农 学 学 报 2014,4(11):80-84 Journal of Agriculture www.caaj.org 海 带 属 配 子 体 DNA 提 取 及 ISSR-PCR 体 系 优 化 李 言, 崔 翠 菊, 罗 世 菊, 李 晓 捷, 赵 聚 萍, 赛 珊, 钱 瑞, 武 瑞 娜 ( 山 东 东 方 海 洋 科 技 股 份 有 限 公 司 / 国 家 海 藻 工 程 技 术 研 究 中 心 / 山 东 省 海 藻 遗 传 育 种 与 栽 培 技 术 重 点 实 验 室, 山 东 烟 台 264003) 摘 要 : 为 了 建 立 一 个 重 现 性 好 稳 定 性 高, 适 用 于 海 带 属 ISSR 遗 传 分 析 的 PCR 反 应 体 系, 从 海 带 属 配 子 体 材 料 中 提 取 基 因 组 DNA 作 为 模 板, 应 用 正 交 设 计 试 验 对 反 应 体 系 中 各 因 子 的 不 同 浓 度 进 行 组 合 优 化 结 果 显 示 : 适 用 于 海 带 ISSR 扩 增 反 应 的 最 佳 体 系 (20 μl) 为 :1 PCR buffer, mmol/l Mg 2 +, mmol/l dntps, μmol/l ISSR 引 物,40 ng 模 板 DNA, U Taq DNA 聚 合 酶 ; 扩 增 PCR 程 序 为 : 95 预 变 性 3 min;95 变 性 45 s,52 退 火 45 s,72 延 伸 2 min, 共 38 个 循 环 ; 最 后 72 延 伸 10 min 在 优 化 的 海 带 ISSR 反 应 条 件 下, 扩 增 条 带 稳 定, 重 现 性 好, 为 应 用 ISSR 分 子 标 记 技 术 进 行 海 带 属 遗 传 多 样 性 研 究 和 分 子 鉴 定 奠 定 了 技 术 基 础 关 键 词 : 海 带 属 ; 配 子 体 ;DNA 提 取 ;ISSR; 体 系 优 化 中 图 分 类 号 :Q75 文 献 标 志 码 :A 论 文 编 号 :2013-0938 Genomic DNA Extraction and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Saccharina Li Yan, Cui Cuiju, Luo Shiju, Li Xiaojie, Zhao Juping, Sai Shan, Qian Rui, Wu Ruina (Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd/National Alage Project Technology Research Centre/ Algae Genetic Breeding and Cultivation Technology Key Laboratory of Shandong Province, Yantai 264003, Shandong, China) Abstract: In order to establish a reproducible, stable, and suitable reaction system of Saccharina for ISSR analysis of genetic differences, the genomic DNA extracted from gametophytes of Saccharina was used as template, the different concentrations of the factors in reaction system were optimized by orthogonal design experiment. The results showed that, the optimal ISSR reaction system (20 μl) contained 1 PCR buffer, mmol/l Mg 2 +, mmol/l dntps, 1 μmol/l ISSR primer, 40 ng template DNA and U Taq DNA polymerase. The PCR program was pre-denatured at 95 for 3 min and followed by 38 cycles of 45 s at 95, 45 s at 52, 2 min at 72, and final extension of 10 min at 72. The optimal ISSR reaction system was stable and repeatable. This system