中 国 农 学 通 报 2012,28(18):194-198 Chinese Agricultural Science Bulletin 植 物 甜 蛋 白 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 多 克 隆 抗 体 的 制 备 与 鉴 定 顾 文 亮 1, 夏 启 玉 2, 姚 晶 1, 胡 新 文 1 2, 郭 建 春 ( 1 海 南 大 学 农 学 院, 海 口 570228; 2 中 国 热 带 农 业 科 学 院 热 带 生 物 技 术 研 究 所, 海 口 571101) 摘 要 : 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 是 中 国 所 特 有 的 植 物 马 槟 榔 种 子 中 的 甜 味 蛋 白, 将 其 作 为 新 型 甜 味 剂 有 着 广 阔 的 市 场 前 景 为 了 给 重 组 马 宾 灵 的 基 因 工 程 应 用 提 供 可 靠 的 蛋 白 质 检 测 与 鉴 定 的 抗 体, 通 过 离 子 交 换 法 从 马 槟 榔 (Capparis masaikai Lévl) 种 子 中 分 离 纯 化 马 宾 灵, 将 其 作 为 抗 原 免 疫 新 西 兰 大 白 兔, 收 集 免 疫 后 血 清 经 抗 原 亲 和 纯 化 制 备 马 宾 灵 多 克 隆 抗 体 结 果 表 明, 制 备 的 马 宾 灵 多 克 隆 抗 体 经 ELISA 检 测 效 价 比 达 到 1:256000,Western-blot 检 测 表 明 其 具 有 良 好 的 反 应 性 和 特 异 性 本 研 究 制 备 的 马 宾 灵 多 克 隆 抗 体 可 用 于 马 宾 灵 在 不 同 生 物 反 应 器 中 表 达 的 检 测, 为 马 宾 灵 的 基 因 工 程 研 究 提 供 灵 敏 可 靠 的 免 疫 学 鉴 定 关 键 词 : 马 槟 榔 ; 马 宾 灵 ; 多 克 隆 抗 体 ; 植 物 甜 蛋 白 中 图 分 类 号 :Q819 文 献 标 志 码 :A 论 文 编 号 :2011-3143 Preparation and Identification of the Polyclonal Antibody Against Plant Sweet Protein MabinlinⅡ Gu Wenliang 1, Xia Qiyu 2, Yao Jing 1, Hu Xinwen 1, Guo Jianchun 2 ( 1 College of Agriculture, Hainan University, Haikou 570228; 2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101) Abstract: The plant sweet protein MabinlinⅡ is found rich in mature seeds of Capparis masaikai Lévl which is particular to China and may have wide application prospects in food sweeteners industry. In this study, in order to provide a reliable testing antibody for engineering applications of recombinant MabinlinⅡ, Mabinlin Ⅱ was separated and purified from the mature seeds of Capparis masaikai Lévl by ion exchange chromatography. The purified protein was used as antigen to immunize New Zealand rabbits to prepare polyclonal antibody against the Mabinlin Ⅱ protein. The result of Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay (ELISA) showed that the titer of the polyclonal antibody to purified Mabinlin Ⅱ was 1:256000, and the polyclonal antibody against the purified Mabinlin Ⅱ also had highly reactivity and specialty