 男, 硕 士 研 究 生 ; 张 晓 东, 男, 副 教 授, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:zhangxiaodongayfy@163.com 神 经 胶 质 瘤 是 颅 内 常 见 恶 性 肿 瘤, 约 占 颅 内 肿 瘤 的 50% [1] 因 其 生 物 学 行 为 多 呈 浸 润 性 生 长, 由 于 手 术 难 以 彻 底 切 除 造 成 复 发 率 高, 严 重 影 响 患 者 的 生 存 质 量 目 前 神 经 胶 质 瘤 的 治 疗 方 法 仍 以 手 术 治 疗 为 主, 放 疗 化 疗 结 合 的 综 合 治 疗 [2] 该 研 究 应 用 统 计 学 单 因 素 多 因 素 方 法 分 析 神 经 胶 质 瘤 患 者 术 后 生 存 期 及 影 响 因 素, 评 价 手 术 预 后, 并 对 患 者 进 行 生 存 预 测, 为 更 好 地 指 导 临 床 工 作 1 材 料 与 方 法 1.1 一 般 临 床 资 料 回 顾 性 分 析 2008 年 1 月 ~ 2010 年 12 月 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 神 经 外 科 资 料 齐 全 的 手 术 治 疗 患 者 119 例, 病 理 证 实 为 胶 质 瘤, 且 为 首 次 诊 断 术 后 平 均 3 个 月 进 行 一 次 门 诊 或 电 话 随 访, 随 访 截 止 至 2013 年 1 月, 集 中 对 以 上 患 者 手 术 后 恢 复 及 死 亡 情 况 进 行 电 话 随 访 或 直 接 访 问, 随 访 已 死 亡 者 获 完 全 数 据, 术 后 死 亡 术 后 死 于 EfectofdexmedetomidineontheEC 50 ofpropofolforinhibiting theinsertionreactionofthesupremelaryngealmaskairway LiYun 1,WangBin 1,2,ZhangYe 1,etal ( 1 DeptofAnesthesiology,TheSecondAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230601; 2 DeptofAnesthesiology,YijishanHospitalofWannanMedicalColege,Wuhu 241001) Abstract Sixty fourpatients(asaⅠ ~Ⅱ)scheduledforelectivegynecologicaloperationundergeneralanesthe siawereenroledinthisstudy.alpatientswererandomlydividedintotwogroups:controlgroupanddexmedetomi dine(dex)group.inthedexgroupthepatientsreceiveddex1.0μg/kgintravenouslywithin15minutesbefore inductionofanesthesia.inthecontrolgroupthepatientsreceivedequalvolumeofsaline.propofolwasusedtoin ductionofanesthesiabytarget controledinfusion(tci)combinedwith2μg/kgremifentanil.theinitialtarget propofolefectiveconcentrationwas3.0μg/ml,folowedbyreducingtheconcentrationofpropofol,eachtime0.2 μg/ml.theefectiveconcentrationoftarget controledpropofolwasdeterminedbydixon ssequentialmethod.if thesupremelaryngealmaskairway(slma)wasinsertedsuccesfuly,thepreviousconcentrationwasselected; otherwise,thenextlevelofconcentrationwasselected.themedianefectiveconcentration(ec 50 )and95%confi denceinterval(95%ci)ofpropofolforinhibitionoftheresponsetoslma insertionwerecalculated.ec 50 of propofoltcicombinedwith2μg/kgremifentanilforinsertingslmawas2.27μg/ml(95%ci2 20~2 33μg/ ml)inthecontrolgroupand1 57μg/ml(95%CI1 47~1 68μg/ml)intheDexgroup. Keywords dexmedetomidine;propofol;target controledinfusion;laryngealmask;medianefectiveconcentra tion

1172 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 非 原 发 病 者 和 失 去 随 访 者 获 取 截 尾 数 据 以 性 别 年 龄 术 前 KPS 评 分 肿 瘤 病 理 分 级 等 10 项 因 素 为 解 释 变 量, 见 表 1 1.2 治 疗 依 据 肿 瘤 术 前 MRI 图 像 表 现 确 定 手 术 范 围, 尽 可 能 全 切 肿 瘤 ; 位 于 功 能 区 肿 瘤 则 在 保 护 正 常 神 经 功 能 基 础 上 尽 可 能 切 除 ; 高 级 别 胶 质 瘤 (high gradeglioma,hgg) 术 后 进 行 放 疗 ( 采 用 直 线 加 速 器 放 疗, 剂 量 为 每 次 2Gy, 共 30 次, 总 剂 量 60 Gy) 和 ( 或 ) 化 疗 ( 化 疗 方 案 为 以 下 三 种 方 案 中 的 一 种 :1 替 尼 泊 苷 300mg/(m 2 d),3d;2 尼 莫 司 汀 2mg/(kg d),1d;3 替 莫 唑 胺 150mg/(m 2 d),6d, 低 级 别 胶 质 瘤 (low gradeglioma,lgg) 患 者 术 后 肿 瘤 复 发 或 生 长 较 快 或 未 能 全 切 时 进 行 放 疗,2 周 后 进 行 化 疗 [ 主 要 方 案 为 尼 莫 司 汀 2mg/(kg d),1d] LGG 患 者 术 后 未 放 疗 者 5 例, 放 化 疗 结 合 者 26 例,HGG 单 纯 放 疗 9 例, 放 化 疗 结 合 57 例 ; 根 据 术 后 早 期 复 查 MRI 并 结 合 医 师 术 中 所 见 判 断 手 术 切 除 程 度, 其 中 手 术 全 切 者 90 例,29 例 为 次 全 切 出 或 仅 取 到 病 理 标 本 1.3 统 计 学 处 理 使 用 SPSSStatistics19 进 行 统 计 分 析 采 用 Kaplan Meier 法 进 行 单 因 素 分 析, 用 存 活 时 间 结 局 作 为 因 变 量, 死 亡 =1, 生 存 =0, 生 存 时 间 以 患 者 手 术 日 期 至 死 亡 日 期 或 最 后 一 次 随 访 日 期 计 算, 考 察 临 床 采 集 的 10 项 因 子 对 其 影 响, 采 用 Log Rank 法 进 行 检 验, 对 于 P<0 05 者 进 行 多 因 素 COX 回 归 模 型 分 析 表 1 Kaplan Meier 单 因 素 分 析 项 目 n 中 位 生 存 期 最 短 生 存 期 / ( 月 ) 最 长 生 存 期 ( 月 ) 性 别 男 66 21 1/59 女 53 18 1/55 年 龄 ( 岁 ) <50 70 24 3/59 50 49 10 1/31 病 理 分 级 LGG 36 43 8/59 HGG 83 15 1/33 术 前 KPS 70 63 26 3/59 <70 56 13 1/50 肿 瘤 直 径 (mm) 5 89 18 1/59 <5 30 24 4/51 手 术 切 除 范 围 全 切 除 90 21 1/59 次 全 切 除 29 12 1/35 术 前 有 无 癫 痫 有 14 26 5/59 无 105 18 1/56 Ki 67 指 数 <10% 77 35 4/59 10% 42 13 1/26 术 后 放 疗 有 92 21 2/59 无 27 12 1/46 术 后 化 疗 有 91 20 3/59 无 28 18 1/59 表 2 COX 多 因 素 比 例 分 析 P 值 0.841 0.004 0.001 0.001 0.159 0.282 0.175 0.001 0.009 0.221 2 结 果 2.1 单 因 素 分 析 对 选 定 的 10 项 因 素 进 行 Kap lan Meier 法 分 析 后 表 明, 发 病 年 龄 术 前 KPS 评 分 肿 瘤 病 理 分 级 肿 瘤 组 织 Ki 67 指 数 及 术 后 是 否 放 疗 对 于 胶 质 瘤 患 者 预 后 有 影 响, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05), 见 表 1 2.2 多 因 素 分 析 对 患 者 发 病 年 龄 术 前 KPS 评 分 肿 瘤 病 理 分 级 肿 瘤 组 织 Ki 67 指 数 及 术 后 是 否 放 疗 5 个 因 素 进 行 COX 多 因 素 回 归 模 型 分 析 后 显 示, 术 前 KPS 评 分 肿 瘤 病 理 分 级 肿 瘤 组 织 Ki 67 指 数 及 术 后 是 否 放 疗 4 个 因 素 对 于 胶 质 瘤 患 者 预 后 有 影 响, 见 表 2 3 讨 论 目 前 公 认 病 理 分 级 和 年 龄 是 影 响 胶 质 瘤 预 后 的 因 素 β P 值 Exp(β) Age 0.012 0.050 1.017 KPS -0.210 0.001 0.979 病 理 级 别 1.085 0.001 2.961 Ki 67 0.019 0.017 1.019 术 后 放 疗 -0.922 0.004 0.398 因 素 本 研 究 通 过 Kaplan Meier 法 和 COX 多 因 素 回 顾 性 分 析 119 例 脑 胶 质 瘤 患 者 临 床 资 料 表 明, 发 病 年 龄 肿 瘤 病 理 分 级 手 术 切 除 程 度 术 前 KPS 评 分 术 后 行 放 疗 是 胶 质 瘤 患 者 术 后 生 存 独 立 危 险 因 [3-4] 素 多 数 研 究 表 明, 患 者 发 病 年 龄 及 术 前 KPS 评 分 是 影 响 胶 质 瘤 患 者 预 后 的 重 要 因 素 本 组 资 料 表 明, 首 次 发 病 年 龄 <50 岁 患 者 中 位 生 存 期 (24 个 月, 显 著 高 于 发 病 年 龄 50 岁 患 者 (10 个 月 ), 这 与 [4] 文 献 报 道 基 本 相 符, 除 其 他 儿 童 好 发 恶 性 肿 瘤 如 小 儿 髓 母 细 胞 瘤 外, 成 人 LGG 患 者 年 龄 >40 岁, 预

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1173 后 较 差 [5],Mikheevetal [6] 研 究 发 现, 成 人 恶 性 胶 质 瘤 随 年 龄 的 增 长, 胶 质 瘤 的 恶 性 程 度 会 增 加 且 治 疗 抗 性 更 强 KPS 评 分 是 影 响 胶 质 瘤 患 者 术 后 独 立 危 险 因 素,KPS 70 分 较 <70 分 患 者 中 位 生 存 期 延 长 13 个 月 胶 质 瘤 的 病 理 级 别 是 公 认 的 影 响 胶 质 瘤 预 后 独 立 危 险 因 素, 本 组 资 料 显 示, 低 级 别 组 较 高 级 别 组 患 者 中 位 生 存 期 明 显 延 长, 但 也 有 Philipponet al [7] 报 道 Ⅰ ~Ⅱ 级 胶 质 瘤 生 存 无 明 显 差 异, 甚 至 认 为 Ⅱ 级 生 存 质 量 优 于 Ⅰ 级, 这 表 明 单 纯 应 用 组 织 病 理 分 级 判 断 预 后 具 有 一 定 的 局 限 性 目 前 手 术 治 疗 为 神 经 胶 质 瘤 的 首 选, 但 目 前 手 术 后 患 者 预 后 仍 不 乐 观 本 组 患 者 生 存 模 型 表 明, 手 术 切 除 程 度 越 高, 其 中 位 生 存 期 延 长, 但 差 异 无 统 计 学 意 义, 表 明 胶 质 瘤 患 者 手 术 是 否 能 肉 眼 全 切 对 于 预 后 无 明 显 影 响 造 成 该 结 果 的 原 因 可 能 是 因 为 胶 质 瘤 多 呈 浸 润 性 生 长 常 伴 有 伪 足 [8], 肿 瘤 所 生 长 的 范 围 远 远 超 出 了 肉 眼 可 见 的 肿 瘤 边 界, 故 外 科 手 术 无 法 达 到 真 正 意 义 上 的 病 理 完 全 切 除 现 患 者 术 后 常 规 采 用 放 疗 化 疗 已 被 业 界 广 泛 认 同 和 应 用 [9-10] 本 研 究 表 明, 进 行 常 规 放 疗 和 化 疗 的 患 者 其 中 位 生 存 率 较 不 进 行 常 规 治 疗 的 患 者 有 明 显 提 高 参 考 文 献 [1] FabiA,MetroG,RusiloM,etal.Treatmentofrecurentmalig nantgliomawithfotemustinemonotherapy:impactofdoseandcor relationwithmgmt promotermethylation[j]. BMC Cancer, 2009,31(9):101. [2] JacksonM,BydderS,MaujeanE.Radiotherapyinthemanage mentofhigh gradegliomasdiagnosedinwesternaustralia:apat ternsofcarestudy[j].jmedimagingradiatoncol,2012,56 (1):109-15. [3] LorenzoniJ,ToricoA,VilanuevaP,etal.Surgeryforhigh grade gliomasinadevelopingcountry:survivalestimationusingasimple stratificationsystem[j].surgicalneurology,2008,70(6):591-7. [4] 朱 浩, 沈 宏, 徐 锦 芳, 等. 脑 功 能 区 胶 质 瘤 预 后 相 关 因 素 分 析 [J]. 中 国 神 经 肿 瘤 杂 志,2012,10(4):240-5. [5] PignatiF,vandenBentM,CuranD,etal.Prognosticfactorsfor survivalinadultpatientswithcerebrallow gradeglioma[j].j ClinOncol,2002,20(8):2076-84. [6] MikheevAM,RamakrishnaR,StolEA,etal.Increasedageof transformedmouseneuralprogenitor/stem celsrecapitulatesage dependentclinicalfeaturesofhumangliomamalignancy[j].ag ingcel,2012,11(6):1027-35. [7] PhilipponJH,ClemneeanSH,FauehonFH,etal.Supratento riallow gradeastrocytomasinadults[j].neurosurgery,1993,32 (4):554-9. [8] WenPY,KesariS.Malignantgliomasinadults[J].EnglJMed, 2008,359(5):492-507. [9] 汪 洋, 盛 晓 芳, 高 晶. 高 分 级 神 经 胶 质 瘤 112 例 术 后 放 化 疗 疗 效 及 其 预 后 分 析 [J]. 肿 瘤,2009,29(7):668-9. [10] WakabayashiT,NatsumeA,FujiM.Chemotherapyformalignant gliomas:anupdate[j].gantokagakuryoho,2013,40(10): 1283-7. Clinicalresearchontheprognositicfactorsinpatients afteroperationwithglioma ChengYifei,ZhangXiaodong,WanQiang,etal (DeptofNeurosurgery,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022) Abstract Clinicaldataof119gliomapatientswereretrospectivelyreviewed,and10factorswereasignedasvari antsandsurvivalstatuswasestimatedusingkaplan Meiersurvivalanalysis,andLog Ranktest.Statisticalysignifi cantparameterswithp<0 05wereappliedtomultivariateCOXregresionanalysis.Unilabiateanalysisshowed thatpatientswithage 50,lowKPS,highgrade,highKi 67indexandpostoperativeradiotherapysuferedpoor prognosis(p<0 05).MultivariateCOXanalysisshowedthatpreoperativeKPSscore,pathologicgrade,Ki 67in dexandpostoperativeradiotherapywereinvolvedinprognosisofgliomapatients(p<0.05,p<0 01). Keyword glioma;surgery;survivalanalysis;prognosis;survivalrate