could provide the technical foundation for the application of ISSR molecular marker technology for the study on genetic diversity and molecular identification of Saccharina. Key words: Saccharina; Gametophyte; DNA Extraction; ISSR; System Optimization 0 引 言 海 带 (Saccharina japonica) 属 于 褐 藻 门 (Phaeophyta) 海 带 目 (Laminariales) 海 带 科 (Laminariaceae) 海 带 属 (Saccharina) 藻 类,19 世 纪 20 年 代 从 日 本 首 次 引 进, 并 逐 渐 适 应 中 国 海 域 条 件, 现 在 是 中 国 人 工 栽 培 历 史 最 长 产 量 最 高 的 大 型 经 济 海 藻, [1-2] 在 医 药 食 品 化 工 等 方 面 都 有 广 泛 的 应 用 近 年 来, 中 国 又 陆 续 引 进 了 多 个 海 带 种 类 如 Saccharina 基 金 项 目 : 国 家 科 技 支 撑 计 划 海 藻 栽 培 新 种 质 苗 种 繁 育 与 栽 培 技 术 研 究 及 产 业 化 示 范 (2012BAD55G01); 国 家 863 重 大 项 目 基 于 全 基 因 组 信 息 的 藻 类 遗 传 选 育 (2012AA10A406); 烟 台 市 科 技 发 展 计 划 项 目 药 用 和 食 用 海 藻 新 种 质 苗 种 繁 育 与 栽 培 技 术 研 究 及 产 业 化 示 范 (2013LGS002) 第 一 作 者 简 介 : 李 言, 女,1983 年 出 生, 山 东 烟 台 人, 工 程 师, 硕 士, 研 究 方 向 为 藻 类 遗 传 学 通 信 地 址 :264003 山 东 烟 台 莱 山 区 澳 柯 玛 大 街 18 号 东 方 海 洋 保 税 库 实 验 楼 305,Tel:0535-6929510,E-mail:liyan-pig@163.com 通 讯 作 者 : 崔 翠 菊, 女,1984 年 出 生, 山 东 济 宁 人, 工 程 师, 博 士, 研 究 方 向 为 藻 类 遗 传 育 种 通 信 地 址 :264003 山 东 烟 台 莱 山 区 澳 柯 玛 大 街 18 号 东 方 海 洋 保 税 库 实 验 楼 305,Tel:0535-6929510,E-mail:cuicuiju@163.com 收 稿 日 期 :2013-11-20, 修 回 日 期 :2014-04-10
81 longissima Saccharina angustata Saccharina 将配子体迅速研碎 再加入 600 μl 2 CTAB 提取缓冲 ochotensis Saccharina religiosa 等丰富了海带种质资 液 置于 65 水浴 30 min, 期间每隔 5 min 上下颠倒数 源 也为开展遗传育种和新品种杂交选育工作提供了 次 4 1200 r/min 离心 10 min 取上清 加入等体积的 海带的分子遗传学方面的基础研究开展较 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 轻摇混匀 4 1200 r/min 离 晚 目前针对海带遗传多样性研究的报道中主要以 心 10 min 重复上述两个步骤 2~3 次 直至有机相和水 SSR RAPD 标 记 技 术 为 主 ISSR Inter- Simple 相界面无白色蛋白层 加入 2 倍体积的无水乙醇 充分 Sequence Repeat 简 单 重 复 间 序 列 是 在 1994 年 由 混匀后-20 静置 2 h 4 1200 r/min 离心 10 min 70% Ziekiewicz 等 在 SSR 标记的基础上开发的一种新的 乙醇洗涤 2~3 次 超净工作台中风干 加 80 μl 的 TE 溶 分子标记 与 SSR 标记相比 ISSR 不需要预先知道基 解 用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测所提 因组的序列信息 也不需要开发引物 成本低 操作简 DNA 的浓度和纯度 DNA 浓度统一稀释为 40 ng/μl 以 便 反应的遗传多态性丰富 但在使用 ISSR 标记进行 方便后续使用 -20 保存备用 PCR 扩增试验时 不同物种的试验材料对引物反应条 1.3 ISSR 反应体系的优化 