in western blot analysis. The polyclonal antibody against Mabinlin Ⅱ could be used for detecting the protein amounts of MabinlinⅡ expressed in various bioreactors, which may serve sensitive and reliable methods for immunology detection in genetic engineering research of MabinlinⅡ. Key words: Capparis masaikai Lévl; MabinlinⅡ; polyclonal antibody; plant sweet protein 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 马 宾 灵 基 因 (Mabinlin) 体 外 甜 味 表 达 及 其 结 构 发 生 规 律 研 究 (31060123);2010 年 海 南 省 研 究 生 创 新 科 研 课 题 分 子 伴 侣 SUMO 融 合 表 达 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 的 研 究 第 一 作 者 简 介 : 顾 文 亮, 男,1984 年 出 生, 湖 北 黄 石 人, 博 士, 主 要 从 事 植 物 分 子 遗 传 学 方 面 的 研 究 通 信 地 址 :571101 海 南 省 海 口 市 龙 华 区 学 院 路 4 号 热 带 生 物 技 术 研 究 所,Tel:0898-66987535,E-mail:gwl84@126.com 通 讯 作 者 : 郭 建 春, 女,1965 年 出 生, 湖 南 桃 江 人, 研 究 员, 博 士 生 导 师, 博 士, 主 要 从 事 分 子 生 物 学 植 物 基 因 工 程 等 方 面 的 研 究 通 信 地 址 :571101 海 南 省 海 口 市 龙 华 区 学 院 路 4 号 热 带 生 物 技 术 研 究 所,Tel:0898-66890635,E-mail:jianchunguoh@163.com 收 稿 日 期 :2011-10-31, 修 回 日 期 :2012-02-14
顾 文 亮 等 : 植 物 甜 蛋 白 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 多 克 隆 抗 体 的 制 备 与 鉴 定 195 0 引 言 目 前 全 世 界 一 共 发 现 有 7 种 植 物 甜 味 蛋 白 及 矫 味 蛋 白 [1], 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 是 唯 一 在 中 国 发 现 的 植 物 甜 蛋 白 [2] 马 宾 灵 来 源 于 植 物 马 槟 榔 的 种 子 [3], 经 研 究 发 现 在 马 槟 榔 种 子 中 存 在 4 种 马 宾 灵 同 系 物 蛋 白, 而 其 中 仅 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 具 有 最 佳 的 热 稳 定 性 也 研 究 的 最 为 深 入 [4] 马 宾 灵 在 食 品 与 药 用 等 方 面 有 着 非 常 大 的 开 发 前 景, 但 是 由 于 野 生 的 马 槟 榔 资 源 极 其 有 限 并 且 还 在 持 续 萎 缩 [5], 人 工 合 成 的 马 宾 灵 因 成 本 偏 高 副 产 物 混 杂 纯 化 复 杂 难 以 大 规 模 开 发 利 用 [6], 利 用 基 因 工 程 手 段 开 发 利 用 马 宾 灵 遂 成 为 研 究 的 热 点 [7] 刘 敬 梅 等 在 2001 年 将 马 宾 灵 基 因 转 入 莴 苣 中 表 达, [8] 李 晓 东 等 在 2004 年 将 马 宾 灵 基 因 转 入 番 茄 中 表 达, [9] 顾 文 亮 等 在 2009 年 将 重 组 马 宾 灵 基 因 转 入 拟 南 芥 与 [10] [11] 大 肠 杆 菌 中 表 达, 张 菲 菲 等 在 2011 年 拟 将 重 组 马 [12] 宾 灵 基 因 转 入 人 参 果 中 表 达, 王 昌 博 等 在 2011 年 也 将 全 长 马 宾 灵 基 因 转 入 大 肠 杆 菌 中 表 达 当 前 随 着 技 术 手 段 的 不 断 进 步, 将 马 宾 灵 及 其 重 组 基 因 导 入 多 中 生 物 反 应 器 中 表 达 已 经 成 为 可 能, 因 而 制 备 专 一 和 灵 敏 