1174 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 葡 萄 糖 转 运 蛋 白 1 在 人 肝 细 胞 癌 中 的 表 达 及 临 床 意 义 卢 贤 映 1,2, 高 群 2 1, 吴 文 涌 摘 要 应 用 免 疫 组 织 化 学 技 术 检 测 100 例 人 肝 细 胞 癌 (HCC) 肿 瘤 组 织 和 相 应 癌 旁 非 肿 瘤 组 织 中 葡 萄 糖 转 运 蛋 白 1(GLUT1) 的 表 达 情 况 GLUT1 在 HCC 肿 瘤 组 织 和 癌 旁 非 肿 瘤 组 织 中 阳 性 表 达 率 分 别 为 83 0% 和 65 0%, 两 者 之 间 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 01);HCC 肿 瘤 组 织 GLUT1 表 达 与 肿 瘤 大 小 临 床 TNM 分 期 均 呈 显 著 正 相 关 (P<0 05), 与 患 者 的 总 生 存 率 和 无 复 发 生 存 率 均 呈 显 著 负 相 关 (P< 0 01) 关 键 词 肝 细 胞 癌 ;GLUT1; 免 疫 组 织 化 学 中 图 分 类 号 R735.7 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1174-03 肝 癌 是 我 国 常 见 的 一 种 恶 性 肿 瘤, 其 发 病 率 和 死 亡 率 均 居 世 界 首 位 [1] 肿 瘤 细 胞 必 须 依 赖 于 宿 主 间 质 细 胞 的 支 持 才 能 够 无 限 增 殖 并 形 成 肿 瘤, 其 增 殖 过 程 中 所 需 的 能 量 决 定 其 生 长 速 度, 葡 萄 糖 转 运 蛋 白 1(glucosetransporter1,GLUT1) 是 细 胞 内 糖 转 运 和 代 谢 的 关 键 限 速 因 子, 在 维 持 细 胞 生 理 状 态 [2-3] 有 着 重 要 作 用 近 来 研 究 显 示 :GLUT1 在 多 种 恶 性 肿 瘤 中 高 表 达, 与 细 胞 恶 性 转 化 生 长 和 侵 袭 有 着 密 切 关 系 本 研 究 应 用 免 疫 组 织 化 学 技 术 检 测 肝 细 胞 肝 癌 (hepaticcelcarcinoma,hcc) 肿 瘤 组 织 及 癌 旁 非 肿 瘤 组 织 中 GLUT1 的 表 达 状 况, 分 析 其 与 患 者 临 床 病 理 特 征 和 预 后 的 关 系, 探 讨 其 在 HCC 预 后 评 估 中 的 临 床 意 义 1 材 料 与 方 法 1.1 病 例 资 料 收 集 2004 年 1 月 ~2007 年 8 月 安 2014-02-17 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 高 校 省 级 自 然 科 学 研 究 项 目 ( 编 号 :KJ2011Z211); 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 项 目 ( 编 号 :1208085MH169); 国 家 自 然 科 学 基 金 青 年 基 金 培 育 计 划 项 目 ( 编 号 :2009KJ05) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 普 通 外 科, 合 肥 230022 2 安 徽 省 儿 童 医 院 普 外 一 科, 合 肥 230051 作 者 简 介 : 卢 贤 映, 男, 主 治 医 师 ; 吴 文 涌, 男, 副 主 任 医 师, 博 士, 责 任 作 者,E mail:hfw wy2006@126.com 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 病 理 科 共 接 收 HCC 病 例 100 例, 男 84 例, 女 16 例, 年 龄 33~72(51 0±2 8) 岁 所 有 患 者 术 前 未 做 化 疗 免 疫 或 放 射 治 疗 HCC 患 者 均 有 详 细 生 存 资 料, 包 括 术 后 总 生 存 期 和 术 后 无 复 发 生 存 期 另 收 集 每 例 样 本 中 距 离 肿 瘤 组 织 边 缘 2cm 以 外 处 非 肿 瘤 性 肝 组 织 所 有 组 织 样 本 均 以 10% 福 尔 马 林 固 定, 石 蜡 包 埋, 行 HE 染 色, 组 织 病 理 学 证 实 诊 断 1.2 试 剂 与 方 法 浓 缩 型 鼠 抗 人 GLUT1 单 克 隆 抗 体 购 于 美 国 SantaCruz 公 司, 工 作 浓 度 1 100; 通 用 型 Envision 两 步 法 免 疫 组 织 化 学 试 剂 盒 及 DAB 显 色 剂 均 购 自 福 州 迈 新 公 司 ; 免 疫 组 织 化 学 操 作 步 骤 按 说 明 书 染 色 进 行 以 PBS 缓 冲 液 代 替 一 抗 作 阴 性 对 照 1.3 结 果 判 定 GLUT1 染 色 结 果 判 断 以 细 胞 质 或 细 胞 膜 出 现 明 显 的 黄 色 或 棕 黄 色 颗 粒 视 为 阳 性 着 [4] 色 阳 性 判 定 标 准 按 照 文 献 报 道, 每 个 样 本 随 机 计 数 五 个 高 倍 视 野 ( 400) 的 阳 性 细 胞 数, 取 其 平 均 值 代 表 每 个 高 倍 镜 视 野 下 GLUT1 细 胞 数, 其 中 1% 的 细 胞 着 色 视 为 阳 性 1.4 统 计 学 处 理 采 用 SPSS10 0 统 计 软 件 进 行 分 析 定 性 资 料 比 较 采 用 χ 2 检 验, 生 存 率 的 组 间 比 较 采 用 Kaplan Meier 生 存 曲 线 法 及 Log Rank 检 验 2 结 果 2.1 GLUT1 的 表 达 及 分 布 GLUT1 主 要 表 达 于 正 常 肝 细 胞 和 肿 瘤 细 胞, 定 位 于 细 胞 质 和 ( 或 ) 细 胞 膜 肝 癌 细 胞 一 般 呈 高 表 达, 而 癌 旁 肝 细 胞 表 达 较 弱, 见 图 1 100 例 HCC 肿 瘤 组 织 中 GLUT1 阳 性 表 达 率 为 83.0%,100 例 癌 旁 非 肿 瘤 组 织 中 GLUT1 阳 性 表 达 率 为 65.0%, 两 者 之 间 差 异 有 统 计 学 意 义 (P <0 01) 2.2 GLUT1 蛋 白 表 达 与 HCC 临 床 病 理 特 征 的 关 系 HCC 组 织 GLUT1 蛋 白 的 表 达 与 肿 块 大 小 肿 瘤 TNM 分 期 均 呈 显 著 正 相 关 (P<0 05), 而 与 患 者 年 龄 性 别 组 织 学 分 级 HBsAg 感 染 和 肝 硬 化 状 况 均 无 显 著 相 关 性 (P>0 05) 见 表 1

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1175 图 1 肝 细 胞 癌 和 癌 旁 非 肿 瘤 组 织 细 胞 中 GLUT1 的 表 达 200 A: 肝 细 胞 癌 ;B: 癌 旁 非 肿 瘤 组 织 表 1 肝 细 胞 癌 组 织 中 GLUT1 蛋 白 表 达 与 患 者 临 床 病 理 特 征 的 关 系 [n(%)] 临 床 病 理 特 征 n GLUT1 表 达 P 值 年 龄 ( 岁 ) 55 54 32(59.3) >55 36 19(52.8) 性 别 男 84 55(65.5) 女 16 10(62.57) 肝 硬 化 有 89 57(64.0) 无 11 8(72.7) HBsAg 阳 性 81 54(66.7) 阴 性 19 11(57.9) 肿 瘤 大 小 (cm) <5 30 15(50.0) 5 70 50(71.4) 组 织 学 分 级 Ⅰ 5 4(80.0) 0.543 0.819 0.569 0.471 0.040 Ⅱ 91 58(63.7) 0.693 Ⅲ 4 3(75.0) 临 床 分 期 Ⅰ ~Ⅱ 73 42(57.5) Ⅲ ~Ⅳ 27 23(85.2) 上 述 表 中 并 未 用 相 关 分 析, 而 是 χ 2 检 验 0.010 2.3 GLUT1 表 达 与 肝 细 胞 癌 患 者 预 后 关 系 采 用 Kaplan Meier 曲 线 法 和 Log Rank 检 验 对 GLUT1 表 达 与 肝 细 胞 癌 患 者 总 生 存 率 (overalsurvival,os) 和 无 复 发 生 存 率 (recurencefreesurvival,rfs) 关 系 进 行 单 因 素 生 存 分 析, 结 果 显 示 :HCC 患 者 中 GLUT1 阳 性 表 达 者 OS 显 著 低 于 阴 性 表 达 患 者 (P = 0 002) 同 时 GLUT1 阳 性 表 达 患 者 RFS 也 显 著 低 于 阴 性 表 达 患 者 (P=0 001) 见 图 2 3 讨 论 恶 性 肿 瘤 的 一 个 重 要 特 点 就 是 相 当 于 正 常 细 胞 显 著 增 高 的 糖 代 谢 率, 肿 瘤 细 胞 通 过 自 身 调 节 机 制 [2] 以 满 足 其 快 速 生 长 需 要 目 前 研 究 显 示, 恶 性 肿 图 2 GLUT1 表 达 与 肝 细 胞 癌 患 者 OS 和 RFS 的 关 系 A:GLUT1 表 达 与 肝 细 胞 癌 患 者 RFS 的 关 系 ;B:GLUT1 表 达 与 肝 细 胞 癌 患 者 OS 的 关 系 瘤 细 胞 GLUT1 的 高 表 达 可 能 是 肿 瘤 糖 代 谢 率 增 高 的 机 制 之 一 GLUT1 是 葡 萄 糖 转 运 蛋 白 家 族 重 要 成 员 之 一, 在 细 胞 转 运 葡 萄 糖 跨 膜 进 入 细 胞 的 过 程 中 发 挥 重 要 作 用 本 研 究 显 示 :GLUT1 在 HCC 肿 瘤 组 织 中 普 遍 表 达, 并 且 表 达 率 和 强 度 显 著 高 于 癌 旁 非 肿 瘤 性 肝 组 织 Wangetal [5] 在 子 宫 内 膜 病 变 中 研 究 发 现, 子 宫 内 膜 癌 中 GLUT1 普 遍 高 表 达, 子 宫 内 膜 非 典 型 增 生 病 变 则 低 表 达, 而 正 常 子 宫 内 膜 组 织 无 表 达, 提 示 GLUT1 的 高 表 达 可 能 是 细 胞 恶 性 转 化 的 一 个 重 要 标 志 本 研 究 进 一 步 显 示 :HCC 肿 瘤 组 织 GLUT1 表 达 与 肿 瘤 大 小 临 床 TNM 分 期 均 呈 显 著 正 相 关, 与 患 者 的 OS 和 RFS 均 呈 显 著 负 相 关 Kangetal [6] 使 用 免 疫 组 织 化 学 技 术 检 测 了 乳 腺 癌 组 织 中 GLUT1 的 表 达, 结 果 发 现 乳 腺 癌 GLUT1 表 达 与 肿 瘤 组 织 学 分 级 呈 显 著 正 相 关, 并 且 与 患 者 RFS 和 OS