材料 [3-4] [5-6] [7] 件的要求也不同 因此需要对引物进行筛选和反应体 参 照 哥 伦 比 亚 大 学 公 布 的 ISSR 引 物 序 列 系的优化 邵峰等 采用高盐低 ph 法提取紫色观赏 (UBC801-UBC900) 由上海捷瑞生物工程有限公司合 辣 椒 的 基 因 组 DNA 并 通 过 正 交 设 计 试 验 优 化 了 成 经 预 试 验 筛 选 对 Mg2 + dntp 引 物 浓 度 Taq ISSR-PCR 反应体系 陈名红等[9]采用单因素试验对影 DNA 聚合酶(Promega USA)4 个因素 分别取 3 个水 响百合 ISSR-PCR 反应体系中的 6 个主要因素进行优 平 设计 L9(34)正交表进行正交试验 表 1 取最适反 化筛选 建立了适合百合属的 ISSR 最佳反应体系 汪 应体系 进行退火温度的梯度试验 PCR 反应程序 斌等 筛选出适合红麻的 ISSR 引物 进行了体系优 95 预变性 3 min 95 变性 45 s 52 退火 45 s 72 延 化 并利用 ISSR 扩增条带建立了 6 份红麻种质材料的 伸 2 min 共 38 个循环 最后 72 延伸 10 min 扩增产 指纹数据库 王新宇等 用 ISSR 分子标记技术构建了 物在 %的琼脂糖凝胶上电泳检测 [8] [10] [11] 多态性水平较低的小麦种内指纹图谱 能将亲缘关系 表 1 ISSR 反应的 L9(34)正交试验设计 很近的品种或品系区分开 目前 ISSR 已被广泛应用 于物种的系统发育 品种鉴定和遗传多样性研究[12-14] 目前在国内 沈永宝等 陈海云等 是利用 ISSR 分 [15] [16] 编号 Mg2+浓度/ dntp 浓度/ 引物浓度/ Taq DNA 聚合酶/ (mmol/l) (mmol/l) (μmol/l) U 子标记技术在种质鉴定方面做得较好的专家 在海带 1 属的分子标记技术研究中 尚未见有对 ISSR 反应体系 2 优化的相关报道 因此本研究以海带配子体的基因组 3 DNA 为模板 应用正交设计试验对海带 ISSR-PCR 反 4 应体系进行优化 为后续开展海带品种鉴定和遗传多 5 样性研究奠定基础 6 1 材料与方法 7 1.1 试验材料 8 9 以保存在国家海藻工程技术研究中心海藻种质库 的海带配子体为试验材料 取状态良好 干净的克隆材 料进行 DNA 提取 2 结果与分析 基因组 DNA 提取 2.1 海带配子体基因组 DNA 的提取 采用改进的 CTAB 法提取配子体基因组 DNA 具 提取的海带配子体 DNA 条带整齐 无降解和杂质 体方法 取 g 湿重的配子体材料 尽可能的吸干水 污染 图 1 紫外分光光度计测定的 A260/A280 比值在 分 在 μl 离心管中 加入 100 μl 2 CTAB 提取缓冲 1.9 左右 浓度约为 50~100 ng/μl 可满足试验需要 液 包 括 2% CTAB(W/V) 2% PVP polyvinylpyrrolidone 聚乙烯吡咯烷酮 100 mmol/l Tris- HCl 20 mmol/l EDTA( ph 8.0) 1.4 mmol/l NaCl 2%β-巯基乙醇(V/V) 用尖头研磨棒在离心管中 该方法不需使用液氮研磨 只需用很少的试验材料便 可提取质量符合要求的基因组 DNA 2.2 海带配子体 ISSR 反应体系优化 本试验根据 4 因素 3 水平正交设计表共有 9 个试
82 李 言 等 : 海 带 属 配 子 体 DNA 提 取 及 ISSR-PCR 体 系 优 化 M 1 2 3 4 M:λDNA(100 ng);1~4: 部 分 配 子 体 DNA 图 1 提 取 的 部 分 海 带 配 子 体 基 因 组 DNA 验 组 合,PCR 扩 增 结 果 见 图 2, 可 知, 除 个 别 泳 道 条 带 模 糊 之 外, 大 部 分 组 合 都 能 扩 出 清 晰 的 条 带 综 合 考 虑 各 因 素 及 用 量, 觉 得 第 5 号 组 合 扩 增 效 果 最 好, 扩 增 位 点 多, 条 带 清 楚, 该 体 系 (20 μl) 为 :1 PCR buffer, mmol/l Mg 2+, mmol/l dntps, μmol/l 引 物, 40 ng 模 板 DNA, U Taq DNA 聚 合 酶 ; 扩 增 PCR 程 序 为 :95 预 变 性 3 min;95 变 性 45 s,52 退 火 45 s, 72 延 伸 2 min, 共 38 个 循 环 ; 最 后 72 延 伸 10 min 选 取 5 号 组 合 的 反 应 体 系 进 行 温 度 梯 度 试 验, 另 选 取 4 个 个 体, 分 设 48 52 55 3 个 温 