马 宾 灵 多 克 隆 抗 体 用 于 马 宾 灵 基 因 工 程 产 物 的 检 测 显 得 尤 为 必 要 为 此, 笔 者 将 具 有 甜 味 活 性 的 植 物 甜 蛋 白 马 宾 灵 免 疫 新 西 兰 大 白 兔, 制 备 了 构 象 型 的 马 宾 灵 兔 源 多 克 隆 抗 体, 经 ELISA 和 Western-blot 检 测 表 明 所 制 备 的 抗 体 可 用 于 植 物 甜 蛋 白 马 宾 灵 的 基 因 工 程 产 物 检 测 以 期 为 重 组 植 物 甜 蛋 白 马 宾 灵 的 开 发 应 用 提 供 相 应 蛋 白 质 鉴 定 方 面 的 参 考 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 马 槟 榔 种 子 采 集 于 广 西 云 南 贵 州 等 地 的 野 生 马 槟 榔 植 物, 保 存 在 4 冰 箱 中 CM Sepharose Fast Flow 羧 甲 基 纤 维 素 层 析 柱 介 质 购 自 GE Healthcare 公 司 ; 新 西 兰 大 白 兔 购 自 海 南 医 学 院 实 验 动 物 中 心 ; 弗 氏 完 全 佐 剂 和 弗 氏 不 完 全 佐 剂 购 自 Sigma 公 司 ;ELISA 酶 标 板 购 自 Cosmo 公 司 ;HRP 标 记 的 羊 抗 兔 IgG 够 自 Abmart 公 司 ;Immobilon-PSQ PVDF 膜 与 Amicon Ultra-15 3K 的 超 滤 管 购 自 Millipore 公 司 ; 低 分 子 量 蛋 白 Marker 预 染 蛋 白 Marker 及 AEC 显 色 试 剂 盒 购 自 上 海 生 工 ; 其 他 试 剂 均 为 进 口 或 国 产 分 析 纯 1.2 方 法 1.2.1 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 的 分 离 与 纯 化 参 照 Liu [13], Li [14] 等 的 方 法 并 适 当 改 变, 马 槟 榔 种 子 去 壳 粉 碎 后 用 石 油 醚 ( 沸 点 30~60 ) 浸 提 脱 脂, 取 0.5 g 自 然 风 干 的 脱 脂 干 粉 溶 于 100 ml 的 0.5 mol/l NaCl 溶 液 中, 浸 提 30 min 后 12000 r/min 4 离 心 10 min 后 再 过 滤 去 除 残 渣, 提 取 液 中 加 入 硫 酸 铵 至 70% 的 饱 和 度 即 出 现 沉 淀, 12000 r/min 4 离 心 10 min 收 集 沉 淀, 沉 淀 用 10 ml 的 50 mmol/l Glycine/NaOH ph 9.0 溶 液 溶 解, 样 品 液 经 0.45 µm 的 滤 膜 过 滤 后 即 可 供 CM Sepharose Fast Flow 羧 甲 基 纤 维 素 层 析 柱 分 离 样 品 液 直 接 上 用 50 mmol/l Glycine/NaOH ph 9.0 含 0.1 mol/l NaCl 的 溶 液 平 衡 的 羧 甲 基 纤 维 素 柱 层 析 柱, 用 前 述 平 衡 液 洗 至 流 出 液 在 紫 外 吸 收 波 长 280 nm 处 无 吸 收, 然 后 分 别 用 含 0.2 mol/l NaCl 0.45 mol/l NaCl 和 0.8 mol/l NaCl 的 50 mmol/l Glycine/NaOH ph 9.0 洗 脱 液 顺 序 分 步 洗 脱, 在 紫 外 波 长 280 nm 处 检 测, 收 集 各 个 洗 脱 峰 收 集 的 各 部 分 洗 脱 峰 可 用 透 析 袋 对 蒸 馏 水 透 析 脱 盐, 或 用 Amicon Ultra-15 3K 的 超 滤 管 超 滤 脱 盐 浓 缩, 经 真 空 冰 冻 干 燥 后 收 集 粉 末 于 -20 冰 箱 中 保 存 1.2.2 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 的 Tricine-SDS-PAGE 分 析 与 甜 味 及 热 稳 定 性 测 试 参 照 Nature Protocol [15] 上 的 方 法 配 制 含 浓 缩 胶 夹 层 胶 与 分 离 胶 的 Tricine-SDS-PAGE 凝 胶 及 其 正 极 与 负 极 电 泳 缓 冲 液, 取 各 部 分 洗 脱 峰 的 [2] 纯 化 蛋 白 溶 液 上 样 凝 胶 电 泳 参 照 胡 忠 等 的 方 法 进 行 纯 化 的 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 的 甜 味 测 试 与 热 稳 