1176 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 呈 显 著 负 相 关, 提 示 其 是 乳 腺 癌 预 后 不 良 的 一 个 标 志 物 Amannetal [7] 使 用 免 疫 组 织 化 学 技 术 检 测 了 152 例 HCC 病 例 的 GLUT1 表 达, 结 果 发 现 GLUT1 表 达 与 肿 瘤 细 胞 增 殖 指 数 临 床 分 期 和 肿 瘤 组 织 学 分 级 呈 正 相 关, 并 且 下 调 GLUT1 表 达 可 以 显 著 降 低 HCC 细 胞 株 的 侵 袭 和 迁 移 能 力, 提 示 GLUT1 可 能 [8] 参 与 了 HCC 的 恶 性 演 进 过 程 张 鹏 飞 等 研 究 还 发 现 : 胃 癌 GLUT1 阳 性 表 达 与 肿 瘤 浸 润 深 度 淋 巴 结 转 移 和 临 床 分 期 显 著 相 关, 提 示 GLUT1 可 能 也 参 与 了 胃 癌 细 胞 的 侵 袭 转 移 综 上 所 述,GLUT1 在 HCC 肿 瘤 组 织 中 高 表 达, 并 且 与 肿 瘤 临 床 进 展 密 切 相 关, 是 HCC 患 者 预 后 不 良 的 潜 在 标 志 物 随 着 对 GLUT1 研 究 的 深 入, 以 其 为 靶 点 的 治 疗 可 能 成 为 恶 性 肿 瘤 综 合 治 疗 和 预 防 的 手 段 之 一 参 考 文 献 [1] El SeragHB,RudolphKL.Hepatocelularcarcinoma:epidemi ologyandmolecularcarcinogenesis[j].gastroenterology,2007, 132(7):2557-76. [2] RamaniP,HeadfordA,MayMT.GLUT1proteinexpresioncor relateswithunfavourablehistologiccategoryandhighriskinpa tientswithneuroblastictumours[j].virchowsarch,2013,462 (2):203-9. [3] SaigusaS,ToiyamaY,TanakaK,etal.Prognosticsignificanceof glucosetransporter 1(GLUT1)geneexpresioninrectalcancer afterpreoperativechemoradiotherapy[j].surgtoday,2012,42 (5):460-9. [4] CooperR,SariogluS,SokmenS,etal.Glucosetransporter 1 (Glut1):apotentialmarkerofprognosisinrectalcarcinoma[J]. BrJCancer,2003,89(5):870-6. [5] WangBY,KalirT,SaboE,etal.Immunohistochemicalstaining ofglut1inbenign,hyperplasia,andmalignantendometrialepi thelia[j].cancer,2000,88(12):2774-81. [6] KangSS,ChunYK,HurM H,etal.Clinicalsignificanceof glucosetransporter1(glut1)expresioninhumanbreastcarci noma[j].jpnjcancerres,2002,93(10):1123-8. [7] AmannT,MaegdefrauU,HartmannA,etal.GLUT1expresion isincreasedinhepatocelularcarcinomaandpromotestumorigene sis[j].amjpathol,2009,174(4):1544-52. [8] 张 鹏 飞, 吴 继 锋, 张 红, 等. 胃 癌 中 HIF 1 VEGF 及 Glut1 的 表 达 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2010,45(1):86-9. ExpresionofGLUT1inhepatocelularcarcinomaand itsclinicopathologicsignificance LuXianying 1,2,GaoQun 2,WuWenyong 1 ( 1 DeptofGeneralSurgery,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022; 2 DeptofPediatricSurgery,TheChildren shospitalofanhuiprovince,hefei 230051) Abstract Theexpresionofglucosetransporter1(GLUT1)wasexaminatedin100casesofhepatocelularcarci noma(hcc)and100casesofnon tumorhepatictisuesbyimmunohistochemicalmethod.thepositiveratesof GLUT1inHCCweresignificantlyhigherthanthatinthenon tumorhepatictisues(83.0% and65.0%,p< 0 01).TheexpresionofGLUT1wassignificantlycorelatedtotumorsizeandTNM staging(p<0.05)andpa tientrelapse freeandoveralsurvival(p<0 01). Keywords hepaticcelcarcinoma;glut1;immunohistochemicalmethod

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1177 薄 型 腹 壁 手 套 样 皮 瓣 修 复 手 背 IV 度 烧 伤 创 面 王 飞, 刘 晟, 周 波, 王 仁 素, 王 超, 王 永 杰, 陈 旭 林 摘 要 探 讨 薄 型 腹 壁 手 套 样 皮 瓣 修 复 严 重 手 背 IV 度 烧 伤 创 面 的 疗 效 收 治 手 部 IV 度 烧 伤 患 者 9 例, 其 中 电 烧 伤 6 例, 热 压 伤 3 例 手 背 创 面 清 创 后 采 用 薄 型 腹 壁 手 套 样 皮 瓣 修 复 结 果 显 示 :8 例 术 后 皮 瓣 完 全 成 活, 颜 色 和 弹 性 与 受 区 较 匹 配, 无 臃 肿 和 畸 形,1 例 术 后 由 于 皮 瓣 下 感 染, 皮 瓣 部 分 坏 死, 创 面 经 换 药 引 流 后 移 植 中 厚 皮 修 复 随 访 6~12 个 月, 手 部 功 能 良 好, 外 观 满 意 薄 型 腹 壁 手 套 样 皮 瓣, 皮 下 脂 肪 组 织 较 少, 厚 度 较 薄, 一 次 成 型, 是 修 复 严 重 手 背 烧 伤 创 面 的 理 想 皮 瓣 之 一 关 键 词 薄 型 皮 瓣 ; 手 ;IV 度 烧 伤 ; 创 面 修 复 中 图 分 类 号 R644;R628 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1177-03 严 重 手 背 部 烧 伤 往 往 易 累 及 肌 腱, 甚 至 关 节 骨 质, 处 理 不 当 会 严 重 影 响 患 者 的 手 功 能 和 整 体 生 活 质 量 修 复 严 重 手 部 烧 伤 仍 是 重 建 外 科 医 师 的 一 大 挑 战 传 统 的 腹 部 局 部 随 机 皮 瓣 或 腹 壁 下 动 脉 皮 瓣 因 为 其 手 术 简 单 安 全, 故 常 常 被 用 于 手 部 软 组 织 损 伤 的 修 复 重 建 然 而, 这 些 一 般 常 规 手 术 的 缺 点 包 括 外 形 臃 肿 和 功 能 受 限, 而 且 需 要 多 次 手 术 修 整 [1-2] 为 获 得 更 为 满 意 的 功 能 性 和 美 容 性 效 果, 该 研 究 在 2010 年 3 月 ~2012 年 3 月 期 间 应 用 薄 型 腹 壁 手 套 样 皮 瓣 来 修 复 了 9 例 严 重 手 背 烧 伤 患 者, 效 果 满 意, 现 报 道 如 下 1 材 料 与 方 法 1.1 病 例 资 料 9 例 患 者 均 来 自 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院, 男 7 例, 女 2 例, 年 龄 为 19~58 岁, 中 位 年 龄 为 28 岁 均 为 IV 度 烧 伤, 其 中 电 烧 伤 6 例, 热 压 伤 3 例, 烧 伤 面 积 0 5% ~6 0% 2 例 为 右 手 烧 伤,4 例 为 左 手 烧 伤,3 例 为 双 手 烧 伤 4 例 合 并 有 甲 床 损 伤, 其 中 1 例 合 并 指 骨 骨 折, 平 均 有 5 5 个 关 节 暴 露 入 院 时 间 为 伤 后 4h~10d 1.2 手 术 方 法 2014-04-02 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 :81000836) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 烧 伤 科, 合 肥 230022 作 者 简 介 : 王 飞, 男, 主 治 医 师 ; 刘 晟, 男, 副 主 任 医 师, 责 任 作 者,E mail:liusheng1217 @hotmail.com 1.2.1 清 创 及 清 创 术 沿 创 缘 切 开, 彻 底 清 除 坏 死 组 织, 保 留 变 性 的 肌 腱 和 骨 膜 组 织, 清 创 后 均 有 肌 腱 或 骨 质 外 露, 关 节 外 露 时 用 克 氏 针 固 定, 反 复 用 体 积 分 数 3% 过 氧 化 氢 溶 液 及 生 理 盐 水 冲 洗 创 面 1.2.2 皮 瓣 设 计 和 切 取 选 择 患 肢 同 侧 的 腹 壁 皮 瓣, 手 套 型 皮 瓣 大 小 一 般 根 据 手 背 烧 伤 创 面 来 设 计 并 在 腹 壁 上 用 美 兰 进 行 标 记 仅 在 手 部 的 入 口 和 每 个 手 指 的 出 口 处 切 开 腹 壁, 组 织 剪 在 皮 下 浅 层 脂 肪 进 行 分 离 皮 瓣, 并 仔 细 地 修 薄 皮 瓣 只 保 留 4~5mm 厚 度 脂 肪 层 来 保 护 真 皮 下 血 管 网, 最 终 形 成 一 个 每 个 手 指 有 独 立 隧 道 的 手 套 样 皮 瓣 其 中 保 留 皮 瓣 下 的 指 间 区 域 组 织 以 固 定 手 指 然 后 手 部 插 入 手 套 样 皮 瓣, 每 个 手 指 通 过 皮 下 隧 道 伸 出, 放 置 橡 胶 引 流 条, 缝 合 手 背 近 端 和 远 端 创 缘 1.2.3 创 面 封 闭 约 3 周 后 从 腹 壁 上 断 蒂, 将 皮 瓣 指 间 区 域 二 等 分 切 开 至 指 蹼 间 并 进 行 指 蹼 的 形 成, 如 果 指 蹼 间 皮 瓣 组 织 不 足 以 覆 盖 手 指 侧, 采 用 中 厚 皮 片 封 闭 余 下 创 面 供 瓣 区 创 面 可 行 皮 下 组 织 分 离 后 拉 拢 缝 合 或 移 植 刃 厚 皮 封 闭 2 结 果 8 例 患 者 术 后 皮 瓣 完 全 成 活, 颜 色 和 弹 性 与 受 区 较 匹 配, 无 臃 肿 和 畸 形,1 例 患 者 严 重 左 手 热 压 伤 皮 瓣 术 后 因 皮 瓣 下 感 染, 术 后 第 5 天 皮 瓣 部 分 坏 死, 创 面 经 换 药 引 流 和 局 部 抗 感 染 治 疗 1 周 后 移 植 中 厚 皮 修 复 ; 全 部 病 例 经 过 包 括 弹 力 手 套 在 内 的 康 复 治 疗, 随 访 6~12 个 月, 手 功 能 恢 复 良 好, 外 形 满 意, 无 需 二 次 手 术 典 型 病 例, 女,48 岁, 因 150 度 压 膜 机 压 伤 左 手 1d 入 院, 检 查 见 左 手 第 3 4 5 指 背 及 部 分 手 背 创 面 呈 深 Ⅱ ~Ⅳ 度 创 面, 第 2 和 3 手 指 甲 床 有 损 伤, 入 院 后 第 4 天 清 创, 见 左 手 第 3 4 5 指 伸 指 肌 腱 外 露, 部 分 变 性, 连 续 性 尚 存 于 左 下 腹 部 设 计 手 套 样 皮 瓣, 术 后 皮 瓣 存 活 良 好, 术 后 3 周 断 蒂, 供 瓣 区 直 接 拉 拢 缝 合 见 图 1 皮 瓣 外 形 较 薄, 不 显 臃 肿 随 访 6 个 月, 左 手 功 能 正 常, 活 动 自 如, 外 形 满 意 3 讨 论 手 部 Ⅳ 度 烧 伤 在 临 床 上 很 常 见, 最 常 见 为 电 烧

1178 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 图 1 典 型 病 例 A: 术 前 左 手 背 IV 度 烧 伤 创 面 ;B: 清 创 后 伸 指 肌 腱 外 露 ;C: 腹 部 设 计 手 套 样 皮 瓣 ;D: 手 指 插 入 腹 部 手 套 样 皮 瓣 后 ;E: 断 蒂 后 左 手 皮 瓣 外 形 较 薄 ;F: 腹 部 供 瓣 区 直 接 拉 拢 缝 合 伤, 其 次 为 热 压 伤 由 于 手 背 部 皮 下 组 织 少 及 皮 肤 薄 的 特 性, 其 不 能 给 肌 腱 和 关 节 等 深 部 组 织 提 供 较 多 的 保 护, 因 此 尤 其 是 热 压 伤 和 电 烧 伤 时, 手 背 部 烧 伤 更 易 累 及 肌 腱 和 关 节, 且 截 指 率 较 高 等 对 于 深 度 手 背 部 烧 伤, 早 期 清 创 和 皮 瓣 覆 盖 可 明 显 保 存 暴 露 的 肌 腱 和 关 节, 最 大 可 能 改 善 手 部 功 能 [3-4] 可 供 使 用 的 皮 瓣 包 括 局 部 远 隔 的 甚 至 游 离 皮 瓣, 多 采 用 的 形 式 从 穿 支 皮 瓣 到 微 血 管 网 皮 瓣 目 前 对 修 复 严 重 手 部 烧 伤, 多 采 用 腹 部 皮 瓣 和 髂 腹 股 沟 皮 瓣 等 带 蒂 皮 瓣 传 统 的 这 些 带 蒂 皮 瓣 手 术 方 式 简 单 且 安 全, 但 这 两 者 主 要 的 缺 点 是 皮 瓣 外 形 臃 肿, 一 般 需 要 多 次 皮 瓣 修 薄 和 分 指 手 术 才 能 达 到 较 理 想 的 效 果 腹 部 手 套 样 皮 瓣 最 早 在 1936 年 首 次 描 述, 但 其 仍 有 不 少 缺 点 如 皮 瓣 外 形 臃 肿 等 [5] 直 至 薄 型 皮 瓣 在 1966 年 被 提 出, 这 些 薄 型 皮 瓣 目 前 已 经 被 用 于 面 颈 等 部 位, 其 优 点 在 于 提 供 最 大 可 能 的 外 观 和 质 感 [6] Goushehetal [7] 率 先 用 薄 型 腹 部 穿 支 皮 瓣 来 修 复 手 背 部 严 重 瘢 痕 挛 缩, 其 皮 瓣 厚 度 薄, 没 有 多 余 的 皮 下 脂 肪, 甚 至 修 剪 至 皮 下 真 皮 血 管 网 应 用 薄 型 腹 部 手 套 样 皮 瓣 修 复 手 部 IV 度 烧 伤, 术 后 皮 瓣 存 活 良 好 只 有 1 例 患 者 皮 瓣 远 端 出 现 部 分 坏 死, 该 患 者 系 全 手 背 及 指 背 热 压 伤, 由 于 入 院 创 面 有 感 染, 术 后 皮 瓣 部 分 坏 死, 经 换 药 植 皮 后 愈 合 薄 型 手 套 样 腹 部 皮 瓣 厚 度 合 适, 术 后 随 访 6~12 个 月, 手 功 能 良 好, 达 到 较 为 理 想 的 外 观 效 果 手 套 样 皮 瓣 可 通 过 皮 下 组 织 间 隔 来 固 定 手 指, 可 以 有 效 地 促 进 皮 瓣 与 受 区 的 及 早 黏 附 尽 管 有 些 [8] 文 献 报 道 可 以 在 皮 瓣 术 后 2 周 断 蒂, 但 3 周 是 比 较 适 宜, 安 全 的 其 主 要 的 原 因 是 由 于 术 后 疼 痛 和 体 位 的 不 适 应 有 可 能 影 响 早 期 皮 瓣 的 黏 附 此 外, 薄 型 手 套 样 腹 部 皮 瓣 手 术 相 对 不 复 杂, 而 且 在 修 复 手 指 深 度 烧 伤 时 不 需 要 进 行 并 指 术, 在 断 蒂 同 时 可 以 进 行 指 蹼 的 重 建, 避 免 传 统 腹 部 皮 瓣 并 指 和 二 次 分 指 手 术, 极 大 缩 短 了 住 院 时 间, 减 轻 了 患 者 的 痛 苦, 并 能 早 期 功 能 锻 炼 参 考 文 献 [1] 黄 国 宝, 张 科 验, 张 磊, 等. 应 用 皮 瓣 移 植 修 复 手 部 深 度 烧 伤 96 例 治 疗 体 会 [J]. 中 华 损 伤 与 修 复 杂 志 ( 电 子 版 ),2010, (52):44-5. [2] 龚 志 鑫, 田 德 虎, 张 经 岐, 等. 双 髂 腹 股 沟 及 腹 部 联 合 皮 瓣 修 复 前 臂 与 手 大 面 积 皮 肤 缺 损 [J]. 中 国 修 复 重 建 外 科 杂 志, 2009,23(8):930-2. [3] 谢 卫 国, 王 德 运, 刘 杰 峰, 等. 手 部 电 烧 伤 的 皮 瓣 修 复 [J]. 中 华 烧 伤 杂 志,2010,26(1):30-3. [4] 黄 晓 元. 皮 瓣 移 植 在 我 国 烧 伤 外 科 中 的 应 用 [J]. 中 华 烧 伤 杂 志,2008,24(5):352-4. [5] PradierJP,OberlinC,BeyE.Acutedeephandburnscoveredby apocketflap graft:long termoutcomebasedonninecases[j].j BurnsWounds,2007,6:e1. [6] YanH,ZhangF,AkdemirO,etal.Clinicalapplicationsofve nousflapsinthereconstructionofhandsandfingers[j].archor thoptraumasurg,2011,131(1):65-74. [7] GoushehJ,ArastehE,MafiP.Super thinabdominalskinpedicle flapforthereconstructionofhypertrophicandcontracteddorsal handburnscars[j].burns,2008,34(3):400-5. [8] UrushidateS,YotsuyanagiT,YamauchiM,etal.Modifiedthin abdominalwalflap(gloveflap)forthetreatmentofacuteburnsto thehandsandfingers[j].jplastreconstraesthetsurg,2010,63 (4):693-9. Abstract RepairofIVdegreeburnswoundonthedorsum ofhandsusing thinabdominalwalgloveflap WangFei,LiuSheng,ZhouBo,etal (DeptofBurns,TheFirstAfiliatedHosptialofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022) ToinvestigatetheefectofthinabdominalwalgloveflapinrepairingtheIVdegreeburnswoundonthe