度, 扩 增 结 果 电 泳 图 谱 见 图 3 48 时 扩 增 条 带 明 亮 清 晰 扩 增 效 率 高, 但 相 M c 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 C: 阴 性 对 照 ;1~9:9 个 试 验 组 合 ;M:100 bp plus DNA marker 图 2 ISSR 正 交 试 验 组 合 电 泳 图 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1 图 3 3 个 温 度 梯 度 下 的 扩 增 电 泳 图 M:100 bp plus DNA marker;1~4: 退 火 温 度 为 48 ;5~8: 退 火 温 度 为 52 ;9~12: 退 火 温 度 为 55
83 比较 52 条件下 个体间的特异条带较多 能较好地反 3 结论 映出个体间的差异 虽然扩增效率不如 48 高 但条带 试验找到了一种适用于 ISSR-PCR 反应的海带基 也清晰可见 所以综合各方面考虑 选取 52 作为最 因组 DNA 提取方法 该方法不需使用液氮研磨 只需 适反应条件 用于后续群体的扩增 用很少的试验材料便可提取质量符合要求的基因组 2.3 海带配子体 ISSR 反应体系稳定性检测 DNA 节约材料 通过预试验和多因子正交设计试验 利用优化的 ISSR 反应体系 选择 12 个海带配子 得到适合海带的 ISSR-PCR 反应体系 1 PCR buffer 体材料 DNA 对该体系进行稳定性检测 从图 4 可以 mmol/l Mg2 + mmol/l dntps μmol/l ISSR 看出 经正交试验优化和温度梯度试验后的 PCR 体系 引物 40 ng 模板 DNA U Taq DNA 聚合酶 扩增 扩增出的条带清晰 位点多 表明该体系稳定可靠 可 PCR 程序为 95 预变性 3 min 95 变性 45 s 52 用于后续海带配子体种质鉴定和遗传多样性分析等相 退 火 45 s 72 延 伸 2 min 共 38 个 循 环 72 延 伸 关研究 10 min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1 M 100 bp plus DNA marker 1~12 12 个不同的海带属配子体 PCR 扩增结果 图 4 12 个个体在最佳条件下的扩增电泳图 姜翠翠等[17]研究发现 PCR 反应体系中的各因素间 存在一定的互作效应 所以本试验用正交试验代替单 稳定性高 但此方法步骤较繁琐 还需用到有机试剂 所以还有待进一步探索研究 因素试验进行 PCR 体系的优化 对 ISSR-PCR 反应体 在设计优化试验的预试验中 试用了不同商家的 系 中 主 要 的 4 个 因 素 Mg dntp 引 物 浓 度 Taq Taq DNA 聚合酶 发现聚合酶的质量对 PCR 扩增结果 DNA 聚合酶 分别选取 3 个水平进化优化试验 从试 影响非常大 不论是从条带的有无 带型的清晰度 还 验结果看出 不同的引物浓度对扩增的条带有无或亮 是扩增的重现性和稳定性等方面都有着直接的影响 度无明显影响 但 Mg 浓度对条带的影响非常明显 这与何礼等 [18] 姜翠翠等 [17] 陈名红等 [9] 在进行随机引 当 Mg2+浓度低时 出现部分条带的缺失 dntp 浓度的 物扩增时得出的结论相同 结合条带扩增的质量和 影响也无明显差异 退火温度影响扩增条带的式样 这 DNA 聚合酶的价格 评估了不同商家聚合酶的性价 2+ 2+ 点研究结果与邵峰等 和陈名红等 的研究相符合 比 决定选用 Promega 生产的 GoTaq Flexi DNA 聚合 4 讨论 酶进行 PCR 扩增条件优化和后续的 ISSR 试验 本研 [8] [9] ISSR-PCR 反应对基因组 DNA 的质量要求很高 究通过对 ISSR-PCR 反应体系中各因素的调整和优 预试验中也采用基因组 DNA 提取试剂盒 天根 中国 化 建立了适合海带进行 ISSR-PCR 扩增反应的体系 进行过海带的基因组 DNA 提取 但因海带本身含多 和 PCR 扩增程序 为以后利用 ISSR 标记技术进行海 糖 多酚 目前还没有针对海带专门设计的基因组提取 带种质鉴定和遗传多样性分析提供了技术支持 试剂盒 所以效果不佳 本试验采用直接研磨配子体 参考文献 法 并利用改良的 CTAB 法进行基因组 DNA 的提取 得到的 DNA 纯度好 无杂质 无降解 在 PCR 扩增中 [1] 李宏基.中国海带养殖若干问题[M].北京:海洋出版社,1996:3-14.
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