定 性 测 试 1.2.3 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 兔 源 多 克 隆 抗 体 的 制 备 初 次 免 疫 前 取 新 西 兰 大 白 兔 的 血 清 作 为 阴 性 对 照 首 次 免 疫 时 取 0.5 mg 的 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 溶 于 1 ml 的 PBS 缓 冲 液 (ph 7.4), 再 与 完 全 弗 氏 佐 剂 以 1:1 的 体 积 比 混 合, 充 分 乳 化 后 采 用 颈 背 部 皮 下 多 点 注 射 法 对 4 只 新 西 兰 大 白 兔 进 行 免 疫 2 周 后 取 0.5 mg 的 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 加 不 完 全 弗 氏 佐 剂 进 行 第 一 次 加 强 免 疫, 分 别 以 同 样 的 剂 量 于 第 五 周 和 第 八 周 时 进 行 第 二 次 与 第 三 次 加 强 免 疫 在 第 一 次 加 强 免 疫 后 的 7 天 后 分 别 对 4 只 新 西 兰 大 白 兔 进 行 耳 静 脉 采 血, 分 离 血 清 测 定 效 价 比 进 行 初 步 免 疫 应 答 评 估, 在 第 三 次 加 强 免 疫 后 的 7 天 后 分 别 对 4 只 新 西 兰 大 白 兔 进 行 耳 静 脉 采 血, 分 离 血 清 测 定 效 价 比 进 行 最 终 免 疫 应 答 评 估 取 最 终 免 疫 应 答 评 估 时 ELISA 效 价 较 高 的 2 只 新 西 兰 大 白 兔 进 行 麻 醉 后 心 脏 取 血, 血 液 在 37 恒 温 箱 中 放 置 30 min 后 置 于 4 过 夜 将 血 液 转 移 至 离 心 管 中, 10000 r/min 4 离 心 10 min, 收 集 上 清 液 即 为 抗 血 清 采 用 抗 原 亲 和 纯 化 法 对 抗 血 清 进 行 纯 化, 经 上 样 平 衡 洗 脱 并 收 集 洗 脱 液, 将 纯 化 的 抗 体 加 入 NaN 3 至 终 浓 度 0.02% 再 分 装 后 于 -20 保 存 备 用 1.2.4 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 兔 源 多 克 隆 抗 体 的 ELISA 测 试 取 少 量 的 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 抗 血 清 进 行 间 接 酶 联 免 疫 吸 附 实 验 测 定 其 效 价 比, 以 免 疫 前 血 清 作 为 阴 性
196 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn 对 照 用 50 mmol/l 的 Na 2CO 3-NaHCO 3 (ph 9.6) 包 被 缓 冲 液 将 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 稀 释 至 0.01 mg/ml, 酶 标 板 上 每 孔 中 加 入 100 µl, 置 于 4 中 过 夜 第 二 日 弃 酶 标 板 孔 内 的 溶 液, 用 洗 涤 缓 冲 液 PBST 洗 3 次, 每 孔 加 200 µl 的 封 闭 液 于 37 封 闭 1 h, 用 PBST 洗 酶 标 板 3 次 后, 将 免 疫 前 血 清 用 封 闭 液 以 1:1000 稀 释, 抗 血 清 以 起 始 1:1000 稀 释, 然 后 依 次 按 前 次 稀 释 倍 数 的 2 倍 进 行 梯 度 稀 释, 每 孔 加 入 100 µl 各 个 梯 度 稀 释 的 抗 血 清, 放 置 于 37 温 育 1 h 用 PBST 洗 板 3 次 后, 每 孔 中 加 入 100 µl 的 1:3000 稀 释 的 HRP 标 记 的 羊 抗 兔 IgG, 放 置 于 37 温 育 1 h, 再 用 PBST 洗 板 3 次, 然 后 用 ddh 2O 洗 涤 1 次, 每 孔 中 加 入 TMB 底 物 溶 液 100 µl, 放 置 于 37 温 育 10 min, 最 后 在 每 孔 中 加 入 50 µl 的 2 mol/l 硫 酸 终 止 反 应 在 ELISA 酶 标 仪 上 于 450 nm 处 以 空 白 对 照 孔 调 零 后 测 每 孔 的 吸 光 值 A, 以 A 大 于 等 于 阴 性 对 照 的 2.1 倍 为 阳 性 1.2.5 马 宾 灵 (Mabinlin Ⅱ) 兔 源 多 克 隆 抗 体 的 