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1179 鲍 曼 不 动 杆 菌 腹 膜 透 析 相 关 性 腹 膜 炎 临 床 病 例 分 析 赵 洪 静, 张 炜, 吴 永 贵, 齐 向 明 摘 要 回 顾 性 分 析 7 例 鲍 曼 不 动 杆 菌 腹 膜 透 析 相 关 性 腹 膜 炎 患 者 资 料, 总 结 相 关 资 料 并 参 阅 国 内 外 相 关 文 献 分 析, 结 果 7 例 鲍 曼 不 动 杆 菌 性 腹 透 相 关 性 腹 膜 炎 中,2 例 为 多 重 耐 药 的 鲍 曼 不 动 杆 菌,1 例 为 耐 碳 青 霉 烯 类 菌 株 所 有 的 多 重 耐 药 菌 都 未 能 治 愈 鲍 曼 不 动 杆 菌 腹 膜 炎 常 为 难 治 性 腹 膜 炎, 细 菌 呈 多 重 耐 药, 及 早 拔 除 腹 膜 透 析 管 可 降 低 该 类 患 者 病 死 率 关 键 词 腹 膜 炎 ; 鲍 曼 不 动 杆 菌 ; 多 重 耐 药 ; 腹 膜 治 疗 中 图 分 类 号 R459.51 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1179-03 鲍 曼 不 动 杆 菌 是 一 种 革 兰 阴 性 杆 菌, 已 经 被 证 实 是 一 种 耐 药 性 感 染 的 重 要 细 菌 并 且 被 认 为 是 最 棘 手 的 病 原 菌 之 一 [1] 耐 碳 青 霉 烯 类 的 鲍 曼 不 动 杆 菌 越 来 越 常 见 一 些 鲍 曼 不 动 杆 菌 菌 株 已 经 被 证 实 对 目 前 已 知 的 所 有 抗 生 素 耐 药 [2] 虽 然 多 重 耐 药 的 鲍 曼 不 动 杆 菌 在 腹 透 患 者 中 很 少 报 道, 但 一 旦 出 现, 将 会 导 致 严 重 的 感 染 并 增 加 腹 膜 透 析 的 退 出 率 和 死 亡 率 [3-5] 现 腹 膜 透 析 中 心 发 生 7 例 鲍 曼 氏 不 动 杆 菌 引 起 的 腹 膜 炎, 其 中 2 例 多 重 耐 药,1 例 是 耐 碳 青 霉 烯 类 的 菌 株 3 例 难 治 性 腹 膜 炎 导 致 住 院 时 间 延 长 及 拔 管,4 例 得 到 治 愈 并 继 续 行 腹 膜 2014-04-02 接 收 基 金 项 目 : 教 育 部 博 士 点 基 金 ( 编 号 :20093420110003) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 肾 脏 内 科, 合 肥 230022 作 者 简 介 : 赵 洪 静, 女, 硕 士 研 究 生 ; 吴 永 贵, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:wuyong gui@medmail.com.cn 透 析, 现 报 道 如 下 1 材 料 与 方 法 1.1 病 例 选 择 回 顾 性 分 析 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 2009 年 ~2011 年 收 治 的 7 例 鲍 曼 不 动 杆 菌 腹 膜 透 析 相 关 性 腹 膜 炎 患 者 资 料, 患 者 均 植 入 Tenckhof 导 管, 使 用 双 联 系 统 进 行 持 续 不 卧 床 腹 膜 透 析 (continuous ambulatory peritoneal dialysis, CAPD), 透 析 液 使 用 Baxter 公 司 生 产 的 PD4 透 析 液, 每 日 腹 透 液 交 换 量 为 6~8L 1.2 腹 膜 炎 诊 断 标 准 1 有 腹 膜 炎 的 症 状 和 体 征 ;2 透 出 液 混 浊, 白 细 胞 计 数 >100 10 6 /L, 中 性 粒 细 胞 百 分 比 >50%;3 透 出 液 找 到 或 培 养 有 致 病 菌 患 者 出 现 上 述 3 项 中 的 2 项 即 诊 断 为 腹 膜 炎 1.3 致 病 菌 培 养 及 药 敏 试 验 方 法 患 者 就 诊 时, 先 留 取 腹 透 液 进 行 细 胞 分 类 计 数, 同 时 进 行 腹 透 液 致 病 菌 培 养 具 体 方 法 为 : 取 10~20ml 腹 透 液 直 接 接 种 于 需 氧 厌 氧 血 培 养 瓶, 如 患 者 入 院 前 已 经 使 用 抗 生 素, 则 采 用 活 性 炭 吸 附 培 养 瓶, 接 种 后 及 时 送 检, 置 于 35 温 箱 培 养 16~18h, 药 敏 用 纸 片 扩 散 法, 判 断 标 准 按 NCCLS2004 版 执 行 1.4 欧 洲 临 床 微 生 物 与 感 染 性 疾 病 学 会 对 获 得 性 耐 药 的 葡 萄 球 菌 属 肠 球 菌 属 肠 杆 菌 科 铜 绿 假 单 胞 菌 不 动 杆 菌 属 耐 药 程 度 的 定 义 1 多 重 耐 药 : 对 药 敏 结 果 中 3 类 或 3 类 以 上 抗 菌 药 物 不 敏 感 ;2 泛 耐 药 : 对 药 敏 结 果 中 只 有 1~2 类 药 物 敏 感 ;3 全 dorsumofhands.ninepatientswithivdegreeburnswoundwerehospitalizedfrommarch2010tomarch2012.six caseswereduetoelectricalburns,3werehotcrushinjuries.afterdebridement,athinabdominalwalskinglove flapwasdesignedtorepairthewounds.theflapsin8patientssurvivedcompletelywitharesultofagoodelasticity andmatchedappearanceoftherecipientareawithoutobviousbulkinesanddeformity.partialnecrosisofflapoc curedinonlyonepatientduetoinfectionanditwasclosedbytransplantationofpartial thicknesskinafterdres ingchange.until6~12monthsfolow up,thefunctionofinjuredhandsrecoveredwelwithsatisfactoryappear ance.thinabdominalwalgloveflapwithlesadiposetisue,isoneoftheidealflapforrepairingsevereburn woundsonthedorsumofhands. Keywords thinflap;hand;ivdegreeburns;woundrepair

1180 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 耐 药 : 对 药 敏 结 果 抗 菌 药 物 均 不 敏 感, 具 体 抗 菌 药 物 谱 参 见 相 关 文 献 [6] 2 结 果 2.1 临 床 资 料 7 例 患 者 中,5 例 发 生 于 腹 膜 透 析 的 第 1 年 只 有 1 例 既 往 发 生 过 感 染 : 上 次 感 染 发 生 在 20d 之 前, 诊 断 为 鲁 氏 不 动 杆 菌 感 染 的 腹 膜 炎 抗 生 素 治 疗 2 周 后 有 效, 腹 透 液 白 细 胞 计 数 降 至 正 常, 然 而,1 周 后 患 者 再 次 出 现 腹 痛 腹 泻, 腹 透 液 培 养 出 耐 多 种 抗 生 素 ( 包 括 亚 胺 培 南 在 内 ) 的 鲍 曼 不 动 杆 菌 所 有 的 这 些 鲍 曼 不 动 杆 菌 的 感 染 均 为 社 区 获 得 性 的, 除 1 例 患 者, 其 他 患 者 均 有 贫 血, 除 2 例 患 者, 其 他 患 者 的 血 白 蛋 白 水 平 均 低 于 30g/L 这 7 例 患 者 均 有 腹 透 液 浑 浊 和 频 繁 的 腹 痛 4 例 有 腹 泻, 只 有 1 例 有 发 热 在 4 例 得 到 治 愈 的 患 者 中, 经 过 4d 的 治 疗 后 腹 透 液 白 细 胞 数 开 始 下 降 然 而, 有 1 例 患 者 在 抗 感 染 治 疗 的 第 5 天 拒 绝 继 续 治 疗, 未 带 任 何 药 物 出 院 另 外 3 例, 持 续 治 疗 了 至 少 14d 感 染 耐 碳 青 霉 烯 类 鲍 曼 不 动 杆 菌 的 患 者, 曾 感 染 过 鲁 氏 不 动 杆 菌, 该 患 者 也 有 贫 血 低 蛋 白 血 症, 体 质 指 数 也 很 低, 仅 有 16 9kg/m 2 该 类 患 者 的 再 发 感 染 没 有 得 到 治 愈, 在 明 确 是 该 种 细 菌 感 染 的 当 天 拔 除 了 腹 透 管, 并 静 脉 予 以 环 丙 沙 星 治 疗 7d 2.2 预 后 7 例 患 者 中,2 例 是 多 重 感 染 3 例 退 出 腹 膜 透 析 改 为 血 透, 其 中 1 例 1 年 后 死 于 脑 出 血 另 外 4 例, 得 到 治 愈 并 继 续 行 腹 膜 透 析 治 疗 在 3 个 退 出 腹 膜 透 析 的 患 者 中, 均 为 耐 药 菌 感 染 : 其 中 2 例 是 多 重 耐 药 的 鲍 曼 不 动 杆 菌,1 例 是 耐 碳 青 霉 烯 类 抗 生 素 的 菌 株 在 4 例 得 到 治 愈 的 患 者 中 只 有 1 例 是 阿 米 卡 星 耐 药 3 讨 论 腹 透 相 关 性 腹 膜 炎 的 预 后 很 大 程 度 上 取 决 于 感 染 的 病 原 菌 的 种 类 革 兰 阳 性 球 菌 仍 是 大 多 数 腹 膜 炎 的 致 病 菌 在 腹 透 相 关 性 腹 膜 炎 中, 鲍 曼 不 动 杆 菌 较 少 见, 一 旦 发 生, 抗 感 染 治 疗 很 难 有 效 [7-8] 本 研 究 回 顾 性 分 析 了 过 去 3 年 (2009 年 ~2011 年 ) 的 腹 透 相 关 性 腹 膜 炎, 其 中 72 4% 为 革 兰 阳 性 球 菌, 只 有 7 6% 为 不 动 杆 菌 属, 在 不 动 杆 菌 属 感 染 中, [1,9] 87 5% 为 鲍 曼 不 动 杆 菌 其 他 的 研 究 也 表 明 最 常 见 的 不 动 杆 菌 属 病 原 菌 为 鲍 曼 不 动 杆 菌 亚 胺 培 南 和 美 罗 培 南 是 目 前 认 为 抗 鲍 曼 不 动 杆 菌 最 有 效 的 抗 生 素 [10] 但 耐 碳 青 霉 烯 类 鲍 曼 不 动 杆 菌 的 报 道 现 在 越 来 越 常 见 耐 药 菌 这 一 标 准 术 语 是 由 一 个 国 际 专 家 小 组 提 出 并 在 临 床 微 生 物 与 感 染 杂 志 上 出 版 [11] 本 研 究 7 例 中 的 2 例 是 由 多 重 耐 药 鲍 曼 不 动 杆 菌 引 起 的, 而 且 其 中 1 例 为 耐 碳 青 霉 烯 类 抗 生 素 这 2 例 均 治 疗 无 效, 最 终 拔 管 该 研 究 中,3 例 退 出 腹 膜 透 析,4 例 治 愈 3 例 转 为 血 透 的 患 者 中,1 例 死 于 脑 出 血 ( 而 不 是 死 于 感 染 ) 所 有 的 对 抗 生 素 反 应 不 佳 的 患 者 感 染 的 均 为 耐 药 细 菌 其 中 1 例 耐 碳 青 霉 烯 类 抗 生 素 的, 该 例 中 耐 阿 米 卡 星 的 的 细 菌 感 染 提 示 鲍 曼 不 动 杆 菌 的 耐 药 可 能 是 腹 膜 炎 再 发 的 一 个 关 键 因 素 Solaket al [5] 曾 报 道 过 仅 对 氨 基 糖 苷 类 和 替 加 环 素 敏 感 的 鲍 曼 不 动 杆 菌 性 腹 膜 炎 最 后 死 于 难 治 性 败 血 症 另 外 2 例 非 多 重 耐 药 鲍 曼 不 动 杆 菌 腹 膜 炎 经 抗 感 染 治 疗 以 后 恢 复 [3-4] Galvaoetal [12] 调 查 了 23 例 不 动 杆 菌 属 腹 膜 炎, 超 过 一 半 发 生 在 腹 透 的 第 1 年 本 研 究 中,7 例 中 的 5 例 是 在 腹 透 的 第 1 年 发 生 的 除 患 者 5 外, 不 动 杆 菌 属 的 感 染 都 是 他 们 腹 透 以 来 首 次 发 生 腹 膜 炎 Galvaoetal [12] 研 究 发 现, 不 动 杆 菌 在 6 例 患 者 中 排 第 2 位 不 动 杆 菌 属 腹 膜 炎 的 发 生 率 在 前 1 次 腹 膜 炎 之 后 的 2~3 个 月 发 生 率 明 显 增 高 [12] 而 在 本 研 究 中, 有 1 例 不 动 杆 菌 的 感 染 发 生 在 前 一 次 感 染 20d 之 后 在 现 有 的 文 献 中, 关 于 不 动 杆 菌 属 合 并 其 他 病 原 微 生 物 感 染 的 临 床 特 点 和 预 后 的 报 道 较 少 见 本 研 究 中, 有 1 例 患 者 为 合 并 感 染, 腹 透 液 同 时 培 养 出 鲍 曼 不 动 杆 菌 和 表 皮 葡 萄 球 菌, 该 患 者 得 到 了 治 愈, 表 明 合 并 其 他 细 菌 感 染 可 能 不 是 鲍 曼 不 动 杆 菌 腹 膜 炎 难 治 的 因 素 另 外, 本 研 究 中 1 例 患 者 发 生 过 两 次 腹 膜 炎, 但 是 在 这 两 次 腹 透 感 染 的 间 期, 腹 透 液 并 未 行 培 养 该 患 者 在 抗 感 染 治 疗 结 束 20d 以 后 腹 透 液 再 次 出 现 浑 浊, 并 且 拔 出 的 腹 透 导 管 培 养 出 绿 脓 杆 菌 本 研 究 的 结 果 表 明 在 腹 透 患 者 中 发 生 腹 膜 炎 的 高 危 因 素 有 : 年 龄 ( 60 岁 ), 贫 血 ( 血 红 蛋 白 <70 g/l), 低 蛋 白 血 症 ( 血 清 白 蛋 白 <30g/L, 或 者 在 一 些 研 究 中 为 <35g/L), 低 钾 血 症 (<3.5mmol/ L), 憩 室 病, 糖 尿 病 及 其 他 [13] 在 本 研 究 中,7 例 中 的 6 例 有 贫 血, 其 中 1 例 血 红 蛋 白 浓 度 低 于 70g/L 患 者 均 有 低 蛋 白 血 症, 其 中 5 例 血 清 白 蛋 白 低 于 30

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1181 g/l 7 例 患 者 中,4 例 有 低 钾 血 症,2 例 有 糖 尿 病 患 者 年 龄 为 28~64 岁 ( 只 有 1 例 患 者 超 过 60 岁 ) 关 于 患 者 是 否 有 憩 室 病, 因 为 未 行 结 肠 镜 和 钡 剂 灌 肠 检 查, 暂 不 能 明 确 这 些 高 危 因 素 中, 低 蛋 白 血 症 可 能 是 更 重 要 的 因 素 总 之, 鲍 曼 不 动 杆 菌 是 一 种 多 重 耐 药 菌, 可 导 致 严 重 的 感 染, 当 抗 感 染 治 疗 无 效 时, 死 亡 率 很 高 本 研 究 中 有 1 例 耐 碳 青 霉 烯 类 的 鲍 曼 不 动 杆 菌 泛 耐 药 的 鲍 曼 不 动 杆 菌 可 能 对 腹 透 患 者 造 成 很 大 的 威 胁 为 了 降 低 腹 膜 炎 的 发 生 率, 应 及 时 纠 正 营 养 不 良 贫 血 低 蛋 白 血 症 等 高 危 因 素 教 育 患 者 或 护 理 人 员 更 换 腹 透 液 时 操 作 规 范 对 预 防 腹 膜 炎 的 发 生 也 很 有 帮 助 参 考 文 献 [1] DijkshoornL,NemecA,SeifertH.Anincreasingthreatinhospi tals:multidrug resistantacinetobacterbaumanni[j].natrevmi crobiol,2007,5(12):939-51. [2] PelegAY,SeifertH,PatersonDL.Acinetobacterbaumanni:e mergenceofasuccesfulpathogen[j].clinmicrobiolrev,2008, 21(3):538-82. [3] FriedmanO,JasalSV,BargmanJM.Acinetobacterperitoneal dialysisperitonitis:descriptionandrelationtothespicefamilyof organisms[j].peritdialint,2008,28(2):195-7. [4] LeeYK,KimJK,OhSE,etal.Succesfulantibioticlockther apyinpatientswithrefractoryperitonitis[j].clinnephrol,2009, 72(6):488-91. [5] SolakY,AtalayH,PolatI,etal.CAPD relatedperitonitisafter renaltransplantation[j].peritdialint,2010,30(6):596-9. [6] MagiorakosAP,SrinivasanA,CareyRB,etal.Multidrug re sistant,extensivelydrug resistantandpandrug resistantbacteria: aninternationalexpertproposalforinterimstandarddefinitionsfor acquiredresistance[j].clinmicrobiolinfect,2012,18(3):268-81. [7] OliveiraLG,LuengoJ,CaramoriJC,etal.Peritonitisinrecent years:clinicalfindingsandpredictorsoftreatmentresponseof170 episodesatasinglebraziliancenter[j].inturolnephrol,2012, 44(5):1529-37. [8] RuizA,RamosB,BurgosD,etal.Acinetobactercalcoaceticus peritonitisincontinuousambulatoryperitonealdialysis(capd) patients[j].peritdialint,1988,8(4):285-6. [9] DoughariHJ,NdakidemiPA,HumanIS,etal.Theecology, biologyandpathogenesisofacinetobacterspp.:anoverview[j]. MicrobesEnviron,2011,26(2):101-12. [10]UnalS,Garcia RodriguezJA.Activityofmeropenemandcompa ratorsagainstpseudomonasaeruginosaandacinetobacterspp.iso latedinthemysticprogram,2002 2004[J].DiagnMicrobiol InfectDis,2005,53(4):265-71. [11]MagiorakosAP,SrinivasanA,CareyRB,etal.Multidrug re sistant,extensivelydrug resistantandpandrug resistantbacteria: aninternationalexpertproposalforinterimstandarddefinitionsfor acquiredresistance[j].clinmicrobiolinfect,2012,18(3):268-81. [12] GalvaoC,SwartzR,RocherL,etal.Acinetobacterperitonitis duringchronicperitonealdialysis[j].amjkidneydis,1989,14 (2):101-4. [13] YipT,TseKC,LamMF,etal.Colonicdiverticulosisasarisk factorforperitonitisinchineseperitonealdialysispatients[j]. PeritDialInt,2010,30(2):187-91. Clinicalanalysisofperitonealdialysis relatedperitonitiswith Acinetobacterbaumanni ZhaoHongjing,ZhangWei,WuYonggui,etal (DeptofNephrology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022) Abstract 7peritonealdialysis relatedperitonitiswitha.baumanniepisodeswerereviewedretrospectivelyforlast threeyearsintheperitonealdialysiscenterofthefirstafiliatedhospitalofanhuimedicaluniversity.bysum minguptherelevantdataandreferingtotherelatedliteratureathomeandabroad,wefoundthatamongthose7ca ses,2wereinvolvedinmulti drugresistant(mdr)a.baumanni,and1wasinvolvedinacarbapenem resistant strain.althemdrbacterialinfectionsfailedtreatment.earlycatheterremovalmayhelpdecreasethemortality. Keywords peritonitis;acinetobacterbaumanni;multi drugresistance;peritonitistreatment

1182 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 后 路 经 椎 弓 根 椎 体 截 骨 术 治 疗 胸 腰 椎 后 凸 畸 形 李 路, 陈 银 河, 杨 庆 国, 申 才 良, 尤 涛, 张 银 顺, 李 伟, 王 磊, 贾 金 龙 摘 要 回 顾 性 分 析 后 路 单 节 段 经 椎 弓 根 椎 体 截 骨 术 (PSO) 治 疗 20 例 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 后 凸 畸 形 患 者 的 临 床 疗 效 比 较 术 前 术 后 及 末 次 随 访 时 后 凸 Cobb 角 疼 痛 视 觉 模 拟 评 分 (VAS) Oswestry 功 能 障 碍 指 数 (ODI) 评 分 通 过 Frankel 分 级 评 分 评 价 患 者 神 经 功 能 恢 复 情 况 术 后 Cobb 角 VAS 评 分 和 ODI 评 分 分 别 与 术 前 相 比, 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P <0 05) 末 次 随 访 时 临 床 症 状 和 神 经 功 能 获 得 较 大 改 善 后 路 单 节 段 PSO 治 疗 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 后 凸 畸 形 是 一 种 安 全 有 效 术 式 关 键 词 胸 腰 椎 ; 创 伤 性 后 凸 畸 形 ; 经 椎 弓 根 椎 体 截 骨 术 中 图 分 类 号 R683.2;R321.6;R687.31 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000-1492(2014)08-1182-03 胸 腰 椎 骨 折 若 未 及 时 治 疗 或 治 疗 方 式 不 当, 可 能 出 现 胸 腰 部 后 凸 畸 形 或 伴 神 经 功 能 障 碍 等 对 于 保 守 治 疗 无 效 的 疼 痛 后 凸 渐 进 性 加 重 或 神 经 症 状 加 重 可 行 手 术 治 疗 矫 形 手 术 分 为 前 路 后 路 前 后 路 联 合 等 术 式 现 回 顾 性 分 析 后 路 单 节 段 经 椎 弓 根 椎 体 截 骨 术 (pediclesubtractionosteotomy,pso) 治 疗 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 后 凸 畸 形 的 临 床 疗 效, 现 报 道 如 下 1 材 料 与 方 法 1.1 一 般 资 料 2009 年 6 月 ~2012 年 6 月 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 骨 科 收 治 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 患 者 20 例, 男 5 例, 女 15 例 ; 年 龄 33~66(49 3± 11 7) 岁 受 伤 原 因 : 车 祸 伤 2 例, 高 处 坠 落 伤 4 例, 重 物 砸 伤 1 例, 摔 伤 13 例 既 往 治 疗 方 式 :18 例 曾 行 保 守 治 疗 ;2 例 曾 行 后 路 内 固 定 椎 板 减 压 术, 均 为 取 出 内 固 定 后 出 现 渐 进 性 后 凸 畸 形 受 伤 至 手 术 时 间 3 个 月 ~34 年 患 者 就 诊 时 均 有 不 同 程 度 胸 腰 部 疼 痛 或 神 经 受 压 症 状 损 伤 节 段 T 12 5 例 L 1 9 例 L 2 6 例 术 前 胸 腰 椎 后 凸 Cobb 角 为 (35 2± 2014-03-20 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目 ( 编 号 :81171797) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 骨 三 科, 合 肥 230022 作 者 简 介 : 李 路, 男, 硕 士 研 究 生 ; 杨 庆 国, 男, 教 授, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:yqgyly@126.com 对 本 文 具 有 同 等 贡 献 6 1), 疼 痛 视 觉 模 拟 评 分 (visualanalogscale, VAS) 为 (6 4±0 5) 分,Oswestry 功 能 障 碍 指 数 (os westrydisabilityindex,odi) 为 (55 9±10 7) 分 术 前 Frankel 分 级 评 分,C 级 1 例,D 级 11 例,E 级 8 例 患 者 术 前 均 拍 摄 站 立 脊 柱 全 长 正 侧 位 X 线 片, 应 用 Cobb 法 测 量 脊 柱 后 凸 角 度, 行 CT 和 MRI 了 解 是 否 伴 有 椎 管 狭 窄 和 脊 髓 压 迫 1.2 方 法 1.2.1 手 术 方 法 患 者 均 行 气 管 插 管 全 身 麻 醉, 俯 卧 位 于 脊 柱 手 术 床 上 手 术 全 程 应 用 体 感 诱 发 电 位 和 动 作 诱 发 电 位 以 及 唤 醒 试 验 监 护 采 用 后 正 中 入 路, 显 露 目 标 椎 体 及 其 邻 近 上 下 位 椎 体 双 侧 椎 板 及 关 节 突 达 横 突 尖 部 在 C 臂 X 线 透 视 机 定 位 下 先 在 截 骨 椎 邻 近 上 下 一 或 两 个 椎 体 置 入 单 向 椎 弓 根 螺 钉 切 除 目 标 椎 体 棘 突 椎 板 关 节 突 横 突 和 肋 骨 头, 应 用 Cobb 剥 离 器 精 确 剥 离 椎 体 两 侧 骨 膜, 并 注 意 保 护 相 应 节 段 神 经 根 及 大 血 管 保 留 椎 弓 根 内 侧 缘 骨 皮 质, 用 骨 刀 切 除 其 余 部 分 椎 弓 根, 保 留 椎 体 前 方 骨 皮 质 以 作 截 骨 铰 链, 保 留 椎 体 后 侧 壁 以 保 护 硬 脊 膜, 用 骨 刀 刮 匙 或 高 速 磨 钻 切 除 椎 体 内 松 质 骨, 根 据 术 前 后 凸 Cobb 角 设 计 截 骨 平 面 向 椎 体 前 方 做 楔 形 截 骨, 并 透 视 探 查 截 骨 深 度 保 持 截 骨 面 上 下 椎 间 盘 的 完 整 性, 双 侧 交 替 进 行, 切 除 对 侧 时 一 侧 用 临 时 棒 固 定 最 后 切 除 椎 弓 根 内 侧 壁 和 椎 体 后 壁 切 除 后 壁 时 注 意 分 离 硬 膜 囊 和 椎 体 后 壁, 避 免 神 经 根 和 硬 膜 囊 过 度 牵 拉, 并 用 电 凝 纱 布 明 胶 海 绵 仔 细 止 血 用 咬 骨 钳 去 除 椎 体 后 缘 皮 质, 确 保 神 经 根 和 硬 膜 囊 周 围 无 皮 质 骨 残 留 放 置 连 接 棒, 用 加 压 装 置 将 螺 钉 加 压 靠 拢, 使 截 骨 面 对 合, 最 后 锁 紧 内 固 定 装 置, 再 次 透 视 检 查 畸 形 矫 正 情 况 后 方 椎 板 及 小 关 节 去 皮 质 后 进 行 后 外 侧 植 骨 融 合, 放 置 引 流 管 关 闭 切 口 1.2.2 术 后 处 理 术 后 常 规 应 用 抗 生 素 预 防 感 染, 留 置 引 流 管 24~48h 或 引 流 量 少 于 50ml 后 拔 除, 复 查 脊 柱 X 线 片 观 察 内 固 定 位 置 以 及 是 否 发 生 松 动 移 动 或 断 裂 等, 测 量 术 后 Cobb 角 以 评 估 后 凸 畸 形 矫 正 程 度 嘱 患 者 床 上 行 腰 背 肌 及 下 肢 主 被 动 功 能 锻 炼, 术 后 2 周 在 硬 质 腰 围 保 护 下 坐 立 及 下 床 活 动, 逐 步 恢 复 日 常 生 活,3 个 月 内 避 免 弯 腰 及 腰 部