Western-blot 鉴 定 取 纯 化 的 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 粉 末 溶 于 PBS 缓 冲 液 (ph 7.4) 中, 稀 释 至 终 浓 度 为 0.01 mg/ml, 取 10 µl 的 稀 释 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 溶 液 上 样 进 行 Tricine-SDS-PAGE 凝 胶 电 泳 电 泳 结 束 后, 根 据 预 染 Marker 将 含 目 的 条 带 的 凝 胶 切 下, 用 半 干 式 转 膜 仪 电 转 移 至 PVDF 膜 上 (60 V,2 h), 用 5% 脱 脂 奶 粉 的 TBST 缓 冲 液 在 室 温 进 行 封 闭 1 h, 用 TBST 缓 冲 液 洗 膜 3 次 后, 加 入 纯 化 多 克 隆 抗 体 作 为 一 抗, 以 1:3000 稀 释 于 TBST 缓 冲 液 中, 放 置 于 4 缓 慢 摇 动 过 夜 第 二 日 用 TBST 缓 冲 液 于 室 温 下 洗 膜 3 次, 加 入 HRP 标 记 的 羊 抗 兔 IgG 作 为 二 抗, 以 1:2000 稀 释 于 TBST 缓 冲 液 中, 放 置 于 37 孵 育 1 h 后 用 TBST 缓 冲 液 洗 膜 3 次, 用 AEC 显 色 试 剂 盒 显 色 并 拍 照 保 存 1.3 数 据 统 计 分 析 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 兔 源 多 克 隆 抗 体 的 ELISA 测 试 以 免 疫 前 的 新 西 兰 大 白 兔 血 清 作 为 阴 性 对 照, 将 免 疫 前 的 新 西 兰 大 白 兔 血 清 用 封 闭 液 以 1:1000 稀 释, 免 疫 后 的 新 西 兰 大 白 兔 抗 血 清 以 起 始 1:1000 稀 释, 然 后 依 次 按 前 次 稀 释 倍 数 的 2 倍 进 行 梯 度 稀 释, 共 进 行 10 个 梯 度 的 稀 释 至 1:512000, 每 个 样 品 设 置 3 个 重 复 孔 取 ELISA 酶 标 仪 上 于 450 nm 处 以 空 白 对 照 孔 调 零 后 测 每 孔 的 吸 光 值 A, 对 每 个 样 品 的 平 均 吸 光 值 A 进 行 数 据 统 计 分 析, 以 A 大 于 等 于 阴 性 对 照 的 2.1 倍 为 阳 性 2 结 果 与 分 析 2.1 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 的 提 取 及 其 鉴 定 分 别 取 0.2 mol/l NaCl 0.45 mol/l NaCl 和 0.8 mol/l NaCl 的 洗 脱 液 样 品, 经 变 性 后 进 行 Tricine-SDS-PAGE 电 泳 分 析 ( 图 1) 结 果 如 图 1 中 所 示,0.2 mol/l NaCl 的 洗 脱 液 ( 图 1 中 4 号 泳 道 ) 中 多 为 杂 质 蛋 白 ;0.45 mol/l NaCl 的 洗 脱 液 ( 图 1 中 5 号 泳 道 ) 中 的 主 要 成 分 为 马 宾 灵 (MabinlinⅡ), 其 在 低 分 量 蛋 白 Marker 的 6.5 kd 处 有 2 条 主 要 的 蛋 白 条 带, 与 马 宾 灵 的 A- 链 和 B- 链 的 分 子 量 相 一 致 ;0.8 mol/l NaCl 的 洗 脱 液 ( 图 1 中 6 号 泳 道 ) 中 的 主 要 成 分 为 马 宾 灵 M 1 2 3 4 5 6 66 kd 45 kd 35 kd 27 kd 20 kd 14.4 kd 9.5 kd 6.5 kd 4.1 kd M: 低 分 子 量 蛋 白 质 Marker;1:CM Sepharose Fast Flow 羧 甲 基 纤 维 素 层 析 柱 样 品 ;2:CM Sepharose Fast Flow 羧 甲 基 纤 维 素 层 析 柱 未 结 合 样 品 ; 3:CM Sepharose Fast Flow 羧 甲 基 纤 维 素 层 析 柱 平 衡 液 洗 脱 样 品 ;4:CM Sepharose Fast Flow 羧 甲 基 纤 维 素 层 析 柱 0.2 mol/l NaCl 的 50 mmol/l Glycine/NaOH ph 9.0 洗 脱 液 洗 脱 样 品 ;5:CM Sepharose Fast Flow 羧 甲 基 纤 维 素 层 析 柱 0.45 mol/l NaCl 的 50 mmol/l Glycine/NaOH ph 9.0 洗 脱 液 洗 脱 样 品 ;6:CM Sepharose Fast Flow 羧 甲 基 纤 维 素 层 析 柱 0.8 mol/l NaCl 的 50 mmol/l Glycine/NaOH ph 9.0 洗 脱 液 洗 脱 样 品 图 1 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 的 过 柱 纯 化 图
顾 文 亮 等 : 植 物 甜 蛋 白 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 多 克 隆 抗 体 的 制 备 与 鉴 定 197 (MabinlinⅡ) 的 其 他 3 种 同 系 物 蛋 白 取 0.45 mol/l NaCl 洗 脱 液 的 纯 化 马 宾 灵 和 0.8 mol/l NaCl 的 洗 脱 液 的 纯 化 马 宾 灵 同 系 物 经 脱 盐 浓 缩 处 理 后 的 样 品 水 溶 液 进 行 甜 味 测 试 与 热 稳 定 测 试, 所 纯 化 的 马 宾 灵 与 纯 化 的 马 宾 灵 同 系 物 都 有 强 烈 的 甜 味 感 觉 ; 纯 化 的 马 宾 灵 在 85 温 浴 0.5 h 后 仍 有 甜 味 感 觉, 而 纯 化 的 马 宾 灵 同 系 物 在 85 温 浴 0.5 h 后 则 没 有 甜 味 感 觉 纯 化 后 的 马 宾 灵 的 在 分 子 量 甜 味 感 觉 和 热 稳 定 性 等 方 面 均 符 合 前 人 的 描 述, 所 纯 化 的 马 宾 灵 的 纯 度 达 86.9%, 满 足 下 一 步 作 为 抗 原 进 行 免 疫 新 西 兰 大 白 兔 的 要 求 2.2 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 兔 源 多 克 隆 抗 体 的 ELISA 测 试 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 兔 源 多 克 隆 抗 体 的 ELISA 结 果 ( 图 2) 显 示, 经 过 4 轮 的 免 疫, 新 西 兰 大 白 兔 的 血 清 抗 体 效 价 达 到 1:256000 以 上, 表 明 马 宾 灵 可 诱 导 所 免 疫 的 新 西 兰 大 白 兔 产 生 良 好 的 体 液 免 疫 反 应, 所 制 备 的 马 宾 灵 兔 源 多 克 隆 抗 体 具 有 较 好 的 效 价 比 2.3 马 宾 灵 (Mabinlin Ⅱ) 兔 源 多 克 隆 抗 体 的 Western-blot 鉴 定 根 据 马 宾 灵 (Mabinlin Ⅱ) 兔 源 多 克 隆 抗 体 的 Western-blot 鉴 定 结 果 ( 图 3) 所 示, 所 制 备 的 马 宾 灵 兔 71 kd 50 kd 35 kd 25 kd 16 kd 8 kd M 1 2 M: 低 分 子 量 范 围 预 染 蛋 白 质 Marker;1: 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 样 品 检 测 ; 2: 未 免 疫 的 新 西 兰 大 白 兔 血 清 作 阴 性 对 照 检 测 图 3 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 多 克 隆 抗 体 的 Western-blot 检 测 图 1 表 示 免 疫 的 1 号 兔 子,2 表 示 免 疫 的 2 号 兔 子 图 2 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 多 克 隆 抗 体 的 ELISA 效 价 图 源 多 克 隆 抗 体 作 为 一 抗 经 1:3000 倍 稀 释 后, 可 特 异 性 识 别 纯 化 的 马 宾 灵 (Mabinlin Ⅱ) 样 品 且 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 的 A 链 与 B 链 均 有 杂 交 条 带 显 示, 而 以 免 疫 前 的 新 西 兰 大 白 兔 血 清 作 为 一 抗 阴 性 对 照 则 未 检 测 到 任 何 条 带, 表 明 所 制 备 的 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 兔 源 多 克 隆 抗 体 具 有 良 好 的 反 应 性 3 结 论 从 马 槟 榔 种 子 中 提 取 纯 化 植 物 甜 蛋 白 马 宾 灵 (MabinlinⅡ), 将 具 有 甜 味 活 性 构 型 的 马 宾 灵 (Mabinlin Ⅱ) 蛋 白 为 抗 原 免 疫 新 西 兰 大 白 兔, 免 疫 后 的 新 西 兰 