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1183 剧 烈 活 动 1.3 疗 效 判 定 以 VAS 评 分 和 ODI 评 分 评 估 患 者 腰 腿 痛 程 度 及 其 功 能, 通 过 Frankel 分 级 评 分 评 价 患 者 神 经 功 能 变 化 影 像 学 评 估 包 括 后 凸 Cobb 角 植 骨 融 合 和 内 固 定 有 无 松 动 断 裂 等 情 况 1.4 统 计 学 处 理 采 用 SPSS17 0 统 计 软 件 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 对 手 术 前 后 及 末 次 随 访 时 的 Cobb 角 VAS 评 分 及 ODI 评 分, 采 用 配 对 t 检 验 进 行 分 析 2 结 果 2.1 治 疗 效 果 20 例 患 者 均 行 后 路 单 节 段 PSO, 截 骨 水 平 分 别 位 于 T 12 5 例 L 1 9 例 L 2 6 例 手 术 时 间 (252±54)min 术 中 失 血 量 (1353±413) ml 1 例 术 后 有 单 侧 下 肢 神 经 根 性 症 状, 予 以 脱 水 营 养 神 经 药 物 等 治 疗 2 周 恢 复 余 未 发 生 明 显 手 术 相 关 并 发 症 所 有 患 者 切 口 Ⅰ 期 愈 合 随 访 时 间 (21 1±7 8) 个 月 典 型 病 例 影 像 学 资 料 见 图 1 2.2 影 像 学 评 估 术 后 Cobb 角 为 (5 6±1 2), 末 次 随 访 Cobb 角 为 (6 4±1 2), 术 后 平 均 矫 正 角 度 为 (29 6±4 6), 术 后 Cobb 角 与 术 前 Cobb 角 相 比 差 异 有 统 计 学 意 义 (t=26 5,P<0 05) 末 次 随 访 时 均 达 骨 性 融 合, 无 假 关 节 形 成 内 固 定 松 动 及 断 裂 等, 矫 正 度 未 见 明 显 丢 失 2.3 功 能 评 估 术 后 VAS 评 分 为 (2 8±0 4) 分, 末 次 随 访 时 为 (1 7±0 5) 分, 术 后 VAS 评 分 与 术 前 相 比 差 异 有 统 计 学 意 义 (t=31 1,P<0 05) 术 后 ODI 评 分 为 (23 6±5 8) 分, 末 次 随 访 时 为 (8 5± 6 6) 分, 术 后 ODI 评 分 与 术 前 相 比 差 异 有 统 计 学 意 义 (t=16 0,P<0 05) 术 后 胸 腰 部 疼 痛 及 下 肢 症 状 均 较 术 前 明 显 改 善, 运 动 及 感 觉 功 能 有 不 同 程 度 恢 复 末 次 随 访 时 Frankel 分 级 评 分,D 级 4 例 E 级 16 例, 见 表 1 术 前 分 级 表 1 手 术 前 末 次 随 访 神 经 功 能 Frankel 分 级 评 估 ( 例 ) 例 数 末 次 随 访 分 级 A 级 B 级 C 级 D 级 E 级 A 级 0 0 0 0 0 0 B 级 0 0 0 0 0 0 C 级 1 0 0 0 1 0 D 级 11 0 0 0 3 8 E 级 8 0 0 0 0 8 合 计 20 0 0 0 4 16 3 讨 论 手 术 目 的 旨 在 矫 正 后 凸 畸 形 稳 定 受 累 节 段 椎 体 解 除 神 经 压 迫 恢 复 神 经 功 能 或 预 防 可 能 发 生 的 神 经 损 害 等, 有 前 路 前 后 路 联 合 后 路 术 式 可 供 选 择 后 路 术 式 又 有 经 关 节 突 截 骨 术 (smith petersen osteotomy,spo) 和 全 椎 体 切 除 术 (vertebralcolumn resection,vcr) 等 单 节 段 SPO 可 矫 正 9 3 ~ 10 7 [1], 适 用 于 后 凸 角 度 较 小 的 后 凸 畸 形 ;VCR 的 矫 正 能 力 虽 大, 因 术 中 失 血 量 并 发 症 较 多, 较 少 适 用 于 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 后 凸 畸 形 患 者 单 节 段 PSO 是 治 疗 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 后 凸 畸 形 (Cobb 角 <55 ) 的 较 佳 术 式 本 研 究 中 患 者 均 采 用 单 节 段 PSO 治 疗, 术 前 后 凸 角 为 (35 2±6 1), 术 后 Cobb 角 为 (5 6±1 2), 术 后 平 均 矫 正 角 度 为 (29 6±4 6), 与 Kimetal [2] 和 Zengetal [3] 的 矫 形 结 果 类 似 而 Xietal [4] 通 过 后 移 楔 形 截 骨 尖 部 和 切 除 病 椎 后 上 部 终 板 等 途 径 增 大 截 骨 角 度, 最 大 矫 正 度 达 56, 但 在 闭 合 截 骨 面 时 可 能 存 在 明 显 的 短 缩 堆 积 或 扭 曲 引 起 神 经 损 伤 的 风 险 双 节 段 PSO 平 均 矫 正 (67 9 图 1 患 者 男,38 岁,L 1 陈 旧 性 骨 折 1 年, 有 严 重 腰 背 痛 A: 术 前 Cobb 角 39 ;B: 后 路 经 椎 弓 根 截 骨 术 后, 后 凸 畸 形 矫 正 ;C: 术 后 1 年 随 访 X 线 片 示 无 明 显 矫 正 丢 失 和 内 固 定 松 动 ;D: 术 后 1 年 CT 矢 状 位 重 建 示 截 骨 椎 体 与 上 位 椎 体 已 形 成 骨 桥 ;E: 术 后 15 个 月 后 取 出 内 固 定,X 线 片 示 无 明 显 矫 正 丢 失

1184 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) ±5 5) [5], 虽 可 获 得 较 大 矫 正 度 数, 但 术 中 失 血 量 多 风 险 大, 也 较 少 适 用 PSO 的 主 要 并 发 症 包 括 术 中 硬 脊 膜 撕 裂 神 经 血 管 损 伤, 术 后 硬 脊 膜 外 血 肿 麻 痹 性 肠 梗 阻 切 口 感 染, 内 固 定 松 动 断 裂 假 关 节 形 成 渐 进 性 后 凸 畸 形 等 [6] 截 骨 的 上 下 椎 板 和 神 经 根 管 需 充 分 减 压, 可 防 止 闭 合 截 骨 面 时 引 起 神 经 受 压 术 中 注 意 保 护 椎 体 外 血 管, 可 防 止 出 血 过 多 先 在 截 骨 椎 邻 近 上 下 一 或 两 个 椎 体 单 侧 置 入 椎 弓 根 螺 钉, 并 于 一 侧 预 置 棒 临 时 固 定, 可 防 止 截 骨 区 移 位 损 伤 神 经 血 管 组 织 本 研 究 中 1 例 术 后 有 单 侧 下 肢 神 经 根 性 症 状, 考 虑 系 术 中 过 度 牵 拉 刺 激 神 经 根 所 致, 予 以 脱 水 营 养 神 经 药 物 等 治 疗 2 周 恢 复, 其 余 患 者 未 发 生 明 显 手 术 相 关 并 发 症 PSO 手 术 要 求 较 高, 术 中 采 用 体 感 诱 发 电 位 和 动 作 诱 发 电 位 以 及 唤 醒 试 验 监 护 等, 在 一 定 程 度 上 可 降 低 手 术 风 险 和 降 低 并 发 症 的 发 生 采 用 PSO 治 疗 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 后 凸 畸 形 可 获 满 意 矫 正, 平 均 矫 正 28 ~42, 长 期 随 访 矫 正 度 平 均 丢 失 1.6 ~7 0 [2-3] 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 伤 椎 上 的 椎 间 盘 可 能 已 严 重 退 变 并 伴 脊 柱 不 稳 [7], 行 PSO 切 除 伤 椎 的 上 位 终 板 时 若 保 留 其 上 的 椎 间 盘, 闭 合 截 骨 区 时 椎 间 盘 紧 邻 截 骨 椎 体 的 松 质 骨, 椎 间 盘 可 能 会 陷 入 松 质 骨 内 以 致 骨 性 融 合 不 佳, 可 能 是 后 期 疼 痛 的 原 因 [8] 本 研 究 末 次 随 访 时 后 凸 Cobb 角 VAS 评 分 ODI 评 分 Frankel 分 级 评 分 均 较 术 前 有 所 改 善 后 凸 矫 正 度 无 明 显 丢 失, 临 床 症 状 和 神 经 功 能 均 有 较 大 改 善 本 研 究 的 手 术 治 疗 和 随 访 结 果 表 明, 后 路 单 节 段 PSO 治 疗 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 后 凸 畸 形, 后 凸 矫 正 度 高, 矫 正 度 丢 失 少, 临 床 效 果 满 意 不 足 之 处 即 例 数 较 少 中 短 期 临 床 疗 效, 尚 需 长 期 随 访 观 察 其 后 凸 矫 正 效 果 参 考 文 献 [1] KimKT,ParkKJ,LeeJH.Osteotomyofthespinetocorectthe spinaldeformity[j].asianspinej,2009,3(2):113-23. [2] KimKT,LeeSH,SukKS,etal.Outcomeofpediclesubtrac tionosteotomiesforfixedsagitalimbalanceofmultipleetiologies: aretrospectivereview of140 patients[j]. Spine(PhilaPa 1976),2012,37(19):1667-5. [3] ZengY,ChenZ,SunC,etal.Posteriorsurgicalcorectionof postraumatickyphosisofthethoracolumbarsegment[j].jspinal DisordTech,2013,26(1):37-41. [4] XiYM,PanM,WangZJ,etal.Corectionofpost traumatictho racolumbarkyphosisusingpediclesubtractionosteotomy[j].eurj OrthopSurgTraumatol,2013,23Suppl1:S59-66. [5] ZhangHQ,HuangJ,GuoCF,etal.Two levelpediclesubtrac tionosteotomyforseverethoracolumbarkyphoticdeformityinanky losingspondylitis[j].eurspinej,2014,23(1):234-41. [6] AuerbachJD,LenkeLG,BridwelKH,etal.Majorcomplica tionsandcomparisonbetween3 columnosteotomytechniquesin 105consecutivespinaldeformityprocedures[J].Spine(PhilaPa 1976),2012,37(14):1198-210. [7] SchnakeKJ,KandzioraF.Corectionofpostraumatickyphosisof thethoracolumbarspinewithmodifiedpediclesubtractionosteoto my[j].eurspinej,2010,19(12):2231-2. [8] ZhangX,ZhangX,ZhangY,etal.Modifiedposteriorclosing wedgeosteotomyforthetreatmentofpostraumaticthoracolumbar kyphosis[j].jtrauma,2011,71(1):209-16. Treatmentofthoracolumbarkyphosisusingposterior pediclesubtractionosteotomy LiLu,ChenYinhe,YangQingguo,etal (DeptofOrthopaedics,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022) Abstract Toretrostectivelyevaluateandanalyzetheclinicalefectonposteriorsingle levelpediclesubtractionos teotomyfortreatingpost traumaticthoracolumbarkyphosisoftwentypatients.thekyphosiscobbangle,visualana logscale(vas)scoreandoswestrydisabilityindex(odi)scoreofpost operationandlastfolow upwerecom paredwiththatofpreoperation.toevaluateclinicalsymptomsandneurologicalfunctionbyfrankelgradescore. PostoperativeCobbangle,VASscoreandODIscoresweresignificantlydiferentcomparedwithpreoperative(P< 0 05).Clinicalsymptomsandneurologicalfunctionamelioratedatlastclinicalexamination.Theposteriormono levelpediclesubtractionosteotomyfortreatmentofpost traumaticthoracolumbarkyphosisisasafeandefectivepro cedure. Keywords thoracolumbar;post traumatickyphosis;pediclesubtractionosteotomy