大 白 兔 血 清 经 抗 原 亲 和 纯 化 制 备 马 宾 灵 多 克 隆 抗 体 本 研 究 所 制 备 的 马 宾 灵 多 克 隆 抗 体 经 ELISA 检 测 效 价 比 达 到 1:256000,Western-blot 检 测 表 明 其 具 有 良 好 的 反 应 性 和 特 异 性, 可 用 于 植 物 甜 蛋 白 马 宾 灵 的 基 因 工 程 产 物 检 测 4 讨 论 抗 体 效 价 比 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 是 目 前 在 世 界 上 所 发 现 的 7 种 植 物 甜 味 蛋 白 中 唯 一 在 中 国 发 现 的 植 物 甜 味 蛋 白, 在 中 国 众 多 的 研 究 人 员 开 展 了 马 宾 灵 的 多 方 面 研 究 工 [4] 作 胡 忠 等 首 次 从 马 槟 榔 种 子 中 分 离 得 到 植 物 甜 蛋 白 马 宾 灵 (MabinlinⅡ), 并 且 研 究 了 采 用 不 同 提 取 溶 液 下 如 磷 酸 缓 冲 液 盐 酸 溶 液 甘 油 水 溶 液 硫 酸 铵 提 取 液 和 50% 丙 酮 水 溶 液 的 马 宾 灵 得 率, 认 为 50% 丙 酮 水 溶 液 的 马 宾 灵 得 率 最 高, 达 到 13.93% 此 后 研 究 人 员
198 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn 多 采 用 50% 丙 酮 水 溶 液 作 为 马 宾 灵 的 提 取 溶 液, 本 研 究 初 期 采 用 前 述 方 法, 但 通 过 具 体 实 验 发 现 50% 丙 酮 水 溶 液 中 离 心 时 极 易 引 起 蛋 白 质 聚 集 而 变 性, 且 直 接 采 用 50% 丙 酮 水 溶 液 上 羧 甲 基 纤 维 素 层 析 柱 进 行 分 离 纯 化 时 对 层 析 介 质 有 较 大 的 破 坏 作 用 笔 者 参 考 了 [13] Liu 等 的 方 法, 采 用 0.5 mol/l NaCl 提 取 溶 液 加 70% 饱 和 度 硫 酸 铵 沉 淀 的 方 法, 该 方 法 较 50% 丙 酮 水 溶 液 的 方 法 温 和 且 对 层 析 介 质 无 损 伤, 通 过 不 同 梯 度 NaCl 浓 度 的 洗 脱 液 的 比 较, 认 为 0.45 mol/l NaCl 浓 度 的 洗 脱 液 对 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 的 洗 脱 效 果 较 好 采 用 本 研 究 的 方 法, 以 干 重 为 1 g 的 马 槟 榔 种 子 脱 脂 干 粉 为 基 础, 可 纯 化 得 到 11.3 mg 的 马 宾 灵, 以 纯 化 的 马 宾 灵 纯 度 为 86.9% 计 算, 最 终 的 马 宾 灵 得 率 达 到 9.82%, 达 到 较 高 的 水 平 目 前 中 国 的 野 生 马 槟 榔 果 树 资 源 已 经 越 来 越 少, 在 2009 年 的 进 行 实 地 植 物 资 源 调 查 中 仅 发 现 野 生 的 马 槟 榔 活 体 植 株 145 株, 据 此 预 测 中 国 野 生 的 马 槟 榔 总 植 株 数 量 已 不 足 2000 株 [5] 随 着 当 前 研 究 的 不 断 深 入, 对 植 物 甜 蛋 白 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 的 蛋 白 质 结 构 及 [14] 其 甜 味 机 理 也 有 了 更 加 全 面 的 认 识, 对 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 的 基 因 进 行 重 组, 将 重 组 后 的 马 宾 灵 基 因 转 入 大 肠 杆 菌 和 毕 赤 酵 母 等 多 个 体 外 蛋 白 质 表 达 系 统 进 行 高 效 表 达, 以 期 获 得 具 有 甜 味 活 性 的 重 组 植 物 甜 蛋 白 马 宾 灵 也 逐 渐 成 为 可 能 制 备 高 效 价 比 与 特 异 构 象 型 的 马 宾 灵 抗 体 是 检 测 与 鉴 定 重 组 马 宾 灵 基 因 工 程 表 达 的 基 础 多 克 隆 抗 体 虽 然 在 特 异 性 稳 定 性 方 面 不 如 单 克 隆 抗 体, 但 其 制 备 简 便 成 本 低 廉 具 有 多 个 与 抗 原 决 定 簇 相 结 合 的 位 点 本 研 究 在 制 备 马 宾 灵 (MabinlinⅡ) 兔 源 多 克 隆 抗 体 时, 所 采 用 的 抗 原 为 纯 化 后 的 具 有 甜 味 活 性 的 马 宾 灵, 而 非 以 大 肠 杆 菌 表 达 的 重 组 马 宾 灵 蛋 白 作 为 抗 原 采 用 正 确 折 叠 形 成 甜 味 构 象 的 活 性 马 宾 灵 为 抗 原 时, 在 动 物 体 内 免 疫 产 生 的 多 克 隆 抗 体 多 为 构 象 型 抗 体, 能 够 识 别 在 基 因 工 程 表 达 的 具 有 甜 味 构 象 的 重 组 马 宾 灵, 符 合 在 马 宾 灵 的 重 组 基 因 工 程 表 达 时 要 求 参 考 文 献 [1] 朱 海 霞. 甜 蛋 白 的 研 究 进 展 [J]. 中 国 食 品 添 加 剂,2003(6):11-24. [2] 胡 忠, 何 敏. 马 槟 榔 甜 味 蛋 白 的 研 究 I. 提 取, 纯 化 和 某 些 特 性 [J]. 云 南 植 物 研 究,1983,5(2):207-212. [3] 李 永 康, 黄 威 廉, 王 兴 国, 等. 贵 州 植 物 志 ( 第 3 卷 )[M]. 贵 州 : 贵 州 人 民 出 版 社,1990:118. [4] 胡 忠, 彭 丽 萍, 何 敏. 马 槟 榔 甜 味 蛋 白 的 研 究 II. 甜 蛋 白 II 和 甜 蛋 白 I 的 比 较 [J]. 云 南 植 物 研 究,1985,7(1):1-10. [5] 于 旭 东, 张 超, 郭 建 春, 等. 马 槟 榔 种 质 资 源 调 查 报 告 [A]. 植 物 科 学 研 究 进 展 暨 中 国 热 带 特 色 植 物 科 学 学 术 研 讨 会 论 文 集 [C]. 海 南 海 口, 海 南 省 植 物 学 会,2009,12: 附 加 页. [6] Kohmura M, Ariyoshi Y. Chemical synthesis and characterization of the sweet protein mabinlin Ⅱ [J]. Biopolymers,1998,46(4): 215-223. [7] 刘 敬 梅, 陈 大 明, 陈 杭. 甜 蛋 白 基 因 MBLⅡ 对 莴 苣 的 遗 传 转 化 [J]. 园 艺 学 报,2001,28(3):246-250. [8] 李 晓 东, 刘 敬 梅, 陈 杭 等. 甜 蛋 白 基 因 MBLⅡ 对 番 茄 的 遗 传 转 化 [J]. 西 北 植 物 学 报,2004,24(5):808-811. [9] 顾 文 亮, 胡 新 文, 郭 建 春. 马 槟 榔 甜 蛋 白 基 因 (MBLⅡ) 的 剪 切 重 组 和 结 构 分 析 [J]. 植 物 生 理 学 通 讯,2009,45(4):333-339. [10] 顾 文 亮, 夏 启 玉, 胡 新 文, 等. 重 组 马 槟 榔 甜 蛋 白 MabinlinⅡ 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达 [J]. 基 因 组 学 与 应 用 生 物 学,2009,28(3):439-444. [11] 张 菲 菲, 彭 治 云, 张 金 文, 等. 马 槟 榔 MBLⅡ 基 因 重 组 及 果 实 特 异 表 达 载 体 构 建 [J]. 甘 肃 农 业 大 学 学 报,2011,46(1):49-54. [12] 王 昌 博, 黄 东 彦, 胡 文 锋, 等. 植 物 甜 蛋 白 Mabinlin Ⅱ 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达 [J]. 现 代 食 品 科 技, 2011,27(4):384-389. [13] Liu X Z, Maeda S J, Hu Z, et al. Purification, complete amino acid sequence and structural characterization of the heat-stable sweet protein, mabinlinⅡ[j].european Journal of Biochemistry,1993(211): 281-287 [14] Li D F, Jiang P H, Zhu D Y, et al. Crystal structure of Mabinlin Ⅱ: A novel structural type of sweet proteins and the main structural basis for its sweetness[j].journal of Structural Biology,2008(162): 50-62. [15] Hermann Schägger. Tricine SDS-PAGE[J].Nature Protocols,2006, 1(1):16-22.