安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １１８５ 综 述 解离素 金属蛋白酶 １ ７活性调控机制的研究进展 朱可馨１综述 王 冰２ 王志成３审校 摘要 血小板在发生活化或凋亡的同时伴随有黏附受体糖 蛋白 ＧＰ Ⅰｂ α酶切 ＧＰⅠｂ α酶切作为血小板发生活化或 凋亡的一个重要生物标志物 目前 ＧＰⅠｂ α酶切主要由解 离素 金属蛋白酶 １ ７ ＡＤＡＭ１ ７ 所介导 ＡＤＡＭ１ ７是锌离 子依赖的金属蛋白酶 属于 ａ ｄ ａ ｍａ ｌ ｙ ｓ ｎ蛋白家族 与其他金 属酶密切相关 现就近年来 ＡＤＡＭ１ ７的结构 功能以及活 性调节等方面的研究进行综述 关键词 金属蛋白酶 血小板 酶切 中图分类号 Ｒ３ ４ Ｒ３ ３ １ １ ４ ３ 文献标志码 Ａ 文章编号 １ １ ４ ９ ２ ２ １ ４ ８ １ １ ８ ５ ４ 图 １ ＡＤＡＭ１７不同结构域及其功能示意图 １ ＡＤＡＭ１７结构 ＡＤＡＭ１７由 ８２ ４个氨基酸残基组成的 Ⅰ 型跨膜 越多的底物被发现 ＡＤＡＭ１７底物包括表皮生长因 蛋白 编码基因定位在染色体 ２ｐ ２５ １ ＡＤＡＭ１７具 子受体配体 促炎症细胞因子 黏附分子 淀粉前体 有显著的结构特点 含有多个结构域 见图 １ 从 Ｎ 蛋白等 ２ ３ 端开始包括 ① 信号肽 １ １ ７位氨基酸残基 ② 前域 １８ ２ １ ４位氨基酸残基 ③ 金属蛋白酶或催 ２ ２ 调节的膜 内 蛋 白 水 解 ｒ ｇｕｌ ａ ｄ ｎ ｒ ａｍ ｍ 化域 ２１５ ４７ ３位氨基酸残基 ④ 解离素域 ４ ７ ４ ５７２位氨基酸残基 ⑤ 表皮生长因子样域 ５ ７ ３ ＡＭ１７或其他蛋白酶酶切以后 跨膜域能被进一步 ６２ ⑥ 半胱氨酸富含域 ６ ３ ６７ １位氨基酸残 蛋白胞外域首先在 α酶切位点被 ＡＤＡＭ１７或 ＡＤ ＡＭ１酶切后 接着在膜内被由多个蛋白酶组成的 ７２ ６９４位氨基酸残基 ⑧ 胞质 基 ⑦ 跨膜域 ６ ＲＩ Ｐ 有些膜蛋白胞外域被 ＡＤ ｂｒ ａｎｐｒ ｏ ｏｌ ｙｓ ｓ 水解酶切 称为 ＲＩ Ｐ ４ Ｃｈｒ ｓ ａ ｎ ５ 研究发现 Ｎｏ ｃ ｈ 域 ６ ９５ ８２４位氨基酸残基 ２ 分泌酶 如早老蛋白 ｐｒ ｓ ｎ ｌ ｎ 所酶切 被 γ 分泌 γ 酶酶切以后剩余的胞内部分被转移到细胞核 调节 ２ ＡＤＡＭ１７功能 不同基因的转录 ２ ２ １ 酶切膜蛋白胞外域 ＡＤＡＭ１７最重要的功能 是水解酶切各种跨膜蛋白的胞外域 酶切位点通常 ３ ＡＤＡＭ１ ７活性调节 位于胞外域的近膜处 ２ 目前被证实的 ＡＤＡＭ１ ７ ３ １ ＡＤＡＭ１７不同结构域对 ＡＤＡＭ１７活性调节 底物已超过 ５个 而且随着研究的深入还会有越来 ３ １ １ 前域 ＡＤＡＭ１ ７前域能抑制 ＡＤＡＭ１ ７金属 蛋白酶域的酶活性 有研究 ６ 表明 ＡＤＡＭ１７解离 ２１ ４ ４ １ ４接收 基金项目 上海市教委科技创新项目 编号 １２ＹＺ６８ 上海市自然 科学基金 编号 １ ２ＺＲ１ ４２９９ １ 上海中医院大学中药学院 上海 ２１２ ３ 作者单位 ７前域在细胞 素域能提高前域的抑制功能 ＡＤＡＭ１ 内高尔基体网络被蛋白原转化酶家族成员 ｆ ｕｒ ｎ在 金属蛋白酶域之前的 ４个氨基酸残基 精氨酸 缬 ２ 氨酸 赖氨酸 精氨酸 处酶切 ６ ３ ３ １ ２ 催化域或金属蛋白酶域 ＡＤＡＭ１ ７催化域 上海中医药大学教学实验中心 上海 ２１２ ３ 上海市中医医院实验中心 上海 ２ ７１ 作者简介 朱可馨 女 硕士研究生 ｍａ ｌ ａ ｈｗｚ ｃ １ ２６ 王志成 男 助理研究员 责任作者 Ｅ ｃ ｏ ｍ 王 冰 女 副教授 责任作者 Ｅ ｍａ ｌ ａ ｎｎ ａ ｂ ｌ ｃ ｎ ｓ ｎａ ｃ ｏ ｍ 含有典型的锌离子螯合序列 ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ Ｘ代 表任意氨基酸残基 负责加工膜结合的蛋白 例 如 肿 瘤 坏 死 因 子 α ｕｍｏ ｒｎ ｃ ｒ ｏ ｓ ｓｆ ａ ｃ ｏ ｒ α ＴＮＦα 使用突变分析研究显示 金属蛋白酶域第

1186 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 225 位 半 胱 氨 酸 和 435 位 蛋 氨 酸 以 及 解 离 素 域 第 600 位 半 胱 氨 酸 残 基 对 于 ADAM17 催 化 活 性 是 必 需 的 [7] 第 435 位 蛋 氨 酸 残 基 对 于 ADAM17 活 性 中 心 的 重 要 性 在 M435I,M435L 和 M435S 突 变 研 究 中 进 一 步 被 证 实 [8] 金 属 蛋 白 酶 组 织 抑 制 剂 3(tisueinhibitorsof metaloproteinases,timp 3) 是 ADAM17 天 然 的 抑 制 剂, 能 结 合 ADAM17 催 化 域 然 而,TIMP 3 抑 制 效 果 受 到 ADAM17C 端 组 分 ( 解 离 素 域 和 半 胱 氨 酸 富 含 域 ) 的 影 响, 这 些 C 端 组 分 能 明 显 削 弱 TIMP 3 对 ADAM17 催 化 域 的 抑 制 活 性 [4] Janesetal [9] 研 究 TIMP 3 与 ADAM17 催 化 域 结 合 构 成 的 复 合 物 的 晶 体 结 构 发 现,TIMP 3 伸 展 到 ADAM17 表 面 独 特 的 疏 水 袋, 通 过 两 个 亮 氨 酸 残 基 有 效 的 将 TIMP 3 结 合 到 ADAM17 催 化 域 3.1.3 解 离 素 域 目 前 能 与 ADAM17 解 离 素 域 结 合 的 整 合 素 是 α5β1,adam17 能 抑 制 α5β1 介 导 的 细 胞 迁 移 [10] 然 而,α5β1 结 合 ADAM17 解 离 素 域 在 体 内 的 生 理 意 义 以 及 是 否 影 响 ADAM17 酶 切 活 性 目 前 尚 不 明 确 [11] 3.1.4 半 胱 氨 酸 富 含 域 有 报 道 表 明,ADAM17 半 胱 氨 酸 富 含 域 对 于 IL 1R I 胞 外 域 的 酶 切 是 必 需 的, 而 对 于 TNFα 或 p75tnfr 胞 外 域 酶 切 不 是 必 需 的 ADAM17 解 离 素 / 半 胱 氨 酸 富 含 域 含 有 2 个 高 度 保 守 邻 近 的 半 胱 氨 酸 模 序 (CXXC,X 代 表 2 个 其 他 氨 基 酸 ),CXXC 模 序 在 其 他 蛋 白 中 已 被 证 实 受 到 氧 化 - 还 原 修 饰 [2] 在 任 何 一 个 模 序 中, 使 用 丙 氨 酸 代 替 半 胱 氨 酸, 明 显 抑 制 ADAM17 活 性 [4], 表 明 半 胱 氨 酸 富 含 域 在 调 节 ADAM17 活 性 中 发 挥 重 要 作 用 [11] 3.1.5 跨 膜 域 过 表 达 截 断 型 ADAM17 研 究 显 示, 在 佛 波 酯 (phorbol12 myristate 13 acetate,pma) 刺 激 的 细 胞, 只 有 表 达 具 有 跨 膜 域 的 ADAM17 才 能 有 效 酶 切 TNFα, 表 明 跨 膜 域 对 于 ADAM17 的 活 性 非 常 重 要 3.1.6 胞 内 域 ADAM17 胞 内 域 是 由 脯 氨 酸 富 含 的 130 个 氨 基 酸 残 基 组 成, 含 有 1 个 潜 在 的 跨 膜 域 近 端 酪 氨 酸 磷 酸 化 位 点 DKKLDKQYESL, 和 1 个 SH3 结 合 位 点 ( 第 731~738 位 氨 基 酸 残 基 ) [2] 有 [11] 研 究 显 示 ADAM17 胞 内 域 对 于 PMA 诱 导 的 AD AM17 底 物 的 酶 切 不 是 必 需 的 PMA 是 诱 导 金 属 蛋 白 酶 活 化 强 的 诱 导 剂, 对 于 研 究 ADAMs 酶 活 性 改 变 是 很 好 的 工 具 但 是,PMA 不 是 生 理 性 诱 导 剂, 因 此 需 要 进 一 步 研 究 在 生 理 性 诱 导 剂 刺 激 条 件 下, 胞 质 域 对 ADAM17 酶 活 性 的 影 响 3.2 翻 译 后 修 饰 对 ADAM17 活 性 调 节 ADAM17 最 重 要 的 翻 译 后 修 饰 是 在 高 尔 基 体 网 络 进 行 的 前 域 酶 切, 导 致 ADAM17 成 熟 [2] 其 他 翻 译 后 修 饰 包 括 ADAM17 的 糖 基 化 和 磷 酸 化 在 成 熟 的 ADAM17 有 6 个 潜 在 的 N 连 接 糖 基 化 位 点 [2], 这 表 明 糖 基 化 可 能 是 重 要 的 ADAM17 活 化 的 调 节 机 制 ADAM17 分 子 量 为 130ku 是 ADAM17 糖 基 化 形 式 [2] 然 而, 到 目 前 为 止 还 不 清 楚 ADAM17 糖 基 化 怎 样 影 响 ADAM17 活 化 和 转 运 另 一 个 重 要 的 翻 译 后 修 饰 是 磷 酸 化 ADAM17 胞 质 域 丝 氨 酸 和 苏 氨 酸 的 磷 酸 化 已 进 行 广 泛 的 研 究 但 是, 不 同 研 究 小 组 得 到 的 结 果 不 同, 有 的 甚 至 相 反 Waheed etal [12] 研 究 发 现, 在 CHO 和 HEK293 细 胞 株,PMA 和 表 皮 生 长 因 子 (epidermal growthfactor,egf) 刺 激 能 诱 导 ADAM17 在 735 位 苏 氨 酸 残 基 发 生 磷 酸 化, 磷 酸 化 由 有 丝 分 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 ERK 催 化, 同 时 伴 有 跨 膜 蛋 白 TrkA 神 经 [13] 营 养 因 子 受 体 酶 切 增 加 其 他 研 究 显 示,PMA 和 EGF 诱 导 ADAM17 在 819 位 丝 氨 酸 残 基 而 不 是 苏 氨 酸 残 基 ( 或 酪 氨 酸 残 基 ) 磷 酸 化, 磷 酸 化 由 ERK 催 化 ; 同 时 发 现 生 长 因 子 刺 激 能 诱 导 ADAM17 在 791 位 丝 氨 酸 残 基 脱 磷 酸 [13] 然 而, 很 少 有 报 道 关 于 非 PMA 刺 激 介 导 的 ADAM17 磷 酸 化 Adrain etal [14] 研 究 发 现, 在 癌 细 胞 系,G 蛋 白 偶 联 受 体 (G proteincoupledreceptor,gpcr) 刺 激 物 胃 泌 素 释 放 肽 能 诱 导 Src PI3K PDK1 信 号 通 路 活 化, 磷 酸 肌 醇 依 赖 的 蛋 白 激 酶 1(phosphoinositide dependentkinase 1,PDK1) 能 直 接 磷 酸 化 ADAM17 的 苏 氨 酸 和 丝 氨 酸 残 基, 但 是,ADAM17 胞 内 域 具 体 磷 酸 化 位 点 和 胞 内 域 在 ADAM17 活 性 中 的 具 体 作 用 需 要 进 一 步 研 究 在 HEK293 细 胞 系, 另 一 个 GPCR 刺 激 物 卡 巴 可 能 诱 导 ADAM17735 位 苏 氨 酸 残 基 和 702 位 酪 氨 酸 残 基 发 生 磷 酸 化 Yinetal [15] 研 究 发 现, 通 过 GPCR 活 化 信 号 通 路, 创 伤 三 磷 酸 腺 苷 (adenosine triphosphate,atp) 或 溶 血 磷 脂 酸 (lysophosphatidic acid,lpa) 处 理 的 角 膜 上 皮 细 胞 能 诱 导 ERK 依 赖 的 ADAM17 丝 氨 酸 磷 酸 化 上 述 这 些 研 究 结 果 有 些 是 相 反 的, 可 能 原 因 是 研 究 者 采 用 的 是 仿 真 系 统 : 过 表 达 ADAM17 的 转 化 或 转 染 细 胞, 以 及 主 要 使 用 非 生 理 性 诱 导 剂 PMA 来 研 究 ADAM17 磷 酸 化 过 程 另 一 种 可 能 原 因 是 ADAM17 在 不 同 的 残 基 发 生 磷 酸 化 取 决 于 细 胞 类 型 和 刺 激 因 此, 为 了 更 好 的 理 解 这 种 现 象, 今 后 在 研 究 ADAM17 翻 译 后 修 饰

安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1187 时, 最 好 采 用 原 代 未 转 染 的 细 胞, 而 且 也 要 使 用 生 理 性 刺 激 物 来 代 替 PMA 3.3 ADAM17 胞 内 转 运 对 其 活 性 调 节 与 翻 译 后 修 饰 一 样,ADAM17 胞 内 转 运 可 能 也 调 控 其 酶 切 活 [2] 性 最 近 研 究 表 明, 在 furin 酶 切 ADAM17 前 域 期 间 和 酶 切 之 后, 活 化 的 ADAM17 定 位 在 胆 固 醇 富 含 的 膜 性 微 区, 这 种 膜 性 微 区 称 为 脂 筏 定 位 在 脂 筏 的 活 化 ADAM17 在 空 间 上 与 其 底 物 分 离, 因 此 从 空 间 上 限 制 其 活 性 [16] 同 时 发 现, 将 细 胞 膜 胆 固 醇 消 耗 后 能 增 加 ADAM17 酶 切 底 物 的 活 性, 表 明 在 细 胞 膜 表 面 ADAM17 酶 切 活 性 可 能 受 到 胆 固 醇 运 转 [17] 的 调 节 最 近 有 报 道 表 明, 高 密 度 脂 蛋 白 (high densitylipoproteins,hdls) 能 改 变 脂 筏 结 构, 进 而 活 化 ADAM17, 引 起 ADAM17 底 物 的 酶 切 增 加 另 外,ERK 依 赖 的 ADAM17 胞 内 域 735 位 苏 氨 酸 残 基 磷 酸 化 对 于 ADAM17 在 成 熟 过 程 中 转 运 到 分 泌 通 路 是 必 需 的 [18] Ebsenetal [19] 研 究 发 现, 使 用 PMA,ADAM17 在 细 胞 表 面 表 达 减 少, 认 为 是 AD AM17 内 化 和 降 解 的 结 果 相 反, 其 他 研 究 小 组 研 [20] 究 发 现,PMA 刺 激 并 不 引 起 ADAM17 在 细 胞 中 重 新 分 布, 但 能 减 少 细 胞 内 总 的 ADAM17 含 量 尽 管 这 方 面 的 研 究 报 道 很 多, 但 是 目 前 对 于 调 控 AD AM17 转 运 的 机 制 还 不 清 楚 4 ADAM17 与 人 类 疾 病 ADAM17 涉 及 许 多 人 类 的 疾 病, 包 括 癌 症 败 血 症 糖 尿 病 多 发 性 硬 化 症 老 年 性 痴 呆 等 4.1 内 毒 素 休 克 和 败 血 症 在 脑 膜 炎 双 球 菌 或 脂 多 糖 (lipopolysaccharide,lps) 刺 激 的 单 核 细 胞, 其 表 面 TNF α 的 量 迅 速 减 少, 表 明 ADAM17 在 败 血 症 中 发 挥 重 要 的 作 用 [21] 脑 膜 炎 患 者 的 血 液 和 腹 水 中 ADAM17 活 性 增 加, 同 时 分 叶 核 中 性 粒 细 胞 表 面 [22] TNFα 和 L 选 择 素 减 少 而 且, 最 近 研 究 显 示, 在 骨 髓 细 胞 缺 乏 ADAM17 活 性 的 小 鼠, 通 过 抑 制 循 环 中 TNFα 的 量, 能 减 少 内 毒 素 休 克 引 起 小 鼠 的 致 死 率, 表 明 ADAM17 在 内 毒 素 休 克 中 的 作 用 4.2 多 发 性 硬 化 症 ADAM17 也 涉 及 神 经 炎 症 性 疾 病, 如 多 发 性 硬 化 症 (multiplesclerosis,ms) 在 急 性 MS 患 者, 外 周 单 核 细 胞 ADAM17 活 化 增 加 而 且, 采 用 免 疫 组 化, 对 死 于 MS 患 者 的 尸 体 进 行 研 [23] 究 显 示,ADAM17 和 TNFR2 存 在 活 化 MS 斑 块, 同 时, 患 者 脑 脊 液 中,ADAM17 和 可 溶 性 TNFR2 含 量 增 加 在 急 性 MS 损 伤, 内 皮 细 胞, 小 胶 质 细 胞, 星 形 胶 质 细 胞 的 ADAM17 表 达 增 加 ADAM17 在 MS 中 的 作 用 可 能 是 通 过 酶 切 酪 氨 酸 激 酶 Axl 和 Mer 诱 饵 受 体, 促 进 斑 块 形 成, 改 变 生 长 因 子 信 号 和 延 长 损 伤 活 动 [24], 然 而, 这 种 可 能 性 需 要 进 一 步 验 证 4.3 老 年 性 痴 呆 ADAM17 在 老 年 性 痴 呆 中 扮 演 重 要 角 色,ADAM17 作 为 α 分 泌 酶 酶 切 淀 粉 样 前 体 蛋 白 (amyloidprecusorprotein,app) 产 生 可 溶 性 APPsα,APPsα 不 参 与 构 成 细 胞 外 老 年 斑 如 果 APP 被 β 分 泌 酶 所 酶 切, 产 生 β 淀 粉 样 多 肽 (Aβ 多 肽 ),Aβ 多 肽 是 构 成 细 胞 外 老 年 斑 的 主 要 成 分 在 老 年 痴 呆 患 者 大 脑 淀 粉 样 斑 块 周 围, 观 察 到 小 胶 质 细 胞 和 星 形 胶 质 细 胞 活 化, 以 及 增 加 的 炎 症 介 质, 证 实 Aβ 多 肽 能 诱 导 炎 症 [25] ADAM17 定 位 在 脑 部 [26] 含 有 淀 粉 样 斑 块 的 区 域 最 近 研 究 显 示, 能 调 节 ADAM17 活 性 的 ADAM17 胞 内 域 结 合 蛋 白 FHL2 对 于 APPsα 的 形 成 也 是 必 需 的 4.4 恶 性 肿 瘤 ADAM17 通 过 酶 切 肿 瘤 生 长 过 程 中 必 需 的 生 长 因 子 而 参 与 癌 症 的 形 成 已 发 现, 肿 瘤 组 织 ADAM17 活 性 升 高, 伴 有 组 织 中 表 皮 生 长 因 子 配 体 酶 切 增 加, 能 促 进 肿 瘤 恶 性 程 度 的 发 展 ADAM17 在 各 种 恶 性 肿 瘤 中 的 作 用, 目 前 了 解 最 深 入 的 是 乳 腺 癌 在 乳 腺 癌,ADAM17 过 表 达 与 TGFα 表 达 肿 瘤 级 数 和 转 移 相 关 联, 而 且 ADAM17 活 化 增 加 预 示 着 乳 腺 癌 患 者 存 活 期 缩 短 [27] 在 乳 腺 癌 转 移 的 患 者, 血 清 中 能 检 测 到 乳 腺 癌 标 志 物 nectin 4,nectin 4 是 被 ADAM17 所 酶 切 体 外 实 [28] 验 显 示,ADAM17 诱 导 乳 腺 癌 细 胞 增 殖 转 移 是 通 过 活 化 EGFR PI3K AKT 信 号 通 路 而 且, 通 过 小 RNAs 干 扰 技 术 干 扰 ADAM17 活 性 后, 乳 腺 癌 细 胞 恶 性 表 型 能 恢 复 到 正 常 表 型, 进 一 步 表 明 ADAM17 在 乳 腺 癌 中 的 重 要 病 理 生 理 作 用 5 结 语 ADAM17 表 达 在 大 多 数 哺 乳 动 物 细 胞, 在 调 控 生 理 性 和 病 理 性 过 程 中 发 挥 重 要 作 用 ADAM17 作 为 重 要 的 sheddase, 对 于 正 常 哺 乳 动 物 的 发 育 和 正 常 生 命 的 维 持 是 必 需 的 鉴 于 ADAM17 的 重 要 作 用, 研 究 ADAM17 活 化 机 制 就 显 得 非 常 重 要 例 如 : 怎 样 做 到 一 种 药 物 只 针 对 癌 症 细 胞 的 ADAM17, 而 不 影 响 其 他 正 常 组 织 细 胞 的 ADAM17 功 能? 虽 然 一 些 ADAM17 特 异 性 抑 制 药 物 能 特 异 性 抑 制 ADAM17 活 性 而 不 抑 制 其 他 金 属 蛋 白 酶 活 性, 但 是 其 副 作 用 还 是 非 常 大 的 由 于 ADAM17 具 有 双 重 特 性 ( 既 能 促 进 细 胞 增 殖 又 能 抑 制 细 胞 增 殖 ), 所 以

1188 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 有 些 效 果 可 能 对 于 某 些 组 织 或 疾 病 是 有 利 的, 但 对 其 他 组 织 是 有 害 的 因 此,ADAM17 活 性 必 需 在 细 胞 所 处 的 特 定 环 境 下 进 行 考 虑, 这 主 要 取 决 于 与 ADAM17 信 号 通 路 相 连 的 其 他 信 号 通 路 和 分 子 在 不 同 组 织 细 胞 所 处 的 环 境 下, 对 ADAM17 活 化 影 响 是 不 同 的 总 之, 理 解 体 内 ADAM17 活 性 调 控 的 机 制 对 于 与 ADAM17 有 关 疾 病 的 治 疗 具 有 重 要 意 义 参 考 文 献 [1] Rose JohnS.ADAM17,shedding,TACEastherapeutictargets [J].PharmacolRes,2013,71(5):19-22. [2] EdwardsDR,HandsleyMM,PenningtonCJ.TheADAMmetal loproteinases[j].molaspectsmed,2008,29(5):258-89. [3] MenqhiniR,FiorentinoL,CasaqrandeV,etal.TheroleofAD AM17inmetabolicinflammation[J].Atherosclerosis,2013,228 (1):12-7. [4] GoozM.ADAM 17:theenzymethatdoesital[J].CritRev BiochemMolBiol,2010,45(2):146-69. [5] ChristianLM.TheADAM family:insightsintonotchproteolysis [J].Fly(Austin),2012,6(1):30-4. [6] LiX,YanY,HuangW,etal.TheregulationofTACEcatalytic functionbyitsprodomain[j].molbiolrep,2009,36(4):641-51. [7] TapeCJ,WilemsSH,DombernowskySL,etal.Cros domain inhibitionoftaceectodomain[j].procnatlacadsciusa, 2011,108(14):5578-83. [8] PerezL,KeriganJE,LiX,etal.Substitutionofmethionine435 withleucine,isoleucine,andserineintumornecrosisfactoralpha convertingenzymeinactivatesectodomainsheddingactivity[j]. BiochemCelBiol,2007,85(1):141-9. [9] JanesPW,SahaN,BartonW A,etal.Adam meetseph:an ADAM substraterecognitionmoduleactsasamolecularswitchfor ephrincleavageintrans[j].cel,2005,123(2):291-304. [10] GoozP,DangY,HigashiyamaS,etal.Adisintegrinandmet aloenzyme(adam)17activationisregulatedbyα5β1integrin inkidneymesangialcels[j].plosone,2012,7(3):e33350. [11] LiX,PerezL,FanH.InhibitoryroleofTACE/ADAM17cytotail inproteinectodomainshedding[j].worldjbiolchem,2011,2 (11):246-51. [12] WaheedF,DanQ,AmoozadehY,etal.Centralroleoftheex changefactorgef H1inTNF α inducedsequentialactivationof Rac,ADAM17/TACE,andRhoAintubularepithelialcels[J]. MolBiolCel,2013,24(7):1068-82. [13] LiX,PerezL,FanH.InhibitoryroleofTACE/ADAM17cytotail inproteinectodomainshedding[j].worldjbiolchem,2011,2 (11):246-51. [14] AdrainC,ZetlM,ChristovaY,etal.Tumornecrosisfactorsig nalingrequiresirhom2topromotetrafickingandactivationofta CE[J].Science,2012,335(6065):225-8. [15] YinJ,YuFS.ERK1/2mediatewounding andg protein cou pledreceptorligands inducedegfractivationviaregulatingad AM17andHB EGFshedding[J].InvestOphthalmolVisSci, 2009,50(1):132-9. [16] TelierE,CanaultM,RebsomenL,etal.Thesheddingactivity ofadam17issequesteredinlipidrafts[j].expcelres, 2006,312(20):3969-80. [17]TelierE,CanaultM,PoggiM,etal.HDLsactivateADAM17 dependentshedding[j].jcelphysiol,2008,214(3):687-93. [18]SoondSM,EversonB,RichesDW,etal.ERK mediatedphos phorylationofthr735intnfalpha convertingenzymeanditspo tentialroleintaceproteintraficking[j].jcelsci,2005, 118(Pt11):2371-80. [19]EbsenH,SchroderA,KabelitzD,etal.Diferentialsurfaceex presionofadam10andadam17onhumantlymphocytesand tumorcels[j].plosone,2013,8(10):e76853. [20] GuoS,PengM,ZhaoQ,etal.RoleofADAM10andADAM17 incd16bsheddingmediatedbydiferentstimulators[j].chin MedSciJ,2012,27(2):73-9. [21]YousefAA,SulimanGA.Thepredictiveprognosticvaluesofser umtnf αincomparisontosofascoremonitoringincriticaly I patients[j].biomedresint,2013,2013:258029 [22]Becker PaulyC,Rose JohnS.TNFαcleavagebeyondTACE/AD AM17:matrixmetaloproteinase13isapotentialtherapeutictarget insepsisandcolitis[j].embomolmed,2013,5(7):902-4. [23]WarenKM,ReevesTM,PhilipsLL.MT5 MMP,ADAM 10, andn cadherinactinconcerttofacilitatesynapsereorganization aftertraumaticbraininjury[j].jneurotrauma,2012,29(10): 1922-40. [24]WeingerJG,OmariKM,MarsdenK,etal.Up regulationofsol ubleaxlandmerreceptortyrosinekinasenegativelycorelates withgas6inestablishedmultiplesclerosislesions[j].am J Pathol,2009,175(1):283-93. [25]PlutaR,Furmaga JablonskaW,MaciejewskiR,etal.Brainis chemiaactivatesβ andγ secretasecleavageofamyloidprecursor protein:significanceinsporadicalzheimer sdisease[j].mol Neurobiol,2013,47(1):425-34. [26] TanahashiH,YoshiokaK.RNAinterferencesilencingofDRAL afectsprocesingofamyloidprecursorprotein[j].neuroscilet, 2008,439(3):293-7. [27] McGowanPM,McKiernanE,BolsterF,etal.ADAM 17pre dictsadverseoutcomeinpatientswithbreastcancer[j].annon col,2008,19(6):1075-81. [28] DufyM J,MuloolyM,O DonovanN,etal.TheADAMsfamily ofproteases:new biomarkersandtherapeutictargetsforcancer [J].ClinProteomics,2011,8(1):9.